JPH0853361A - 安定なタンパク含有凍結乾燥製剤およびアッセイキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 安定な凍結乾燥製剤の提供。 【構成】 マンニトールの質量／アラニンの質量の比Ｒ
が０.１〜１であることを特徴とする、タンパク、緩衝
液、アラニンおよびマンニトールからなる医薬的に許容
される安定な凍結乾燥製剤。 【効果】 医薬的に許容される安定な凍結乾燥製剤が得
られた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、凍結乾燥生成物の形態
であり、かつ、活性成分としてタンパクを含有する医薬
的に許容される製剤に関する。この製剤は、２５℃で安
定であり、溶媒の添加によって液体形態に再構成するこ
とができ、ヒトまたは動物に非経口投与することができ
るか、または、アッセイキットにおいて使用することが
できる。

【０００２】製剤は、凍結乾燥の間にタンパクの分解へ
のかなりの影響を有し、凍結乾燥形態でのそれらの安定
性への大きな影響を有することが知られている。これら
のパラメーターに影響を与える種々の製剤変数は、主
に、ｐＨ、存在する塩の量、賦形剤のタイプおよび量、
選択される凍結防止剤のタイプ、ならびに冷凍、昇華お
よび乾燥操作のために選択される温度、圧力および時間
である。これらの種々の変数は、得られた凍結乾燥生成
物の物理的状態、すなわち、ガラス状アモルファス、軟
質アモルファス、結晶形またはこれらの状態の組合せに
影響を与える。

【０００３】これらの変数の各々の役割は、別々に研究
されてきたが、それらの相乗効果は、まだ、あまり説明
されていない［ピカル・エム・ジェイ（Ｐikal Ｍ
Ｊ．）、デラーマン・ケイ・エム（Ｄellerman Ｋ
Ｍ．）、ロイ・エム・エル（Ｒoy ＭＬ．）、リギン・
エム・エヌ（Ｒiggin ＭＮ．）、製剤変数の、凍結乾燥
したヒト成長ホルモンの安定性への影響（Ｔhe effects
of formulation variables on the stability of free
ze-dried Ｈuman Ｇrowth Ｈormone）、ファーマシュー
ティカル・リサーチ（Ｐharm.Ｒesearch）、１９９１、
８、第４号、４２７−４３６］。

【０００４】アミノ酸およびポリオールの、凍結乾燥し
ようとする溶液または凍結乾燥生成物の特性への影響に
書誌的レビューにより、以下の結論を引き出すことがで
きた。

【０００５】アミノ酸、マンニトール、結晶相またはア
モルファス相の存在に関係する長所および短所を以下に
挙げる。

【０００６】アミノ酸の存在に関係する長所 凍結乾燥生成物におけるグリシンの存在は、凍結乾燥の
冷凍段階の間に溶液中に存在する分子の結晶化を誘発す
る［コリィ・ディ・ジェイ（Ｋorey ＤＪ．）、シュワ
ルツ・ジェイ・ビー（Ｓchwartz ＪＢ．）、凍結乾燥の
間の医薬化合物の結晶化への賦形剤の影響（Ｅffects o
f excipients on the crystallizationof pharmaceutic
al compounds during lyophilixation）、Ｊ.Ｐarenter
al Ｓci.Ｔech.、１９８９、４３、２、８０−８３］。
この活性成分の結晶化は、タンパクの場合には非常に起
こりにくいが、その安定性を増強させることができる。

【０００７】結晶形のアラニンは、昇華および乾燥の間
の凍結乾燥生成物の崩壊を防止するという長所を有し、
より大きな比表面積を有する凍結乾燥生成物を生成さ
せ、したがって、より迅速に乾燥させる［ピカル・エム
・ジェイ、タンパクの凍結乾燥（Ｆreeze-drying of pr
oteins）、Ｂiopharm.１９９０年１０月２６−３０
日］。

【０００８】アミノ酸の存在に関係する短所 凍結乾燥しようとする溶液中の糖またはポリオールへの
アミノ酸の添加は、一般に、糖のガラス転移温度の低下
という影響を有する［テ・ブーイ・エム・ピー・ダブリ
ュ・エム・デ・ルイター・アール・エイ（te Ｂooy Ｍ
ＰＷＭ de Ｒuiter ＲＡ．）、デ・メーア・エイ・エム
・ジェイ（de Ｍeere ＡＬＪ．）、示差走査熱量計によ
る凍結乾燥シュークロース含有製剤の物理的安定性の評
価（Ｅvaluation of the physical stability of freez
e-dried sucrose containing formulations by differe
ntial scanning calorimetry）、Ｐharm.Ｒesearch、１
９９２、９、１０９−１１４］。ここで、ガラス転移温
度の低下は、一般に、凍結乾燥生成物の安定性の低下と
同意語である［フランクス・エフ（Ｆranks Ｆ．）、凍
結乾燥；経験論から予想可能性まで（Ｆreeze-drying;
from empiricism topredictability）、クリオ−レター
ズ（Ｃryo-letters）、１９９０、１１、９３−１１
０］。

【０００９】マンニトールの存在に関係する長所 タンパクの周囲におけるアモルファス形のマンニトール
の存在は、冷凍の間、タンパクに関係する非結晶水の存
在を保証し、それによって、タンパクの変性を防止す
る。さらにまた、ポリオールの存在は、親水性相互作用
を介して、熱変性に対してタンパクを安定化する［バッ
ク・ジェイ・エフ（Ｂack ＪＦ．）、オーケンフル・デ
ィ（Ｏakenfull Ｄ．）、スミス・エム・ビー（Ｓmith
ＭＢ．）、糖およびポリオールの存在下でのタンパクの
増加した熱安定性（Ｉncreased thermal stability of
proteins in hte presence of sugars and polyols）、
Ｂiochemistry、１９７９、１８、２３、５１９１−９
６］。

【００１０】マンニトールの存在に関係する短所 ラクトースとは反対に、マンニトールは、３７℃で酵素
の活性を保存することができないことが開示された［フ
ォード・エイ・ダブリュ（Ｆord ＡＷ．）、ドーソン・
ピー・ジェイ（Ｄawson ＰＪ．）、アルカリホスファタ
ーゼの凍結乾燥における炭水化物添加剤の影響（Ｔhe e
ffect of carbohydrate additives in the freeze-dryi
ng of alkaline phosphatase）、Ｊ．Ｐharm.Ｐharmaco
l.、１９９３、４５（２）、８６−９３］。

【００１１】結晶相の存在に関係する長所 冷凍溶液における結晶化溶質の存在は、乾燥の間にタン
パクを安定化する手段である［カーペンター・ジェイ・
エフ・アンド・クロウェ・ジェ・エイチ（Ｃarpenter
ＪＦ．＆ Ｃrowe ＪＨ．）、乾燥の間の有機溶質による
タンパクの安定化のモード（Ｍodes of stabilization
of a protein by organic solutes during desiccatio
n）、クリオバイオロジー（Ｃryobiology）、１９８
８、２５、４５９−４７０］。

【００１２】結晶相の存在に関係する短所 凍結乾燥タンパクの活性の損失は、凍結保護分子の結晶
化度に直接関係することが開示された［イヅツ・ケイ・
エル・Ｉzutsu ＫＬ）、ヨシオカ・エス（Ｙoshioka
Ｓ．）、テラオ・ティ（Ｔerao Ｔ．）、結晶化による
凍結防止剤の低下したタンパク安定化効果（Ｄecreased
protein-stabilizing effects of cryoprotectants du
e to crystallization）、Ｐharm.ｒesearch、１９９
３、１０、第８号、１２３２−１２３７］。

【００１３】タンパクを含有する医薬生成物の製剤にお
いて、賦形剤の結晶化は、回避されるべきである［ハー
マンスキー・エム（Ｈermansky Ｍ．）、ペサック・エ
ム（Ｐesak Ｍ．）、薬物の凍結乾燥、ＶＩアモルファ
スおよび結晶形（Ｌyophilization of drugs. ＶＩ Ａm
orphous and Ｃristalline forms）、Ｃesk.Ｆarm.、１
９９３、４２、（２）、９５−９８］。

【００１４】アモルファス相の存在に関係する長所 アモルファス状態の添加剤の存在は、添加剤の濃度に比
例して、ある種の酵素の活性を安定化させる［イヅツ・
ケイ・エル、ヨシオカ・エス、テラオ・ティ、結晶化に
よる凍結防止剤の低下したタンパク安定化効果、Ｐhar
m.Ｒesearch、１９９３、１０、第８号、１２３２−１
２３７］。

【００１５】賦形剤の凍結防止効果は、得られた凍結乾
燥生成物中のグリシンのアモルファス状態に起因してい
る［ピカル・エム・ジェイ、デラーマン・ケイ・エム、
ロイ・エム・エル、リギン・エム・エヌ、凍結乾燥した
ヒト成長ホルモンの安定性に対する製剤変数の影響、フ
ァーマシューティカル・リサーチ、１９９１、８、第４
号、４２７−４３６］。

【００１６】アモルファス相の存在に関係する短所 固体アモルファス相だけの存在下、凍結乾燥生成物は、
冷凍の間、ガラス転移温度よりも高い温度で崩壊する。
軟質アモルファス相では、化学的変性反応は、結晶相に
おけるよりも迅速な速度を有する。

【００１７】最後に、タンパクの安定化への賦形剤の効
果に関する科学文献の余す所のないレビューにより、そ
れらの性質についての相反する情報を見いだすことがで
きる。凍結乾燥生成物の構造とその安定性との間の関係
についての理論は、一般に受け入れられていない。同様
に、ポリオールおよびアミノ酸の、単独でまたは組み合
わせての役割は、一組の一般化される性質に従って開示
されないが、研究されるタンパクおよび使用される賦形
剤の量に従って、相反する結果が見られた。

【００１８】したがって、驚くべきことに、マンニトー
ルとアラニンとの間に、凍結乾燥タンパクの安定化につ
いて相乗効果が見いだされた。この相乗効果は、これら
の２つの賦形剤の各々の相対濃度の範囲でのみ存在する
ことが示された。最適な効果は、比率Ｒについて限界を
定められる。ここで、凍結乾燥生成物中に存在するマン
ニトール質量／アラニン質量を表すＲは、０.１〜１、
特に、０.２〜０.８である。

【００１９】さらにまた、０.１〜１のＲについて以下
のことが示された：凍結乾燥生成物は、アモルファス相
および結晶相からなる。アモルファス相は、主としてマ
ンニトールおよびタンパクからなる。結晶相は、主とし
てアラニンからなる。

【００２０】０.１〜１のＲについて、予想される仮説
は、以下のとおりである。形成されたアモルファス相
は、冷凍の間にタンパクを凍結防止する。結晶相は、凍
結乾燥生成物の構造を固化し、その崩壊を回避する。そ
れは、アモルファス相および凍結乾燥タンパクを安定化
させる結晶相の共存間のこの驚くべき相乗効果である。
したがって、本発明は、好ましいＲ比についてこの効果
を生じることに関する。

【００２１】かくして、本発明は、生物学的に活性なタ
ンパクの有効量、タンパクの安定性について最適なｐＨ
に調整される緩衝液、アラニンおよびマンニトールを含
有する凍結乾燥医薬投与形態に関する。最後の２つの賦
形剤は、マンニトールの質量／アラニンの質量である質
量比Ｒ＝０.１〜１である。当該製剤に含まれるタンパ
クは、凍結乾燥形態でもなお安定なままである。得られ
た凍結乾燥生成物の溶解は、迅速かつ完全である。凍結
乾燥生成物の構造は、破壊または崩壊されず、その含水
量は、タンパクの活性の維持に適合する。

【００２２】当業者によく知られている他の医薬的に許
容される賦形剤、例えば、共溶媒、保存剤、抗酸化剤ま
たはキレート化剤などをこの製剤中に導入することがで
きる。

【００２３】本発明の目的は、実質的にはタンパクおよ
びマンニトールからなるアモルファス相によって冷凍の
間に凍結防止されるタンパクを含有する安定な凍結乾燥
タンパクを得ることからなる。このアモルファス相は、
冷凍溶液の昇華および乾燥後に得られた凍結乾燥生成物
中で、実質的にアラニンからなる結晶相と共存する。

【００２４】本発明に従って製剤化される生物学的に活
性な（または生物活性な）タンパクは、臨床または研究
に使用される場合のグリコシル化または非グリコシル化
された、天然、合成、半合成または組換えポリペプチド
である。さらに詳しくは、当該タンパクは、例えば、成
長ホルモン、好ましくは、ヒト成長ホルモン（ｈＧ
Ｈ）、黄体化ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、ゴナドトロピン
などのホルモンである。タンパクは、また、酵素、例え
ば、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナ
ーゼ、スタフィロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性
化因子（ｔＰＡ）などの血栓崩壊性酵素、または、ホス
ファターゼ、スルファターゼ、アシルトランスフェラー
ゼ、モノアミンオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼなどの
酵素であってもよい。同様に、本発明に従って製剤化さ
れるタンパクは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、
インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン
−６（ＩＬ−６）またはインターロイキン−１３（ＩＬ
−１３）などのサイトカインであってもよい。本発明の
タンパクの別の分類としては、抗体、免疫グロブリン、
イムノトキシンが挙げられる。コレシストキニン（ＣＣ
Ｋ）、サブスタンスＰ、ニューロキニンＡ、ニューロキ
ニンＢ、ニューロテンシン、ニューロペプチドＹ、エレ
ドイシン、ボンベシンなどのペプチドは、本発明に従っ
て製剤化することができる。

【００２５】生物学的に活性なタンパクは、好ましく
は、ｈＧＨ（またはヒト成長ホルモン）、尿酸オキシダ
ーゼまたはインターロイキン−１３である。

【００２６】ヒト成長ホスファターゼは、システイン残
基５３と１６５との間およびシステイン残基１８２と１
８９との間に２つのジスルフィド架橋を有する１９１ア
ミノ酸のポリペプチド一本鎖からなるタンパクである。

【００２７】尿酸オキシダーゼは、尿酸をアラントイン
に酸化する酵素であり、アスペルギルス・フラーブス
（Ａspergillus flavus）のバイオマスから抽出される
［レイバリュワー（Ｌaboureur）ら、Ｂull.Ｓoc.Ｃhi
m.Ｂiol.、１９６８、５０、８１１−８２５］。それ
は、２０年以上の間、高尿酸血症の治療に使用されてき
た。

【００２８】このタンパクをコードするｃＤＮＡは、最
近、クローン化され、イー・コリ（Ｅ.coli）［リゴウ
クス・アール（ＬＥＧＯＵＸ Ｒ）ら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ.of Ｂiol.Ｃhe
m.）、１９９２、２６７、１２、８５６５−８５７
０］、アスペルギウス・フラーブス（Ａspergillus fla
vus）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓaccharomy
ces cerevisiae）において発現された。該酵素は、３
２,０００の領域の分子量の同一サブユニットによる四
量体である。３０１アミノ酸のポリペプチド一本鎖から
なるモノマーは、ジスルフィド架橋を持たず、Ｎ末端で
アセチル化される。

【００２９】インターロイキン−１３は、２つのジスル
フィド架橋を有する１１２アミノ酸のポリペプチド一本
鎖からなる［ミンティ（Ｍinty）ら、ネイチャー（Ｎat
ure）、１９９３、３６２、２４８−２５０］。

【００３０】アモルファス（マンニトール＋タンパク）
相の結晶アラニン相との共存の獲得は、溶液のｐＨを調
節するための緩衝液の存在および濃度とは無関係である
が、前記定義のＲ比に関係している。

【００３１】治療薬として公衆に利用可能であるタンパ
ク製剤を提案するためには、製剤化の時間および使用時
間の間、それらの生物学的活性を維持するように充分に
安定な形でそれらを製剤化することが必須である。例え
ば、ｈＧＨは、以下の特許または特許出願：米国特許第
５,０９６,８８５号、ＷＯ８９／０９６１４、ＷＯ９２
／１７２００、Ａｕ−３０７７１／８９、ＷＯ９３／１
９７７３、ＷＯ９３／１９７７６に開示されているよう
な種々の方法で製剤化されてきた。

【００３２】本発明の製剤は、室温で提供することがで
きるが、一方、現在、これらのタンパクを含有する市販
の製剤は、２℃〜８℃の温度で保存しなければならな
い。

【００３３】ほとんどの場合、医薬投与形態は、凍結乾
燥されているか、冷凍されているか、または溶液であ
る。それは、タンパク、緩衝液、グリシン、アルギニ
ン、マンニトール、亜鉛、界面活性剤、デキストラン、
ＥＤＴＡまたは他の賦形剤を含有するが、０.１〜１の
質量比Ｒのアラニン／マンニトールの組合せを含有して
いない。凍結乾燥または冷凍形態は、分子の生化学的完
全性および生物学的活性を維持するために使用される。
凍結乾燥製剤は、使用前に、ベンジルアルコール、フェ
ノールまたはメタクレゾールなどの抗菌保存剤を含有し
ていてもよい蒸留水、塩化ナトリウム０.９％またはグ
ルコース５％の水溶液または他の生理的に許容される溶
媒などの医薬的に許容される無菌溶媒の添加によって再
構成されるべきである。

【００３４】再構成されるまで室温で安定な製剤は、ビ
ンまたはマルチドースペン（multidose pen）の形態に
適合したプレゼンテーションの形態のｈＧＨの場合、外
来治療に特に好都合である。

【００３５】このようにして調製された製剤は、また、
アッセイキット中に導入することもできる。

【００３６】したがって、本発明は、凍結乾燥生成物の
好ましい組成物である。この凍結乾燥生成物は、溶液を
用いて開始する凍結乾燥によって得られる。

【００３７】この製剤化の方法は、混合、溶解、濾過お
よび凍結乾燥の工程を含む。凍結乾燥されるべき溶液の
組成物は、以下のとおりである：タンパク、ｐＨを調整
するための医薬的に許容される緩衝液、アラニン、マン
ニトール（Ｒ＝マンニトールの質量／アラニンの質量
は、０.１〜１である）、注射用水。

【００３８】凍結乾燥されるべき溶液は、以下の方法で
調製される：タンパク溶液は、ゲル濾過カラム上で得ら
れ、タンパクの安定性に適合するゾーンでそのｐＨを維
持する緩衝液を含有する。

【００３９】この溶液に緩衝液、アラニン、マンニトー
ルおよび水の所望の量を添加して、全ての賦形剤を溶解
させる。該溶液を無菌的に濾過し、容器、好ましくは、
バイアルまたはカープル（carpule）中に分散させる。

【００４０】溶液の凍結乾燥は、以下のとおり行う：溶
液を冷凍、次いで、昇華および乾燥のサイクルに付す。
それは、凍結乾燥されるべき容量および溶液を含有する
容器に適合する。好ましくは、ＳＭＨ１５またはＳＭＪ
１００またはＳＭＨ２０００タイプのウシフロイド（Ｕ
sifroid）凍結乾燥器（フランス）において、約−２℃
／分の冷凍速度が選択される。

【００４１】凍結乾燥生成物の乾燥の時間、温度および
圧力は、凍結乾燥されるべき溶液の容量および凍結乾燥
生成物中の望まれる残存含水量の関数として調節され
る。

【００４２】注射用製剤の調製のための技術についての
完全な情報は、以下の文献において、当業者に入手可能
である：レミントンズ・ファーマシューティカル・サイ
エンシズ（Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓcience
s）、１９８５、第１７版またはウイリアム・エヌ・エ
イ・アンド・ポリ・ジー・ピー（Ｗilliam ＮＡ ＆ Ｐo
lli ＧＰ）、ザ・リオフィライゼーション・オブ・ファ
ーマシューティカルズ：ア・リタラチュア・リビュー
（Ｔhe lyophilization of pharmaceuticals:a literat
ure review）、Ｊ.Ｐarenteral Ｓci.Ｔech.、１９８
４、３８、（２）、４８−５９またはフランクス・エフ
（Ｆranks Ｆ．）、凍結乾燥；経験論から予想可能性ま
で、クリオ−レターズ、１９９０、１１、９３−１１
０。

【００４３】これによって、アラニンが結晶形であり、
マンニトールがアモルファス形である凍結乾燥生成物が
得られる。凍結乾燥生成物は、それが含有するタンパク
の生物学的活性を低下させずに２５℃で保存することが
できる。

【００４４】本発明を説明するために、タンパクの例と
してｈＧＨまたは尿酸オキシダーゼを選択して評価を行
った。かくして、生物学的に活性なタンパクとしてｈＧ
Ｈまたは尿酸オキシダーゼ、ｈＧＨを含有する溶液（４
ＩＵ／０.５ｍｌ）についてはｐＨ＝７の、および尿酸
オキシダーゼを含有する溶液（３０ＥＡＵ／ｍｌ、マン
ニトール単独、アラニン単独、またはアラニン／マンニ
トール混合物）についてはｐＨ＝８の種々の濃度のリン
酸塩緩衝液を含有するいくつかの溶液を調製し、凍結乾
燥し、分析した。

【００４５】組成物は、下記表１および表２の実施例に
おいて詳述する。分析方法ならびに安定化時間および温
度も以下に示す。

【００４６】

【表１】

【００４７】

【表２】

【００４８】種々のパラメーターの測定に使用した分析
方法は、以下のとおりである。

【００４９】二量体およびより高い分子量の関連物質の
含量：ＳＵＰＥＲＯＳＥ １２カラム（ファルマシア
（Ｐharmacia）、Ｒef.１７−０５３８−０１）を使用
して、排除クロマトグフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によ
って、二量体およびより高い分子量の関連物質の含量を
測定する。生成物を、ｐＨ＝７.０のリン酸アンモニウ
ム緩衝溶液（水１リットル中、リン酸水素アンモニウム
１.３８ｇ、濃水酸化アンモニウムでｐＨ＝７.０に調
整、流速０.４ｍｌ／分）で溶離する。２２０ｎｍで検
出を行う（この含量は、オリゴマー＋ポリマーのパーセ
ンテージとして分析結果で示す）。

【００５０】二量体およびより高い分子量の物質の含量
は１９９４年１月の欧州薬局方モノグラフ「ソマトロピ
ン・プア・プレパレイション・インジェクタブル」（Ｓ
omatropine pour preparation injectable）（注射用製
剤のためのソマトロピン）に開示された方法によって測
定することもできる。

【００５１】 逆相クロマトグラフィーによるタンパク力価のアッセイ バイアル当たりのｍｇで表して、直径４.６ｍｍ、長さ
２５ｃｍのＣ１８−３００Åカラム（ＳＹＮＣＨＲＯ
Ｍ、ｒｅｆ．ＣＲ１０３−２５）を使用して、逆相クロ
マトグラフィーによって測定した。生成物を、０.１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｖ／ｖ）の水７５容量お
よび０.０８％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）のアセトニトリル２５
容量から０.１％ＴＦＡの水３０容量および０.０８％Ｔ
ＦＡのアセトニトリル７０容量の移動相を用いて勾配モ
ードで３５分間溶離する。流速は、１ｍｌ／分であり、
２２０ｎｍで検出を行う。

【００５２】尿酸オキシターゼの酵素活性のアッセイ ＥＡＵとして表される尿酸オキシダーゼの酵素活性は、
リゴウクス・アール（ＬＥＧＯＵＸ Ｒ）、デルペチ・
ブルノ（Ｄelpech Ｂruno）、デュモント・エックス
（Ｄumont Ｘ）、ギルレモット・ジェイ・シー（Ｇuill
emot ＪＣ）、レイモンド・ピー（Ｒamond Ｐ）、シャ
ー・ディ（Ｓhire Ｄ）、カプット・ディ（Ｃaput
Ｄ）、フェララ・ピー（Ｆerrara Ｐ）、ロイソン・ジ
ー（Ｌoison Ｇ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー、１９９２、２６７、１２、８５６５−
８５７０に従って、２９２ｎｍで、尿酸の消失をモニタ
ーすることによって、３０℃で、サーモスタット付キュ
ベット中で分光光度測定によって測定する。

【００５３】再構成溶液の濁度 溶液中に取ったｈＧＨ含有凍結乾燥生成物の濁度は、パ
ーキン・エルマー（Ｐerkin Ｅlmer）５５４分光光度計
で５００ｎｍで分光光度測定によって測定する。結果
は、吸光度単位×１０００で示す。

【００５４】溶液中に取った尿酸オキシターゼ含有凍結
乾燥生成物の濁度は、Ｒatio Ｈach１８９００−００濁
度計によって測定する。濁度は、アメリカン・パブリッ
ク・ヘルス・アソシエイション（Ａmerican Ｐublic Ｈ
ealth Ａssociation）の水および廃水の試験のための標
準的な方法によって定義された比濁度単位（Ｎephelome
tric Ｔurbidity units）（ＮＴＵ）で表す。

【００５５】タンパク光度もまた、分析されるべき試料
を対照懸濁液と比較することによって、欧州薬局方（Ｉ
Ｉ）Ｖ．６の方法に従って測定される。

【００５６】凍結乾燥生成物の官能的判定基準 これらの判定基準は、肉眼で試験し、凍結乾燥生成物の
色、その構造（崩壊しているか、または否か）および凍
結乾燥生成物のクラスト（crust）とクラム（crum）と
の間の可能な相シフトの観察を考慮する。

【００５７】粉末についてのＸ線回折 凍結乾燥生成物についてのＸ線回折分析は、ＤＩＥＭＥ
ＮＳ Ｄ５００ ＴＴ回折測定器において行われる：ソー
ス：ＣuＫα１；発電機：４０ＫＶ、２５ｍＡ；バック
モノクロメーター；スリット：１／１／１／０.１６／
０.６；パイレックスラック上で試料採取；走査領域：
２ブラッグ・ゼータ（Ｂragg theta）において４°〜４
０°／分。

【００５８】示差熱分析 示差熱分析による凍結乾燥生成物の研究は、以下の条件
下で行われる。

【００５９】装置：ＤＳＣ ７パーキン・エルマー（Ｐe
rkin Ｅlmer）；検量線の作成：インジウムおよび鉛；
試料サイズ：５０μｌの皿中５ｍｇ〜１０ｍｇ；初期温
度：１０℃；加熱速度１０℃／分；最終温度：３００
℃。

【００６０】ｈＧＨのアミド分解 アミド分解形態のパーセンテージは、陰イオン交換カラ
ム（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ モノ−Ｑ ＨＲ ５／５、ref.
１７−０５４６−０１）を使用して、陰イオン交換クロ
マトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）によって測定され
る。溶離は、溶液Ａ（水１０００ｍｌ中のリン酸水素ア
ンモニウム１３.８ｇ；濃水酸化アンモニウムを用いて
ｐＨ＝７に調整）および溶液Ｂとしての水を、以下のプ
ログラムを使用して用いて行われる：溶液Ａ５％２分
間、次いで、１５分間かけて溶液１５％まで、２０分間
かけて溶液Ａ５０％まで、最後に、５分間かけて溶液Ａ
１００％まで、５分間最後の溶液を維持。ｈＧＨ（ｔ_R
約１５分）およびアミド分解形態の溶出を２２０ｎｍで
モニターする。流速は、１ｍｌ／分である。

【００６１】これらの種々の方法を使用して得られた分
析結果を以下に示す。

【００６２】 二量体およびより高い分子量の関連物質の含量 水０.５ｍｌ中に取った４ＩＵのｈＧＨを含有する凍結
乾燥生成物のオリゴマー＋ポリマーの含量は、Ｒ比率の
関数として測定した（図１）。図１は、該溶液のオリゴ
マー＋ポリマーの最少含量が０.１〜１のＲについて得
られることを示す。０.１という値は、曲線から補間さ
れる。

【００６３】別の実施例によって、ｈＧＨ ４ＩＵおよ
び８ＩＵの２つのバッチを、２５℃および３５℃での安
定性についてモニターした。６カ月間の保存の後のそれ
らの安定性は、優れている。

【００６４】下記表３および表４は、欧州薬局方標準と
比較して、種々の時間および温度での脱アミド化形態の
オリゴマーおよびポリマーのパーセンテージを示す。

【００６５】これらの表において、Ｒ＝０.４５であ
る。

【００６６】

【表３】

【００６７】

【表４】

【００６８】尿酸オキシターゼの酵素活性のアッセイ 水１ｍｌ中に取った尿酸オキシターゼ３０ＥＡＵを含有
する凍結乾燥生成物の酵素活性を、３５℃で１カ月後
に、Ｒ比の関数として測定した（図２を参照）。図２
は、尿酸オキシターゼの初期の酵素活性が０.４〜１の
Ｒについて３５℃で１カ月後に保存されていることを示
す。

【００６９】別の実施例によって、Ｒ＝０.４５または
Ｒ＝０.６７の処方は、２５℃で３カ月後、完全に安定
である（残存活性は、０時の活性の１００％に近い）。

【００７０】再構成溶液の濁度 水０.５ｍｌ中に取った４ＩＵのｈＧＨを含有する凍結
乾燥生成物の濁度を、Ｒ比の関数として測定した（図３
を参照）。図３は、溶液の最小濁度が０〜１.５のＲに
ついて得られることを示す。

【００７１】水１ｍｌ中に取った尿酸オキシターゼ３０
ＥＡＵを含有する凍結乾燥生成物の濁度を、Ｒ比の関数
として測定した（図４を参照）。図４は、溶液について
得られた最小濁度が０.２〜１のＲについて得られるこ
とを示す。

【００７２】 凍結乾燥生成物についての官能的判定基準 ｈＧＨ ４ＩＵまたは尿酸オキシターゼ３０ＥＡＵを含
有するかまたはタンパクを含有しない、種々の含量のリ
ン酸塩緩衝液を含有する各凍結乾燥生成物についての官
能性判定基準をＲ比の関数として測定し、表５に示す。
表５は、凍結乾燥生成物が０.１２５〜１.７のＲについ
ての充分な官能判定基準を示すことを示す。

【００７３】これらの特徴は、時間関数として変化しな
い。

【００７４】

【表５】

【００７５】Ｘ線回折 ０から＋∞まで変化するＲ比でのアラニン／マンニトー
ル混合物を含有する凍結乾燥生成物の粉末についてのＸ
線回折分析の結果を表５に示す。

【００７６】得られたディフラクトグラムは、０〜１の
Ｒについて、アラニン結晶格子のラインだけが表れるこ
とを示す；さらにまた、ディフラクトグラムの基線から
の偏差は、マンニトールからなるアモルファス相の存在
を示す。Ｒが大きくなる程、マンニトールによるアモル
ファス相が大きくなる。Ｒ＞１について、マンニトール
も結晶化される。

【００７７】０〜１のＲについて、マンニトールからな
るアモルファス相およびアラニンからなる結晶相が得ら
れる。

【００７８】示差熱分析 ｈＧＨ ４ＩＵまたは尿酸オキシダーゼ２０ＥＡＵを含
有するかまたはタンパクを含有しない凍結乾燥生成物の
ガラス転移温度およびリン酸塩緩衝液の種々の含量を、
Ｒ比の逆数の関数として測定した（図５を参照）。図５
は、アラニンおよびマンニトールを含有する凍結乾燥生
成物について得られた最大ガラス転移温度が（１／Ｒ）
＞１について、すなわち、０〜１のＲについて得られる
ことを示す。

【００７９】それは、凍結乾燥生成物の安定性の最大温
度を示す凍結乾燥生成物のガラス転移温度である。した
がって、凍結乾燥生成物の安定性の最大温度は、０〜１
のＲについて達成される。

【００８０】アミド分解形態 ＩＵおよび８ＩＵバッチについて得られた結果は、欧州
薬局方のソマトロピンモノグラフについての標準と比較
して、非常に許容される非常に小さな変化を示すだけで
ある。それらにより、この製剤は、２５℃で充分に安定
であると考えることができる。

【００８１】最後に、凍結乾燥生成物について評価され
た各特性は、以下の方法でまとめることができるＲ値の
間隔についての最適値を示すことを証明した。

【００８２】

【表６】

【００８３】各分析的判定基準（％オリゴマー＋ポリマ
ー、ｈＧＨ安定性、３５℃で１カ月後の尿酸オキシダー
ゼの酵素活性、ｈＧＨ溶液の濁度、尿酸オキシダーゼの
濁度、凍結乾燥生成物の外観、アラニン単独結晶、最大
ガラス転移温度）は、特性当たりの特異的な最適値間隔
を定義する。許容される製剤を得るために、Ｒの好まし
い間隔は、０.１＜Ｒ＜１であると定義される。

【００８４】以下の実施例は、本発明を説明するもので
あるが、限定するものではない。

【００８５】

【実施例】

実施例１ 注射用水０.５ｍｌ中に取った４ＩＵのｈＧＨを含有す
る凍結乾燥生成物の組成物

【００８６】

【表７】

【００８７】実施例２ 注射用水１ｍｌ中に取った８ＩＵのｈＧＨを含有する凍
結乾燥生成物の組成物

【００８８】

【表８】

【００８９】実施例３ 注射用水１ｍｌ中に取った１８ＩＵのｈＧＨを含有する
凍結乾燥生成物の組成物

【００９０】

【表９】

【００９１】実施例４ １ｍｌ中の８ＩＵの注射用ｈＧＨ含有凍結乾燥生成物

【００９２】

【表１０】

【００９３】実施例５ ０.５ｍｌ中の４ＩＵの注射用ｈＧＨ含有凍結乾燥生成
物

【００９４】

【表１１】

【００９５】実施例６ １８ＩＵのｈＧＨの５℃での安定性の１年後の分析結果

【００９６】

【表１２】

【００９７】全結果について、Ｒ＝０.４５。

【００９８】実施例７ １８ＩＵのｈＧＨの２５℃で安定性の３カ月後の分析結
果

【００９９】

【表１３】

【０１００】全結果について、Ｒ＝０.４５。

【０１０１】実施例８ ３０ＥＡＵ／バイアルの尿酸オキシターゼ含有凍結乾燥
生成物の組成物

【０１０２】

【表１４】

【０１０３】実施例９ ３５℃で１カ月後、ならびに５℃、２５℃および３５℃
で３カ月後の３０ＥＡＵ／バイアルの尿酸オキシダーゼ
含有凍結乾燥生成物の安定性の結果

【０１０４】

【表１５】

【０１０５】

【発明の効果】本発明により、医薬的に許容される安定
な凍結乾燥製剤が得られた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 凍結乾燥生成物のオリゴマー＋ポリマー含量
とマンニトール／アラニン質量比Ｒとの関係を表すグラ
フ。

【図２】 酵素活性とマンニトール／アラニン質量比Ｒ
との関係を表すグラフ。

【図３】 凍結乾燥生成物の濁度とマンニトール／アラ
ニン質量比Ｒとの関係を表すグラフ。

【図４】 凍結乾燥生成物の濁度とマンニトール／アラ
ニン質量比Ｒとの関係を表すグラフ。

【図５】 凍結乾燥生成物のガラス転移温度とマンニト
ール／アラニン質量比Ｒとの関係を表すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/43 38/44 47/16 47/26 Ｃ１２Ｑ 1/26 6807−4Ｂ 1/62 6807−4Ｂ // Ｇ０１Ｎ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/36 37/48 37/50 (72)発明者 パトリス・デュパン フランス31520ラモンヴィル・サン・タニ ェ、アヴニュー・サン−エグズペリィ３番 (72)発明者 フィリップ・フォール フランス34970モーリン、リュ・デ・ジョ ズ９番

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マンニトールの質量／アラニンの質量の
   比Ｒが０.１〜１であることを特徴とする、タンパク、
   緩衝液、アラニンおよびマンニトールからなる医薬的に
   許容される安定な凍結乾燥製剤。
2. 【請求項２】 タンパクがホルモン、酵素またはサイト
   カインである請求項１記載の製剤。
3. 【請求項３】 注射用溶液再構成用の請求項１記載の製
   剤。
4. 【請求項４】 ヒトまたは動物に皮下、静脈内または筋
   肉内注射可能な溶液の再構成用の請求項１記載の製剤。
5. 【請求項５】 ホルモンがｈＧＨである請求項２記載の
   製剤。
6. 【請求項６】 酵素が尿酸オキシダーゼである請求項２
   記載の製剤。
7. 【請求項７】 サイトカインがインターロイキン−１３
   である請求項２記載の製剤。
8. 【請求項８】 アラニンが結晶形であり、マンニトール
   がアモルファス形である請求項１記載の製剤。
9. 【請求項９】 凍結乾燥生成物がアモルファス相および
   結晶相からなり、該アモルファス相が主としてマンニト
   ールおよびタンパクからなり、該結晶相が主としてアラ
   ニンからなる請求項１記載の製剤。
10. 【請求項１０】 緩衝液がリン酸塩緩衝液である請求項
    ２記載の製剤。
11. 【請求項１１】 請求項１記載の製剤からなることを特
    徴とするアッセイキット。