KR20050079740A - 산안정성 단백질의 주사용 용액 제형 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인 과립구 콜로니 자극인자(hG-CSF)와 같은 산안정성 단백질을 장기간 안정적으로 보존할 수 있고 그것의 활성을 유지하면서 주사시 통증을 방지할 수 있는 용액 제형에 관한 것이다. 본 발명에 따른 주사용 용액 제형은, (a) 산안정성을 가진 생리적 활성 단백질을 함유하는 강산성의 활성 용액 분획; 및 (b) 상기 활성 용액 분획으로부터 분리되어 있고, 상기 활성 용액 분획과의 혼합시 상기 강산성을 중화시키며 생리식염수와 같은 삼투압을 유지시키는 중화액 분획;을 포함하는 것으로 구성되어 있다.
Description
본 발명은 산안정성 단백질(acid-stable protein)의 주사용 용액 제형에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 인 과립구 콜로니 자극인자(hG-CSF: human granulocyte colony stimulating factor)와 같이 산 조건에서 안정한 단백질이 장기간 보존될 수 있고 그 활성을 유지하면서도 환자에게 통증없이 용이하게 주사될 수 있도록 디자인된 용액 제형에 관한 것이다.
산안정성 단백질의 대표적인 예인 hG-CSF는 인 골수 중의 과립구계 전구세포에 작용하여 호중구로의 분화와 증식을 촉진하는 조혈인자이다. hG-CSF 단백질은 임상시험에서 골수이식, 특정암종에 대한 화학요법, 또는 골수 이형성 증후군의 원질환에 수반되는 여러가지 호중구 감소에 대해 호중구수 회복촉진 효과가 확인되어 있으며, 성숙호중구의 방출을 촉진시킴과 동시에 성숙호중구의 기능도 항진시키는 것으로 알려져 있다.
174 개의 아미노산으로 이루어진 hG-CSF 단백질은 의약품으로 사용되는 다른 많은 종류의 면역활성 단백질들에 비해 매우 강한 소수성을 가진다는 특징으로 인해, 주사제로의 개발이 용이하지 못하며 용액내에서의 낮은 안정성으로 인해 그 사용이 제한되는 경우가 많았다. 또한, 분자내의 결합에 의해 단백질의 구조를 안정시키는 것으로 알려진 시스테인기가 5 개 포함되어 있기 때문에, 2 개의 분자내 공유결합 후 잔존하는 자유 시스테인(free-cystein)기가 존재하여 고온에서 단백질 분자간의 응결 및 다중체 형성을 통한 침전반응을 촉진하는 등 그 안정성에 많은 문제를 가진다.
EP 1 060 746에 공지되어 있는 바와 같은 동물세포배양으로 얻은 당화된 hG-CSF(glycosylated hG-CSF)의 경우는, 분자내의 당사슬이 분자의 소수성을 경감시켜 당화 단백질을 안정시키는 역할을 하므로, 통상적인 단백질 액상 제형에 쓰이는 계면활성제만으로도 상기와 같은 문제점을 해소할 수 있지만, 동물세포 배양을 통한 당화 단백질의 제조비용은 재조합 대장균 발효를 통한 비당화 단백질 제조비용의 수십 배에 달하는 문제점을 가지고 있다. 따라서, 비당화 hG-CSF분자의 안정한 제형 개발이 상품화에 있어서 매우 중요한 요소로 부각되고 있고, 많은 연구자들에 의해 그 해결책이 연구되어 왔다.
US 5,919,443은 동결건조하여 제조한 hG-CSF 제형을 제시하고 있으나, 동결건조 제형은 그 사용상의 단점들로 인해 액상 제형으로 대체되고 있는 것이 현재의 추세이다. 즉, 동결건조 제품은 사용할 때 다시 주사용수에 녹여야 하는 불편이 있고 동결건조 과정이 생산 공정에 포함되어 있어 대용량의 동결 건조기를 사용해야만 하는 등 대규모의 투자가 필요하다. 분무 건조기를 사용하여 단백질을 분말화하는 방법도 고려할 수 있지만, 이 경우 낮은 수율로 인하여 경제성이 떨어지는 단점이 있고, 고온에 노출되어야 하는 까닭에 단백질 자체의 안정성에 부정적인 영향을 미칠 수도 있다. 따라서, 동결건조 제형은 액상 제형에 비하여 시장경쟁력이 낮은 제형이므로 액상 제형의 개발이 요구되어 왔다.
US 5,104,651은 소수성 단백질 hG-CSF가 통상의 단백질들이 안정한 중성 pH와 생리식염수 정도의 염의 농도에서 그것의 안정성이 매우 열악하여 안정한 용액 주사제의 제조가 불가능함을 보인 바 있고, hG-CSF를 안정화하는 방법으로 완충용액의 사용 없이 pH 2.7 ~ 4.0 의 강산성 용액 조건을 제시하고 있다. 그러나, 그러한 조건은 낮은 pH로 인해 주사가 불가능한 조건이며, 특히 그것의 명세서에서 기재하고 있는 바와 같은, hG-CSF 단백질이 최대의 안정성을 갖는 pH 3.5 ~ 3.7의 용액 조건은 환자에게 심한 통증과 조직의 괴사 등을 유발할 수 있으므로, 사실상 실시가 불가능하다. 실제로, 동 특허권자가 시판중인 제품인 뉴포젠(상표)(암젠, 미국)의 경우에도 동 특허에서 주장하는 최적의 pH 범위를 사용하지 못하고 있음이 이를 반증한다.
따라서, 본질적으로 소수성이 강하며 자유 시스테인기로 인한 응집과 다중체 형성 반응에 민감한 비당화 hG-CSF와 같은 산안정성 단백질이 보존기간 중에 안정화되어 있고 동시에 환자에게 부작용 없이 용이하게 투여될 수 있는 주사용 용액 제형의 개발이 강력히 요구되고 있다.
이상의 사실들을 고려하여, 본 발명에 따른 주사용 용액 제형은, 산안정성 단백질의 안정에는 효과적이나 주사에는 적합하지 않은 강산성 용액의 조건과, 주사에는 효과적이나 해당 단백질의 안정성에는 치명적인 중성 용액의 조건을 동시에 만족시킬 수 있는 구성으로 되어 있다.
즉, 본 발명에 따른 산안정성 단백질의 주사용 용액 제형은,
(a) 산안정성을 가진 생리적 활성 단백질을 함유하는 강산성의 활성 용액 분획; 및
(b) 상기 활성 용액 분획으로부터 분리되어 있고, 상기 활성 용액 분획과의 혼합시 상기 강산성을 중화시키며 생리식염수와 같은 삼투압을 유지시키는 중화액 분획;
을 포함하는 것으로 구성되어 있다.
따라서, 본 발명에 따른 주사용 용액 제형은 상호 분리되어 있는 활성 용액 분획과 중화액 분획으로 이루어져 있고, 주사 직전에 이들을 혼합하여 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어들 중의 일부에 대해 설명한다.
여기서 사용된 용어 "산안정성을 가진 생리적 활성 단백질(physiologically active protein having acid-stability)"은, 산 조건하에서 안정적으로 유지(보존)될 수 있는 단백질로서 생체내에서 일정한 활성을 나타내는 단백질을 의미한다. 즉, 생체내에서 그것의 활성을 발휘할 수 있도록 주사전에 생체외에서 보관될 때, 산 조건을 필요로 하는 단백질이다.
여기서 사용된 용어 "분획(fraction)"은 어떠한 요소(element)가 물리적 및 화학적으로 다른 요소와 구별될 수 있는 물질 상태를 이루고 있는 것을 의미한다.
여기서 사용된 용어 "분리되어 있다(divided)"는 물리적 및 화학적으로 서로 접하지 않도록 서로 이격되어 있는 것을 의미한다.
여기서 사용된 용어 "중화시키다(neutralize)"는 강산성의 활성 용액 분획의 낮은 pH와 낮은 삼투압을 생체내의 pH와 삼투압 또는 그것에 근사한 범위로 변화시키는 것을 의미한다.
기타 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 적용되는 의미로 해석될 수 있다.
상기 활성 용액 분획과 중화액 분획의 비율은, 주사시 상호 혼합하였을 때, 단백질의 활성이 변화되지 않고 안정적으로 유지되면서 객체에 통증을 유발하지 않는 pH와 삼투압 등의 조건을 제공하는 것이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 활성 용액의 pH, 중화액의 pH, 중화액의 pH 완충작용 여부 등 다양한 요소들에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 활성 용액 분획:중화액 분획의 비율은 약 1:5 내지 5:1(v/v), 더욱 바람직하게는 약 1:2 내지 2:1(v/v), 특히 바람직하게는 약 1:1(v/v)이다.
활성 용액 분획의 강산성 조건은 단백질의 산안정성의 정도에 따라 달라질 수 있는 바, 바람직하게는 pH 2.0 내지 3.8이다. 예를 들어, 단백질이 hG-CSF인 경우에 활성 용액 분획의 강산성 조건은 바람직하게는 pH 3.2 내지 3.7이다. 용액의 산도는 염산, 황산, 질산, 아세트산 등과 같은 산성 화합물을 첨가하여 조절될 수 있으며, 바람직하게는 염산을 사용할 수 있다.
상기 산안정성을 가진 생리적 활성 단백질의 예로는 천연(naturally occurring)의 것이든, 유전자 재조합의 것이든 특별히 한정되지 않으며, 앞서 설명한 바와 같은 hG-CSF와 기타 IL-2, IL-3 등을 대표적으로 들 수 있다.
상기 활성 용액 분획에는 단백질의 보유 상태를 더욱 안정화시키기 위하여 생체적합성 계면활성제를 더 포함할 수도 있다. 그러한 생체적합성 계면활성제의 예로는, 다음의 것으로 한정되는 것은 아니지만, Tween 80, Tween 20, Pluronic F-68 등을 들 수 있다.
상기 중화액 분획은 강산성의 활성 용액 분획과의 혼합시 그것의 pH를 앞서 설명한 바와 같은 조건으로 중화시키는 역할을 하며, 바람직하게는pH 7.0 내지 11.0의 용액이다. 그러한 중화액의 예로는, 다음의 것으로 한정되는 것은 아니지만, 증류수, NaCl 수용액, 생리식염수(0.9% NaCl), 완충용액 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 상대적으로 적은 량의 분획에 의해 중화 작용을 실행할 수 있는 완충용액이 특히 바람직하다. 상기 완충용액의 예로는, 다음의 것으로 한정되는 것은 아니지만, 인산염 완충용액, Tris 완충용액, 에탄올아민 완충용액, CAPS 완충용액, 초산나트륨 완충용액, CHES 완충용액, TAPS 완충용액, 메틸아민 완충용액 등을 들 수 있다. 완충용액의 농도는 10 내지 300 mM이 바람직한 바, 농도가 너무 낮으면 완충능력(Buffering power)에 문제점이 있을 수 있고 반대로 너무 높으면 혼합시 침전 또는 생체내의 삼투압 이상의 삼투압을 나타낼 수 있다.
바람직하게는, 상기 중화액에 삼투압 조절을 위한 물질("삼투압 조절제")을 더 첨가할 수 있다. 이러한 삼투압 조절제는 주사 단계에서 혼합되는 활성 용액과 중화액의 삼투압을 생체내 삼투압으로 등장화시키는 역할을 한다. 삼투압 조절제의 예로는, 다음의 것으로 한정되는 것은 아니지만, NaCl, Sorbitol, Mannitol 등을 들 수 있으며, 그 중 NaCl이 관련 분야에서 가장 널리 사용된다. 삼투압 조절제의 부가량은 주사 단계에서 혼합되는 활성 용액 분획과 중화액 분획의 상대량에 따라 결정될 수 있는데, 예를 들어, 1:1(v/v)의 용액 제형의 경우, 통상적인 주사용 용액 제형에 사용되는 삼투압 조절제의 2 배에 해당하는 량을 중화액 분획에 첨가함으로써, 주사를 위한 활성 용액 분획과 중화액 분획의 혼합시 전체 삼투압을 적절히 조절할 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 활성 용액 분획과 중화액 분획은 생체내로의 주사 전에는 서로 분리되어 있도록 제형화되어 있는 바, 이들 분획은 앰플과 같은 각각 독립된 용기에 포함되어 있을 수 있고, 이중 구획 주사기(dual chambered syringe)와 같은 일체형 용기에 포함되어 있을 수 있다. 다만, 본 발명에서의 효과를 발휘하는 것이라면 상기의 것들로 한정되지 않는 것은 물론이다.
이하 실시예들에서 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 하기의 실시예들은 본 발명의 예시일 뿐이므로 하기의 실시예들에 의하여 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] hG-CSF 이분획 용액 제형의 제조 및 보관에 관한 실험
600 mcg/㎖의 효모 유래 재조합 인 과립구 콜로니 자극인자(hG-CSF) 수용액에 1 N HCl을 첨가하여 pH 3.5로 맞추고, 이를 이중 구획 주사기(Dual chamber syringe, Vetter Pharma-Turm Inc., 독일)의 한 쪽 구획에 0.5 ㎖로 충진하였다. 다른 한 쪽의 구획에는 1.7% NaCl을 포함하고 있는 20 mM 인산염 완충용액(pH 7.4)을 0.5 ㎖로 충진하였다. 분석에 필요한 수 만큼의 충진된 주사기들을 단백질 제형 안정성 가속 시험 온도(각각 40℃ 및 50℃)의 배양기에 넣고 보관하였다.
[실시예 2] 고온 보관 후의 이분획 용액 제형의 혼합 용액 조건 및 안정성 분석에 관한 실험
실시예 1에서 배양기에 보관한 주사기를 보관 시간이 경과한 후 꺼내어, 주사기의 밀대를 두 분획의 혼합위치로 전진시키고 잘 흔들어 혼합한 후, 시험관에 주사하여 용액의 pH와 삼투압을 측정하였다. 각 주사기의 혼합 용액은 pH 7.08 내지 7.10 및 285 내지 304 mOsm의 삼투압을 나타내는 것으로 확인되었으며, 이는 주사시 통증을 유발하지 않는 생리식염수(287 mOsm)와 유사하다. 측정 후 용액을 100 mcl 취하여 한외여과 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)를 사용, 그것에 포함되어 있는 단백질의 단량체를 정량하였다. 시간의 경과에 따른 단량체 함유량의 변화를 통해 보관 기간에 따른 hG-CSF 안정성의 변화를 측정하여, 하기 표 1에 나타내었다.
| 50℃ 보관 조건 | 40℃ 보관 조건 | ||
| 경과시간 (일) | 잔여 단량체 (%) | 경과시간 (일) | 잔여 단량체 (%) |
| 0 | 100 | 0 | 100 |
| 7 | 97.2 | 14 | 101.1 |
| 14 | 93.9 | 28 | 99.8 |
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 주사용 용액 제형에서는, 매우 가혹한 조건으로 알려져 있는 고온의 보관 조건에서도 hG-CSF가 오랜 기간 동안 매우 안정적으로 유지됨을 알 수 있었으며, 주사 직전 활성 용액 분획과 중화액 분획의 혼합으로 주사에 매우 적합한 용액이 얻어짐을 알 수 있다.
[비교예 1] 단일상 제형에서의 hG-CSF 안정성의 확인 실험
본 발명에 따른 이분획 용액 제형을 사용하지 않고, 처음부터 일반적으로 주사에 적합한 pH와 삼투압으로 맞추어 단일상 제형을 제조하였다. 300 mcg/㎖의 효모 유래 재조합 hG-CSF가 함유되어 있는 10 mM 인산 완충용액(pH 7.0)에 NaCl을 0.9%로 첨가하여 삼투압을 조절한 다음, 유리 주사기에 1 ㎖로 충진하였다. 분석에 필요한 수 만큼의 충진된 주사기들을 단백질 제형 안정성 가속 시험 온도(각각 40℃ 및 50℃)의 배양기에 넣고 일정 기간 보관하였다. 그 결과, 수 시간 내에 다량의 침전이 형성되어 SE-HPLC 분석이 불가능하였으므로, 에스 디 에스 - 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 활성이 있는 단량체와 변성된 이중체 및 중합체를 분리한 후 덴시토미터 스캐닝으로 정량하여 안정성을 분석하였다 (표 2 참조).
| 50℃ 보관 조건 | 40℃ 보관 조건 | ||
| 경과시간(시간) | 잔여 단량체 (%) | 경과시간(일) | 잔여 단량체 (%) |
| 0 | 100 | 0 | 100 |
| 2 | 44.6 | 2 | 97.1 |
| 4 | 18.3 | 4 | 93.8 |
| 8 | 6.7 | 8 | 90.7 |
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 이분획 용액 제형(실시예 2)에 비해 매우 열악한 안정성을 보였으며, 분석 이전에도 육안으로 단백질이 변성되었음을 인지할 수 있었다.
[비교예 2] 시판중인 약산성의 용액 제형과의 비교 실험
시판중인 hG-CSF의 공지 조성을 모사하여, 본 발명에 따른 주사용 용액 제형과의 안정성을 비교하였다. 뉴포젠(암젠, 미국)은 10 mM 초산 나트륨 완충용액(pH 4.0), 0.004% 트윈 80, 및 5% 만니톨을 포함하는 조성을 갖는 것으로 알려져 있는데, 이는 주사할 수 있는 최저 허용 pH(4.0, 약산성)를 사용하고 있으며 등장화제로 만니톨을 사용하는 제형이다. 실시예 2와 동일한 분석법으로 단량체의 함량을 측정한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 50℃ 보관 조건 | 40℃ 보관 조건 | ||
| 경과시간(일) | 잔여 단량체 (%) | 경과시간(일) | 잔여 단량체 (%) |
| 0 | 100 | 0 | 100 |
| 4 | 82.3 | 14 | 93.0 |
| 8 | 72.4 | 21 | 91.1 |
| 16 | 55.5 | 28 | 89.3 |
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 이분획 용액 제형(실시예 2)와 비교하여, 뉴포젠의 안정성은 현저히 낮으며, 제형의 pH가 주사 적합 한계치에 근접한 pH이므로 환자에 따라 통증의 발생 확률이 매우 높음을 알 수 있다.
[실시예 3] 다양한 pH의 활성 용액 분획을 포함하는 용액 제형의 제조 및 보관시 안정성의 확인 실험
600 mcg/㎖의 효모 유래 재조합 hG-CSF 수용액을, 1 N HCl을 사용하여, 각각 pH 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 및 3.8로 맞추어 이중 구획 주사기(Dual chamber syringe, Vetter Pharma-Turm Inc., 독일)의 한 쪽 구획에 0.5 ㎖로 충진하였다. 각 제형의 용액 조건은 하기 표 4에서와 같다. 다른 한 쪽의 구획에는 1.7% NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충용액(pH 7.4)을 0.5 ㎖로 충진하였다. 분석에 필요한 수 만큼의 충진된 주사기들을 단백질 제형 안정성 가속 시험 온도(50℃)의 배양기에 넣고 보관하였다.
| 제형 | 활성 용액 분획 | 중화액 분획 |
| A | pH 2.0, 600ug/㎖ hG-CSF | 1.7% NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충용액(pH 7.4) |
| B | pH 2.5, 600ug/㎖ hG-CSF | |
| C | pH 3.0, 600ug/㎖ hG-CSF | |
| D | pH 3.5, 600ug/㎖ hG-CSF | |
| E | pH 3.8, 600ug/㎖ hG-CSF |
[실시예 4] 고온 보관 후 이분획 제형의 혼합 용액 조건과 안정성 분석
실시예 3에서 배양기에 보관한 주사기를 정해진 보관 시간(1 주일 및 2 주일)이 경과한 후 꺼내어, 주사기의 밀대를 두 분획의 혼합위치로 전진시키고 잘 흔들어 혼합한 후, 시험관에 주사하여 용액의 pH를 측정하였다. pH를 측정한 후의 용액에서 100 mcl를 취하여, 한외여과 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)를 사용하여 단량체를 정량하였다. 시간의 경과에 따른 단량체 함유량의 변화를 통해 보관 기간에 따른 hG-CSF의 안정성의 변화를 측정하여 하기 표 5에 나타내었다. 대조군(뉴포젠 모사제형)은 비교예 2에서와 같은 조성으로 제조되었다.
| 제형 | 50℃ 보관시 잔여 단량체(%) | 혼합 후의 pH | |
| 1 주 경과 후 | 2 주 경과 후 | ||
| A | 85.12 | 70.67 | 5.91 |
| B | 90.14 | 82.49 | 6.70 |
| C | 96.97 | 93.08 | 6.91 |
| D | 99.84 | 94.01 | 6.97 |
| E | 94.56 | 82.77 | 6.99 |
| 대조군 | 89.41 | 79.56 | N.A |
※ N.A : 적용 불가
표 5에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 주사용 용액 제형에서 hG-CSF의 안정성은 매우 가혹한 조건으로 알려져 있는 고온(50℃)의 보관 조건에서도 뉴포젠 모사제형에 비하여 매우 우수함을 알 수 있다. 또한, 그것의 최적 제형은 활성 용액 분획으로 pH 3.5, 600 g/㎖의 hG-CSF를 사용하고 중화액 분획으로 1.7% NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충용액(pH 7.4)을 사용한 경우임을 알 수 있다. 이러한 제형에서, 주사시 활성 용액 분획과 중화액 분획의 혼합액은, 그것의 pH가 6.97로서, 예측한 대로 주사에 적합하고 동시에 활성 성분이 안정함을 알 수 있었다.
[실시예 5] 다양한 pH의 중화액 분획을 포함하는 hG-CSF 이분획 용액 제형의 제조 및 보관에 관한 실험
600 mcg/㎖ 의 효모 유래 재조합 hG-CSF 수용액을 1 N HCl을 사용하여 pH 3.5로 맞추고, 이를 이중 구획 주사기(Dual chamber syringe, Vetter Pharma-Turm Inc., 독일)의 한 쪽 구획에 0.5 ㎖로 충진하였다.
다른 한 쪽의 구획에는 하기 표 6과 같은 중화액 분획을 0.5 ㎖로 충진하였다. 분석에 필요한 수 만큼의 충진된 주사기들을 단백질 제형 안정성 가속 시험 온도(50℃)의 배양기에 넣고 보관하였다.
| 제형 | 활성 용액 분획 | 중화액 분획 |
| F | pH 3.5, 600 g/㎖ hG-CSF | 1.7% NaCl을 함유한 20 mM 인산염 완충용액(pH 7.4) |
| G | 1.7% NaCl을 함유한 20 mM Tris 완충용액(pH 8.0) | |
| H | 1.7% NaCl을 함유한 20 mM Ethanolamine 완충용액(pH 9.0) | |
| I | 1.7% NaCl을 함유한 20 mM Ethanolamine 완충용액(pH 10.0) | |
| J | 1.7% NaCl을 함유한 20 mM CAPS 완충용액(pH 11.0) |
[실시예 6] 고온 보관 후의 이분획 용액 제형의 혼합 용액 조건 및 안정성의 분석 실험
실시예 5에서 배양기에 보관한 주사기를 정해진 보관 시간(1 주일 및 2 주일)이 경과한 후 꺼내어, 주사기의 밀대를 두 분획의 혼합위치로 전진시키고 잘 흔들어 혼합한 후, 시험관에 주사하여 용액의 pH를 측정하였다. pH를 측정한 후의 용액에서 100 mcl를 취하여, 한외여과 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)를 사용하여 단량체를 정량하였다. 시간의 경과에 따른 단량체 함유량의 변화를 통해 보관 기간에 따른 hG-CSF의 안정성의 변화를 측정하여 표 7에 나타내었다. 대조군(뉴포젠 모사제형)은 비교예 2에서와 같이 제조한 것을 사용하였다.
| 제형 | 50℃ 보관시 잔여 단량체 (%) | 혼합 후의 pH | |
| 1 주 경과 후 | 2 주 경과 후 | ||
| F | 97.66 | 95.35 | 6.99 |
| G | 98.03 | 94.43 | 7.87 |
| H | 95.85 | 90.95 | 8.71 |
| I | 95.53 | 91.00 | 9.74 |
| J | 92.11 | 84.86 | 10.58 |
| 뉴포젠 모사제형 | 89.41 | 79.56 | N.A |
※ N.A : 적용 불가
상기 표 7에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 주사용 용액 제형에서 hG-CSF의 안정성은, 매우 가혹한 조건으로 알려져 있는 고온(50℃)의 보관 조건에서도, 뉴포젠 모사제형과 비교하여, 다양한 제형들에서 우수함을 알 수 있다.
[실시예 7] 다양한 중화액 분획을 포함하는 이분획 용액 제형의 제조 및 보관에 관한 실험
600 mcg/㎖ 의 효모 유래 재조합 hG-CSF 수용액을 1 N HCl 을 사용하여 pH 3.5로 맞추어 이중 구획 주사기(Dual chamber syringe, Vetter Pharma-Turm Inc., 독일)의 한 쪽 구획에 0.5 ㎖로 충진하였다.
다른 한 쪽의 구획에는 하기 표 8과 같은 중화액 분획을 0.5 ㎖로 충진하였다. 분석에 필요한 수 만큼의 충진된 주사기들을 단백질 제형 안정성 가속 시험 온도(50℃)의 배양기에 넣고 보관하였다.
| 제형 | 활성 용액 분획 | 중화액 분획 |
| K | PH 3.5, 600ug/㎖ hG-CSF | 1.8% NaCl |
| L | 0.9% NaCl (생리식염수) | |
| M | 0.52% NaCl을 함유한 100 mM 인산염 완충용액(pH 7.0) | |
| N | 0.007% NaCl을 함유한 140 mM 인산염 완충용액(pH 7.0) | |
| O | 200mM 인산염 완충용액(pH 7.0) | |
| P | 300mM 인산염 완충용액(pH 7.0) |
[실시예 8] 고온 보관 후 이분획 용액 제형의 혼합 용액 조건과 안정성의 분석 실험
실시예 7에서 배양기에 보관한 주사기를 정해진 보관 시간(1 주 및 2 주)이 경과한 후 꺼내어, 주사기의 밀대를 두 분획의 혼합위치로 전진시키고 잘 흔들어 혼합한 후, 시험관에 주사하여 용액의 pH를 측정하였다. pH를 측정한 후의 용액에서 100 mcl를 취하여, 한외여과 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)를 사용하여 단량체를 정량하였다. 시간 경과에 따른 단량체 함유량의 변화를 통해 보관 기간에 따른 hG-CSF의 안정성의 변화를 측정하여 하기 표 9에 나타내었다. 대조군(뉴포젠 모사제형)은 비교예 2에서와 같이 제조한 것을 사용하였다.
| 제형 | 50℃ 보관시 잔여 단량체(%) | 혼합 후의 pH | |
| 1 주 경과 후 | 2 주 경과 후 | ||
| K | 99.01 | 93.01 | 3.79 |
| L | 100.49 | 94.79 | 3.77 |
| M | 99.08 | 95.63 | 7.05 |
| N | 101.49 | 94.58 | 7.03 |
| O | 97.96 | 95.03 | 7.10 |
| P | 98.76 | 94.80 | 7.06 |
| 뉴포젠 모사제형 | 89.41 | 79.56 | N.A |
※ N.A : 적용 불가
상기 표 9에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 주사용 용액 제형의 hG-CSF 안정성은, 매우 가혹한 조건으로 알려져 있는 고온(50℃)의 보관 조건에서도, 대조군(뉴포젠 모사제형)과 비교하여, 다양한 제형들에서 우수함을 알 수 있고, 제형의 안정성면이나 주사시 통증 유발의 원인이 되는 pH면에서 탁월한 제형인 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 주사용 용액 제형은, hG-CSF와 같은 산안정성 단백질이 장기간의 보관 중에 응집 또는 다중체 형성으로 인해 생리적 활성을 잃게 되는 것을 방지하고, 그것의 주사시에 통증을 유발하지 않는 효과를 발휘한다. 따라서, 본 발명으로 인해, 소수성이 강한 비당화 단백질을 동결건조 제형에 비해 많은 장점을 가진 용액 제형으로 제조하는 것이 가능하게 되었으며, 동물세포 배양 유래의 당화 단백질에 비해 매우 저렴하게 생산되는 활성 물질의 사용이 가능하게 되었다.
Claims (8)
- (a) 산안정성을 가진 생리적 활성 단백질을 함유하고 있는 강산성의 활성 용액 분획; 및(b) 상기 활성 용액 분획으로부터 분리되어 있고, 상기 활성 용액 분획과의 혼합시 상기 강산성을 중화시키며 생리식염수와 같은 삼투압을 유지시키는 중화액 분획;을 포함하는 것으로 구성되어 있는 산안정성 단백질의 주사용 용액 제형.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 천연 또는 유전자 재조합 hG-CSF인 것을 특징으로 하는 주사용 용액 제형.
- 제 1 항에 있어서, 상기 중화액 분획으로는 pH 7.0 내지 11.0의 완충 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 주사용 용액 제형.
- 제 3 항에 있어서, 상기 완충용액의 농도는 10 내지 300 mM인 것을 특징으로 하는 주사용 용액 제형.
- 제 3 항에 있어서, 상기 완충용액에는 삼투압 조절제가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 주사용 용액 제형.
- 제 1 항에 있어서, 상기 활성 용액 분획의 pH는 2.0 내지 3.8인 것을 특징으로 하는 주사용 용액 제형.
- 제 1 항에 있어서, 상기 활성 용액 분획에는 생체적합성 계면활성제가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 주사용 용액 제형.
- 제 1항에 있어서, 상기 활성 용액 분획과 중화액 분획은 앰플과 같은 각각 독립된 용기에 포함되어 있거나, 또는 이중 구획 주사기(dual chambered syringe)와 같은 일체형 용기에 포함되어 있음으로써 서로 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 주사용 용액 제형.
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-
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- 2004-02-06 KR KR1020040007841A patent/KR20050079740A/ko not_active Application Discontinuation
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