JP4751993B2 - シンカリド製剤 - Google Patents

Description

本発明は、製薬業で容認可能なシンカリド製剤に関する。

ＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）（米国薬局方；注射用シンカリド）は、非経口投与用の胆嚢膵臓、および消化管のホルモンペプチドである。この有効薬用成分である１−デ（５−オキソ−Ｌ−グルタミン−５−Ｌ−プロリン）−２−デ−Ｌ−メチオニンセルレイン、すなわち「シンカリド（ｓｉｎｃａｌｉｄｅ）」（ＣＡＳ番号２５１２６−３２−３）は合成的に調製されたコレシストキニンのＣ末端オクタペプチド（ＣＣＫ−８）で、アミノ酸配列は以下のとおりである。：Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ₃Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂
ＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）は１９７６年に初めて導入され、完成品は、５ｍＬ（公称）ガラスバイアル入りの滅菌済み非発熱性の凍結乾燥白粉で、張度を与えるために４５ｍｇ塩化ナトリウムを加えた、５μｇのシンカリドを含有し、さらに、ｐＨ調整用（ｐＨ５．５〜６．５）に、水酸化ナトリウムあるいは塩酸が加えられることもある。このＩ型ガラスバイアルを、ヘッドスペースに窒素を充填して、トンプキンスＢ０８４９栓（ＴｏｍｐｋｉｎｓＢ０８４９ Ｃｌｏｓｕｒｅ）で密封される。この二成分製剤は、米国薬局方国民医薬品集、ＵＳＰ２４、ＮＦ１９、２０００年１月１日に記載されている。

ＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）の導入以来、その製造および分析上の様々な問題が確認されている。例えば、この二成分製剤には効能が変動するという問題がある。シンカリドおよびＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）の両者の効能は、モルモット胆嚢収縮バイオアッセイを用いて分析されるので、この変動性はさらに悪化する。このバイオアッセイでは、シンカリドの生物活性と劣化したシンカリドの生物活性との間の差を見分けることができない。従って、このバイオアッセイの限界を補償するため、従前のシンカリド製剤では、シンカリドの２０％増しの量が必要とされた。このため、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のようなシンカリド特有のアッセイによって達成されるような、改良され、一貫した効能を有するシンカリド製剤が求められている。
米国薬局方国民医薬品集、ＵＳＰ２４、ＮＦ１９、２０００年１月１日

本発明は、シンカリドを２０％増量する必要のない製剤を提供することによって、改良されたシンカリド製剤に対する要求を満たすものである。本発明のシンカリド製剤は、従来技術による製剤に比べ純度は高く、劣化量は少なく、効能はより安定している。さらに、この製剤の純度は、ＨＰＬＣによって評価できるため、従来技術による製剤で必要とされていたバイオアッセイの必要性は無くなる。

本発明は、注射による投与用のシンカリド製剤を提供する。これらのシンカリド製剤は、安定性が改善されていることを特徴とし、比較的容量の大きなバッチ（約１００Ｌ）で調製できる。

一つの態様において、本発明は、有効量のシンカリド、充てん剤／等張化剤、一つあるいは複数の安定剤、界面活性剤、キレート剤、および緩衝剤を含むシンカリド製剤であることを特徴とする。また、本発明は、胆嚢関連疾患の治療、予防および診断のための方法、並びに、改良シンカリド製剤を調製するためのキットおよび方法にも特徴を有する。

本発明の製剤のｐＨは６．０〜８．０の間であることが好ましい。好適な緩衝剤として、リン酸、クエン酸、スルホサリチル酸、ホウ酸、酢酸、およびアミノ酸緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されることはない。リン酸水素二カリウムなどのリン酸緩衝剤が好ましい。

本発明の各実施形態において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、好ましくは、ポリソルベート２０あるいはポリソルベート８０といったポリソルベート；キレート剤はペンテト酸（ＤＴＰＡ）；安定剤は抗酸化剤および／またはアミノ酸である。本発明の特に望ましい実施形態において、製剤は、複数の安定剤、好ましくは、Ｌ−アルギニンモノヒドロクロライド、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リジンモノヒドロクロライド、およびメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。

好適な充てん剤／等張化剤として、マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム、マルトース、スクロース、ＰＥＧ類、シクロデキストリン、デキストラン、ポリスクロース（フィコール）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が挙げられるが、これらに限定されることはない。Ｄ−マンニトールは、好ましい充てん剤／等張化剤である。

特に好ましい実施形態において、再構成された製剤は、０．０００８〜０．００１２ｍｇ／ｍＬの有効成分（すなわち、シンカリド）；２０．０〜５０．０ｍｇ／ｍＬのマンニトール；２．０〜７．０ｍｇ／ｍＬのアルギニン；０．２〜１．０ｍｇ／ｍＬのメチオニン；２．０〜３０．０ｍｇ／ｍＬのリジン；０．００２〜０．０１２ｍｇ／ｍＬのメタ重亜硫酸ナトリウム；０．０００００１〜０．００３ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０；０．１〜３．０ｍｇ／ｍＬのペンテト酸 （ＤＴＰＡ）；および５．４〜１２．０ｍｇ／ｍＬのリン酸水素二カリウムを含む。さらに好ましい実施形態において、再構成された製剤は、約０．００１ｍｇ／ｍＬのシンカリド；約３４ｍｇ／ｍＬのＤ−マンニトール；約６ｍｇ／ｍＬのＬ−アルギニンモノヒドロクロライド；約０．８ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン；約３ｍｇ／ｍＬのＬ−リジンモノヒドロクロライド；約０．００８ｍｇ／ｍＬのメタ重亜硫酸ナトリウム；約０．０１ｍｇ／ｍＬ未満のポリソルベート２０；約０．４ｍｇ／ｍＬのペンテト酸（ＤＴＰＡ）；および約１．８ｍｇ／ｍＬのリン酸水素二カリウムを含む。

本発明のキットは、例えば、粉末形状にした製剤の各種構成成分混合物とその混合粉末を収容するための容器（例えば、バイアル）および、生理学的に許容される製剤再構成用の液体を含む。製剤の構成成分は、混合粉末あるいは流体の形状でキット内に含めることができる。本発明のキット内には、全部の構成成分を混合液中に含めることもできるし、あるいは一部は混合液中に、一部は粉末形状にして含めることもできる。

本発明の製剤は、従来のシンカリド製剤に比べて安定性および効能において改善がなされており、患者の肝胆道系を撮像するための診断補助剤として有用である。補助剤として使用する場合、シンカリド製剤は、例えば、^99ｍＴｃ−メブロフェニンのような急速な肝臓摂取性の放射性薬剤や、胆嚢疾患および関連障害の診断を補助する類似の肝胆道造影剤と併用投与しても良い。加えて、この製剤は、画像診断（例えば、磁気共鳴画像診断、シンチグラフィ画像診断、超音波画像診断等）の前後に投与できる。

本発明のシンカリド製剤は、完全非経口栄養法（ＴＰＮ）を受けている患者に対し、ＴＰＮ関連疾患の治療および／または予防のためにも投与できる。

本発明の他の特徴および効果は、後述する詳細な説明によって明らかにされる。

改良シンカリド製剤の開発を目的とし、シンカリド製剤の各種賦形剤の効果を測定するために、以下の実施例に記載する一連の実験を実施した。これらの実験を通し、一定の望ましい機能を備える賦形剤を周到に選択することによって、シンカリド製剤の効能と安定性を著しく高めることができることを発見した。従って、本発明は、従来の製剤よりも安定性および／または効能を改良した新規のシンカリド製剤を提供する。

ここで使用される「シンカリド」という用語は、合成的に調製されたコレシストキニンのＣ末端オクタペプチド（ＣＣＫ−８）で、Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ₃Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂ というアミノ酸配列を有するもの、および、（安定性、効能、薬物動態性等を改良するために）最適化あるいは修飾したその誘導体であって、オリジナルのオクタペプチドの生物活性を保持しているものを含む。例えば、生物活性に著しく影響を与えずに、メチオニンおよび／またはアスパラギン酸残基が置換されたペプチドは、ここで使用される「シンカリド」に含まれる。同様に、「シンカリド」という用語は、モノマーのみではなく、ペプチドの多量体、さらには、生理学的に活性な、ペプチド分解物やペプチドの一部、およびその誘導体も含む。

本発明のシンカリド製剤は、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、充てん剤／等張化剤、キレート剤、錯化剤、架橋剤、共溶媒、浸透圧調整剤、可溶化剤、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調整剤、抗溶解剤／抗凍結剤、気液および／または固液界面保護剤（表面誘起変性に対する保護剤）、凍結融解保護剤、抗タンパク／ペプチド変性剤、再水和に対する保護剤、および湿潤剤、といった各種の賦形剤を含めることができる。好ましい実施形態において、当該製剤は、少なくとも（ｉ）充てん剤／等張化剤、（ｉｉ）安定剤、（ｉｉｉ）界面活性剤、（ｉｖ）キレート剤、（ｖ）緩衝剤としての機能を果たす賦形剤を含む。一般的に、これらの各機能はそれぞれ異なる賦形剤によって果たされる。しかし、本発明の実施形態のいくつかにおいては、一つの賦形剤が複数の機能を果たすこともある。例えば、一つの賦形剤が多機能性であっても良く、例えば、アミノ酸が充てん剤、安定剤および／または緩衝剤として機能し、他の賦形剤が例えば、安定剤およびキレート剤を兼ね備えて、あるいは充てん剤および等張化剤を兼ね備えて機能することも可能である。あるいは、同じ機能を果たす複数の賦形剤を使用しても良い。例えば、この製剤は安定剤として機能する複数の賦形剤を含むことができる。

以下の表１は、調査した各種賦形剤の濃度範囲を示す。全般的に、この範囲に関する実験は、凍結乾燥前のバイアル当たり２ｍＬのバルク充填溶液に基づいて行った。注射用に５ｍＬの水を加えて再構成により、最終的なシンカリド製剤は等張液になる。必要に応じて、表１によるこの各種成分の濃度範囲は、最終的な再構成溶液のバイアル当たりの充填容積を増減したり、所望のｐＨ値、再構成容量、および張度を得ることによって、上下調整可能である。例えば、上述したように、表１に示す濃度は等張液にするために展開したものであるが、等張液が不必要な場合には、より広い濃度範囲について使用できることを当業者は認識しうる。

表２は、再構成後のバイアル内バルク溶液の好適な賦形剤の好適範囲を示している。表中のバルク溶液の全濃度は、２ｍＬの充填容量を基本に測定された。ｐＨが中性よりやや低くなり、凍結乾燥バイアルの再構成後の等張液が１８０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３２０ｍＯｓｍの範囲の浸透圧となるように、成分量は調節される。「最終製剤」と示された欄については、特に好ましい製剤となる。

キレート剤
製薬業で製造される製剤には、賦形剤不純物および／または栓からの溶性物のために、微量金属が混入することがある。シンカリドは、遊離金属により酸化されやすい二種のメチオニン残基（Ｍｅｔ３およびＭｅｔ６）を含む。従って、本発明のシンカリド製剤は、シンカリド中に存在する二種のメチオニン残基（Ｍｅｔ３およびＭｅｔ６）の酸化を阻害するためのキレート剤を含む。好ましいキレート剤として、ペンテト酸（ＤＴＰＡ）とエデト酸（ＥＤＴＡ）、およびその塩を含む誘導体などが挙げられる。ＤＴＰＡは好ましいキレート剤である。下記の実施例２で説明するように、劣化量、つまりシンカリドＭｅｔ３およびシンカリドＭｅｔ６モノスルホキシドの量は、一定の金属の存在下およびＤＴＰＡの非存在下において増加するが、一方、ＤＴＰＡの存在は、これらのモノスルホキシドの形成に対する阻害効果を有する。ＤＴＰＡの非存在下では、特に、銅やマンガンが、シンカリドのメチオニン残基に対し最も強い酸化効果を示し、その結果、Ｍｅｔ３およびＭｅｔ６モノスルホキシドの結合（対シンカリド）が、それぞれ８５．５％および１２８．９％という高い割合で生ずる。

好ましい実施形態において、再構成後のシンカリド製剤は１ｍＬ当たり０．１〜３．０ｍｇのＤＴＰＡを含む。特に好ましい実施形態において、本発明のシンカリド製剤は５ｍＬに再構成後、０．４ｍｇＤＴＰＡ／ｍＬを含有する。

緩衝剤
本発明のシンカリド製剤のｐＨを安定させ、ひいては極度のｐＨ値において化学的に不安定になる可能性を減少させるために、緩衝剤を採用する。本発明の製剤キットの調製において有用な緩衝剤として、これらに限定はされないが、リン酸、リン酸塩（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等）、クエン酸、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム等）、スルホサリチル酸、酢酸、酢酸塩（例えば、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム等）、ボロン酸メチル、ボロン酸塩、コハク酸二ナトリウム六水和物、アミノ酸塩（ヒスチジン、グリシン、リジン、イミダゾ−ル等）を含むアミノ酸、乳酸、乳酸塩（例えば、乳酸ナトリウム等）、マレイン酸、マレイン酸塩、塩化カリウム、安息香酸、安息香酸ナトリウム、炭酸、炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム等）、重炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム等）、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、塩化ナトリウム、コハク酸、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、酒石酸、酒石酸塩（例えば、酒石酸ナトリウム等）、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、生物学的緩衝剤（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン、Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＣＨＡＰＳおよびその他の「適切な緩衝液」）が挙げられる。

リン酸塩は、シンカリドとの相互作用がなく、生理学的なｐＨ範囲内で理想的な緩衝能を示すので、好ましい緩衝剤である。リン酸水素二カリウムは、本発明のシンカリド製剤において、特に好ましい緩衝剤である。下記の実施例１で説明するように、本発明のシンカリド製剤は、５．５〜９．１のｐＨ範囲内で安定していることが証明されている。５．５〜８．５のｐＨ範囲内では、本発明のシンカリド製剤の初期シンカリド回収率に、目立ったｐＨ依存性関連の傾向は見られなかった。本発明のシンカリド製剤のｐＨは６．０〜８．０であるのが好ましい。

安定剤
このオクタペプチド、すなわちシンカリドは、一つのトリプトファンと二つのメチオニン残基を含む。メチオニンは、最も容易に酸化されるアミノ酸の一つとして確認されており、相当するスルホキシド、さらに強い酸化条件下ではスルホンに劣化する。過酸化物基、ペルオキシルラジカル、一重項酸素、ヒドロキシルラジカルが、メチオニン残基をスルホキシドやその他の物質等に酸化することを考慮すると、この酸化メカニズムは活性酸素種にかなり依存していると考えられる。このため、このペプチドの酸化可能性に基づき、ペプチド安定化のための機能的な添加剤を同定する必要がある。

抗酸化剤／還元剤。本発明の好ましい実施形態において、シンカリド製剤は抗酸化剤あるいは還元剤を安定剤として含む。安定剤として、多様な抗酸化剤あるいは還元剤が使用でき、例えば、アセチルシステイン、システイン、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、クエン酸、ペンテト酸あるいはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、没食子酸プロピル、メチルパラベン、スルホキシル酸塩、プロピルパラベン、エデト酸あるいはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジナトリウムＥＤＴＡ二水和物、ジチオスレイトール、グルタチオン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、塩化第一スズ、チオ酢酸、チオジグリセロール、チオエタノールアミン、チオグリコール酸、２−アミノエタンチオール（システアミン）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＴ）、硫酸ナトリウム、およびその塩と亜硫酸塩を含む誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。メタ重亜硫酸ナトリウムは、好ましい抗酸化安定剤である。加えて、好ましいキレート剤であるＤＴＰＡも、抗酸化安定剤である。

アミノ酸。アミノ酸も、凍結乾燥中における凍結防止剤として作用し、熱変性に対し安定化し、凝集体形成を阻害し、可溶性あるいは再水和作用を向上し、異性化を阻害し、表面吸着を減少させ、またはキレート剤として作用する、ペプチドの安定剤あるいは共同安定剤として使用される。また、これらは製品のガラス転移温度（Ｔ_ｇ）も高めるので、二次乾燥中の過乾燥を最小限に抑えることによって、製品を安定化させ、さらに、製造安定性も向上させる。表面露出残基は、生理学的ｐＨにおいて酸化剤と容易に反応できるので、酸化分子を除去し、ペプチドの臨界領域を保護する。

各種Ｄ−および／またはＬ−アミノ酸が、シンカリド製剤の安定剤として使用できる。ここで使用される「アミノ酸」および特異アミノ酸と名付けられたもの（例えば、アルギニン、リジン、メチオニン等）には、Ｄ−および／またはＬ−アミノ酸、アミノ酸塩、誘導体、同族体、二量体、オリゴマー、またはその混合物が含められる。本発明において、安定剤として使用するのに好ましいアミノ酸としては、メチオニン、リジン、アルギニンが挙げられる。安定剤として好適な他のアミノ酸（およびアミノ酸塩）として、グルタミン酸アルギニン、アスパラギン、ガンマアミノ酪酸、グリシン（およびグリシン緩衝剤）、グルタミン酸、グルタミン酸塩、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン（およびヒスチジン緩衝剤）、グルタミン酸リジン、アスパラギン酸リジン、アスパラギン酸アルギニン、イミダゾール、セリン、スレオニン、アラニン、ポリグルタミン酸、ポリリジン、グリシルグリシン、および、そのヒドロキシプロピルやガラクトース誘導体等が例示できるが、これらに限定されることはない。特に好ましい実施形態の一つでは、Ｌ−アルギニンモノヒドロクロライド、Ｌ−メチオニンおよびＬ−リジンモノヒドロクロライドが使用される。

抗凍結剤／抗溶解剤
本発明では、各種の抗凍結剤／抗溶解剤を使用できる。好適な抗凍結剤は、凝固点を減少させ、および／またはガラス相に達するのに必要な冷却率を減少させるような水分子構造を有する。また、これらは、ガラス状態のガラス転移温度範囲も上げる。これらの抗凍結剤／抗溶解剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、デキストラン、スクロース、１，２−プロパンジオール、グリシン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、プロリン等のアミノ酸／およびその塩、グリセロール、ソルビトール、塩化ナトリウム、フルクトース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、プロピレングリコール、２，３−ブタンジオール、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ＰＥＧおよび同様の化合物、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、ゼラチン（あるいはＰｒｉｏｎｅｘ等の誘導体）等のタンパク安定剤、デキストロース、グルコース、マルトース、アラビノース、ラクトース、イノシトール、ポリオール（ソルビトール、キシリトール、エリトリトール、グリセロール、エチレングリコール等）、テトラメチルグルコース、硫酸ナトリウム、シクロデキストリン、およびそれらの混合物が挙げられる、これらに限定されることはない。リジンおよびアルギニンは、好ましい抗凍結剤／抗溶解剤である。

界面活性剤／可溶化剤／表面活性剤
ペプチドは、変性、凝集、沈殿、容器表面吸着、および／または撹拌により誘発された変性などにより物理的に劣化しやすい。ポリソルベートのような非イオン性界面活性剤を組成に加えることにより、界面張力を減少あるいは可溶化を補助するので、溶液中の製品の気液あるいは固液界面における変性や劣化を予防または減少を図れる。

界面活性剤／可溶化剤として、遊離脂肪酸；ポリオキシプロピレングリコールおよびポリオキシエチレングリコールのようなポリオキシアルキレン化合物が結合した脂肪酸のエステル；ポリオキシアルキレングリコールが結合した脂肪族アルコールのエーテル；ポリオキシアルキル化されたソルビタンが結合した脂肪酸のエステル；石ケン類；グリセロール−ポリアルキレン・ステアレート； グリセロール−ポリオキシエチレン・リシノリエート；ポリアルキレングリコールのホモポリマーおよびコポリマー；ポリエトキシル化された大豆油、ヒマシ油およびその硬化誘導体；脂肪酸、脂肪族アルコールが結合したスクロースその他の糖質のエーテルおよびエステル、あるいはそれらを任意にポリオキシアルキル化したもの；飽和または不飽和脂肪酸のモノ、ジ、トリグリセリド；グリセリド、または大豆油とスクロース；カプロン酸ナトリウム；硫酸アンモニウム；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；トリトン−１００；アルキル、アリールまたは複素環構造を含む陰イオン界面活性剤といった化合物が挙げられる。

本発明の使用に好適な界面活性剤／可溶化剤として、プルロニック類（例えば、ＬｕｔｒｏｌＦ６８やＬｕｔｒｏｌＦ１２７）、ポロキサマー、ＳＤＳ、トリトン−１００、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０やＴＷＥＥＮ（登録商標）８０のようなポリソルベート、プロピレングリコール、ＰＥＧや同様の化合物、ブリッジ（Ｂｒｉｊ）５８（ポリオキシエチレン２０セチルエーテル）、クレモホール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬ、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ＮＰ−４０（ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（Ｐｈａｒｍａｓｏｌｖｅ）、グリシンや他のアミノ酸／アミノ酸塩、アルキル、アリールあるいは複素環構造を含む陰イオン界面活性剤、およびシクロデキストリン等が例示できるが、これらに限定されることはない。ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０は、本発明の製剤において最も好ましい界面活性剤である。

充てん剤／等張化剤
本発明の製剤には、少量のシンカリドしか含まれないため、構造を与え、有効成分であるシンカリドを支持し、さらには等張化するために、充てん剤／等張化剤が有用である。本発明の凍結乾燥製品の調製において有用な充てん剤／等張化剤（凍結乾燥補助剤とも言う）は、当技術分野において公知であり、マンニトール、ラクトース、塩化カリウム、塩化ナトリウム、マルトース、スクロース、ＰＥＧ類（例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００等）、トレハロース、ラフィノース、デキストロース、ポリガラクツロン酸、ガラクツロン酸、例えば、リジン、アルギニン、グリシン、ガラクトース等のアミノ酸類（アミノ酸塩を含む）、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（ＨＰ−γ−ＣＤ）といったシクロデキストリン、デキストラン、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）があげられる。中でも、Ｄ−マンニトールは、本発明での使用に最も好ましい充てん剤／等張化剤である。

他の賦形剤
本発明の製剤において任意に使用できる他の賦形剤としては、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム）、浸透圧調節剤（例えば、デキストロース）、抗溶解剤（例えば、硫酸ナトリウム）、可溶化剤、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム）、ケーキ形成剤、錯化剤、および溶解補助剤があげられる。非経口投与用のシンカリド製剤に使用される各種の賦形剤の一覧は、例えば、以下の文献に記載されている。“The Handbook of Pharmaceutical Additives”第２版、Michael & Irene Ash編；Easton, Pa.およびPollock等、“Remington's Pharmaceutical Sciences”,(第１８版) 1990、A. Gennaro編、Mack Publishing Company；Strickly, Robert G.、“Parenteral Formulations of Small Molecules Therapeutics Marketed in the United States (1999)-Part I”PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 53(6):324 (1999)；Strickly, Robert G.、“Parenteral Formulations of Small Molecules Therapeutics Marketed in the United States (1999)-Part II”PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 54(1):69 (2000)；“Parenteral Formulations of Small Molecules Therapeutics Marketed in the United States (1999)-Part III”PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 54(2):154 (2000)；Nema, Sandeep等、“Excipients and Their Use in Injectable Products”PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 51(4):166 (1997)；Wang, Y. J.等、“Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers (Technical Report No. 10)”Journal of Parenteral Science and Technology, Vol.42 (2S), Supplement 1988；Carpenter, J.等、“Freezing- and Drying-Induced Perturbations of Protein Structure and Mechanisms of Protein Protection by Stabilizing Additives”Louis Rey および Joan C. May編、Drugs and The Pharmaceutical Sciences、Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y. (1999)；Michael J. Pikal、“Mechanisms of Protein Stabilization During Freeze-Drying and Storage: The Relative Importance of Thermodynamic Stabilization and Glassy State Relaxation Dynamics”Louis Rey および Joan C. May編、Drugs and The Pharmaceutical Sciences、Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y. (1999) ；Shah, D.等、“The Effects of Various Excipients on the Unfolding of Basic Fibroblast Growth Factor”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology, 52(5):238 (1998)；Powell, M. F.等、“Compendium of Excipients for Parenteral Formulations”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology, 52(5):238 (1998)；“Inactive Ingredient Guide”Div. Of Drug Information Resources, FDA, CDER, January 1996；L. A. Trissel、“Handbook of Injectable Drugs”第８版、Am. Soc. Hospital Pharmacists, 1994。

製剤キット
本発明のキットは、所定量のシンカリド、凍結乾燥補助剤または充てん剤／等張化剤、一つまたは複数の安定剤、界面活性剤、キレート剤、および緩衝剤からなる滅菌製剤を含む、一つあるいは複数のバイアルからなることが好ましい。この製剤組成の全てあるいは一部を含む、一つあるいは複数のバイアルは、独立して滅菌液あるいは凍結乾燥した固体の形状をとることができる。本発明の製剤キットの調製において有用な緩衝剤として、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、スルホサリチル酸塩、酢酸塩、およびアミノ酸（アミノ酸塩を含む）を含む。リン酸水素二カリウムは、本発明のシンカリド製剤において好ましい緩衝剤である。このキットは、注射前に製剤を再構成するための、例えば、水や食塩水のような流体を含んでもよい。

凍結乾燥キットの調製に有用な凍結乾燥補助剤あるいは充てん剤／等張化剤は上述の通りであるが、マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム、マルトース、スクロース、ＰＥＧ、ガラクツロン酸、ポリガラクツロン酸、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（ＨＰ−γ−ＣＤ）等のシクロデキストリン、 デキストラン、アミノ酸（アミノ酸塩を含む）、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）があげられる。中でも、マンニトール、塩化ナトリウム、マルトース、スクロース、ＰＥＧ類、ＨＰ−γ−ＣＤ、およびデキストランが、本発明で使用するのに好ましい充てん剤／等張化剤であり、最も好ましいのはマンニトールである。

上述したように、製剤キットの一つの構成成分は、複数の機能を示しても良い。例えば、安定剤として機能する一つの賦形剤は、キレート剤としての機能を兼ね備えても良く、充てん剤として機能する一つの賦形剤は、等張化剤としての機能を兼ね備えても良い。加えて、各実施形態により、賦形剤が全て乾燥粉末形状あるいは全て液状である場合もあれば、賦形剤の一部が乾燥粉末形状で残りはキット内に含まれる流体、あるいはキットとは別の固体である場合もある。

本発明の特に好ましいキットは以下のものを含有する；約０．００５ｍｇのシンカリド、約１７０ｍｇのＤ−マンニトール、０．０１ｍｇ以下のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、約２ｍｇのＤＴＰＡ、約０．０４ｍｇのメタ重亜硫酸ナトリウム、約９ｍｇのリン酸水素二カリウム、約４ｍｇのＬ−メチオニン、約１５ｍｇのＬ−リジンモノヒドロクロライド、および約３０ｍｇのＬ−アルギニンモノヒドロクロライド。

治療／診断への利用
シンカリドは、生体内部生産性のホルモンコレシストキニン（ＣＣＫ−８）の合成類似体である。ＣＣＫ−８は、胆嚢壁中のレセプターに作用し、収縮させ、胆嚢内に蓄積する可能性のある残留胆泥や胆汁を除去する。ＣＣＫ−８は、胆汁の流動を促進し、大小腸の運動能を向上させるので、幽門括約筋を収縮させ、膵酵素の分泌作用も高める。また、ＣＣＫ−８は、胆汁の腸への移動を遅らせる働きもある。シンカリドは、胆嚢の収縮および弛緩という観点から考えると、人体で生成される内因性ホルモン（ＣＣＫ−８）よりも迅速な生理学的効果があるので、シンカリド製剤は、単独投与であっても、他の肝胆道造影剤との併用投与であっても、肝胆道撮像用の診断補助剤として有用である。シンカリドは、例えば、各種病状の視覚化および／または診断能を改善する目的で、画像診断（例えば、磁気共鳴画像診断、シンチグラム造影診断、超音波画像診断等）の前後に投与できる。

一つの実施形態において、肝胆道撮像は、例えば、肝胆道シンチグラフィや、肝胆系疾患の診断および評価で使われる画像診断器具を利用して実施することができる。急性および慢性の胆嚢炎、胆道閉塞、胆汁漏れや他の肝胆系疾患といった疾患が検出できると、医師は肝胆系異常の疑いのある患者に対する治療および管理についてより適切な決定をなすことができる。

後述するように、肝胆道撮像にシンカリドを使用すると、（ａ）（胆嚢（ＧＢ）内の非放射標識（ラジオラベルされていない）胆汁を空にするため）撮像の２０〜２４時間以上前から絶食した患者の前処置、および、（ｂ）ＧＢＥＦ（ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ、胆嚢駆出分画率）の測定などの胆嚢運動機能解析に利用できるといった効果がある。

画像の質を高め、偽陽性および偽陰性の結果数を減らすために、肝胆道撮像の前に患者に対して適切な処置を施すことが重要である。患者は、肝胆道撮像の４〜１２時間前から絶食するのが好ましい。しかし、絶食時間が長過ぎると偽陽性というテスト結果になってしまうことがある（すなわち、胆嚢の視覚化の失敗）。患者が２４時間以上絶食した場合、撮像の前に、前述のシンカリド製剤を投与して、患者に対してシンカリド前処置を行うことが好ましい。通常、シンカリド注射後１５分以内に胆嚢は収縮し、その３０分後に肝胆道造影剤（例えば、放射性トレーサー）を注射する。その後、胆嚢が空となり、造影剤（例えば、放射性トレーサー）を取り込み蓄積できるようにする。これにより、偽陽性の結果数を減らすことができる。

肝胆道撮像の使用に好ましい放射性薬剤として、Ｔｃ−９９ｍメブロフェニンＣＨＯＬＥＴＥＣ（登録商標）、Ｔｃ−９９ｍジソフェニン（ＤＩＳＩＤＡ）、およびＴｃ−９９ｍリドフェニン（米国特許第４４１８２０８号明細書も参照）のような、Ｔｃ−９９ｍＩＤＡ（イミノ二酢酸）類似体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔｃ−９９ｍメブロフェニンは、好ましい肝胆道造影剤である。Ｔｃ−９９ｍＩＤＡ（イミノ二酢酸）類似体と、ＣＣＫおよびシンカリドを併用投与する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、以下の文献に記載されている。Ziessman H A.、“Cholecystokinin cholescintigraphy: victim of its own success?”J. Nucl. Med. 1999, 40:2038-2042；Krishnamurthy S.等、“Gallbladder ejection fraction: A decade of progress and future promise”J. Nucl. Med. 1992, 32:542-544；Krishnamurthy G T.等、“Quantitative biliary dynamics: introduction of a new noninvasive scintigraphic technique.”J. Nucl. Med. 1983;24:217-223；Mesgarzadeh M.等、“Filling, post-cholecystokinin emptying and refilling of normal gallbladder: effects of two different doses of CCK on refilling: Concise Comm.”J. Nucl. Med. 1983, 24:666-671；Krishnamurthy G T.等、“The gallbladder emptying response to sequential exogenous cholecystokinin”Nucl. Med. Com., 1984, 5 (1) pp 27-33；Krishnamurthy G T. 等、“Detection, localization, and quantitation of degree of common bile duct obstruction by scintigraphy”J. Nucl. Med. 1985, 26:726-735；Fink-Bennet D. 等、“Cholecystokinin cholescintigraphic findings in the cystic duct syndrome”J. Nucl. Med. 1985, 26:1123-1128；Fink-Bennet D.、“The role of cholecystogogues in the evaluation of biliary tract disorders.”Nucl. Med. Ann. 1985、Lenny Freeman および Heidi Weissman, 編、New York, Raven Press, 1985, pp. 107-132；Newman P. 等、“A simple technique for quantitation cholecystokinin-HIDA scanning.”British J. of Radiology, vol. 56, pp. 500-502, 1983；Pickleman J. 等、“The role of sincalide cholescintigraphy in the evaluation of patients with acalculous gallbladder disease.”Archives of Surgery, vol. 120, 693-697；Ziessman, H A.等、“Calculation of a gallbladder ejection fraction: Advantage of continuous sincalide infusion over the three-minute infusion method.”J. Nucl. Med. 1992, 33:537-41；Sitzmann, J V.等、“Cholecystokinin prevents parenteral nutrition induced biliary sludge in humans”Surg. Gynecol. Obstet. 170:25-31, 1990；Teitelbaum D H.等、“Treatment of parenteral nutrition-associated cholestasis with cholecystokinin-octapept- ide.”J. Pediatr. Surg. 30:1082, 1995。

肝胆道造影用剤の投与後、患者の肝胆道系は適切な検出装置を用いて撮像される。ＣＨＯＬＥＴＥＣ（登録商標）のようなＴｃ−９９ｍＩＤＡ（イミノ二酢酸）類似体を造影剤として使用する場合、患者の体をスキャンして放射線を見るためにγカメラが採用できる。胆嚢の画像により、胆嚢駆出分画率（ＧＢＥＦ）を含む各種胆管の運動機能の非侵襲的測定および解析が可能になる。ＧＢＥＦの測定は、慢性無石胆嚢炎（ＣＡＣ）を含む、ある種の胆嚢関連疾患の診断および処置に臨床的に有益である。特に、低ＧＢＥＦ値は、９０％以上の適中率でＣＡＣ陽性であることが見出されている。他の胆管動特性についての変化も、各種胆管疾患の診断に利用できる。

ＧＢＥＦをシンチグラフィで測定する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、上記の参考文献に記載されている。シンカリドは、例えば、胆嚢収縮や内容物排出を促進するといった胆嚢に対する生理学的効果があるので、ＧＢＥＦの測定を含む胆機能の解析において有用である。ＧＢＥＦ測定の一つの技術として、シンカリドを１〜３分間注入で遅速投与し、約２０分後にＧＢＥＦを算出するという方法が挙げられる。あるいは、シンカリドをボーラスで急速に注入しても良いし、１５〜６０分にわたりゆっくりと連続注入しても良い。シンカリドは、肝胆道撮像中に、ある種の胆機能を誘発することにより、そのような機能の異常を検出しやすくし、ある種の肝胆系疾患の一指標となりうる。

シンカリド製剤の投与は、静脈注射であっても筋肉注射であっても良い。静脈投与において、用量はボーラス注入でも、時間をかけた遅速注入であっても良く、任意に輸液ポンプを利用しても良い。静脈投与量は、通常０．００５〜０．０４μｇ／ｋｇ（ボーラス注入）、あるいは一連の３分×４回注入では０．００５μｇ／ｋｇである。２〜３分以上、ただし１時間を超えない範囲での０．０２〜０．０４μｇ／ｋｇの静脈投与が当該技術分野の先行文献に記載されている。輸液ポンプを利用した０．５８μｇ／ｋｇ／ｈｒの注入速度も採用できる。１０ｎｇ／ｋｇ／ｈｒから始まり１６０ｎｇ／ｋｇ／ｈｒまで増やすといった他の投薬法も当該技術分野において公知である。ボーラス注入は全ての症例に推奨できるわけではないが、２〜３分以上１５分以下で０．０２〜０．０４μｇ／ｋｇを注入する方法は、胆嚢管あるいは胆嚢のけいれんを避けるために使用できる。

筋肉投与量は、一般的に多めで、０．１〜０．４μｇ／ｋｇの範囲である。一実施形態において、通常０．４μｇ／ｋｇの筋注投与量だと、副作用が最も少なく胆嚢の反応が最も優れた結果になり好ましい。投与についてのさらに詳しい記述は、例えば以下の文献に記載されている：Mesgarzadeh M.等、“Filling, post cholecystokinin emptying and refilling of normal gallbladder: effects of two different doses of CCK on refilling”J. Nucl. Med. 1983, 24:666-671；Ziessmann H A.等、“Calculation of a gallbladder ejection fraction: Advantage of continuous sincalide infusion over the three-minute infusion method.”J. Nucl. 1992, 33:537-541；Pickleman J等、“The role sincalide cholescintigraphy in the evaluation of patients with acalculous gallbladder disease.”Archives of Surgery, vol. 120, 693-697；Krishnamurthy G T.等、“The gallbladder emptying response to sequential exogenous cholecystokinin”Nucl. Med. Com., 1984, 5 (1) pp 27-33；Krishnamurthy G T.等、“Quantitative biliary dymanics: introduction of a new noninvasive scintigraphic technique.”J. Nucl. Med. 1983, 24:217-223；Fink-Bennet D.、“The role of cholecystogogues in the evaluation of biliary tract disorders.”N
ucl. Med. Ann. 1985, Lenny Freeman および Heidi Weissman編、New York, Raven Press, 1985, pp. 107-132；Balon H. R.等、“Society of Nuclear Medicine procedure guideline for hepatobiliary scintigraphy.”
本発明のシンカリド製剤は、完全非経口的栄養法（ＴＰＮ）を受けている患者の治療にも有用である。ＴＰＮは、胆泥、胆汁うっ滞の進行、胆石形成や、他の胆嚢関連合併症を誘発する。実際に、ＴＰＮ関連胆汁うっ滞（ＴＰＮ−ＡＣ）は致命的になる場合がある。ＴＰＮ−ＡＣは、敗血症、肝硬変、リンパ球機能の衰え、閉塞性黄疸、肝機能不全、そして死亡率の上昇との関連性が臨床的に示唆されている。これらの疾患がどのようなメカニズムで進行するのかは未だ決定的に証明されていないが、胆汁うっ滞、および胆嚢排出能、胆汁流量、胆汁酸分泌量の減少は、ＴＰＮ−ＡＣや他のＴＰＮ関連合併症の原因となることが示唆されている。シンカリドをＴＰＮ患者に投与し、胆嚢収縮および内容物排出を促進することにより、長期ＴＰＮに関連した疾患および他の合併症を治療および予防することができる。

ＴＰＮ患者に対する用量０．０５μｇ／ｋｇは、通常、毎日１０分以上の静脈注射によって投与される。乳幼児への用量は、高ビルリビンレベルを治療するために、毎日２〜３回の０．０２μｇ／ｋｇの静脈投与または筋肉投与であり、増量は最高０．３２μｇ／ｋｇまでにする。ＣＣＫは胆嚢収縮を誘発するのみでなく、肝内胆汁の流量を増加する。ＴＰＮ患者の治療に関する情報は、例えば、以下の文献に記載されている：Sitzmann, J V.等、“Cholecystokinin prevents parenteral nutrition induced biliary sludge in humans”Surg. Gynecol. Obstet. Vol. 170:25-31, 1990；Moss R L.等、“New approaches to understanding the etiology and treatment of total parenteral nutrition-associated cholestasis”Surg. Gynecol. Obstet. Vol. 8:140-147, 1999；Teitelbaum D H. 等、“Treatment of parenteral nutrition-associated cholestasis with cholecystokinin-octapeptide.”J. Pediatr. Surg. 30:1082, 1995；Teitelbaum D H.、“Parenteral nutrition-associated cholestasis”、Current Opinion in Pediatrics 1997, 9:270-275；Teitelbaum D H.等、“Parenteral nutrition-associated cholestasis.”Seminars in Pediatric Surgery, Vol. 10, pp. 72-80。

本発明は、以下の実施例によって説明されるが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。

［実施例１］
シンカリド製剤に対する緩衝剤と製剤ｐＨの影響
シンカリドの化学的安定性に対するｐＨの影響を測定するための実験を行った。化学的不安定性や劣化は、例えば、酸化、還元、脱アミド、加水分解、イミド形成、ラセミ化、異性化、および／またはβ脱離によって引き起こされる。リン酸緩衝溶液中でのシンカリドに対するｐＨの影響を調べるために、３５ｍＭリン酸緩衝液中にシンカリド溶液（約１．７μｇ／ｍＬ）を調製し、最終ｐＨ値を希釈ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いて３．０〜９．１の範囲で調整した。勾配溶出を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用し、２１５ｎｍでのＵＶ検出で、ｐＨ調整後０、６、２４時間後のシンカリドの回収率を測定することにより、溶液中のシンカリドの安定性を評価した。

１．０〜９．１のｐＨ範囲におけるリン酸緩衝液中のシンカリドの安定性についての２４時間にわたる実験の結果を表３にまとめ、図５にグラフ化した。回収率の測定によれば、３５ｍＭリン酸緩衝液中のシンカリドは、５．０〜９．１範囲のｐＨ値において２４時間以上安定していた。５．０未満のｐＨ値では、実験開始時からシンカリドの劣化が明らかであった。

表３に示した結果によれば、リン酸塩はシンカリドとの相互作用が無く、生理学的なｐＨ範囲において理想的な緩衝能を示すので、好ましい緩衝剤として選択した。続いて、表４に示すようなリン酸塩を使用した製剤で、上記の通り確認済みの安定ｐＨ範囲内において各実験を行った。簡略して、以下の成分を含有するシンカリド溶液（濃度は表４に示す）を調製した：シンカリド、Ｄ−マンニトール、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リジン、メタ重亜硫酸ナトリウム、ポリソルベート２０、ペンテト酸、およびリン酸水素二カリウム。

溶液のｐＨを希釈ＨＣｌまたはＮａＯＨによって５．５〜８．５に調整し、ｐＨ調整０、４、８時間後のシンカリド回収率を、前述のように勾配溶出ＲＰ−ＨＰＬＣを用い２１５ｎｍＵＶ検出にて測定することによって、その安定性を評価した。前記製剤の、５．５〜８．５のｐＨ範囲におけるシンカリドの安定性に関する８時間実験の結果を表５にまとめ、図６にグラフ化した。

ここで実験したｐＨ範囲では、初期シンカリドの回収率に、目立ったｐＨ依存性関連の傾向は見られなかった。シンカリド回収率の経時的な変動性は、劣化ではなく、通常の分析変動性に起因すると考えることができる。クロマトグラフの形状解析により、ｐＨ５．５〜８．５における８時間実験でのシンカリド関連劣化物が一定して１．２〜１．６％（不純指数）であることがわかったので、この製剤のシンカリドが安定しているということがさらに支持される。シンカリド製剤のバルクバッチ溶液は、緩衝剤として２５ｍＭリン酸塩を含有し、６．８（６．７〜６．９の範囲）の目標ｐＨ値になるように調製した。５ｍＬの水で凍結乾燥からの再構成を行った場合、薬剤製品中１０ｍＭリン酸塩に相当する。このデータは、生理学的に適合なｐＨ範囲における溶液の安定性を示すものであり、再構成後のシンカリドの好適ｐＨが６．０〜８．０であるということを支持する。

［実施例２］
シンカリド製剤に対するキレート剤の効果
図１に示すように、シンカリドのアミノ酸組成には、構造配列においてＭｅｔ３およびＭｅｔ６として表示した２種のメチオニン（Ｍｅｔ）が含まれる。シンカリド中に存在するこれらの残基が、遊離金属によって酸化されやすいかどうかを調べるために実験を行った。また、これらの実験で、金属をキレート化することによって、シンカリドの酸化を阻害する製剤賦形剤としてのＤＴＰＡの役割も調べた。図２〜４は、モノ、またはジスルホキシドの何れか一方を含むシンカリドの３つの酸化形を示す。金属の存在による潜在的酸化効果を評価するために、表６に示すように、１ｍＭのＤＴＰＡ（０．３９ｍｇのＤＴＰＡ／ｍＬ）有り、あるいはＤＴＰＡ無しの実験用製剤（アミノ酸無し）をｐＨ６．５〜７．０で調製した。

ＤＴＰＡ有り（＋）／無し（−）の実験用製剤（２５ｍＬ）溶液に、表７にまとめたような９種の金属イオンをそれぞれ入れた。

金属含有溶液のシンカリドおよび関連酸化形について、前述のように勾配溶出のＲＰ−ＨＰＬＣにて、２１５ｎｍのＵＶ検出により８時間解析を行った。図７は、スルホキシド（Ｍｅｔ３およびＭｅｔ６）の形成に対するＤＴＰＡの存在、または非存在下での９種の金属の影響を示す。これらのデータにより、Ｃｒ^３＋は例外であるが、シンカリドＭｅｔ３およびＭｅｔ６モノスルホキシドの量は、ある程度の金属存在下かつＤＴＰＡ非存在下において増大し、一方、ＤＴＰＡが存在するとシンカリドＭｅｔ３およびＭｅｔ６モノスルホキシドの形成に対する阻害効果を及ぼすことがわかる。ＤＴＰＡの非存在下では、銅やマンガンが、シンカリドのメチオニン残基に対し最も強い酸化効果を示し、その結果、Ｍｅｔ３およびＭｅｔ６モノスルホキシド（対シンカリド）の結合重量パーセントはそれぞれ８５．５％および１２８．９％になる。シンカリドＭｅｔ３およびＭｅｔ６モノスルホキシド（ｔ_Ｒ：約１４．８分{二重状態}およびｔ_Ｒ：約１８分）の存在に加え、シンカリドジスルホキシド（ｔ_Ｒ：約６．５分）の形成が銅やマンガンの場合に見られたが、他の金属では見られなかった。

銅またはマンガンを入れた製剤のクロマトグラム（ＤＴＰＡ有り／無し、図８〜１１）もこの結論を支持する。クロマトグラフの形状解析により、１ｍＭ（０．３９ｍｇＤＴＰＡ／ｍＬ）レベルのＤＴＰＡは、シンカリドを金属触媒作用によるスルホキシドへの酸化から保護するということが示唆される。賦形剤不純物および／または栓からの溶性物のために、微量金属が製剤に混入することがある。微量遊離金属をキレート化するために、ペンテト酸（ＤＴＰＡ）を製剤の賦形剤として使用すると、シンカリドメチオニンモノおよびジスルホキシドの形成を減少させるので、溶液中のシンカリドの劣化を阻害するということを本実験の結果は支持している。シンカリド製剤は、５ｍＬで再構成した１ｍＭに相当の２ｍｇＤＴＰＡ／バイアルを含有するように調製した。

［実施例３］
シンカリド製剤に対する界面活性剤の効果
充てん剤／等張化剤、緩衝剤、塩、キレート剤、およびシンカリドから成る新製剤の予備開発研究において、バルク溶液中の有効薬用成分シンカリドの回収率は、外気との接触状態に影響されやすいことが、ＨＰＬＣ解析により確認された。例えば、逆相勾配溶出ＨＰＬＣを用いて、２１５ｎｍでＵＶ検出することでシンカリドの効力をモニターした場合、開栓バイアル中の２ｍＬバルク充填溶液を、１７時間空気に暴露しながら、かき混ぜる、または静置した場合、シンカリド回収率に５０〜６０％というかなりの減少が見られた。このシンカリドの減少は、シンカリドモノおよびジスルホキシド劣化物の増加にある程度起因しているが、これは全減少量のごく一部でしかない。このため、この回収率の減少は、吸着／変性、あるいは気液界面効果のいずれかによるものであると考えられる。この表面吸着に伴うシンカリドの劣化を抑えるために、界面活性剤を製剤の賦形剤として、バルクあるいは凍結乾燥シンカリド製剤に加える。

充てん剤／等張化剤（Ｄ−マンニトール）、緩衝剤（リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム）、張度調整用塩（塩化ナトリウム／カリウム）、キレート剤（ペンテト酸）、および有効成分（シンカリド）から成る製剤を、様々な濃度の非イオン性界面活性剤、ポリソルベート８０ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を用いて調製した。バルク溶液および再構成された凍結乾燥サンプルを、すぐに栓で密閉するか、あるいは開栓状態のまま、１７時間放置した後、そのシンカリド回収率を逆相勾配溶出ＨＰＬＣ、２１５ｎｍによって測定した。

表８に示されるように、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の効果は、空気に暴露された製剤で最も高い。データによると、シンカリド回収率は、１ｍｇ／ｍＬ濃度のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含有する製剤と比較すると、バルク溶液では約５０％、再構成凍結乾燥製剤では約２０％の減少が見られた。密封状態におけるＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含まないバルクおよび再構成凍結乾燥製剤のシンカリド回収率も明らかに低いが、空気に暴露した製剤に比べるとその減少度（４〜８％）は異なっている。このＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の濃度の影響に関する予備スクリーニング実験によって、バルク当たり１ｍｇ／ｍＬ以下が最適であることがわかる。

二つの非イオン性界面活性剤の効果を比較するために、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０あるいはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の一方を、各量加えたシンカリド製剤（７５ｍｇ／ｍＬのＤ−マンニトール、６．０ｍｇ／ｍＬのＫＣｌ、３．２５ｍｇ／ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄、１．０ｍｇ／ｍＬのＫ₂ＨＰＯ₄、１．０ｍｇ／ｍＬのＤＴＰＡ、０．００２５ｍｇ／ｍＬのシンカリド（バルク製剤））を調製した。この実験結果を表９に示す。

表９に示すように、データにより、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０あるいはＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の一方が微量（２．５〜７．５μｇ／ｍＬ）存在すると、界面活性剤無しの製剤に比べると、シンカリド回収率に有益な効果があることが示された。しかし、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有する製剤のシンカリド回収率（９８〜１０２％）のほうが、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含有する場合の回収率（９５〜９８％）より常に高いので、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０が好適な界面活性剤である。

空気暴露あるいは密封バルク製剤におけるシンカリド回収率に対する、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の濃度の効果を確認するための追加実験を行った。ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を各微量加えたバルク製剤（７５．０ｍｇ／ｍＬのＤ−マンニトール、６．０ｍｇ／ｍＬのＫＣｌ、３．２５ｍｇ／ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄、１．０ｍｇ／ｍＬのＤＴＰＡ、０．００２５ｍｇ／ｍＬのシンカリド）を開封および密封バイアルで保管し、そのシンカリド回収率を逆相勾配溶出ＨＰＬＣで測定した結果を表１０に示す。

表１０に示すように、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有するバルク製剤のシンカリド回収率は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含まない製剤よりも高く、そのシンカリド回収率は実験したＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の濃度範囲（２．５〜７．５ μｇ／ｍＬのバルク）に対し非依存的である。加えて、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有する開封および密封両製剤は、同等のシンカリド回収率を示すことから、シンカリド回収率に関する空気感受性はなくなっている。このデータは、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の使用を支持しているが、５μｇ／ｍＬのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有する２ｍＬ充填バイアルを激しく攪拌すると、再構成製品にわずかな発泡が見られた。発泡を抑えるには、低濃度のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０が評価される。

表１１にまとめたように、凍結乾燥製品におけるＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（２．５ｎｇ／ｍＬ）含有および非含有製剤のシンカリド回復率を比較する実験を行った。本実施例およびその後の実施例において、マンニトールはＤ−マンニトール、メチオニンはＬ−メチオニン、アルギニンはＬ−アルギニンモノヒドロクロライド、リジンはＬ−リジンモノヒドロクロライドのことを示す。

ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を最小微量濃度（２．５ｎｇ／ｍＬ）に減らしても、製剤の気液界面に対する効果が見られ、かつ、発泡形成を抑えられた。この結果に統計的両側ｔ−検定を行うと、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の２．５ｎｇ／ｍＬ含有製剤と非含有製剤の間に有意な差が（Ｐ＜０．０５）見られた。このデータより、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、すなわちモノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンは、製剤のシンカリド回収を促進し、シンカリド効力を維持するので、界面活性剤としての効果が確認された。シンカリド製剤は、非イオン性界面活性剤、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を微量賦形剤として、バルク製剤中に、５ｍＬに再構成した最終製品においては１ｎｇ／ｍＬに相当する２．５ｎｇ／ｍＬの濃度で含むことが好ましい。

［実施例４］
シンカリド製剤に対する抗酸化剤の効果
安定剤としての抗酸化剤の添加による、シンカリド製剤のシンカリド酸化抑制効果を評価するための実験を行った（実施例４の製剤は、８５ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．００５ｍｇ／ｍＬのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、２．７５ｍｇ／ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄、１．０ｍｇ／ｍＬのＤＴＰＡ、２．０ｍｇ／ｍＬのメチオニン、７．５ｍｇ／ｍのＬリジン、１５ｍｇ／ｍＬのアルギニン、０．００２５ｍｇ／ｍＬのシンカリドを含有する（バルク製剤）、ただし、シンカリドを含まない偽薬は除く）。シンカリドメチオニン（Ｍｅｔ３またはＭｅｔ６）モノスルホキシド、脱硫化シンカリド、および未知の劣化物の形成を調査した。メタ重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、硫酸ナトリウム、ベンザルコニウムクロライド、およびベンゼトニウムクロライドのシンカリド劣化阻害効果を、シンカリド回収率およびシンカリド関連不純物への影響という観点から、ＨＰＬＣにより評価した。

シンカリドの安定化に対する各種抗酸化剤の効果を、１５時間開封または密封したシンカリド製剤において評価した。抗酸化剤を除く全ての製剤成分を含有し、水で再構成した凍結乾燥シンカリド製剤に、抗酸化剤を１０μｇ／ｍＬの濃度で個別に添加した。添加溶液と非添加溶液をプールしてから細分し、１５時間空気に暴露するか、あるいは密封保護した。シンカリドおよび全シンカリド関連不純物は、勾配溶出を用いた逆相ＨＰＬＣにより２１５ｎｍのＵＶ検出でモニターし、各抗酸化剤の効果を比較した。

表１２に示すように、これら各濃度データより、ベンザルコニウムクロライドおよびベンゼトニウムクロライドには明らかな不安定化効果があり、一方、アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、および硫酸ナトリウムは対照製剤（抗酸化剤無し）と実質的に同等であることが示唆される。調査した全てのシンカリド製剤および抗酸化剤の組み合わせのうち、１ｍＬ当たり１０μｇのメタ重亜硫酸ナトリウムを含有する製剤は、８時間後に最も高いシンカリド効力（９８．３％）と、１５時間後に最も低い全シンカリド関連不純物量（１．７９％）を示した。よって、メタ重亜硫酸ナトリウムが、本発明の製剤にとって好ましい抗酸化剤である。

製剤中のメタ重亜硫酸ナトリウムレベルを最適化するために、凍結乾燥シンカリド製剤は、表１３にまとめたように４つのレベルのメタ重亜硫酸ナトリウム（０、１０、３０、６０μｇ／バイアル）を含むよう調製した。各濃度におけるサンプルは、非ストレス条件およびストレス条件（６５℃、６４時間）下に置かれた後、ＨＰＬＣ分析した。「シンカリドの割合（％）」を決定し、「（Ｍｅｔ６）モノスルホキシドの割合（％）」（ｔ_Ｒ：〜約１９．７分）をシンカリド酸化の指標としてモニターした。そのデータを表１４に示す。

メタ重亜硫酸ナトリウムを最高６０μｇ／バイアルまで添加すると、ストレス条件下におけるシンカリドの回収率は上がり、シンカリドの（Ｍｅｔ６）モノスルホキシド誘導体への酸化は阻害された。このデータからはっきりとした濃度関連性が見られないことより、４０μｇ／バイアルのメタ重亜硫酸ナトリウムを最終製剤の好適濃度として選択し、３０μｇ／バイアルを下限とし、かつ、６０μｇ／バイアルを上限とした。

シンカリド劣化に対する保護作用を確認するために、長期促進型保管条件下で、最適濃度（４０μｇ／バイアル）のメタ重亜硫酸ナトリウムを加えたシンカリド製剤を用いて別の実験を行った。同じバッチから得た抗酸化剤含有および非含有シンカリド凍結乾燥製剤に対し、４０℃および６０℃で、６週間にわたり、熱ストレスを与えた。また、同じバッチからのシンカリド非含有製剤には、４０℃で８月にわたり熱ストレスを与えた。シンカリドの割合（％）および全不純物量の割合（％）のＨＰＬＣ解析結果を表１５に示す。

この長期促進型保管実験の結果により、賦形剤のメタ重亜硫酸ナトリウムの必要性がさらに明確になった。メタ重亜硫酸ナトリウム（４０μｇ／バイアル）を含むシンカリド製剤は、抗酸化剤を含まないシンカリド製剤に比べて、シンカリド熱ストレス性劣化物形成（３．３０％）に対する保護作用があり、抗酸化剤を含まないシンカリド製剤のシンカリド熱ストレス性不純物は、その数倍の値（６．５６％）を示した。これらの不純物は、シンカリド非含有製剤のクロマトグラムには見られないことから、シンカリドの熱ストレス性（ｔ_R＝３５〜４４分）によることが確認された。アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、硫酸ナトリウム、ベンザルコニウムクロライド、およびベンゼトニウムクロライドよりも、シンカリドの酸化およびシンカリドの熱ストレス性の劣化を阻害することについて優れた保護作用を示すことから、メタ重亜硫酸ナトリウムを、好適な抗酸化剤および安定剤として選択した。凍結乾燥製剤における好適なメタ重亜硫酸ナトリウム濃度は、バイアル当たり４０μｇ、あるいは再構成製品中８μｇ／ｍＬである。

［実施例５］
充てん剤／等張化剤の選択
本発明の製剤中の有効薬用成分（ＡＰＩ）シンカリド（５μｇ／バイアル）は微量なので、充てん剤の使用が、構造を与えおよびＡＰＩを支持するという役割のみではなく、張度を与えるという意味でも非常に有用と思われる。本発明のシンカリド製剤中の充てん剤の選択およびその最適化のための実験を行った。評価基準は、効率的な凍結乾燥サイクル、製薬業上見栄えの良い最終製品、製品の溶解性の向上、および再構成製品の等張化賦形剤としての有用性である。ラクトース、ラクトース／塩化ナトリウム、およびマンニトールの各濃度を考慮し、これらの賦形剤入りの実験用バッチを、ケーキ形状、浸透圧（オスモル濃度）、溶解速度、凍結乾燥顕微鏡検査、および、電気抵抗対温度測定値を含む熱分析の観点から評価した。

実験製剤：
バッチＡ：成分：ラクトース：３７５ｍｇ／バイアル、リン酸水素二ナトリウム：１２．０ｍｇ／バイアル、ＤＴＰＡ：２．０ｍｇ／バイアル、リン酸二水素ナトリウム：１９．５ｍｇ／バイアル、シンカリド：０．００５ｍｇ／バイアル。

バッチＣ_1-3：成分：マンニトール：１７０ｍｇ／バイアル、リン酸水素二カリウム９．０ｍｇ／バイアル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０：＜０．０１ｍｇ／バイアル、メチオニン：４．０ｍｇ／バイアル、リジン：１５．０ｍｇ／バイアル、アルギニン：３０．０ｍｇ／バイアル、メタ重亜硫酸ナトリウム：０．０４ｍｇ／バイアル、シンカリド：０．００５ｍｇ／バイアル、ＤＴＰＡ：２．０ｍｇ／バイアル。

バッチＤ₁：成分：ラクトース：１５０ｍｇ／バイアル、リン酸水素二カリウム：９．１ｍｇ／バイアル、ＤＴＰＡ：２．０ｍｇ／バイアル、リン酸二水素ナトリウム：９．８ｍｇ／バイアル、ＮａＣｌ：２１．０ｍｇ／バイアル。

バッチＥ₁：成分：ラクトース：２００ｍｇ／バイアル、リン酸水素二ナトリウム：７．５ｍｇ／バイアル、ＤＴＰＡ：２．０ｍｇ／バイアル、ＮａＣｌ：１７ｍｇ／バイアル。

バッチＦ_1-2：Ｆ₁：成分：マンニトール：２５０ｍｇ／バイアル、リン酸水素二ナトリウム：７．５ｍｇ／バイアル、ＤＴＰＡ：２．０ｍｇ／バイアル、シンカリド：０ｍｇ／バイアル；および、
Ｆ₂：成分：マンニトール：２０６ｍｇ／バイアル、リン酸水素二ナトリウム：７．５ｍｇ／バイアル、ＤＴＰＡ：２．０ｍｇ／バイアル、シンカリド：０．００５ｍｇ／バイアル。

バッチＨ_1-2：Ｈ₁：成分：マンニトール：１８０ｍｇ／バイアル、リン酸水素二ナトリウム：６．０ｍｇ／バイアル、シンカリド：０ｍｇ／バイアル、ＮａＣｌ：５ｍｇ／バイアル、ＤＴＰＡ：２．０ｍｇ／バイアル；および、
Ｈ₂：成分：マンニトール：１５０ｍｇ／バイアル、リン酸水素二カリウム：４．５ｍｇ／バイアル、シンカリド：０．００５ｍｇ／バイアル、ＮａＣｌ：１０ｍｇ／バイアル、ＤＴＰＡ：２．０ｍｇ／バイアル。

バッチＩ_1-2：Ｉ₁：成分：マンニトール：１４０ｍｇ／バイアル、リン酸水素二カリウム：５．５ｍｇ／バイアル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０：０．０１ｍｇ／バイアル、メチオニン：４．０ｍｇ／バイアル、リジン：６０．０ｍｇ／バイアル、シンカリド：０．００５ｍｇ／バイアル、ＤＴＰＡ：２．０ｍｇ／バイアル；および、
Ｉ₂：成分：マンニトール：１７０ｍｇ／バイアル、リン酸水素二カリウム：５．５ｍｇ／バイアル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０：０．０１ｍｇ／バイアル、メチオニン：４．０ｍｇ／バイアル、リジン：３０．０ｍｇ／バイアル、シンカリド：０．００５ｍｇ／バイアル、ＤＴＰＡ：２．０ｍｇ／バイアル。

バッチＪ：成分：マンニトール：１７０ｍｇ／バイアル、リン酸水素二カリウム：８．５ｍｇ／バイアル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０：０．０１ｍｇ／バイアル、メチオニン：４．０ｍｇ／バイアル、リジン：１５．０ｍｇ／バイアル、アルギニン：３０．０ｍｇ／バイアル、メタ重亜硫酸ナトリウム：０．０４ｍｇ／バイアル、シンカリド：０．００５ｍｇ／バイアル、ＤＴＰＡ：２．０ｍｇ／バイアル。

方法：
１．外観：凍結乾燥プラグの目視評価。

２．浸透圧（オスモル濃度）：蒸気圧浸透圧測定により決定。

３．溶解性：溶解時間は、５ｍＬの水で再構成中に検査光下における外観検査により測定。

４．熱分析：
ａ．電気抵抗対温度測定値：電気抵抗は標準的な抵抗測定器を用いて測定、温度は３２ゲージ型Ｔ熱電対を用いて測定。

ｂ．凍結乾燥顕微鏡検査：凍結乾燥顕微鏡、インフィニバ（Ｉｎｆｉｎｉｖａｒ）顕微鏡およびカラーカメラを用いて実施。

予備検査において、ラクトースを充てん剤／等張化剤として使用した。表１６にその一覧を示すように、製剤は再構成製品を等張化するための高濃度ラクトースを加えた３ｍＬ充填容量を基本としている。５ｍＬの水で再構成したこの製剤の浸透圧は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇである。

この実験製剤のバッチＡに１３０時間（約５．４日間）凍結乾燥サイクルを行うと、凍結乾燥ケーキにメルトバックの形跡が見られ、再構成溶解時間は９分以上かかった。バルク製剤は、その溶解性に対し高濃度のラクトース（１２５ｍｇ／ｍＬ）を含有し、小バイアル中に高充填容量の３ｍＬが入っているために、不良ケーキ形成したバイアル数が多く、長い凍結乾燥サイクルが必要となる。

追加賦形剤である塩化ナトリウムを使用して初期ラクトース形成を修正することにより、ラクトース濃度および充填容量を３ｍＬから２ｍＬに減らすことで、サイクル時間を短縮して製品の外観・可溶性を向上するための実験を行った。

ＮａＣｌを使用することにより、ラクトースの濃度を下げつつ、製品の等張性をオスモル濃度値２４０〜２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に保つことが出来る。ラクトース、塩化ナトリウム、およびリン酸ナトリウムの量を変えることにより、凍結乾燥サイクルを１３０時間から９６時間に下げることができるが、必ずしも凍結乾燥ケーキの外観が改善できるわけではない。

ラクトース／塩化ナトリウム比（表１８）を変えた二つの実験製剤の熱分析により、これらの製剤は、一次乾燥温度が−３８℃〜−４２℃の範囲という低温のため、凍結乾燥サイクルが比較的長くなり、その結果、この温度での昇華速度も遅くなってしまうということが確認された。この長い凍結乾燥サイクルに加え、一次乾燥温度が低いので、バイアル間のばらつきが大きくなり、溶解性の問題に関連するプラグ外観が不良となる可能性が増す。

凍結乾燥調剤用の一般的な賦形剤であるマンニトールは、マンニトール／氷共融混合物の融解温度が高く（約−１．５℃）、冷凍水性溶液から結晶化し易い傾向にあるので、充てん剤としての評価では２番目に選択された。このことにより、一次および二次乾燥時間が短くなり、効率的な凍結乾燥サイクル、および、物理的に安定で製薬業上見栄えの良い凍結乾燥固体がもたらされるのが理想的である。サイクル時間および一次乾燥温度のパラメーターを求め、固体ケーキの溶解性を評価するために、２ｍＬの充填容量において等張性を維持しながらラクトースをＤ−マンニトールに置換して、いくつかのベンチスケールバッチを調製した。５ｍＬの再構成量にした凍結乾燥製品の再構成時間に沿った凍結乾燥サイクルパラメーターを表１９に示す。

バッチＦ₂の凍結乾燥サイクル時間は、ラクトース製剤の１３０時間以上からマンニトール製剤用の約６９時間までにした。Ｆ₁およびＦ₂両方からのケーキは、１分未満というほぼ同じ時間範囲内で５ｍＬの水に溶解した。バッチＦ₂に対しバッチＦ₁の一次乾燥温度を−３４℃以下から−２５℃に上げると、全サイクル時間が８５時間から６９時間になるという望ましい効果が得られた。

マンニトール濃度および２ｍＬ充填容量の凍結乾燥サイクル時間を最適化するために追加実験を行った。これらの実験は、製剤開発実験と同時に行い、再構成後の浸透圧を約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇに調節し、製剤に他の賦形剤を加えることによりペプチドを安定化した（表２０）。

これらの結果から、一次乾燥温度を−２５℃以下−８〜−１２℃の範囲に上げると、サイクル時間が６９時間から３０時間とかなり減り、１分以内に再構成可能な固体乾燥ケーキが製造できるということが証明された。

シンカリドの長期安定性を強化するよう意図した追加最適化実験の結果、好適なシンカリド製剤は、１７０ｍｇ／バイアルのＤ−マンニトールおよび以下の賦形剤（ｍｇ／バイアル）を含むことを見出した：ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（０．０１）、Ｋ₂ＨＰＯ₄（８．５）、メチオニン（４．０）、リジン（１５．０）、アルギニン（３０．０）、ＤＴＰＡ（２．０）、メタ重亜硫酸ナトリウム（０．０４）。５ｍＬの水で再構成した最適製剤の浸透圧は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであった。凍結乾燥顕微鏡検査および電気抵抗対温度測定値を使用したこの製剤の熱分析により、製品が合格品質に達するための一次乾燥温度の上限は−１３℃〜−１５℃であると示唆された。

全ての知見を確認するために、好適なシンカリド製剤の充填容量２ｍＬ／バイアルの三種のスケールアップパイロットバッチＣ_1-3を調製し、この工程が研究開発用の装置から実際の製造装置に応用可能であることを証明するために、フルスケール製造用の乾燥機で凍結乾燥した。これらのバッチ乾燥サイクルの一次乾燥温度は−１２℃±３℃で、サイクル時間は５３〜６１時間である（表２１）。

これらの実験データは、マンニトールを特に好適な充てん剤として、好ましくは約１７０ｍｇ／バイアルの量で選択することを支持するものである。この濃度を用いると、凍結乾燥サイクルは２ｍＬ充填容量の場合５３〜６１時間になる。この最終製品は、製薬業上見栄えの良い白色固体ケーキであり、５ｍＬの水で１分以内に再構成できるので、結果として浸透圧が約３００ｍＯｓｍ／Ｋｇの溶液になる。

［実施例６］
シンカリド製剤に対するアミノ酸の効果
この製剤の研究において、空気暴露および凍結乾燥は、製剤中のシンカリドの効力が減少するために、スケールアップした製造にとって問題となる領域であることが確認されていた。シンカリドを空気に暴露すると表面吸着／変性が起こり、酸化を通じて劣化物を生成するため、その結果、効能が減少する。また、凍結乾燥中にシンカリド製剤を熱ストレスに曝すと、シンカリドの劣化物が生成され、回収率は減少する。

シンカリドの安定剤として、無極性（疎水性）メチオニン残基と、アスパラギン酸およびグルタミン酸と、極性グリシンおよびシステイン残基と、塩基性リジンおよびアルギニンアミノ酸を含む数種のアミノ酸を評価するための実験を行った。

特に例外を言及しない限り、各種アミノ酸の検査用に本実験で使用する製剤は、以下の成分を含有する（バルク）：７５．０ｍｇ／ｍＬのマンニトール；３．２５ｍｇ／ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄；１．０ｍｇ／ｍＬのＫ₂ＨＰＯ₄；１．０ｍｇ／ｍＬペンテト酸（ＤＴＰＡ）；５．０ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ；有効ペプチド、シンカリド（０．００２５ｍｇ／ｍＬ）。始めに、製剤再構成のための無極性アミノ酸Ｌ−メチオニンを評価した。その理由は、メチオニン残基は、ヒドロキシルフリーラジカルや他の反応性酸素種と反応することにより内因性抗酸化剤、あるいはスカベンジャーとして機能しうるからである。このため、メチオニンは、シンカリドに保護あるいは抗酸化効果を与え、自身を優先的に酸化させることにより、シンカリド製剤の製造安定性を向上することができる。下記の表２２は、マンニトール、塩化ナトリウム、リン酸カリウム、およびペンテト酸を含む製剤に、様々な量のＬ−メチオニンを加えてから、この実験製剤を空気暴露した結果をまとめたものである。これらの実験では、製品の製造工程をシミュレートするために、開封あるいは密封バイアルに入った液体製剤を使用した。開封バイアル中の製剤について、バルク製剤中のメチオニンレベルを０．０ｍｇ／ｍＬから２．０ｍｇ／ｍＬに上げるにつれ、シンカリドの回収率は約６０％向上し、シンカリド関連不純物の濃度は減少した。

製造安定剤として有望な無極性アミノ酸メチオニンに対する比較として、グリシンやシステインなどの極性アミノ酸についての評価も行った。これらのアミノ酸を含有する製剤を開封バイアル内で空気暴露し、密封バイアル中の製品と比較した。これらのアミノ酸の効果を、シンカリド回収率およびシンカリド関連不純物の観点から、先に観察したメチオニン存在下での液体製剤についての効果と比較した。表２３は、メチオニン、システイン、またはグリシンを様々な濃度で含む実験製剤のシンカリド回収率を示している。

結果から、マンニトール、リン酸カリウム、塩化ナトリウムおよびペンテト酸を含むバルク製剤に、システインあるいはグリシンのいずれか一方を加えた製剤を開封バイアル中で空気暴露すると、シンカリド不純物レベルの減少も、シンカリド回収率の向上も十分に得られないことが証明された。

塩基性アミノ酸であるリジンは、本発明のシンカリド製剤で使用するために評価された第２のアミノ酸である。表２４に示すように、実験製剤（７０〜８５ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．００５ｍｇ／ｍＬのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、２．７５ｍｇ／ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄、１．０ｍｇ／ｍＬのＤＴＰＡ、２．０ｍｇ／ｍＬのメチオニン、０．００２５ｍｇ／ｍＬのシンカリド）を様々な濃度のリジンを含むように調製し、シンカリドの回収率を評価した。

促進保管後、リジン含有凍結乾燥製剤のシンカリド回収率は、対照リジン非含有凍結乾燥製剤に比べ有意に向上した。リジン含有製剤のシンカリド回収率は、４０℃で３週間の保管で５０％、５週間の保管で７５％の改善が見られたので、リジンは熱ストレスにさらされた凍結乾燥製剤の安定性に貢献することが証明された。

メチオニンおよびリジンの存在により、シンカリド回収率が向上することが確認されたので、他のアミノ酸もこの製剤のバルク添加剤として好適であることが示唆される。よって、二つの酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸の評価をするための製剤実験を続いて行った。表２５は、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸のうちいずれか一つを、以下の量含有した実験製剤（８５．０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．００５ｍｇ／ｍＬのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、２．７５ｍｇ／ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄、１．０ｍｇ／ｍＬのＤＴＰＡ、２．０ｍｇ／ｍＬのメチオニン、０．００２５ｍｇ／ｍＬのシンカリド）におけるシンカリド回収率を示す。

この結果より、４０℃での保管時間が長い場合、リジンは一貫してアスパラギン酸やグルタミン酸よりも優れた保護作用があることが証明された。リジンについて得られたこの結果より、他の塩基性アミノ酸であるアルギニンや、リジンとアルギニンとの混合物は、凍結乾燥や熱ストレス下での保護作用をさらに強める可能性も示唆される。実験製剤（８５．０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．００５ｍｇ／ｍＬのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、２．７５ｍｇ／ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄、１．０ｍｇ／ｍＬのＤＴＰＡ、２．０ｍｇ／ｍＬのメチオニン、０．００２５ ｍｇ／ｍＬのシンカリド）を様々な濃度のリジン、アルギニン、あるいはリジンとアルギニンの混合物を含むように調製し、シンカリドの回収率を評価した（表２６）。

この結果により、凍結乾燥と６５℃６４時間のストレス下において、リジン、アルギニン、あるいはその二つの混合物を含む製剤のシンカリド回収率には、約５０〜７０％の改善が見られることが確認された。リジンとアルギニンの両方を含む製剤は、最も高いシンカリド回収率を示したので、これら二つのアミノ酸を混合すると熱ストレス保管条件下における安定作用が特に向上することが示唆された。７．５ｍｇ／ｍＬのリジンおよび１５．０ｍｇ／ｍＬのアルギニンを含有する中間混合物は、シンカリド回収率が９５％超という結果であり、凍結乾燥および熱ストレスを与えた製品に対し好適な保護作用を示した。

メチオニン、リジンおよびアルギニンは、本発明のシンカリド製剤中の安定剤として使用されるグリシン、システインのような極性アミノ酸や、アスパラギン酸、グルタミン酸のような酸性アミノ酸よりも好適である。メチオニンは、製剤の製造安定性を改善するので、その結果、シンカリドの回収率が改善される。また、リジンとアルギニンの混合物は、凍結乾燥および熱ストレス下での製品の安定性に貢献するので、これによってもシンカリドの回収率が改善される。本発明の凍結乾燥製剤の好適な濃度は、メチオニン（４．０ｍｇ／バイアル）、リジン（１５．０ｍｇ／バイアル）、およびアルギニン（３０．０ｍｇ／バイアル）である。

［実施例７］
再構成製品の貯蔵寿命実験
Ａ．バイアル内における再構成後の安定性
再構成後のシンカリドを室温にて８時間放置し、外観、溶解度、微粒物質、色、ｐＨ、シンカリド含有率、脱硫化シンカリド含有率、および、その他のシンカリド関連不純物の観点より、その安定性を測定するための実験を行った。シンカリド製剤の三つの１０５Ｌスケールアップパイロットバッチから採られた凍結乾燥バイアルを５．０ｍＬの純水で再構成した。

再構成後０、２、４、６、８時間における外観、溶解度、微粒物質、色、ｐＨの試験を行った。再構成後０、４、８時間における複製バイアルについてのシンカリド含有率、脱硫化シンカリド含有率、および、その他のシンカリド関連不純物の試験を、勾配溶出逆相ＨＰＬＣを用い、２１５ｎｍのＵＶ検出にて行った。

三つのシンカリド製剤調薬の再構成後０、２、４、６、８時間における外観、溶解度、微粒物質、色、ｐＨの試験結果を表２７に示す。

この試験された三つの調剤（以下、調剤Ａ、Ｂ、Ｃとする）は、パラメーターに変化は見られず、８時間の試験期間での結果も全て規格内であった（８５ｍｇ／ｍＬのマンニトール；２．５×１０^-6ｍｇ／ｍＬのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０；４．５ｍｇ／ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄；１．０ｍｇ／ｍＬのＤＴＰＡ、０．０２ｍｇ／ｍＬのメタ重亜硫酸ナトリウム、２．０ｍｇ／ｍＬのメチオニン、７．５ｍｇ／ｍＬのリジン、１５．０ｍｇ／ｍＬのアルギニン、０．００２５ｍｇ／ｍＬのシンカリド（バルク製剤））。三つのシンカリド製剤調薬の再構成後０、４、８時間におけるシンカリド含有率、脱硫化シンカリド含有率、および、その他のシンカリド関連不純物に対するＨＰＬＣ試験の結果を表２８に示す。

試験結果は全て規格内であった。シンカリドの効力には時間変化がみられなかった。脱硫化シンカリドおよび他のシンカリド関連不純物は、比較的少量の増加のみが見られたが、それぞれの規格である２％および５％に対し有意ではない。この実験より、シンカリド製剤の再構成直後の試験値は、再構成製品の８時間貯蔵寿命直後の結果を表すことがわかる。このデータにより、製剤の再構成後の安定性が立証され、再構成後室温で８時間放置しても貯蔵寿命は保たれることが支持された。

Ｂ．再構成後希釈実験
本発明のシンカリド製剤における再構成および希釈後の安定性を測定するための実験を行った。

本発明のシンカリド製剤の三つの１０５Ｌバッチから得た複製バイアルを、５ｍＬの水で再構成した。バイアルの内容物を定量的に１００ｍＬメスフラスコに移し（リンス液には、米国薬局方（ＵＳＰ）の塩化ナトリウム注入液を用いる）、最大８．４ｍＬの製剤を米国薬局方（ＵＳＰ）の塩化ナトリウム注入液で１００ｍＬに希釈した。シンカリドの効力、ｐＨ、外観を調製から１時間後に検査した。この試験結果を表２９に示す。

再構成から１時間後に測定した希釈サンプル（再構成バイアルの内容物をさらに１００ｍＬに希釈したもの）は、シンカリドの効力、ｐＨ、外観の結果において再構成製品（５ｍＬの水で再構成したバイアル）の製品規格内であった。

［実施例８］
ＨＰＬＣを用いたシンカリド特異的アッセイ
ＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）におけるシンカリド効力を測定し、脱硫化シンカリドの不純度を定量し、シンカリド関連不純物指数を測定するためのＨＰＬＣ法を開発および評価した。この方法は、ＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）を製品パッケージの説明書に従って再構成する場合に、再構成後の安定性を測定するのに好適である。この逆相法は、Ｃ₁₈（５μｍ、３００Å）カラム、０．１５％トリフルオロ酢酸水溶液（溶液Ａ）および０．１２５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（溶液Ｂ）から成る移動相を用いた階段的勾配溶出を採用し、２１５ｎｍのＵＶ検出を行った。

図１２は、５ｍＬの水で再構成し、シンカリド濃度を１μｇ／ｍＬにしたＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）の凍結乾燥改良製剤の等倍および拡大スケールクロマトグラムを示す。

［他の実施例］
本発明は好ましい実施例を参照して説明したが、当業者はこの本質的な特徴を容易に認め、本発明のその精神および要旨から逸脱することなく、各種用途や条件に合わせて、各種変形や修正をなすことが可能である。当業者は、通常の実験の範囲を超えることなく、ここに説明した本発明の具体的な実施例に相当するものを多く認識しうる。このような相当物は、本発明の趣旨に包含される。

本明細書において言及された出版物、特許および出願は、参照により、この明細書に組み込まれる。

１−デ（５−オキソ−L−グルタミン−５−L−メチオニンカエルレイン[１−デ（５−オキソ−Ｌ−グルタミン−５−Ｌ−プロリン）−２−デ−Ｌ−メチオニンカエルレイン]、すなわち、「シンカリド」（ＣＡＳ番号２５１２６−３２−３）の化学構造を示す図である。アミノ酸残基である「Ｍｅｔ３」および「Ｍｅｔ６」の輪郭を点線で示す図である。 シンカリド（Ｍｅｔ３）モノスルホキシドの化学構造を示す図である。 シンカリド（Ｍｅｔ６）モノスルホキシドの化学構造を示す図である。 シンカリド（Ｍｅｔ３、６）ジスルホキシドの化学構造を示す図である。 ３５ｍＭのリン酸緩衝液中で、２４時間にわたる、シンカリド回収率に対するｐＨの影響を示すグラフ図である。データは各ｐＨ毎に示され、縦のバーは、左から順に０、６、２４時間後の結果を示す。 本発明の製剤中で、８時間にわたる、シンカリド回収率に対するｐＨの影響を示すグラフ図である。データは各ｐＨ毎に示され、縦のバーは、左から順に０、４、８時間後の結果を示す。 ペンテト酸（ＤＴＰＡ）の存在下・非存在下におけるシンカリドＭｅｔ３およびＭｅｔ６モノスルホキシドの割合（対シンカリド）を示すグラフ図である。 ０．６３ｍＭのＣｕ²⁺と混合したＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）実験用製剤（ＤＴＰＡなし）のクロマトグラムである。 ０．６３ｍＭのＣｕ²⁺とスパイクしたＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）実験用製剤（１ｍＭのＤＴＰＡ）のクロマトグラムである。 ０．１８ｍＭのＭｎ²⁺と混合したＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）実験用製剤（ＤＴＰＡなし）のクロマトグラムである。 ０．１８ｍＭのＭｎ²⁺と混合したＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）実験用製剤（１ｍＭのＤＴＰＡ）のクロマトグラムである。 ５ｍＬの水で再構成され、シンカリド濃度を１μｇ／ｍＬにしたＫＩＮＥＶＡＣ（登録商標）の凍結乾燥改良製剤の等倍および拡大クロマトグラムを示す。

Claims (9)

1. （ａ）有効量のシンカリド、
   （ｂ）マンニトール、
   （ｃ）アルギニン、
   （ｄ）メチオニン、
   （ｅ）リジン、
   （ｆ）メタ重亜硫酸ナトリウム、
   （ｇ）ポリソルベート２０、
   （ｈ）ペンテト酸（ＤＴＰＡ）、および、
   （ｉ）リン酸水素二カリウム、
   からなる、安定化しており、かつ、生理的に許容されるシンカリド製剤。
2. ６．０〜８．０のｐＨを有する請求項１に記載の製剤。
3. 非経口投与に適する請求項１に記載の製剤。
4. （ａ）０．０００８〜０．００１２ｍｇ／ｍＬのシンカリド、
   （ｂ）２０〜５０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、
   （ｃ）２〜７ｍｇ／ｍＬのアルギニン、
   （ｄ）０．２〜１．０ｍｇ／ｍＬのメチオニン、
   （ｅ）２〜３０ｍｇ／ｍＬのリジン、
   （ｆ）０．００２〜０．０１２ｍｇ／ｍＬのメタ重亜硫酸ナトリウム、
   （ｇ）０．０００００１〜０．００３ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０、
   （ｈ）０．１〜３．０ｍｇ／ｍＬのペンテト酸（ＤＴＰＡ）、および、
   （ｉ）１．１〜１．８ｍｇ／ｍＬのリン酸水素二カリウム、
   からなり、安定化しており、かつ、生理的に許容されるシンカリド製剤。
5. （ａ）有効量のシンカリド、
   （ｂ）マンニトール、
   （ｃ）アルギニン、
   （ｄ）メチオニン、
   （ｅ）リジン、
   （ｆ）メタ重亜硫酸ナトリウム、
   （ｇ）ポリソルベート２０、
   （ｈ）ペンテト酸（ＤＴＰＡ）、および、
   （ｉ）リン酸水素二カリウム
   を混合するステップを有する、安定化したシンカリド製剤の製造方法。
6. （ｉ）（ａ）有効量のシンカリド、
   （ｂ）マンニトール、
   （ｃ）アルギニン、
   （ｄ）メチオニン、
   （ｅ）リジン、
   （ｆ）メタ重亜硫酸ナトリウム、
   （ｇ）ポリソルベート２０、
   （ｈ）ペンテト酸（ＤＴＰＡ）、および、
   （ｉ）リン酸水素二カリウム、
   からなる粉末混合物、
   （ｉｉ）前記粉末混合物を保持する容器、および、
   （ｉｉｉ）選択的に、生理的に許容される流動体、
   からなるキット。
7. 前記容器がバイアルである請求項６に記載のキット。
8. 完全非経口栄養法（ＴＰＮ）に伴う病状を治療または防止するための薬剤の調合における、請求項１に記載のシンカリド製剤の使用。
9. 前記病状が、ＴＰＮ関連の胆汁うっ滞である請求項８に記載の使用。

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