PL179240B1

PL179240B1 - Stabilny, liofilizowany srodek dopuszczalny farmaceutycznieoraz roztwór do iniekcji podskórnych, dozylnych lub domiesniowych PL PL PL

Info

Publication number: PL179240B1
Application number: PL95308416A
Authority: PL
Inventors: Alain Bayol; Thierry Breul; Patrice Dupin; Philippe Faure
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1994-05-04
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 2000-08-31
Also published as: CZ108195A3; AU1777495A; ES2131781T3; DK0682944T3; FR2719479B1; IL113578A0; FI952119A0; EP0682944B1; ZA953596B; GR3030146T3; JP2948125B2; CN1116522A; IL113578A; PL308416A1; NO320364B1; MX9502034A; EP0682944A1; KR100273053B1; ATE178484T1; SI0682944T1

Abstract

1. Stabilny, liofilizowany srodek dopuszczalny farmaceutycznie, zawierajacy proteine, bufor, mannit i aminokwasy, znamienny tym, ze zawiera alanine i mannit w stosunku R = masa mannitu/masa alaniny zawartym pomiedzy 0,1 a 1. 9. Roztwór do iniekcji podskórnych, dozylnych lub domiesniowych, dla ludzi lub zwierzat, zawie- rajacy jalowy, dopuszczalny farmaceutycznie roz- puszczalnik, przeciwbakteryjny srodek konserwujacy oraz liofilizat proteiny zawierajacy bufor, mannit i aminokwas, znamienny tym, ze zawiera alanine i mannit w stosunku R=masa alaniny/masa mannitu za- wartym pomiedzy 0,1 a 1. FIG. 2 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazkujest także roztwór do iniekcji podskórnych, dożylnych lub domięśniowych, dla ludzi lub zwierząt, zawierający jałowy, dopuszczalny farmaceutycznie rozpuszczalnik, przeciwbakteryjny środek konserwujący oraz liofilizat proteiny zawierający bufor, mannit i aminokwas, charakteryzujący się tym, że zawiera alaninę i mannit w stosunku R=masa alaniny/masa mannitu zawartym pomiędzy 0,1 a 1.

Roztwór ten może zawierać inne dopuszczalne farmaceutycznie zaróbki, znane z techniki, jak na przykład korozpuszczalniki, środki konserwujące, antyutleniacze lub czynniki chelatujące.

Korzystnie roztwórjako proteinę zawiera hormon, zwłaszcza ludzki hormon wzrostu hGH (hormon wzrostu człowieka), enzym, zwłaszcza moczan oksydazy lub cytokinę, zwłaszcza interleukinę-13, zaś jako bufor korzystnie zawiera bufor fosforanowy.

Korzystny jest rozpuszczalnik wybrany z wody destylowanej, 0,9% wodnego roztworu chlorku sodu i 5% roztworu wodnego glukozy.

Proteina bilogicznie aktywna (lub bioaktywna), o której mowa w niniejszym wynalazku, może być polipeptydem glukozowanym lub nie, naturalnym, syntetycznym, półsyntetycznym lub kombinacją takąjak stosowana w praktyce klinicznej lub laboratoryjnej. W szczególności omawiana proteina może być na przykład hormonem jak hormon wzrostu, korzystnie hormon wzrostu człowieka (hGH), hormon luteinowym (LH-RH), gonadotropiną. Proteina może być również enzymem, na przykład enzymem trombolitycznym takimjak urokinaza, pro-urokinaza, streptokinaza, stafilokinaza, aktywatorem tkankowym plazminogenu (tPA) lub enzymem takim jak fosfataza, sulfataza, acylo-transferaza, mono-aminooksydaza, moczan oksydazy. Także, proteina o której mowa według wynalazku może być cytokiną, jak na przykład interleukina-2 (IL-2), interleukina -4 (IL-4) interleukina-6 (IL-6) lub interleukina-13 (IL-13). Inną klasą protein objętych wynalazkiem są na przykład antyciała, imunoglobuliny, imunotoksyny. Peptydy takie jak cholecystokinia (CCK), substancja P, neurokinina A, neurokinia B, neurotensina, neuropeptyd Y, eledoizyna, bombezyna mogą stanowić składniki według wynalazku.

Proteinąbiologicznie aktywnąjest korzystnie hGH (ludzki hormon wzrostu), moczan oksydazy lub interleu.kina-13.

Hormon wzrostu człowieka jest proteiną złożoną z jednego łańcucha polipeptydowego o 191 aminokwasach z dwoma mostkami disiarczkowymi pomiędzy pozostałościami cysteiny 53 i 165, a pozostałościami cysteiny 182 i 189.

Moczan oksydazy jest enzymem, który utlenia kwas moczowy do alantoiny i jest ekstrahowany z biomasy Aspergillus flavus (Labourer etal., Bull. Soc. Chimj. Biol. 1968,50, 811-825). Od ponad 20 lat jest używany również do leczenia hiperurycemii.

ANDc kodujący dla tej proteiny został niedawno klonowany i poddawany ekspresji w E. coli (Legoux R et al., J. ofBiol. Chem., 1992-267,12,8565-8570) Aspergillus flavus et Saccharomyces cerevisiae. Enzym jest tetramerem posiadającym identyczne grupy o masie molekularnej rzędu 32000. Monomer, złożony zjednego łańcucha polipeptydowego o 301 aminokwasach, nie posiada mostków disiarczkowych i jest acetylowany na grupie N-końcowej.

Interleukina-13 jest cytokiną złożoną z jednego łańcucha polipeptydowego o 112 aminokwasach z dwoma mostkami disiarczkowymi (Minty i inni, Nature, 1993, 362, 248-250).

Uzyskanie współistnienia fazy amorficznej (mannit+proteina) z faząalaniny krystalicznej jest niezależne od obecności i stężenia roztworu buforowego korygującego pH roztworu, ale zależy od poprzednio zdefiniowanego stosunku R.

W celu zaproponowania środka proteinowego powszechnie dostępnego jako czynnik terapeutyczny, niezbędne jest przygotowanie go w formie wystarczająco stabilnej, aby utrzymać jego aktywność biologiczną pomiędzy momentem wytworzenia a czasem zastosowania. Na przykład, hGH został spreparowany na bardzo liczne sposoby, takiejak przedstawiono w opisach

179 240 lub następujących zgoszeniach patentowych: US 5,096,885; WO 89/09614; WO 92/17200·

Au-30771/89; WO 93/19773; WO 93/19776. ’

Środki, według wynalazku, mogąbyć przechowywane w temperaturze otoczenia, podczas gdy środki zawierające te proteiny, obecnie dostępne handlowo, muszą być przechowywane w temperaturze od 2°C do 8°C.

Dla większości przypadków postać farmaceutyczna jest liofilizowana, zamrożoną lub w roztworze. Zawiera proteinę, roztwór buforowy, glicynę, argininę, mannit, cynk, środki powierzchniowo czynne, dekstran, EDTA lub inne zarobki, ale nigdy połączenie alanina/mannit o stosunku masowym R zawartym pomiędzy 0,1 a 1. Formy liofilizowane lub zamrożone są stosowane dla utrzymania integralności biochemicznej i aktywności biologicznej cząsteczki. Środki liofilizowane powinny być odtworzone przed zastosowaniem przez dodanie sterylnego, farmaceutycznie dopuszczalnego rozpuszczalnika, jak woda destylowana, roztwory wodne chlorku sodu o stężeniu, 0,9% lub glukoza o stężeniu 5% lub wszystkie inne rozpuszczalniki fizjologicznie dopuszczalne, zawierające lub nie środki konserwujące antybakteryjne, takie jak alkohol benzylowy, fenol lub metakrezol.

Środek stabilny w temperaturze otoczenia, aż do jego odtworzeniajest szczególnie korzystny do podawania ambulatoryjnego jak w przypadku hGH w postaci fiolek lub w postaci dawek wielokrotnych.

Środek w ten sposób przygotowany może być również dołączony do zestawu dozującego.

Kompozycjąkorzystną, według wynalazku, jest więc liofilizat. Liofilizat tenjest otrzymywany przez liofilizację z roztworu.

Procedura otrzymywania tego środka obejmuje etapy mieszania, rozpuszczania, filtracji i liofilizacji.

Skład roztworu poddawanego liofilizacji jest następujący:

Proteina, roztwór buforowy farmaceutycznie dopuszczalny dla uregulowania pH, alanina, mannit o stosunku masowym R=masa mannitu/masy alaniny, zawartym pomiędzy 0,1 a 1, woda dla przygotowania roztworu do wstrzyknięć.

Roztwór do liofilizowania przygotowuje się w sposób następujący:

Roztwór proteinyjest otrzymywany na kolumnie żelowo-filtracyjnej i zawiera roztwór buforowy utrzymujący pH na poziomie równoważnym ze stabilnością proteiny. Do roztworu tego dodaje się żądaną ilość buforu, alaniny, mannitu i wody w taki sposób, aby rozpuścić wszystkie składniki. Roztwór jest filtrowany w sposób sterylny i przenoszony do pojemników, korzystnie fiolek lub kapsułek. Liofilizację roztworu prowadzi się następująco:

Roztwór przechodzi cykl zamrażania, następnie sublimacji i suszenia, przystosowany do objętości poddawanej liofilizacji oraz do zbiornika zawierającego roztwór. Korzystnie wybiera się szybkość zamrażania około -2°C/mn w liofilizatorze Usifroid(France) typu SMH15 lub SMJ100 lub SMH2000.

Czas, temperatura i ciśnienie suszenia liofilizatu sądostosowane do objętości roztworu liofilizowanego i ilości wody pozostającej w liofilizacie.

Wyczerpujące informacje na temat techniki otrzymywania środków gotowych do wstrzyknięć sądo dyspozycji techników w Pharmaceutical Sciences, 1985,17- te wydanie lub w William Na & Poili GP, The lyophilization of pharmaceuticals : przeglądzie literatury, J. Parenteral Sci. Tech., 19^^^, 38, (2), 48-59 lub w Franks F., Freeze-diying: from enpiricism to predictability, Cryo-letters, 1990,11, 93-110.

Otrzymuje się więc liofilizat, w którym alanina znajduje się wpostaci krystalicznej, a mannit w amorficznej postaci. Liofilizat może być przechowywany w temperaturze 25°C bez utraty aktywności biologicznej proteiny, którą zawiera.

Dla zilustrowania niniejszego wynalazku, oceniono wybrane przykładowo proteiny hGH lub moczanu oksydazy. Tak więc kilka roztworów zawierających hGH lub moczan oksydazy jako proteiny biologicznie aktywne, bufor fosforanowy o różnych stężeniach, o pH = 7 dla roztworów zawierających hGH (o 4 UI/0,5 ml) i pH = 8 dla tych, które zawierały moczan oksydazy

179 240 (o 30 UAE/ml, samego mannitu, samej alaniny lub mieszaniny alanina/ mannit) zostało przygotowanych, zliofilizowanych i zanalizowanych.

Kompozycje są opisane szczegółowo w przykładach tabeli 1 i 2 poniżej. Metody analizy, jak również czasy i temperatury uzyskiwania stabilności są również podane poniżej.

Tabela 1

W tabeli 1, poniżej podano badane kompozycje zawierające moczan oksydazy.

Nr zestawu	mg Mannitu	mg Alaniny	R	Bufor fosforanowy pH=8; mM	Moczan oksydazy UAE⁽¹⁾
1	33,0	0,0	+^	50	30
2	27,7	6,9	4	30	30
3	20,8	10,4	2	30	30
4	13,6	13,6	1,000	40	30
5	10,2	15,3	0,67	40	30
6	7,3	16,0	0,46	40	30
7	7,3	16,2	0,45	30	30
8	9,5	21,0	0,45	50	30
9	4,6	18,3	0,25	40	30
10	2,5	20,0	0,125	40	30
11	0,0	16,0	0	50	30

⁽¹) : UAE oznacza jednostkę aktywności enzymatycznej

Tabela 2

W tabeli 2 poniżej, podano badane kompozycje zawierające hGH.

Nr zestawu	mg Mannitu	mg Alaniny	R	Bufor fosforanowy pH=7;mM	hGH UI’
12	12,5	0,0	+00	2,50	4
13	20,0	2,5	8	1,95	4
14	12,5	6,5	2	0,00	4
15	12,5	6,5	2	2,50	4
16	12,5	13,0	1	2,50	4
17	4,7	10,5	0,45	1,95	4
18	0,0	6,5	0	2,50	4

(’); UI Jednostka Międzynarodowa

Dla określenia różnych parametrów stosowano następujące metody analityczne:

Zawartość dimerów i substancji pokrewnych o wyższej masie cząsteczkowej:

Zawartość dimerów i substancji pokrewnych o wyższej masie cząsteczkowej była określana chromatograficznie (SEC-HPLC) przy zastosowaniu kolumny Superose 12 (Pharmacia, Ref.

17-0538-01). Produkt był eluowany roztworem buforowym fosforanu amonu o pH = 7,0 (1,38 g

179 240 diwodorofosforanu amonu w 1 litrze wody, korekta pH roztworu na wartość pH=7,0' za pomocą stężonego amoniaku 0,4 ml/minutę). Detekcję prowadzono przy 220 nm. (Zawartość tę podano w wynikach analitycznych jako procent oligomerów + polimerów).

Zawartość dimerów i substancji o wyższej masie cząsteczkowej można również oznaczać metodą opisanąw monografii Farmakopea Europejska „Somatropine pour preparation injectable” ze stycznia 1994.

Oznaczanie miana proteiny metodą chromatograficzną z odwróconą fazą.

Wyrażono w mgfiolkę i oznaczono metodą chromatograficzną z odwróconą fazą na kolumnie C18-300A - 25 cm, średnicy 4,6 mm (Synchrom, Ref. CR 103-25). Produkt eluowano 35 minut w sposób stopniowy, stosując fazę ruchomą, przechodząc od 75 części objętościowych wody do 0,1% kwasu trifluorooctowego (obj./obj.) (TFA) i 25 objętości acetonitrylu do 0,08% TFA (obj./obj.) do 30 objętości wody do 0,1%o TfA i 70 objętości acetonitrylu do 0,08% TFA. Przy przepływie 1 ml na minutę oznaczenie wykonuje się przy 220 nm.

Oznaczanie aktywności enzymatycznej moczanu oksydazy.

Aktywność enzymatyczną moczanu oksydazy, wyrażoną w UAE, oznaczano spektrofotometrycznie w zbiorniku termostatowanym w temperaturze 30°C śledząc znikanie kwasu moczowego przy 292 nm według Legoux R, Delpech Bruno, Dumont X, Guillemont JC, Ramond P, Shire D, Caput D, Ferrara P, Loison G, J. Biol. Chem., 1992,267 (12), 8565-8570.

Zmętnienie odtworzonych roztworów składników rozpuszczonych

Zmętnienie liofilizatów zawierających hGH w roztworze oznaczano spektrofotometrycznie (Ph.Eur.2(I)V. 619) przy 500 nm na spektrofotometrze Perkin Elmer 554. Wyniki sapodane w Jednostkach Absorbancji x 1000.

Zmętnienie liofilizatów zawierających moczan oksydazy w roztworze jest oznaczane turbidymetrem Ratio Hach 18900-00. Wyniki zmętnienia podano w Nefelometrycznych Jednostkach Zmętnienia (NTU) zdefiniowanych w: Standard Methods for examination of water and waste water wydane przez American Public Health Association.

Stopień opalescencji jest również oznaczany według metody Farmakopea Europejska (II) V. 6, porównując próbkę badaną z zawiesiną wzorcową.

Badania organoleptyczne liofilizatów

Badanie prowadzono wzrokowo, biorąc pod uwagę zabarwienie liofilizatu, jego strukturę (zapadniętąlub nie), oraz ewentualne przesunięcie pomiędzy skorupką a miąszem liofilizatu.

Dyfraktometria Promieni X na proszku

Analiza dyfraktometryczna Promieni X na lioflizatach jest wykonywana na dyfraktometrze Siemens^ D500 TT; źródło: CuKa l; Generator: 40 KV, 25 mA; Monochromator tylny; szczeliny: 1/1/1/0,16/0,6; próbki na podłożu pyreksowym; Zakres zamiatania: od 4° do 40° na minutę 2 teta Bragga.

Analiza termiczna różnicowa

Badania liofilizatów metodą analizy termicznej różnicowej wykonuje się w następujących warunkach:

Aparat: DSC 7 Perkin Elmer; cechowanie Ind i Ołów; pobieranie próbki: od 5 mg do 10 mg w kapsułkach 50 μ; temperatura początkowa: 10°C; szybkość grzania: 10°C/min; temperatura końcowa: 300°C.

Formy hGH zdezamidowane

Procentową zawartość form zdezamidowancyh oznacza się metodą chromatografii amonitowej (AEX-HPLC) stosując kolumnę amonitową (Pharmacia mono-Q HR 5/5, ref. 17-0546-01). Elucję prowadzi się roztworem A (13,8 g) diwodorofosforanu amonu w 1000 ml wody; pH=7 korygowane stężonym amoniakiem i wodąjako roztworem B, stosując następujący program: 5% roztworem A przez 2 minuty, następnie 15% roztworem A przez 5 minut, następnie 5 0% roztworem A przez 20 minut i na zakończenie 100% roztworem A przez 5 minut i utrzymuje się ten ostatni roztwór przez 5 minut. Elucja hGH (ok. 15 minut) i form zdezamidowanych badana jest przy 220 nm. Przepływ wynosi 1 ml na minutę.

Uzyskane tymi różnymi metodami wyniki analityczne są opisane poniżej.

179 240

Zawartość dimerów i substancji pokrewnych o wyższym ciężarze cząsteczkowym

Zawartość oligomerów plus polimerów w liofilizatach zawierających 4 UI hGH odtworzonych w 0,5 ml wody, została oznaczona w funkcji stosunku R (wykres 1). Wykres 1 wykazuje, że minimalnązawartość oligomerów plus polimerów w roztworach uzyskuje się, gdy Rjest zawarte pomiędzy 0,1 a 1, z tym, że wartość 0,1 została interpolowana z krzywej.

Tytułem przykładu uzupełniającego zbadano stabilność w temperaturze 25°C i 35°C dwóch zestawów hGH o 4UI i 8UI. Po sześciu miesiącach przechowywania ich stabilność jest doskonała.

W tabelach 3 i 4 poniżej, przedstawiono zawartość procentową oligomerów i polimerów i form zdezamidowanych po różnym czasie i różnych temperaturach w porównaniu z normami Farmakopea Europejska. W tych tabelach R = 0,45.

Tabela 3

Zestaw 4UI/fiolkę

	Norma Pharmacopee Europeenne	Czas 0	Przy 25°C	Przy 35°C
3 miesiące	3 miesiące	6 miesięcy
Oligomery i polimery %	6,0	1,0	1,9	3	3,3
Formy zdezamidowane %	6,6	1,3	1,9	2,8	3,9
Oznaczenie w mg/fiolkę	-	1,58(*)	1,61(*)	1,540	1,550

(*): Miano zmienia się nieznacznie w czasie ze względu na dokładność metody oznaczania (± 5%).

Tabela 4

Zestaw 8UI/fiolkę

	Norma Pharmacopee Europeenne	Czas 0	Przy 25°C	Przy 35°C
3 miesiące	6 miesięcy	3 miesiące	6 miesięcy
Oligomery i polimery %	6,0	1,0	1,5	1,2	1,7	2,2
Formy zdezamidowane %	6,6	1,0	1,5	1,95	2,2	3,3
Oznaczenie w mg/fiolkę	-	3,0(*)	3,00	2,93(*)	2,950	2,940

Oznaczanie aktywności enzymatycznej moczanu oksydazy

Aktywność enzymatycaiąliofilizatów zawierających 30 UAE moczanu oksydazy odtworzonego w 1 ml wody określano w funkcji stosunku R po 1 miesiącu w temperaturze 35°C (Wykres 2). Wykres 2 wskazuje, że początkowa aktywność enzymatyczna moczanu oksydazy jest zachowana po 1 miesiącu w temperaturze 35°C, dla R zawartego pomiędzy 0,4 a 1.

Tytułem przykładu uzupełniającego, środek dla którego R=0,45 lub R = 0,67 jest doskonale stabilny po 3 miesiącach w temperaturze 25°C (Aktywność końcowa bliska 100% tej o czasie zero).

Zmętnienie odtworzonych roztworów składników rozpuszczonych

Zmętnienie liofilizatów zawierających 4 UI hGH odtworzonych w 0,5 ml wody zostało oznaczone w funkcji stosunku R (Wykres 3). Wykres 3 wskazuje, ze zmętnienie minimalne roztworów uzyskuje się dla R zawartego pomiędzy wartością 0 a 1,5.

Zmętnienie liofilizatów zawierających 30 UAE moczanu oksydazy odtworzonego w 1ml wody, zostało oznaczone w funkcji stosunku R (Wykres 4). Wykres 4 wskazuje, że zmętnienie minimalne roztworów uzyskuje się dla R zawartego pomiędzy 0,2 a 1.

Badania organoleptyczne liofilizatów

Badania organoleptyczne każdego liofilizatu zawierającego 4 UI hGH lub 30 UAE moczanu oksydazy lub żadnej proteiny i zmienne ilości buforu fosforanowego, zostały przeprowadzone w funkcji stosunku R i są zebrane w tabeli 5. Tabela 5 wskazuje, że liofilizaty posiadaj ą zadawalające własności organoleptyczne dla R zawartego pomiędzy 0,125 a 1,7. Własności te nie zmieniają się w czasie.

Tabela 5

Badania organoleptyczne liofilizatów i zaróbek krystalicznych w funkcji R = masa mannitu/masa alaniny

R	Badania organoleptyczne	Zaróbki krystaliczne Dyfrakcja promieni X
+00	Zapadnięty	Mannit
10	Zapadnięty	Mannit + Alanina
6,469	Zapadnięty	Mannit + Alanina
5	Zapadnięty	Mannit + Alanina
4,014	Zapadnięty	Mannit + Alanina
2	Zapadnięty	Mannit + Alanina
1,705	dobry	Mannit + Alanina
1,-402	dobry	Mannit + Alanina
1,25	dobry	Mannit + Alanina
1,097	dobry	Mannit + Alanina
1	dobry	Alanina
0,667	dobry	Alanina
0,456	dobry	Alanina
0,456	dobry	Alanina
0,451	dobry	Alanina
0,452	dobry	Alanina
0,251	dobry	Alanina
0,125	dobry	Alanina
0	Przesunięcie faz	Alanina

Dyfrakcja promieni X

Wyniki analizy dyfrakcyjnej promieni X na uzyskanych proszkach liofilizatów zawierających mieszaniny Alanina/Mannit w stosunkach od 0 do + to są podane w tabeli 5.

Uzyskane dyfraktogramy wykazują, że dla R zawartego pomiędzy 0 a 1, pojawiiająsię tylko prążki sieci krystalicznej alaniny, poza tym odchylenie linii bazowej dyfraktogramu wskazuje

179 240 na obecność fazy amorficznej utworzonej przez mannit. Przy wzroście R wzrasta ilość fazy amorficznej wynikającej z obecności mannitu. Dla R> 1 mannit także krystalizuje.

Dla R zawartego pomiędzy 0 a 1, uzyskuje się fazę amorficzną utworzoną przez mannit i fazę krystaliczną utworzoną przez alaninę.

Analiza termiczna różnicowa

Temperatura zeszklenia liofilizatów zawierających 4 UI hGH lub 30 UAE moczanu oksydazy łub żadnej proteiny i zmienne ilości buforu fosforanowego, określono w funkcji odwrotności stosunku R(Wykres 5). Wykres 5 wskazuje, że maksymalna uzyskana temperatura zeszklenia dla liofilizatów zawierających mieszaniny alaniny i mannitu jest uzyskiwana dla wartości (1/R)>1, to znaczy dla R zawartego pomiędzy 0 a 1.

To temperatura zeszklenia liofilizatu wskazuje na maksymalnątemperaturę stabilności liofilizatu. Maksymalnątemperaturę stabilności liofilizatu otrzymano dla R zawartego pomiędzy 0 a 1.

Formy zdezamidowane

Uzyskane wyniki na zestawach 4UI i 8UI wykazują słabą ewolucję, którajest dopuszczalna w porównaniu z normami z monografii somatropiny Pharmacopee Europeenne, co pozwala przypuszczać, że środek ten będzie wystarczająco stabilny w temperaturze 25°C.

W konkluzji dowiedziono, że każda oceniana własność liofilizatu posiada wartość optymalną dla pewnego zakresu wartości R, co zostało podsumowane poniżej:

% Oligomerów+Polimerów (stabilność hGH)	R pomiędzy 0,1 a 1
Aktywność enzymatyczna moczanu oksydazy po 1 mies. przy temp. 35°C	R pomiędzy 0,4 a 1
Zmętnienie roztworów hGH	R pomiędzy 0 a 1,5
Zmętnienie roztworów moczanu oksydazy	R pomiędzy 0,2 a 1
Wygląd liofilizatów	R pomiędzy 0,125 a 1,7
Sama alanina krystaliczna	R pomiędzy 0 a 1
Maks. temp. zeszklenia	R pomiędzy 0 a 1

Każde kryterium analityczne (% oligomerów + polimerów, stabilność hGH, aktywność enzymatyczna moczanu oksydazy po 1 miesiącu przy temp. 35°C, zmętnienie roztworów hGH zmętnienie roztworów moczanu oksydazy, wygląd liofilizatów, sama alanina krystaliczna, maksymalna temperatura zeszklenia) definiuje optymalny zakres szczególny dla każdej własności. Aby otrzymać odpowiedni środek określa się korzystny zakres R, to znaczy 0,1 <R< 1. Następujące przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając jego zakresu.

Przykładl i Konfekcjonowanie kompozycji liofilizatu hGH o 4UI do odtworzenia w 0,5 ml wody PPI.

Składniki	Skład jednostkowy (mg)
hGH	4 UI
Alanina	10,5 mg
Mannit	4,77 mg
12. hydrat fosforan disodowy	0,7 mg
Woda do przygotowania wstrzyknięć	0,5 ml QSP
Fiolka z białego szkła typ 1 - 3 ml	1
Zamknięcie z szarego chlorobutylu	1
Kapsel aluminiowy niebieski typu Flip-off o średnicy 13 mm	1

179 240

Przykład II: Konfekcjonowanie kompozycji liofilizatu hGH o 8UI do odtworzenia w 1 ml wody PPI.

Składniki	Skład jednostkowy (mg)
hGH	8 UI
Alanina	21 mg
Mannit	9,54 mg
12. hydrat fosforan disodowy	1,4 mg
Woda do przygotowania wstrzyknięć	1 ml QSP
Fiolka z białego szkła typ 1 - 3 ml	1
Zamknięcie z szarego chlorobutylu	1
Kapsel aluminowy niebieski typu Flip-off o średnicy 13 mm	1

Przykład III: Konfekcjonowanie kompozycji liofilizatu hGH o 18 UI do odtworzenia w 1 ml wody PPI.

Składniki	Skład jednostkowy (mg)
hGH	18 UI
Alanina	21 mg
Mannit	9,54 mg
12. hydrat fosforan disodowy	1,4 mg
Woda do przygotowania wstrzyknięć	1,0 ml QSP
Fiolka z białego szkła typ 1 - 3 ml	1
Zamknięcie z szarego chlorobutylu o średnicy 13 mm	1
Kapsel aluminiowy z wieczkiem o średnicy 13 mm	1

Przykład IV: Liofilizaty hGH dla preparatu do wstrzyknięcia o 8 UI w 1 ml

TEMPERATURA °C	X	5	25	35	5	25	35
CZAS W DNIACH	0	90	90	90	180	180	180
Rodzaj kontroli	Stosowane metody	Normy	Wyniki	Wyniki	Wyniki	Wyniki	Wyniki	Wyniki	Wyniki

CHARAKTERYSTYKA

Wygląd

Zgodna

Zgodna | Zgodna

Zgodna

179 240

IDENTYFIKACJA

hGH	Faza odwrócona	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna
Chromatografia ekskluzyjna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna

PRÓBY

Formy zdeamidowane	Wymiana amonitowa	<6,5%	1,0%	1,0%	1,5%	2,2%	1,5%	1,95%	3,3%
Dimery i substancje pokrewne	Chromato- grafia ekskluzyjna	<6,0%	1,0%	0,75%	1,5%	1,7%	0,8%	12%	2,2%
Formy obcięte	Elektrofo- reza	<2,0%	<2,0%	<2,0%	<2,0%	<2,0%	<2,0%	<2,0%	<2,0%
Proteiny pokrewne	Elektrofo- reza	Zgodna⁽¹⁾	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna
Zawartość wody		<1,5%	0,45	0,41	0,68	0,73	0,47	n.b.(²⁾	n.b.(2

Oznaczanie	Faza	2,93 do	3,0	3,1	3,0	2,95	2,96	2,93	2,94
w mg/fiolkę	odwrócona	3,24

Badanie Wygląd	Farmakopea Europejska	<zaw. II		<zaw. U	<zaw.II	<zaw. II	<zaw. II
Farmakopea Europejska	Bezbarwny		Bezbarw- ny	Bezbarw- ny	Bezbarw- ny	Bezbarw- ny
Oznaczanie pH	6,5 do 7,5		6,94	7,02	7,03	7,01
Rozpuszczanie	<przy 1 mn		<przy 1 mn	<przy 1 mn	<przy 1 mn	<przy 1 mn

(1) : Brak pasm dodatkowych innych niż śladowe występujące we wzorcu lub ślady oligomerów hGH.

(2) : n.b. = niebadano

Przykład V: Liofilizat hGH dla preparatu do wstrzyknięcia o 4 UI w 0,5 ml

Temperatura °C	X	5	25	35	5	35
Czas w dniach	0	90	90	90	180	180
Rodzaj kontroli	Stosowane metody	Normy	Wyniki	Wyniki	Wyniki	Wyniki	Wyniki	Wyniki

CHARAKTERYSTYKA

Wygląd

Zgodna

Zgodna J Zgodna | Zgodna

179 240

IDENTYFIKACJA

hGH	Faza odwrócona	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna
Chromatografia ekskluzyjna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna

PRÓBY

Formy dezamidowane	Wymiana amonitowa	<6,5%	1,3%	1,0%	1,9%	2,8%	1,3%	3,9%
Dimery i substancje pokrewne	Chromatografia ekskluzyjna	< 6,0%	1,0%	0,6%	1,9%	3,0%	1,0%	3,3%
Formy obcięte	Elektroforeza	< 2,0%	<2,0%	< 2,0%	< 2,0%	<2,0%	<2,0%	< 2,0%
Proteiny pokrewne	Elektroforeza	Zgodna ⁰⁾	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna	Zgodna
Zawartość wody		< 15%	0.65	0,58	0,97	0,93	0,81 .	n.b.(²⁾

Oznaczanie	Faza	1,50 do	1,58	1,57	1,61	1,54	1,56	1,55
w mg/fiolkę	odwrócona	1,70

OD'	TWORZONY SKŁADN	IK ROZPUSZCZONY
Badanie	Farmakopea Europejska	<zaw. Π	<zaw. II	<zaw. II	<zaw. II	<zaw. II	<zaw. Π	<zaw. II
Wygląd	Farmakopea Europejska	Bezbarwny	Bezbarwny	Bezbarwny	Bezbarwny	Bezbarwny	Bezbarwny	Bezbarwny
Oznaczanie pH	6,5 do 7,5	7,01	7,22	6,96	6,99	7,06	7,00
	Rozpuszczanie	<przy 1 mn	<przy 1 mn	<przy 1 mn	<przy 1 mn	<pizy 1 mn	<przy 1 mn	<przy 1 mn

(2) : n.b. = nie badano

Przykład VI: Wyniki analityczne po rocznej stabilizacji w temperaturze 5°C hGH'o 18UI

	Opalescencja (UA..xl0'3)	pH	Zawartość wody	Formy zdezamidowane	Oligomery + Polimery
Normy	<20		< 1,5%	<5%	<6%
t = 0	1	7,9	0,33%	1,36%	0,63%
1 mies.	1	S	0,29%	-	-
3 mies.	3	7,83	0,32%	1,25%	0,45%
6 mies.	4	-	1,03%	1,4%	0,5%
12 mies.	7	-	1,19%	1,15%	1,11%

Dla zestawionych wyników, R = 0,45

179 240

Przykład VII: Wyniki analityczne po 3 miesiącach stabilizacji w temperaturze 25°C hGH o 18UI

	Opalescencja (U.A.xł0‘O	pH	Zawartość wody	Formy zdezamidowane	Oligomery + Polimery
Normy	<20		<1,5%	<5%	<6%
t = 0	1	7,9	0,33%	1,36%	0,63%
1 mies.	3	7,72	0,35%	-	-
3 mies.	9	7,65	0,54%	1,37%	0,85%

Dla zestawionych wyników, R = 0,45

Przykład VIII: Skład liofilizatów mocznika oksydazy przy 30 UAE/fiolkę

Kompozycja	Odtworzone roztwory składników rozpuszczonych
Przezroczystość Farmakopea Europejska	Zabarwienie Farmakopea Europejska
t=0	1 miesiąc 35°C	3 miesiące	t=0	1 miesiąc 35°C	3 miesiące
5°C	25°C	5°C	25°C
Mannit 7,3 mg + L Alanina 16,2 mg Na₂HPO₄ 30 mM	<=i	<=I	I-H	I-III	bezbarwne	bezbarwne	bezbarwne	bezbarwne
Mannit 20, 8 mg + L Alanina 10,4 mg Na₂HPO₄ 30 mM	<I	>=m	<n	II-I	bezbarwne	bezbarwne	bezbarwne	bezbarwne
Mannit 27,7 mg + L Alanina 6,9 mg Na₂HPO₄21 mM	<m	>IV	= III	>IV	bezbarwne	bezbarwne	bezbarwne	bezbarwne

Przykład VIII (c.d. 1):

Kompozycja	pH odtworzonego roztworu składnika rozpuszczonego	Aktywność enzymatyczna UAE/fiolkę	Zawar- tość wody %
t=0	1 miesiąc 35°C	3 miesiące	t=0	1 miesiąc 35°C	3 miesiące
5°C	25°C	5°C	25°C
Mannit 7,3 mg + L Alanina 16,2 mg Na2HPO4 30 mM	7,96	7,96	7,91	7,93	32,9(*)	30,0(*)	30,2(*)	33,3(*)	3,2
Mannit 20,8 mg + L Alanina 10,4 mg Na2HPO4 30 mM	8,03	8,05	8,01	8,01	28,1(*)	22,5	32,0(*)	22,7	2,8
Mannit 27,7 mg + L Alanina 6,9 mg Na2HPO4 21 mM	8,04	8,06	8,00	8,03	28,7(*)	23,0	31,2(*)	20,5	2,1

(*) Miano nie zmienia się znacznie, ze względu na dokładność metody oznaczania (±10%)

179 240

Przykład IX: Wyniki stabilności liofilizatów moczanu oksydazy o 30UAE/fiolkę po czasie 1 miesiąca w temperaturze 35°C i po 3 miesiącach w temperaturze 5°C, 25°C i 35°C

Kompozycja	Odtworzony roztwór składnika rozpuszczonego
Przezroczystość Farmakopea Europejska	Zabarwienie Farmakopea Europejska
t =0	1 miesiąc 35°C	3 miesiące	t=0	1 miesiąc 35°C	3 miesiące
5°C	25°C	5°C	25°C	35°C
Na2HPO4 40 mM Alanina 14,15 mg Mannit 14,15 mg	I-II	= IV	I-U	=n	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne
Na2HPO4 40 mM Alanina 15,9 mg Mannit 10,6 mg	I-II	II-UI	<I	= I	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne
Na2HPO4 40 mM Alanina 16 mg Mannit, 7,3 mg	I-II	IU-IV	= I	<I	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne
Na2HPO4 40 mM Alanina 18,9 mg Mannit 4,72 mg	I-n	<IV	<I	i-n	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne
Na2HPO4 40 mM Alanian 20 mg Mannit 2,5 mg	U-Π	<IV	n-ni	>IV	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne	bezbar- wne

Przykład IX (c.d. 1)

Kompozycja	pH odtworzonego roztworu składnika rozpuszczonego	Zawartość wody
t = 0	1 miesiąc 35°C	3 miesiące
5°C	25°C
Na2HPO4 40 mM Alanina 14,15 mg Mannit 14,15 mg	8,01	8,01	8,04	8,02	-
Na2HPO4 40 mM Alanina 15,9 mg Mannit 10,6 mg	8,00	7,97	8,02	8,01	-
Na2HPO4 40 mM Alanina 16 mg Mannit 7,3 mg	7,99	7,98	8,02	8,00	2,0%
Na2HPO4 40 mM Alanina 18,9 mg Mannit 4,72 mg	7,96	7,94	7,97	7,96	-
Na2HPO4 40 mM Alanina 20 mg Mannit 2,5 mg	7,96	7,93	7,96	7,95	-

179 240

Przykład IX (c.d. 2)

Kompozycja	Aktywność enzymatyczna UAE/fiolkę
t = 0	1 miesiąc 35°C	3 miesiące
5°C	25°C
Na₂HPO4 40 mM Alanina 14,15 mg Mannit 14,15 mg	30,3 (*)	23,2	29.8 (*)	30,5 ()
Na₂HPO4 40 mM Alanina 15,9 mg Mannit 10,6 mg	29,7(()	28,9 (*)	30,9 (*)	29,8 (*)
Na₂HPO4 40 mM Alanina 16 mg Mannit 7,3 mg	29,2 (*)	26,8 (*)	30,3 (*)	30,0 (*)
Na2HPO4 40 mM Alanina 18,9 mg Mannit 4,7 2 mg	30,1 (*)	20,5	30,1 (♦)	30,5 (()
Na2HPO4 40 mM Alanina 20 mg Mannit 2,5 mg	29,4 0)	17,9	29,4 (()	25,7

(*) : Miano zmienia się nieznacznie z czasem ze względu na dokładność metody oznaczania (± 10%)

179 240

Aktywność enzymatyczna (UAE)

R=Mannit / Alanina (wag/wag)

FIG.2

179 240

R= Mannit / Alanina (wag/wag)

179 240

Zmętnienie (NTU)

R- Mannit / Alanina (wag/wag)

FIG. 4

179 240

/R ^alanina / mannit

179 240

R=Mannit/Alanina (wag/wag)

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Stabilny, liofilizowany środek dopuszczalny farmaceutycznie, zawierający proteinę, bufor, mannit i aminokwasy, znamienny tym, że zawiera alaninę i mannit w stosunku R=masa mannitu/masa alaniny zawartym pomiędzy 0,1 a 1.
2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako proteinę zawiera hormon, enzym lub cytokinę. ,
3. Środek według zastrz. 2, znamienny tym, że jako hormon zawiera ludzki hormon wzrostu hGH.
4. Środek według zastrz. 2, znamienny tym, że jako enzym zawiera moczan oksydazy.
5. Środek według zastrz. 2, znamienny tym, że jako cytokinę zawiera interleukinę-13.
6. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera alaninę w postaci krystalicznej, a mannit w postaci amorficznej.
7. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że liofilizat składa się z fazy amorficznej i fazy krystalicznej, faza amorficzna w większości jest utworzona z mannitu i proteiny, faza krystaliczna w większości jest utworzona z alaniny.
8. Środek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako bufor zawiera bufor fosforanowy.
9. Roztwór do iniekcji podskórnych, dożylnych lub domięśniowych, dla ludzi lub zwierząt, zawierający jałowy, dopuszczalny farmaceutycznie rozpuszczalnik, przeciwbakteryjny środek konserwujący oraz liofilizat proteiny zawierający bufor, mannit i aminokwas, znamienny tym, że zawiera alaninę i mannit w stosunku R=masa alaniny/masa mannitu zawartym pomiędzy 0,1 a 1.
10. Roztwór według zastrz. 9, znamienny tym, że proteinę stanowi hormon, enzym lub cytokina.
11. Roztwór według zastrz. 10, znamienny tym, że jako hormon zawiera ludzki hormon wzrostu hGH.
12. Roztwór według zastrz. 10, znamienny tym, żejako enzym zawiera moczan oksydazy.
13. Roztwór według zastrz. 10, znamienny tym, żejako cytokinę zawiera interleukinę-13.
14. Roztwór według zastrz. 10, znamienny tym, że zawiera rozpuszczalnik wybrany z wody destylowanej, 0,9% wodnego roztworu chlorku sodu i 5% roztworu wodnego glukozy.

Wynalazek niniejszy dotyczy środka farmaceutycznie dopuszczalnego, występującego w formie liofilizatu i zawierającego proteinę jako składnik aktywny. Środek ten jest stabilny w temperaturze 25°C i może być odtworzony w formie ciekłej przez dodanie rozpuszczalnika. Może być podawany doustnie ludziom lub zwierzętom lub stosowany w zestawie do dozowania. Wynalazek dotyczy także roztworu do iniekcji podskórnych, dożylnych i domięśniowych, zawierającego proteinę jako składnik aktywny.

Wiadomo, że sposób wytwarzania ma znaczący wpływ na degradację protein w trakcie liofilizacjijak również bardzo silny wpływ na ich stabilność w formie liofilizowanej. Różne zmienne sposobu wytwarzania, które mają wpływ na te parametry to głównie pH, ilość występujących soli, rodzaj i ilość zarobek, typ wybranej krioprotekcji jak również temperatura, ciśnienie i czas operacji zamrażania, sublimacji i wybranego suszenia. Te różne zmienne wpływająna stan fizy179 240 czny otrzymanego liofilizatu, to znaczy: amorficzny szklisty, amorficzny miękki, krystaliczny lub kombinację tych stanów.

Rola każdej z tych zmiennych była badana niezależnie, ale ich efekt synergetycznyjest wciąż niejasny (Pikal MJ., Dellermann KM., Roy ML. Riggin MN., The effects of formulation variables on the stability of freeze-dried Human Growth Hormone, Pharm. Research., 1991,8, Nr 4,427-436).

Przegląd bibliografi dotyczącej wpływu aminokwasów i polioli na własności roztworów do liofilizowania lub liofilizatów prowadzi do następujących wniosków:

Zalety i wady wynikające z obecności aminokwasów; mannitu w fazie krystalicznej lub fazie amorficznej są zebrane poniżej;

Zalety związane z obecnością aminokwasów

Wykazano, że obecność glicyny w liofilizacie pobudza krystalizację cząstek obecnych w roztworze na etapie zamrażania procesu liofilizacji (Korey DJ., Schwartz JB, Effects of excipients on the cristallization of pharmaceutical compounds during lyophylization, J. Parenteral Sci. Tech., 1989,43,2,80-83). Krystalizacja składnika aktywnego, mimo że mało prawdopodobna w przypadku protein zwiększa ich stabilność.

Alanina w formie krystalicznej powstrzymuje opadanie liofilizatu w trakcie sublimacji i suszenia i pozwala na otrzymanie liofilizatu o dużej powierzchni właściwej i w ten sposób pozwala na szybsze wysuszenie(Pikal MJ., Freeze-drying of proteins, Biopharm. 26-30 październik 1990).

Wady związane z obecnością aminokwasów

Dodatek aminokwasu do cukru lub poliolu z roztworu poddawanego liofilizacji ma na ogół wpływ na obniżenie temperatury zeszklenia cukru. (Booy MPWM Ruiter RA., Meere ALJ., Evaluation of the phisical stability of freeze-dried sucrose containing formulations by differential scanning calorimetry, Pharm. Research., 1992,9,109-114). Otóż, obniżenie temperatury zeszklenia jest na ogół synonimem zmniejszenia stabilności liofilizatu (Franks F., Freezedrying; from empiricism to predictability, Cryo-letters, 1990.77,93-110).

Korzyści związane z obecnością mannitu

Obecność mannitu w formie amorficznej zawierającej proteinę zapewnia obecność wody niekrystalicznej związanej z proteiną w trakcie zamarzania i powstrzymuje denaturację białka. Ponadto obecność polioli chroni proteiny przed degradacją termiczną przez oddziaływanie hydrofobowe (Back JF, Oakenfull D., Smith MB., Increased thermal stability of proteins in the presence of sugars and polyols, Biochemistry, 197S^, 18,23,5191-96).

Wady związane z obecnością mannitu

Stwierdzono, że mannit nie pozwala na zachowanie aktywności enzymu w temperaturze 37°C w przeciwieństwie do laktozy. (Ford AW, Dawson PJ., The effect of carbohydrate additives in the freeze-drying of alkaline phosphatase, J. Pharm. Pharmacol., 1993, 45 (2), 86-93).

Korzyści związane z obecnościąfazy krystalicznej

Obecność wykrystalizowanego składnika rozpuszczalnego w roztworze zamrożonym jest sposobem stabilizacji protein podczas suszenia (Carpenter JF. &Crowe JH., Modes of stabilization of protein by organic solutes during dessiccation, Cryobiology, 1988,25, 459-470).

Wady związane z obecnościąfazy krystalicznej

Wykazano, że utrata aktywności proteiny liofilizowanej jest bezpośrednio związana ze stopniem krystaliczności cząstki krioprotekcyjnej(Izutsu KL, Yoshioka S., Terao T., Decreased protein-stabilizing effects of cryoprotectants due to crystllization., Pharm. Research. 1993,10, Nr 8, 1232-1237).

W preparatach medycznych zawierających proteiny powinno unikać się krystalizacji zarobek, według: (Hermansky M., Pesak M., Lyophilization of drugs. VI Amorphous and Cristalline forms Cesk. Farm., 17^7^:^, 42, (2), 95-98).

179 240

Korzyści związane z obecnościąfazy amorficznej

Obecność dodatków w stanie amorficznym stabilizuje aktywność pewnych enzymów proporcjonalnie do stężenia dodatków, według (Izutsu KL, Yoshioka S., Terao T., Pharm. Research

1993,10, Nr 8,1232-1237).

Krioprotekcyjny efekt zarobek przypisuje się amorficznemu stanowi glicyny w otrzymanym liofilizacje (Pikal MJ., Dellermann KM., Roy ML. RigginMN., The effects offormulation variables on the stability of freeze-dried Human Growth Hormone, Pharm. Research., 1991,8, Nr 4,427-436).

Wady związane z obecnościąfazy amorficznej

W obecności tylko samej, stałej fazy amorficznej liofilizat zapada się w trakcie zamrażania w temperaturach wyższych od temperatury zeszklenia.

Wewnątrz miękkiej fazy amorficznej reakcje chemicznej degradacji są kinetycznie dużo szybsze niż wewnątrz fazy krystalicznej.

Podsumowując, wyczerpujący przegląd literatury naukowej dotyczącej wpływu zarobek na stabilizację protein, pozwala znaleźć informacje sprzeczne o ich właściwościach. W żadnej teorii na temat relacji pomiędzy strukturą liofilizatu a jego stabilnością nie ma jednomyślności. Także rola polioli i aminokwasów pojedynczych lub połączonych, nie została opisana według zestawu ogótóych własności, ale została opisana ze sprzecznymi wynikami w zależności od badanych protein i stosowanych ilości zaróbek.

I tak teraz, w sposób nieoczekiwany odkryto efekt synergetyczny mannitu i alaniny na stabilizację liofilizowanych protein. Wykazano, że ten efekt synergetyczny występuje tylko w zakresie względnych stężeń każdego z nich. Efekt optymalny jest ograniczony stosunkiem R, który oznacza stosunek masa maninitu/masy alaniny obecnych w liofilizacie, zawarty pomiędzy 0,1 a 1, zwłaszcza pomiędzy 0,2 a 0,8.

Ponadto wykazano, że dla R zawartego pomiędzy 0,1 a 1:

Liofilizat składa się fazy amorficznej i fazy krystalicznej.

Faza amorficzna jest w większości utworzona z mannitu i proteiny.

Faza krystaliczna składa się w większości z alaniny.

Przyjmuje się hipotezy, że dla R zawartego pomiędzy 0,1 a 1:

Wytworzona faza amorficzna kriochroni proteiny podczas zamrażania.

Faza krystaliczna utrwala strukturę liofilizatu i zapobiega jego zapadaniu.

To ten nieoczekiwany efekt synergetyczny pomiędzy współistniejącymi fazami amorficzną i krystaliczną stabilizuje liofilizowaną proteinę. Niniejszy wynalazek wykorzystuje uzyskiwanie tego efektu dla korzystnych stosunków R.

Tak więc przedmiotem wynalazku jest stabilny, lifilizowany środek dopuszczalny farmaceutycznie, zawierający skuteczne ilości proteiny aktywnej biologicznie, bufor o pH optymalnym dla stabilizacji proteiny, manniti aminokwasy. Środek zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że zawiera alaninę i mannit w stosunku R = masa mannitu/masa alaniny zawartym pomiędzy 0,1 a 1.

Proteina zawarta w środku pozostaje stabilna w formie liofilizowanej. Rozpuszczanie uzyskanego liofilizatujest szybkie i całkowite. Liofilizat nie ma wyglądu zapadniętego, a ilość zawartej w nim wody jest taka, że nie wpływa na obniżenie aktywności proteiny.

Środek ten może zawierać inne dopuszczalne farmaceutycznie zarobki, znane z techniki, jak na przykład korozpuszczalniki, środki konserwujące, antyutleniacze lub czynniki chelatujące.

Korzystnie środek jako proteinę zawiera hormon, zwłaszcza ludzki hormon wzrostu hGH (hormon wzrostu człowieka), enzym, zwłaszcza moczan oksydazy lub cytokinę, zwłaszcza interleukinę-13, zaś jako bufor korzystnie zawiera bufor fosforanowy.

Środek korzystnie zawiera alaninę wpostaci krystalicznej, a mannit w postaci amorficznej.

Korzystnie liofilizat składa się z fazy amorficznej i fazy krystalicznej, faza amorficzna w większości jest utworzona z mannitu i proteiny, faza krystaliczna w większości jest utworzona z alaniny.

179 240

Środek ma więc postać stałego liofilizatu, zawierającego proteinę kriochronionąw trakcie zamrażania przez stałąfazę amorficzną utworzonązasadniczo z proteiny i mannitu, która to faza amorficzna współistnieje wewnątrz liofilizatu uzyskanego po sublimacji i wysuszeniu roztworu zamrożonego z fazą krystaliczną utworzoną głównie przez alaninę.