NO144057B - Fremgangsmaate for aa minske vannbehovet og eliminere utslipp av forurensninger ved behandling av halm med alkali i vannopploesning for aa oeke dens forverdi - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til stabilisering av terapeutisk anvendelige plasminoppløsninger.

Det er kjent å benytte sterile plasminoppløsninger til forskjellige terapeutiske formål, hvor man søker å utnytte plasminets proteinspaltende egenskaper. Anvendelsesmåten avhenger av karakteren av den sykdom man søker å lindre eller å helbrede. Således har man gjort bruk av injeksjoner f.eks.

i tilfelle av empyemer, hemotoraks og sinusit, og infusjoner f.eks. i tilfelle av tromboser og ødemer, likesom man har anvendt instillasjoner, f.eks. i forbindelse med fistler av forskjellig art og vaginit. Også overflateapplikasjon, f.eks. i forbindelse med sårbehandlinger, har vært anvendt.

Styrken av plasminoppløsninger uttrykkes vanligvis

i antallet av plasminenheter pr. ml. Imidlertid finnes det ennu Kfr.kl. 30h-2/04

ikke noen internasjonalt vedtatt definisjon av en plasminenhet. Her og i det følgende skal det ved 1 plasminenhet forståes den plasminmengde som i løpet av 20 minutter bevirker dannelsen av perklorsyreoppløselige spaltningsprodukter med en ekstinksjon på 1 enhet ved 275 ryx. under følgende forsøksbetingelser:

Til to reagensglass, som hvert inneholder 1 ml av

en til 35,5°C forvarmet 3%'s oppløsning av Hammarsten kasein 1 0,4 molær fosfatbuffer (pH 7,50) tilsettes 1 ml av den plasminoppløsning hvis aktivitet skal bestemmes, og som har en pH-verdi på 7,5. Efter å ha stått i 2 minutter i termostat ved 35,5°C tilsettes det til det ene glass 3 ml av en 1,7

molær oppløsning av perklorsyre i destillert vann, og efter 22 minutters henstand ved 35,5°C tilsettes den samme mengde perklorsyreoppløsning til det annet glass. Ved perklorsyre-tilsetningen foregår det en utfelling, og de to reagensglass står nu i 20 minutter, hvorefter det foretaes en filtrering to ganger gjennom filtrerpapir (J.H. Munktells unrivalled Genuine Swedish Filtering Paper No. 0,9 om). De to oppløsningers ekstinksjon måles derefter ved 275 m^t i et Beckman D U spektrofotometer (1 cm kvartskuvetter), idet verdien for prøven som har stått i 2 minutter, benyttes som blindverdi. Den plasminoppløsning, hvis styrke skal undersøkes, fortynnes i en slik grad at ekstinksjonen ikke blir høyere enn 0,5, da det ved høyere plasminkonsentrasjoner ikke er proporsjonalitet mellom ekstinksjonen og plasminkonsentrasjonen.

Mens en vandig plasminoppløsning med en pH-verdi på

2 til 3 er praktisk talt stabil ved temperaturer helt opp til

35°C, er den samme plasminoppløsning med nøytral reaksjon (pH 7 eller blodets pH) ustabil, forutsatt at oppløsningen ikke er meget sterkt fortynnet. Hvis man stiller som betingelse at det maksimalt må finne sted et plasmintap i oppløsningen på

20% i løpet av 2 timer ved 25°C, må plasminoppløsninger som inneholder mere enn ca. 0,1 enhet pr. ml betraktes som ustabile.

Da de terapeutisk anvendte plasminoppløsninger inneholder betydelig mere plasmin, har man hittil måttet anvende ny-fremstilte plasminoppløsninger, og finne seg i eventuelle plasmintap.

Foreliggende oppfinnelse tar sikte på å muliggjøre fremstillingen av klinisk brukbare plasminoppløsninger, som er betydelig mere stabile enn de hittil kjente plasminoppløs-

ninger. Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å tilveie-

bringe plasminoppløsninger, som er praktisk talt stabile selv ved en temperatur omkring ca. 35°C.

Oppfinnelsen bygger på den nye vitenskapelige

iakttagelse, at stabiliteten av terapeutisk brukbare plasmin-oppløsninger kan forbedres betydelig ved tilsetning av én eller flere aminosyrer. Det har tidligere av flere forskere vært foretatt vitenskapelige undersøkelser med hensyn til virkningen av en tilsetning av forskjellige aminosyrer til vandige systemer som inneholder plasmin og dettes proenzym plasminogen. Disse undersøkelser har vist at de anvendte aminosyrer alt efter sin kjemiske struktur selv i meget lave konsentrasjoner er i stand til i større eller mindre grad å inhibere plasminogenets omdannelse til plasmin, og derved midlertidig hindre en plasminaktivitet in vivo. Herav kan man imidlertid ikke trekke noen som helst slutninger med hensyn til aminosyrens innflytelse på stabiliteten og aktiviteten av plasminoppløsninger. Det må på bakgrunn av hva som hittil var kjent på det foreliggende område sies å være overraskende at aminosyrer er i stand til å

bibringe vandige plasminoppløsninger en sterkt forøket stabili-

tet, som gjør den betydelig bedre egnet til praktisk klinisk bruk, ikke minst til infusjon.

Det har også vist seg at aminosyretilsetningen øker plasminets oppløselighet i det vandige medium. Mens en nøytral oppløsning av plasmin i vann blir uklar som følge av en plasmin-utfelling, når plasminkonsentrasjonen er 0,01 enhet og derover pr. ml, vil det ved en aminosyretilsetning kunne fremstilles klare, nøytrale plasminoppløsninger med en plasminkonsentrasjon opp til 100 enheter pr. ml.

Ved de undersøkelser som har ført til foreliggende oppfinnelse, og ved hvilke det er gjort bruk av en lang rekke forskjellige aminosyrer, har det vist seg at aminosyrens kjemiske struktur har innflytelse på deres stabiliserende virkning.

I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes således en fremgangsmåte til stabilisering av terapeutisk anvendelige plasminoppløsninger. Fremgangsmåten karakteriseres ved at det til en plasminoppløsning settes én eller flere sulfhydryl-eller disulfid-frie, alifatiske aminomonokarboksylsyrer med mer enn 3 karbonatomer og en endestillet aminogruppe.

Det synes å kunne oppnåes bedre stabilisering jo lengre avstanden er mellom aminosyrens karboksylgruppe og dens aminogruppe(r).

Til belysning av den stabiliserende virkning, som

kan oppnåes ifølge oppfinnelsen, skal det i det følgende gjøres rede for en rekke stabiliseringsforsøk, blant annet under henvisning til tegningen, på hvilken:.

Fig. 1 og 2 grafisk viser den stabiliserende virkning av forskjellige aminosyrer.

Den stabiliserende virkning av en lang rekke aminosyrer er undersøkt i forbindelse med plasmin som stammer fra svineblod og oppløst i fosfatbuffer (pH 7,5). En vandig opp-løsning av vedkommende aminosyre blandes med plasminoppløsningen under eventuell fortynning i slike mengdeforhold at den fremkomne blanding inneholder ca. 0,4 plasminenheter pr. ml, og 0,25 millimol aminosyre per plasminenhet, såfremt aminosyrens oppløselighet tillater denne aminosyrekonsentrasjon; ellers anvendes en mettet aminosyreoppløsning. Den således fremstilte aminosyreholdige plasminoppløsning anbringes i en termostat ved 35,5°C, og til forskjellige tider uttaes det prøver som analyseres for plasminaktivitet, som beregnes i % av utgangs-aktiviteten (ca. 0,4 enheter pr. ml).

Forsøksresultatene er sammenstillet i nedenstående tabell.

Kurvene på fig. 1 og 2 viser den stabilitet som kan

oppnåes under de i det foregående omtalte forsøksbetingelser,

også ved lengre tids oppbevaring ved 35,5°C under anvendelse av de angitte aminosyrer, idet kurvenes abscisse angir oppbeva-ringstiden i timer, og ordinaten % av den opprinnelige aktivitet.

Til sammenligning er inntegnet stabilitetskurven for den benyttede plasminoppløsning uten aminosyretilsetning.

I belgisk patentskrift 576.562 er beskrevet en fremgangsmåte til fremstilling av en stabilisert vandig oppløsning av ett eneste enzym, nemlig chymotrypsin, og det er angitt at fremgangs-

måten består i tilsetning av en sulfhydryl- og disulfidfri amino-

syre. Eftersom chymotrypsin er vesentlig forskjellig fra plasmin,

kan man imidlertid ikke derav slutte seg til at slike aminosyrer også kan anvendes til stabilisering av plasmin.

Den stabiliserende virkning bevares praktisk talt ufor-andret, selv om det foruten den langt fra karboksylgruppen plaserte aminogruppe finnes en aminogruppe i a-stilling. Det har vist seg at den stabiliserende virkning av f-aminokapronsyre og lysin (a,£-diaminokapronsyre) er særlig god, og disse forbindelser er derfor foretrukket til anvendelse ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Også ornitin { a, i -diamjino-valeriansyre) stabiliserer utmerket.

Substituering av en aminogruppe med en ikke-basisk gruppe hindrer ikke den stabiliserende virknings fremkomst, såfremt aminosyren stadig har en basisk gruppe langt fra karboksylgruppen. Således stabiliserer a-N-acetyl-L-arginin utmerket.

Mens glycin i den anvendte konsentrasjon bare oppviser en svak stabiliserende virkning, oppnåes det en kraftig stabiliserende virkning med glycylglycin, hvilket er i overensstemmelse med det som ovenfor er anført, at det er av betydning for den stabiliserende virkning at det finnes en aminogruppe så langt som mulig fra aminosyrens karboksylgruppe.

Tilsvarende undersøkelser som de ovenfor anførte, hvor det er benyttet plasmin som stammer fra svineblod, er også blitt utført under anvendelse av plasmin som stammer fra okse-blod. I nedenstående tabell er de resultater sammenstillet, som er oppnådd under anvendelse av de angitte aminosyrer.

At aminosyrer også virker stabiliserende på oppløsninger av plasmin som stammer fra humant blod, fremgår av nedenstående tabell. Forsøksomsteridighetene er de samme som nevnt i det foregående.

Tilsettes det til plasminoppløsningene en forholdsvis

stor mengde av de aminosyrer, som f.eks. L-lysin eller

<£-aminokapronsyre, som oppviser en kraftig stabiliserende virkning,

og analyseres oppløsningene for plasminaktivitet umiddelbart efter tilsetningen, så finner man mindre plasminaktivitet enn ventet.

Dette skyldes formentlig at den forholdsvis høye aminosyrekonsentrasjon bevirker dannelsen av merkbare mengder av et plasmin-aminosyrekompleks, som ikke er aktivt. Fortynnes imidlertid oppløsningen før analyseringen, gjenfinnes den totale plasminaktivitet. Til belysning av dette skål nevnes følgende forsøk.

a) Det fremstilles en plasminoppløsning ut fra

svineblod, som inneholder ca. 0,4 plasminenheter pr. ml., og

2 millimol L-lysin pr. plasminenhet, i fosfatbuffer (pH 7,5), hvorefter man bestemmer blandingens plasminaktivitet og sammen-

ligner den med aktiviteten av plasminoppløsningen uten aminosyretilsetningen, og uttrykker blandingens aktivitet i % av den ublandede plasminoppløsnings aktivitet. Derefter foretaes en fortynning av oppløsningen uttrykt i det opprinnelige volum av plasminoppløsningen dividert med volumet av plasminoppløsningen efter fortynningen, og aktiviteten av de fortynnede oppløsninger bestemmes. Resultatene av disse forsøk er sammenstillet i nedenstående tabell.

b) Det samme forsøk som under a) utføres, men under anvendelse av é^-aminokapronsyre i stedet for L-lysin. Resultatene er sammenstillet i nedenstående tabell: Med hensyn til den aminosyremengde som bør benyttes til oppnåelse av en i praksis brukbar stabilisering, skal det først bemerkes at stabiliteten såvel av en plasminoppløsning uten aminosyretilsetning, som av en plasminoppløsning med aminosyretilsetning, er meget sterkt avhengig av den temperatur ved hvilken oppløsningen henstår. Ved 25°C er halveringstiden for en ustabilisert plasminoppløsning ca. 4-5 ganger større enn ved 35,5°C, forutsatt at samme plasminkonsentrasjon er benyttet. Også for en ved aminosyretilsetning stabilisert plasminoppløsning er stabiliteten meget temperaturavhengig. Til belysning av dette skal det vises til nedenstående tabeller, som på lignende måte som tabell I viser aktiviteten av en plasminoppløsning som inneholder henholdsvis 0,4 og 0,3 plasminenheter pr. ml., tilsatt varierende mengder L-lysin og oppbevart i hensholdsvis 60 minutter og 120 minutter ved henholdsvis 35,5°C og 25°C.

Såfremt man bare tillater et plasmintap på ca. 20%

ved henstand i 2 timer ved henholdsvis 25°C og 35,5°C, kan man ved den førstnevnte temperatur nøye seg med en lysinkonsentrasjon på omkring 0,005 millimol pr. plasminenhet, mens man ved 35,5°C

skal opp på en lysinkonsentrasjon på ca. 0,1 millimol pr. plasminenhet.

Det vil således sees at den nedre grense for den

praktisk brukbare aminosyrekonsentrasjon ikke bare avhenger av hvilken aminosyre man vil anvende, men også av hvilket krav man i hvert enkelt tilfelle i klinikken vil stille til de anvendte plasminoppløsningers stabilitet.

Med lysin som eksempel vil det sees at man for å unngå plasmintap ved henstand i to timer ved 35,5°C og en plasmin-konsentras jon på 0,4 pr. ml skal anvende en lysinkonsentrasjon på over 0,25 millimol pr. plasminenhet, mens den tilsvarende lysinkonsentrasjon ved 25°C er 0,04 millimol pr. plasminenhet. Imidlertid vil det ikke alltid i praksis være nødvendig å stille

så store krav til stabiliteten. Det vil godt kunne tolereres et aktivitetstap på 20% i løpet av 2 timer ved 25°C.

For lysins vedkommende kan den nedre grense for den

i praksis nødvendige lysinmengde settes til 0,002 millimol pr. plasminenhet, og da lysin må sies å være en av de kraftigst stabiliserende aminosyrer, bør det alltid anvendes minst 0,002 millimol aminosyre pr. plasminenhet, for at man kan oppnå en brukbar stabiliseringseffekt. Helst bør aminosyremengden ligge over 0,005 millimol pr. plasminenhet.

Som det fremgår av tabell IV vil lysin under anvendelse

av en plasminkonsentrasjon svarende til 1/2 enhet pr. millimol lysin virke inaktiverende på plasminoppløsningen, såfremt lysinet er tilstede i en konsentrasjon over 0,32 millimol pr. ml. Da> imidlertid inaktiveringen, som det også fremgår av tabell IV, er reversibel, idet den forsvinner ved fortynning,

og da det ved administrasjonen av plasminoppløsninger, ikke minst ved infusjon, foregår en kraftig fortynning av plasminoppløsningen,

og utskillelsen av aminosyrer fra blod og vevsvæske er mange ganger raskere enn utskillelsen av plasmin, er det til oppfinnelsens formål mulig å bruke lysin i konsentrasjoner som langt overstiger 2 millimol pr. plasminenhet. I virkeligheten er det fysiologisk ingen øvre grense for den anvendte aminosyremengde utover den dose som virker toksisk, og som er av en helt annen størrelsesorden enn de aminosyremengder som er nødvendig for å

oppnå oppfinnelsens formål.

Av kliniske grunner vil man i alminnelighet ha betenke-ligheter ved intravenøst å anvende en plasminoppløsning som inneholder en slik mengde aminosyre at en del av denne fore-

ligger uoppløst i suspensjon i plasminoppløsningen. Ren praktisk vil aminosyrens oppløselighet derfor kunne betraktes som vei-ledende for den maksimale aminosyremengde, som bør anvendes ved intravenøs injeksjon, herunder infusjon. Oppløseligheten av de forskjellige aminosyrer fremgår av litteraturen, og er i de fleste tilfeller så stor at den tilstrebte stabilisering kan oppnåes uten at det er nødvendig å gå til anvendelse av konsentrerte aminosyreoppløsninger.

Hvis plasminoppløsningen er bestemt for infusjon, er

den optimale aminosyrekonsentrasjon den konsentrasjon som gir den ønskede stabilitet ved infusjonstemperaturen (10 til 36°C)

i infusjonstidsrommet (opptil 3-4 timer). Tallmessig vil det være hensiktsmessig å benytte en aminosyrekonsentrasjon av

0,005 til 1 millimol pr. plasminenhet, avhengig av den anvendte aminosyre.

Ved de i det foregående omtalte undersøkelser, er det benyttet plasminoppløsninger med et plasmininnhold av 0,3 og 0,4 enheter pr. ml. Ved anvendelsen av mere konsentrerte oppløsninger, f.eks. inneholdende 10 plasminenheter pr. ml., vil det fremkomme et merkbart initialtap av plasmin umiddelbart ved pH-verdiens forskyvning fra 2-3 opp til nøytral reaksjon,

medmindre aminosyrer er tilstede i tilstrekkelige mengder.

Således vil det f.eks. i løpet av få minutter kunne oppstå

initialtap på 20% når en sur plasminoppløsning•som inneholder -

10 plasminenheter pr. ml innstilles på pH 7,5 ved 25°C, selv om det i oppløsningen er lysin tilstede i en mengde av 0,002

millimol pr. plasminenhet. Et slikt initialtap kan imidlertid unngåes ved økning av aminosyrekonsentrasjonen. Med et lysin-innhold på 0,04 millimol pr. plasminenhet vil det under de ovenfor nevnte forsøksbetingelser helt kunne unngåes initialtap.

Til disse forhold bør det taes hensyn ved fremstillingen av konsentrerte plasminoppløsninger med nøytral reaksjon.

For å oppnå den ifølge oppfinnelsen tilstrebte stabilisering kan man gå frem på flere måter.

Man kan således fremstille en plasminoppløsning, som sterilfiltreres, hvorefter plasminet isoleres fra oppløsningen, f.eks. ved frysetørking, utsalting eller felling, og fylles på ampuller, hvis dette ikke allerede er gjort under isoleringen.

Det fremstilles også en aminosyreoppløsning, som sterilfiltreres

og fylles på ampuller. Umiddelbart før anvendelsen av plasminet oppløses plasminet fra ampullen i aminosyreoppløsningen, hvorved det fremkommer en steril og stabil plasminoppløsning,

ferdig til bruk.

Man kan også fremstille en sterilfiltrert plasmin-oppløsning som inneholder en eller flere aminosyrer, og bringe blandingen i tørr form f.eks. ved frysetørking eller utfelling, og fylle den tørre blanding på ampuller. Umiddelbart før anvendelsen av plasminet oppløses den tørre blanding i sterilt vann, bufferoppløsning eller lignende, hvorved det fremkommer et stabilisert plasminpreparat.

Videre kan man fremstille en steril plasminoppløsning

som innstilles på pH 1-4. En slik sur oppløsning er stabil i flere måneder, såfremt den oppbevares ved 4 - 5°C. Ved sammenblanding før bruken med en steril aminosyreoppløsning, som enten er bufrert med et av de normale syre-base-buffer-systemer, eller har et tilstrekkelig aminosyreinnhold, kan man komme frem til en nøytral stabil plasminoppløsning.

Endelig kan man fremstille en steril plasminoppløsning som inneholder den nødvendige mengde aminosyre, og som er inn-stillet på en pH-verdi på 1 - 5, fortrinnsvis 2-3. Ved sammenblanding av denne med en steril vandig oppløsning, som enten er bufrert med et av de normale syre-base-buffer-systemer, eller bare inneholder tilstrekkelig base, kan man komme frem til en nøytral og stabil plasminoppløsning.

Til ytterligere belysning av den praktiske realisering av oppfinnelsen tjener følgende eksempler, som viser fremstillingen av stabiliserende plasminoppløsninger, som fortrinnsvis er egnet til infusjon.

EKSEMPEL 1

50 ml av en plasminoppløsning, som har en pH-verdi

på 2,5 og inneholder 10 plasminenheter pr. ml., sterilfiltreres, frysetørkes og fylles på hetteglass. 50 ml 0,2 molær fosfatbuffer, som inneholder lysin i en konsentrasjon av 0,4 mol pr. liter, sterilfiltreres og fylles likeledes på hetteglass. Umiddelbart før bruken av plasminet oppløses det frysetørkede plasmin i lysinoppløsningen, hvorved det fremkommer et sterilt, stabilisert plasminpreparat med pH 7,5.

EKSEMPEL 2

50 ml av en plasminoppløsning, som har en pH-verdi

på 7,5 og inneholder 10 plasminenheter pr. ml. og 0,1 mol £-aminokapronsyre pr. liter, sterilfiltreres, frystetørkes og fylles på hetteglass. Umiddelbart før plasminets anvendelse, oppløses det fryse-tørkede preparat i 50 ml destillert vann, hvorved det fremkommer et sterilt stabilisert plasminpreparat med pH 7,5.

EKSEMPEL 3

45 ml av en plasminoppløsning, som har en pH-verdi på 2,5, og inneholder 20 plasminenheter pr. ml, sterilfiltreres og fylles på hetteglass. 10 ml 1 molær fosfatbuffer (pH 7,5)

som inneholder lysin i en konsentrasjon av 1 mol pr. liter, sterilfiltreres og fylles likeledes på hetteglass. Umiddelbart før plasminoppløsningens anvendelse, tilsettes det 5 ml av lysinoppløsningen, hvorved det fremkommer et sterilt stabilisert plasminpreparat med en pH-verdi på 7,5.

EKSEMPEL 4

45 ml av en plasminoppløsning, som har en pH-verdi

på 3,0 og inneholder 6 plasminenheter pr. ml, samt 948 mg L-argininhydroklorid, sterilfiltreres og fylles på hetteglass.

10 ml 1 molar fosfatbuffer sterilfiltreres og fylles likeledes på hetteglass. Umiddelbart før anvendelsen av plasminopp-

løsningen tilsettes det 5 ml av fosfatbufferen, hvorved det fremkommer et sterilt stabilisert plasminpreparat med pH 7,0.

EKSEMPEL 5

En oppløsning av plasmin i fortynnet svovelsyre med

pH 2-3 sterilfiltreres og frysetørkes. En oppløsning av L-lysin-monohydroklorid i fosfatbuffer sterilfiltreres og fryse-

tørkes. De frysetørkede stoffer sammenblandes i slike mengdeforhold at blandingen inneholder 0,04 millimol lysin pr. plasminenhet. En mengde av den fremkomne blanding svarende til 500 plasminenheter overføres sterilt til en infusjonsflaske med et volum på 500 ml, og flasken lukkes lufttett efter delvis evakuering. Umiddelbart før anvendelsen tilføres det flasken et injiserbart oppløsningsmiddel i passende mengde, f.eks. sterilt destillert vann, en steril glukoseoppløsning, eller sterilt saltvann, hvilket lettes på grunn av det delvis vakuum i flasken. Oppløsningens pH-verdi kommer til å ligge mellom 7,0 og 7,5.

Virkningen av de ifølge oppfinnelsen stabiliserte plasminoppløsninger, som er fremstilt ut fra svineblod, er blitt undersøkt med fortrinnlige resultater, både i dyreforsøk og klinisk. Ved de kliniske undersøkelser har anvendelsen av plasminet ikke vist noen antigen virkning. Som følge av sta-biliseringen inneholder de anvendte plasminoppløsninger mindre mengder av plasmin som er dekomponert ved autolyse, og som kan

gi anledning til toksiske bivirkninger.

I ovenstående eksempler kommer man frem til oppløsninger som inneholder fra 1 til 18 plasminenheter pr. ml. Det er imidlertid intet iveien for å fremstille mere eller mindre konsentrerte oppløsninger, f.eks. ned til 0,02 plasminenheter og opp til 100 plasminenheter pr. ml eller mere.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte til stabilisering av terapeutisk anvendelige plasminoppløsninger, karakterisert ved at det til en plasminoppløsning settes én eller flere sulfhydryl- eller disulfid-frie, alifatiske aminomonokarboksylsyrer med mer enn 3 karbonatomer og en endestillet aminogruppe.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at aminosyren tilsettes i en mengde på minst 0,005 millimol pr. plasminenhet, fortrinnsvis 0,05 til 1 millimol pr. plasminenhet.

3. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 og 2, karakterisert ved at det tilsettes f-aminokapronsyre eller a,£-diaminokapronsyre.