NO320364B1

NO320364B1 - Farmasoytisk akseptabelt, stabilt, frysetorket proteinpreparat og testsettanalysepakke

Info

Publication number: NO320364B1
Application number: NO19951724A
Authority: NO
Inventors: Alain Bayol; Thierry Breul; Patrice Dupin; Philippe Faure
Original assignee: Sanofi Aventis
Priority date: 1994-05-04
Filing date: 1995-05-03
Publication date: 2005-11-28
Also published as: DE69508837T2; AU1777495A; NZ272045A; AU694763B2; NO951724L; TW397687B; FI117321B; DE69508837D1; CZ108195A3; PL179240B1; KR950031103A; FR2719479A1; RU2136306C1; DK0682944T3; FI952119A; CA2148537C; CN1088583C; EP0682944A1; MX9502034A; GR3030146T3

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et farmasøytisk akseptabelt preparat tilveiebragt i form av et stabilt frysetørket produkt og inneholdende et protein som aktiv ingrediens. Preparatet er stabilt ved 25°C og kan bli rekonstituert i flytende form ved tilsetning av et løsningsmiddel. Det kan administreres parenteralt til mennesker eller dyr eller anvendes i en testsettanalysepakke.

Det er kjent at preparatet har en betydelig effekt på ned-brytning av proteiner under frysetørking, så vel som høy inn-virkning på deres stabilitet i frysetørket form. Diverse preparat-variable som påvirker disse parametere er hovedsakelig pH-verdien, mengden av salter som er til stede, typen og mengden av

eksipienter, typen av kryobeskyttelse som velges, så vel som temperaturene, trykket og tiden som velges for frysing, sublimering og awanning. Disse forskjellige variable influerer den fysiske tilstand av det oppnådde frysetørkede produkt, nemlig: glassaktig amorf, myk amorf, krystallinsk eller en kombinasjon av disse tilstander.

Rollen av hver av disse variable er blitt studert separat, men deres synergistiske effekt er fremdeles dårlig belyst

(Pikal MJ., Dellerman KM., Roy ML., Riggin MN.: "The effects of formulation variables on the stability of freeze-dried Human Growth Hormone", Pharm. Research, 1991, 8, nr. 4, 427-436).

En bibliografisk oversikt angående innflytelsen av aminosyrer og polyoler på egenskapene til de løsninger som skal frysetørkes eller de frysetørkede produkter har gjort det mulig å trekke følgende konklusjoner.

Fordelene og ulempene som er knyttet til nærvær av aminosyrer, mannitol, en krystallinsk fase eller en amorf fase er oppgitt nedenunder.

Fordeler knyttet til nærvær av aminosyrer.

Det er blitt vist at nærvær av glysin i et frysetørket produkt induserer krystallisasjon av de molekyler som er til stede i løsning under frysetrinnet i frysetørkingen {Korey DJ., Schwartz JB.: "Effects of excipients on the crystallization of pharmaceutical compounds during lyofilization", J. Parenteral Sei. Tech., 1989, 43, 2, 80-83). Denne krystallisering av den aktive ingrediens, som ikke desto mindre ikke er særlig sannsynlig når det gjelder proteiner, gjør det mulig å forsterke dens stabilitet.

Alanin har, i krystallisert form, den fordel at det forhindrer sammenklapping av det frysetørkede produkt under sublimering og awanning og tillater produksjon av et frysetørket produkt med større spesifikt overflateareal og tillater derfor hurtigere awanning (Pikal MJ.: "Freeze-drying of proteins", Biopharm. 26-30 October 1990).

Ulemper knyttet til nærvær av aminosyrer.

Tilsetning av en aminosyre til et sukker eller til en'polyol

i en løsning som skal frysetørkes har generelt den effekt å redusere glasstemperaturen til sukkeret (te Booy MPWM de Ruiter RA., de Meere ALJ.: "Evaluation of the physical stability of freeze-dried sucrose containing formulations by differential scanning calometry", Pharm. Research., 1992, 9, 109-114). Nå er generelt en senkning i glasstemperaturen synonymt med lavere stabilitet hos et frysetørket produkt (Franks F.: "Freeze-drying; from empiricism to predictability", Cryo-letters, 1990, 11, 93-110) .

Fordeler knyttet til nærvær av mannitol.

Nærvær av mannitol i amorf form som omgir proteinet garanterer nærvær av ikke-krystallisert vann bundet til proteinet, under frysing, og forhindrer derved denaturering av proteinet. Videre stabiliserer nærvær av polyoler proteinene mot varmenedbrytning, via hydrofobe interaksjoner (Back JF., Oakenfull D., Smith MB.: "Increased thermal stability of proteins in the presence of sugars and polyols", Biochemistry, 1979, 18, 23, 5191-96).

Ulemper knyttet til nærvær av mannitol.

Det er blitt rapportert at mannitol ikke gjør det mulig å konservere aktiviteten av et enzym ved 37°C, i motsetning til laktose (Ford AW., Dawson PJ.; "The effect of carbohydrate additives in the freeze-drying of alkaline phosphatase", J. Pharm. Pharmacol., 1993, 45 (2), 86-93).

Fordeler knyttet til nærvær av en krystallinsk fase.

Nærvær av et krystallisert middel som kan oppløses i en frossen løsning er et hjelpemiddel til å stabilisere proteinene under awanning (Carpenter JF. & Crowe JH. : "Modes of stabilization of a protein by organic solutes during desiccation", Cryobiology, 1988, 25, 459-470).

Ulemper knyttet til nærvær av en krystallinsk fase.

Det er blitt vist at tap av aktivitet hos et frysetørket protein er direkte knyttet til graden av krystallinitet hos det kryobeskyttende molekyl (Izutsu KL., Yoshioka S., Terao T.: "Decreased protein-stabilizing efects of cryoprotectants due to crystallization", Pharm. Research, 1993, 10, nr. 8, 1232-1237).

Ved tillaging av medisinske produkter som inneholder proteiner bør krystallisering av eksipienter unngås i henhold til: (Hermansky M., Pesak M.: "Lyophilization of drugs VI Amorphous and Christalline forms", Cesk. Farm., 1993, 42, (2), 95-98).

Fordeler knyttet til nærvær av en amorf fase.

Nærvær av additiver i den amorfe tilstand stabiliserer aktiviteten til visse enzymer proporsjonalt med konsentrasjonen av additivet i henhold til (Izutsu KL, Yoshioka S., Terao T.: "Decreased protein-stabilizing effects of cryoprotectants due to crystallization", Pharm. Research, 1993, 10, nr. 8, 1232-1237).

Den kryobeskyttende effekt hos eksipientene tilskrives den amorfe tilstand hos glysinet i det oppnådde frysetørkede produkt (Pikal MJ., Dellermann KM., Roy ML, Riggin MN.: "The effects of formulation variables on the stability of freeze-dried Human Growth Hormone", Pharm. Research, 1991, 8, nr. 4, 427-436).

Ulemper knyttet til nærvær av en amorf fase.

I nærvær av bare en fast amorf fase klapper det frysetørkede produkt sammen ved temperaturer over glasstemperaturen under frysing.

I en myk, amorf fase har de kjemiske nedbrytningsreaksjoner meget hurtigere kinetikk enn i en krystallinsk fase.

Som konklusjon gjør en uttømmende oversikt fra den viten-skapelige litteratur med hensyn til effekten av eksipienter på stabilisering av proteiner det mulig å finne motsigende informasjon angående deres egenskaper. Ingen teori angående slektskapet mellom strukturen til et frysetørket produkt og dets stabilitet er universelt akseptert. Likeledes er rollen til polyoler og aminosyrer, alene eller i kombinasjon, ikke beskrevet i henhold til et sett av generaliserbare egenskaper, men er blitt observert med motsigende resultater ifølge de proteiner som er studert og de mengder av eksipienter som er benyttet.

En synergistisk effekt er derfor nå funnet, helt overraskende, mellom mannitol og alanin på stabilsering av frysetørkede proteiner. Det er blitt vist at denne synergistiske effekt eksisterer bare i et område med relative konsentrasjoner av hver av disse to eksipienter. Den optimale effekt er begrenset for forhold R, hvor R representerer mannitolmasse/ alaninmasse som er til stede i det frysetørkede produkt, på mellom 0,1 og 1, spesielt 0,2 og

0,8.

Videre er det vist at for en R på mellom 0,1 og 1:

-består det frysetørkede produkt av en amorf fase og en krystallinsk fase; -består den amorfe fase overveiende av mannitol og protein;

-består den krystallinske fase overveiende av alanin.

De hypoteser som fremsettes er at for en R på mellom 0,1

og 1:

-kryobeskytter den amorfe fase som har dannet seg, proteinet under frysing; -fiksere den krystallinske fase strukturen til det frysetørkede produkt og unngår at det kollapser.

Det er denne overraskende synergistiske effekt mellom koeksistensen av en amorf fase og en krystallinsk fase som stabiliserer det frysetørkede protein. Foreliggende oppfinnelse beskriver derfor produksjonen av denne effekt for foretrukne

R-forhold.

Oppfinnelsen vedrører således et farmasøytisk akseptabelt, stabilt, frysetørket preparat av et protein kjennetegnet ved at det omfatter et protein, en buffer, alanin og mannitol, hvor forholdet R = masse av mannitol/masse av alanin er mellom 0,1 og 1. Proteinet som er inkludert i nevnte blanding forblir stabilt i frysetørket form. Oppløsningen av det oppnådde frysetørkede produkt er hurtig og fullstendig. Strukturen til det frysetørkede produkt blir ikke brutt eller faller sammen, og dets vanninnhold er forlikelig med opprettholdelsen av aktiviteten til proteinet.

Andre farmasøytisk akseptable eksipienter, som er velkjente for fagmannen på området, kan innføres i denne blanding, f.eks. ko-løsningsmidler, konserveringsmidler, antioksydanter eller chelateringsmidler.

Formålet med foreliggende oppfinnelse består derfor i å oppnå stabile frysetørkede produkter som inneholder et protein som er kryobeskyttet ved en amorf, fast fase under frysing, bestående i alt vesentlig av protein og mannitol, idet denne amorfe fase ko-eksisterer i det frysetørkede produkt som er oppnådd etter sublimering og awanning av den frosne løsning, med en krystallinsk fase som består i alt vesentlig av alanin.

Det biologisk aktive (eller bioaktive) protein som lages i henhold til oppfinnelsen, kan være et glykosylert eller ikke-glykosylert, naturlig, syntetisk, halvsyntetisk eller rekombinant polypeptid slik det anvendes i klinisk eller laboratoriepraksis. Mer spesielt kan proteinet f.eks. være et hormon, f.eks. et veksthormon, fortrinnsvis humanveksthormon (hGH), et luteiniserende hormon (LH-RH), et gonadotropin. Proteinet kan også være et enzym, f.eks. trombolytisk enzym, f.eks. en urokinase, en prourokinase, en streptokinase, en stafilokinase,en vevsplasminogenaktivator (tPA) eller et enzym, f.eks. en fosfatase, en sulfatase, en acyltransferase, en monoamin-oksydase, en uratoksydase. Likeledes kan et protein som lages i henhold til oppfinnelsen være et cytokin, f.eks. interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-6 (IL-6) eller interleukin-13 (IL-13). En annen klasse av proteiner i henhold til oppfinnelsen inkluderer f.eks. antistoffer, immunoglobuliner, immunotoksiner. Peptider som f.eks. kolecyBtokinin (CCK), substans P, neurokinin A, neurokinin B, neurotensin, neuropeptid Y, eledoisin, bombesin, kan lages i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Det biologisk aktive protein er fortrinnsvis hGH (eller humanveksthormon), uratoksydase eller interleukin-13.

Humanveksthormon er et protein som består av en enkelt polypeptidkjede med 191 aminosyrer med 2 disulfidbroer mellom cysteinrestene 53 og 165 og cysteinrestene 182 og 189.

Uratoksydase er et enzym som oksyderer urinsyre til allantoin og blir ekstrahert fra biomassen av Aspergillus flavus (Laboureur et al., Bull. Soc. Chim. Biol. 1968, 50, 811-825). Det er blitt anvendt for behandling av hyperuricemi i mer enn 20 år.

Det cDNA som koder for dette protein er ganske nylig blitt klonet og uttrykt i E. coli (LEGOUX R et al., J. of Biol. Chem., 1992, 267, 12, 8565-8570). Aspergillus flavus og Saccharmomyces serevisiae. Enzymet er en tetråmer med identiske subenheter med molekylmasse i området 32.000. Monomeren, som består av en enkelt polypeptidkjede på 301 aminosyrer, har ingen disulfidbroer og er acetylert ved N-terminalenden.

Interleukin-13 er et cytokin som består av en enkelt polypeptidkjede med 112 aminosyrer med 2 disulfidbroer (Minty et al., Nature, 1993, 362, 248-250).

Oppnåelsen av koeksistensen av den amorfe (mannitol + protein) fase med den krystallinske alanin-fase er uavhengig

av nærvær og av konsentrasjonen av en buffer for justering av løsningens pH-verdi, men den avhenger av R-forholdet som er definert ovenfor.

For å foreslå proteinblandinger som er tilgjengelige for publikum som terapeutiske midler, er det essensielt å sette dem sammen i tilstrekkelig stabil form for å opprettholde deres biologiske aktivitet mellom tidspunktet for blandingen og for bruk. F.eks. er hGH blitt sammensatt på forskjellige måter slik som beskrevet i følgende patentskrifter eller søknader: US-5.096.885; WO-89/09614; WO-92/17200; AU-30771/89; WO-93/19773; WO-93/19776.

Preparatene i henhold til oppfinnelsen kan konserveres ved romtemperatur, mens for tiden markedsførte preparater som inneholder disse proteiner må konserveres ved temperaturer på 2-8°C.

I de fleste tilfeller er den farmasøytiske doseringsform frysetørket, frosset eller i løsning. Den inneholder proteinet, en buffer, glysin, arginin, mannitol, zink, overflateaktive midler, dekstran, EDTA eller andre eksipienter, men aldri kombina-sjonen alanin/mannitol i et masseforhold R mellom 0,1 og 1. De frysetørkede eller frosne former blir anvendt for å opprettholde den biokjemiske integritet og den biologiske aktivitet hos molekylet. De frysetørkede preparater må rekonstitueres før bruk ved tilsetning av farmasøytisk akseptable sterile løsningsmidler, f.eks. destillert vann, vandige løsninger av natriumklorid ved 0,9% eller av glukose ved 5% eller hvilket som helst annet fysiologisk akseptabelt løsningsmiddel, som inneholder eller på annen måte antibakterielle konserveringsmidler slik som benzylalkohol, fenol eller metakresol.

Et preparat som er stabilt ved romtemperatur inntil det blir rekonstituert er spesielt fordelaktig for ambulerende behandling slik som i tilfellet med hGH i form av en flaske eller presentasjon tilpasset i form av en multidoseringspenn.

Det således fremstilte preparat kan også bli innført i en testsettanalysepakke.

Oppfinnelsen er derfor en foretrukket blanding av et fryse-tørket produkt. Dette frysetørkede produkt blir oppnådd ved frysetørking idet man går ut fra en løsning.

Fremgangsmåten for fremstilling av dette preparat inkluderer trinn med blanding, oppløsning, filtrering og frysetørking. Sammensetningen av løsningen som skal frysetørkes er som følger: Et protein, en farmasøytisk akseptabel buffer for å justere pH-verdien, alanin, mannitol hvor masseforholdet R = masse av mannitol/masse av alanin er mellom 0,1 og 1, vann for injeksjon.

Løsningen som skal frysetørkes blir laget på følgende måte: Proteinløsningen oppnås på en gelfiltreringskolonne og inneholder en buffer som opprettholder sin pH-verdi i en sone som er forlikelig med stabiliteten av proteinet.

De ønskede mengder av buffer, alanin, mannitol og vann settes til denne løsning for å solubilisere alle eksipientene. Løsningen blir sterilfiltrert og fordelt i beholdere, fortrinnsvis rør eller karpuler.

Frysetørkingen av løsningene blir utført som følger:

Oppløsningen følger en syklus av frysing, deretter sublimering og desikkasjon som er tilpasset til det volum som skal frysetørkes og til beholderen som inneholder løsningen. Fortrinnsvis velges en frysehastighet som er nær ved -2°C/min., i en Usifroid frysetørker (fra Frankrike) av typen SMH15 eller SMJ100 eller SMH200.

Tid, temperatur og trykk for awanning av det frysetørkede produkt blir justert som funksjon av volumene av løsning som skal frysetørkes og det ønskede resterende vanninnhold i det frysetørkede produkt.

Fullstendig informasjon angående teknikkene for fremstilling av de injiserbare blandinger er tilgjengelig for fagmannen på området i Remington's Pharmaceutical Science, 1985, 17. utgave eller i William NA & Polli GP: "The lyophilization of pharmaceuticals: a literature review", J. Parenteral Sei. Tech., 1984, 38, (2), 48-59 eller Franks F.,: "Freeze-drying: from empiricism to predictability", Cryo-letters, 1990, 11, 93-110.

Et frysetørket produkt blir derved oppnådd i hvilket alanin er i krystallisert form og mannitol er i amorf form. Det frysetørkede produkt kan konserveres ved 25°C uten forringelse av den biologiske aktivitet av proteinet som det inneholder.

For å illustrere oppfinnelsen ble det gjort vurderinger ved valg av hGH eller uratoksydase som et eksempel på protein. Således ble det fremstilt flere løsninger som inneholdt hGH eller uratoksydase som biologisk aktivt protein, en fosfatbuffer ved forskjellige konsentrasjoner, ved pH = 7 for de løsninger som inneholdt hGH (ved 4 IU/0,5 ml), og pH = 8 for dem som inneholdt uratoksydase (ved 30 EAU/ml, mannitol alene, alanin alene eller alanin/mannitol-blandinger), og de ble frysetørket og analysert.

Blandingene er beskrevet i detalj i eksemplene i tabellene 1 og 2 nedenunder. Analysemetodene så vel som de stabiliserende tider og temperaturer er også beskrevet nedenunder.

Analysemetodene som ble anvendt for bestemmelse av de forskjellige parametere er som følger.

Innhold av dimerer og beslektede substanser med høyere molekylmasse: Innholdet av dimerer og beslektede substanser med høyere molekylmasse bestemmes ved utelukkelseskromatografi (SEC-HPLC) under anvendelse av en SUPEROSE 12 kolonne (Pharmacia, ref. 17-0538-01). Produktet blir eluert med en ammoniumfosfatbuffer-løsning ved pH = 7,0 (1,38 g ammoniumdihydrogenfosfat i 1 liter vann, justert til pH = 7,0 med konsentrert ammoniumhydroksyd ved en strømningshastighet på 0,4 ml/min.). Påvisningen blir utført ved 220 nm. (Dette innhold noteres i de analytiske resultater som prosenter av oligomerer + polymerer).

Innholdet av dimerer og substanser med høyere molekylmasse kan også bestemmes ved den metode som er beskrevet i europeisk farmakopø monograf: "Somatropine pour preparation injectable" fra januar 1994.

Bestemmelse av proteintitre ved reversert fasekromatografi.

Uttrykt i mg pr. rør foretas bestemmelse ved reversert fasekromatografi ved hjelp av en C18-300Å kolonne - 25 cm, diameter 4,6 mm (SYNCHROM, ref. CR103-25). Produktet blir eluert i løpet av 35 minutter på gradientmåte med en mobil fase som passerer fra 75 volumdeler vann ved 0,1% trifluoreddikByre (V/V)

(TFA) og 25 volumdeler acetonitril ved 0,08% TFA (V/V) til 30 volumdeler vann ved 0,1% TFA og 70 volumdeler acetonitril ved 0,08% TFA. Strømningshastigheten er 1 ml/min., og påvisningen utføres ved 220 nm.

Analyse av den enzymatiske aktivitet av uratoksydase.

Den enzymatiske aktivitet av uratoksydase uttrykt som EAU blir bestemt ved spektrofotometri i en termostatert kyvette ved 30°C ved overvåkning av forsvinning av urinsyre ved 292 nm i henhold til Legoux R., Delpech Bruno, Dumont X., Guillemot JC, Ramond P., Shire D., Caput D., Ferrara P., Loison G.,

J. Biol. Chem. 1992, 267 (12), 8565-8570.

Turbiditet av de rekonstituerte løsninger.

Turbiditeten av de hGH-holdige frystetørkede produkter tatt opp i løsning blir bestemt ved spektrofotometri (Ph. Eur. 2 (I) V.619 ved 500 nm i et Perkin Eimer 554 spektrofotometer. Resultatene blir gitt i absorbansenheter x 1000.

Turbiditeten av de uratoksydaseholdige fyrsetørkede produkter tatt opp i løsning blir bestemt ved hjelp av et Ratio Hach 18900-00 turbidimeter. Turbiditetsresultåtene uttrykkes i nefelometriske turbiditetsenheter (NTU) definert ved: standardmetoder for undersøkelse av vann og avløpsvann i henhold til American Public Health Association.

Graden av opalescens blir også bestemt ved hjelp av metoden til europeisk farmakopø (II) V. 6, ved å sammenligne prøven som skal analyseres, med en kontrollsuspensjon.

Organoleptiske kriterier for de frysetørkede produkter.

Disse kriterier blir undersøkt visuelt, og det tas hensyn til fargen på det frysetørkede produkt, dets struktur (sammenklappet eller annerledes), og observasjonen av et eventuelt faseskift mellom skorpen og krummen til det frysetørkede produkt.

Røntgendiffraktometri på pulver.

Røntgendiffraktormetrisk analyse på de frysetørkede produkter blir utført i et SIEMENS D500 TT dif f raktometer; kilde: CuKctl; generator: 40 KV, 25 mA; bak-monokromator;

spalte: 1/1/1/0,16/0,6; prøvetaking på en Pyrex rack; sveipeområde: 4°-40° pr. min. i 2 Bragg theta (0).

Differensialtermal-analyse.

Studien av de frysetørkede produkter ved differensialtermal-analyse blir utført under følgende betingelser:

Deamiderte former av hGH.

Prosenten av deamiderte former blir bestemt ved anionebytte-kromatografi (AEX-HPLC) under anvendelse av en anionebyttekolonne (PHARMACIA mono-Q HR 5/5, ref. 17-0546-01). Elueringen blir utført med en løsning A (13,8 g ammoniumdihydrogenfosfat i 1000 ml vann; pH = 7 justert med konsentrert ammoniumhydroksyd) og vann som løsning B, ved anvendelse av følgende programmering: 5% av løsning A i 2 min., deretter passasje til 15% av løsning A over 5 min., deretter passasje til 50% av løsning A over 20 min., endelig passasje til 100% av løsning A over 5 min. og opprettholdelse av sistnevnte løsning i 5 min. Elueringen av hGH (tR ca. 15 min.) og av de deaminderte former blir overvåkt ved 220 nm. Strømningshastigheten er 1 ml/min.

De oppnådde analyseresultater under anvendelse av disse forskjellige metoder er beskrevet nedenunder.

Innholdet av dimerer og beslektede substanser

med høyere molekylmasse.

Innholdet av oligomerer pluss polymerer av de frysetørkede produkter som inneholder 4 IU av hGH tatt opp i 0,5 ml vann ble bestemt som funksjon av R-forholdet (fig. 1). Fig. 1 indikerer at det minste innhold av oligomerer pluss polymerer i løsningene blir oppnådd for R på mellom 0,1 og 1, idet verdien 0,1 er interpolert fra kurven.

Ved hjelp av et ytterligere eksempel ble to satser av hGH ved

4 IU og 8 IU overvåket med hensyn til stabilitet ved 25°C

og 35°C. Deres stabilitet er utmerket etter 6 måneders konservering.

Tabellene 3 og 4 nedenunder indikerer prosentene av oligomerer polymerer av deamiderte former ved forskjellige tidspunkter og temperaturer sammenlignet med europeisk farmakopø-standardene.

I disse tabeller betyr R = 0,45.

Analyse av den enzymatiske aktivitet av uratoksydase.

Den enzymatiske aktivitet av de frysetørkede produkter som inneholder 3 0 EAU uratoksydase tatt opp i 1 ml vann ble bestemt som funksjon av R-forholdet etter 1 måned ved 35°C (kfr. fig. 2). Fig. 2 indikerer at den initielle enzymatiske aktivitet av uratoksydase blir konservert etter 1 måned ved 35°C for et R på mellom 0,4 og 1.

Ved hjelp av et ytterligere eksempel er en blanding med

R = 0,45 eller R = 0,67 perfekt stabil etter 3 måneder ved 25°C (restaktivitet nær opp til 100% av verdien for tid null).

Turbiditet av den rekonstituerte løsning.

Turbiditeten av de frysetørkede produkter som inneholder

4 IU hGH tatt opp i 0,5 ml vann ble bestemt som funksjon av R-forholdet (kfr. fig. 3). Fig. 3 indikerer at den minste turbiditet av løsningene oppnås for en R på mellom 0 og 1,5.

Turbiditeten av de frysetørkede produkter som inneholder

3 0 EAU uratoksydase tatt opp i 1 ml vann ble bestemt som funksjon av R-forholdet (kfr. fig. 4). Fig. 4 indikerer at den minste turbiditet som ble oppnådd på løsningene blir oppnådd for en R på mellom 0,2 og 1.

Organoleptiske kriterier for de frysetørkede produkter.

De organoleptiske kriterier for hvert frysetørket produkt som inneholdt 4 IU hGH eller 30 EAU av uratoksydase eller intet protein, og varierende innhold av fosfatbuffer, ble bestemt som funksjon av R-forholdet og er vist i tabell 5. Tabell 5 indikerer at de frysetørkede produkter oppviser tilfredsstillende organoleptiske kriterier for en R på mellom 0,125 og 1,7.

Disse karakteristikker varierer ikke som funksjon av tiden.

Røntgen-diffraksjon.

Resultatene fra røntgen-diffraksjonsanalysen på pulveret av de frysetørkede produkter som ble oppnådd og inneholdt alanin/ mannitol-blandinger i R-forhold som varierte fra 0 til + oo er vist i tabell 5.

Diffraktogrammene som ble oppnådd viser at for en R på mellom 0 og 1 viser bare linjene for alanin-krystallgitteret seg; videre indikerer avviket fra basislinjen av diffrakto-grammet nærvær av en amorf fase som består av mannitol. Jo større R er, desto større er den amorfe fase på grunn av mannitol. For R > 1 krystalliserer også mannitolen.

En amorf fase blir oppnådd som består av mannitol og en krystallinsk fase som består av alanin for en R på mellom 0 og 1.

Differensialtermalanalyse.

Glasstemperaturene for de frysetørkede produkter som inneholder 4 IU av hGH eller 30 EAU uratoksydase eller intet protein, og varierende innhold av fosfatbuffere ble bestemt som funksjon av det resiproke av R-forholdet {kfr. fig. 5). Fig. 5 indikerer at den maksimale glasstemperatur som ble oppnådd på de frysetørkede produkter som inneholder blandinger av alanin og mannitol blir oppnådd for (l/R) > 1, dvs. for en R på mellom 0 og 1.

Det er glasstemperaturen til det frysetørkede produkt som indikerer den maksimale stabilitetstemperatur for det frysetørkede produkt. Den maksimale stabilitetstemperatur for det frysetørkede produkt blir derfor nådd for en R på mellom 0 og 1.

Deamiderte former

De resultater som ble oppnådd på satsene med 4 IU og 8 IU viser bare svært liten variasjon, noe som er svært akseptabelt sammenlignet med standardene for somatropin-monografen fra europeisk farmakopø. De gjør det mulig å tro at denne blanding vil være tilstrekkelig stabil ved 25°C.

Som konklusjon er det påvist at hver egenskap vurdert på de frysetørkede produkter oppviser et optimum for et intervall av R-verdier som kan oppsummeres på følgende måte:

Hvert analytisk kriterium (% oligomerer + polymerer, hGH-stabilitet, enzymatisk aktivitet av uratoksydase etter 1 måned ved 35°C, turbiditets-hGH-løsninger, turbiditets-uratoksydase-løsninger, utseende av de frysetørkede produkter, alanin alene krystallinsk, maksimum glasstemperatur) definerer et spesifikt optimalt intervall pr. egenskap. For å oppnå en akseptabel blanding er det definert et foretrukket intervall av R, dvs. 0,1 < R < 1.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen uten imidlertid å begrense den.

EKSEMPEL 1

Sammensetning av et frysetørket produkt av hGH ved 4 IU

som skal tas opp i 0,5 ml vann for injeksjon

EKSEMPEL 2

Sammensetning av et frysetørket produkt av hGH ved 8 IU

som skal tas opp i 1 ml vann for injeksjon

EKSEMPEL 3

Sammensetning av et frysetørket produkt av hGH ved 18 IU

som skal tas opp i 1 ml vann for injeksjon

EKSEMPEL 6 Analyseresultater etter 1 år stabilitet ved 5°C av hGH ved 18 IU

For alle resultatene er R = 0,45

EKSEMPEL 7

Analyseresultater etter 3 måneder stabilitet ved 25°C av hGH ved 18 IU

For alle resultatene er R = 0,45

Claims

1. Farmasøytisk akseptabelt, stabilt, frysetørket preparat av et protein, karakterisert ved at det omfatter et protein, en buffer, alanin og mannitol, hvor forholdet R = masse av mannitol/masse av alanin er mellom 0,1 og 1.

2. Preparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at proteinet er et hormon, et enzym eller et cytokin.

3. Preparat som angitt i krav l, karakterisert ved at det skal være for rekon-stituering av en injiserbar løsning.

4. Preparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at det skal være for rekon-stituering av en løsning som er injiserbar til mennesker eller dyr subkutant, intravenøst eller intramuskulært.

5. Preparat som angitt i krav 2, karakterisert ved at hormonet er hGH.

6. Preparat som angitt i krav 2, karakterisert ved at enzymet er uratoksydase.

7. Preparat som angitt i krav 2, karakterisert ved at cytokinet er interleukin-13.

8 . Preparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at alaninet er i krystallinsk form og mannitolen er i amorf form.

9. Preparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at det frysetørkede produkt består av en amorf fase og en krystallisert fase, idet den amorfe fase overveiende består av mannitol og protein, mens den krystallinske fase overveiende består av alanin.

10. Preparat som angitt i krav 2, karakterisert ved at bufferen er en fosfatbuffer.

11. Testsettanalysepakke, karakterisert ved at den omfatter et preparat som angitt i krav l.