WO2006132389A1

WO2006132389A1 - 核酸、当該核酸をコードするアミノ酸、当該核酸及びアミノ酸からなるプローブ、及び当該プローブを用いたスクリーニング法

Info

Publication number: WO2006132389A1
Application number: PCT/JP2006/311677
Authority: WO
Inventors: Masahiro Ishiura; Kiyoshi Onai
Original assignee: National University Corporation Nagoya University
Priority date: 2005-06-09
Filing date: 2006-06-05
Publication date: 2006-12-14
Also published as: JPWO2006132389A1; JP5145560B2; US20100297613A1

Abstract

　以下の(ａ)、又は(ｂ)からなる生物時計の制御に関与する核酸。(ａ)配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−2846で示される塩基配列からなる核酸。(ｂ)前記塩基配列番号１−2846の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸

Description

核酸、当該核酸をコードするアミノ酸、当該核酸及びアミノ酸からなるプローブ、及ぴ当該プローブを用いたスクリーニング法

技術分野

本発明は、核酸、当該核酸を明コードするアミノ酸、当該核酸及ぴアミノ酸からなるプローブ、及ぴ当該プローブを用いたスクリーニング法に関し、特に、生物時計に関与する核酸、当該核酸をコードするアミノ酸、当該核酸及びアミノ酸からなるプローブ、及び当該プローブを用いたスクリーニング法に関する。

背景技術

書

外界の昼夜交替に伴う光や温度変化の日周変動に適応するため、シァノバクテリアからヒトに至るまで、ほとんど全ての生物は生物時計（概日時計または体内時計とも呼ばれる）を備えており、生理活性に 24時間周期のリズム（概日リズム）を示す。この概日リズムの発振は時計遺伝子の正と負のフィードバック発現制御によって生み出されていることが藍色細菌、ァカパンカビ、ショウジヨウバエ、ネズミ、ヒトなどで明らかにされている（Dunlap, Cell, 96 : 271-290 (1999) ; Ishiura et al.， Science 281： 1519-1523 (1998) ; Stanewsky, J. Neurosci. 54 : 111-147 (2003) )。生物界の間で時計遺伝子の類似性は見い出されていないが、リズム発振の制御メカニズムは極めて類似している。植物においては、気孔の開閉、葉の就眠運動、胚軸伸長、光合成、光周的花成、形態形成、様々な代謝活性など、ほとんど全ての生理現象が生物時計によって支配されている（Lumsden and Millar, Biological Rhythms and Photoperiodism m Plants, Oxford: Bios Scientific Publisher (1998)； McClung, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52 : 139-162 (2001) )。また、生物時計は遺伝子発現も制御している。例えば、モデル高等植物であるシロイヌナズナでは連続明条件下で全遺伝子の約 6 % が日周変動を伴った発現をしていることが明らかとなっている（Harmer et al. , Science 290:2110-2113 (2000))_o し力し、植物の時計遺伝子は未だに確定されておらず、生物時計の分子メカニズムもほとんど未解明である。

一般に、植物の時計遺伝子として必要とされる条件は以下の 5点である：（1) —遺伝子の機能喪失によって全ての概日リズムが失われる、（2)—遺伝子の機能喪失によつて光周性が喪失する、 (3)遺伝子発現が連続明条件下およぴ連続暗条件下で概日リズムを示す、（4)遺伝子の過剰発現は全ての概日リズムを破壌する、（5) 自身の遺伝子発現をフィードパック制御する。しかし、これらの条件を全て満たす植物の遺伝子は発見されていな!/、。

シロイヌナズナにおいては、遺伝子 (Wang and Tobin, Cell 93:1207 - 1217 (1998))、遺伝子（Schaffer et al.， Cell 93: 1219-1229 (1998))、 T0C1/APRR1 遺伝子（Makino et al.， Plant Cell Physiol. 43:58-69 (2000)； Strayer et al. , Science 289:768-771 (2000))、 L¾遺伝子（Doyle et al. , Nature 419 :74 - 77 (2002) )、が時計遺伝子であるとする説が存在している (Young and Kay, Nat. Rev. Genet. 2:702—715 (2001); Yanovsky and Kay, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4:265-275 (2003))。また、シロイヌナズナにおいては概日リズムのパラメーター (リズムの周期や位相、および振幅）に影響する遺伝子が発見されているが、これらは光受容体および光シグナル伝達系の遺伝子である（Hayama and Coupland, Curr. Op in. Plant Biol. 6:13-19 (2003)； Yanovsky and Kay, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4:265-275 (2003))。

発明の開示

し力しながら、これらの遺伝子は、先に述べた植物の時計遺伝子として必要とされる条件を満たさない。これらの遺伝子を時計遺伝子と考える場合の最大の問題点は、これらの遺伝子はいずれも一遺伝子の機能喪失で概日リズムが喪失しないので、これらの遺伝子はリズム発振に必須ではないという点である。以上の状況から、植物の時計遺伝子はまだ同定されていないと考えられる。

そこで、本発明は、生理現象、生理活性を制御することが可能な生物時計を構成する遺伝子、及び当該遺伝子がコードするタンパク質を提供することを目的とするものである。

上記目的を達成するために、本発明者らは、まず、シロイヌナズナにおいて網羅的かつ大規模な時計変異体のスクリ一ユングを行い、無周期変異体 ^ - 変異体と

これらの変異体の原因遺伝子として本発明の核酸、及び当該核酸がコードするタンパク質を見出した。

すなわち、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ a )、又は（ b ) 、すなわち、

( a )配列表の配列番号 1に示す、塩基配列番号 1一 2846で示される塩基配列からなる核酸、

( b )前記塩基配列番号 1一 2846の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。

また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の )、又は（b )、すなわち、

( a )配列表の配列番号 2に示す、塩基配列番号 1一 4554で示される塩基配列からなる核酸、

( b )前記塩基配列番号 1—4554の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 8 0 %の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。

また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の）、又は（b )、すなわち、

( a )配列表の配列番号 3に示す、塩基配列番号 1一 4700で示される塩基配列からなる核酸、

( b )前記塩基配列番号 1一 4700の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 8 0 %の相同性を有する核酸、力らなることを特徵とする。

また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（a )、又は（b )、すなわち、

( a )配列表の配列番号 4に示す、塩基配列番号 1一 1505 で示される塩基配列からなる核酸、

( b )前記塩基配列番号 1一 Ιδθδの塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。

( a )配列表の配列番号 5に示す、塩基配列番号 1一 400で示される塩基配列からなる核酸、

( b )前記塩基配列番号 1—400 の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 8 0 %の相同性を有する核酸からなる。

( a )配列表の配列番号 6に示す、塩基配列番号 1一 641 で示される塩基配列からなる核酸、

( b )前記塩基配列番号 1—641 の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 8 0 %の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。

( a )配列表の配列番号 7に示す、塩基配列番号 1一 1400で示される塩基配列からなる核酸、

( b )前記塩基配列番号 1一 1400の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。

また、本発明のプローブは、請求項 1〜 7項のいずれか 1項に記載の核酸からなることを特 ί敷とする。

また、本発明のプローブの好ましい実施態様において、生物における生物時計の制御に関与する遺伝子を探索用に使用することを特徴とする。

本発明の生物時計の制御に関与するぺプチド断片は、以下の（ a )、又は（ b )、すなわち、

( a )配列表の配列番号 8に示す、アミノ酸配列番号 1一 323 で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、

( b )当該配列番号 8に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片、からなることを特敷とする。

また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（a )、又は ( b )、すなわち、

( a )配列表の配列番号 9に示す、ァミノ酸配列番号 1一 298 で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、

( b )当該配列番号 9に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、からなることを特 ί敷とする。

( a )配列表の配列番号 1 0に示す、ァミノ酸配列番号 1一 238 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片、

( b )当該配列番号 1 0に示す、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片、からなることを特徴とする。

また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（a)、又は (b) 、すなわち、

(a)配列表の配列番号 1 1に示す、アミノ酸配列番号 1—312 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片、

( b )当該配列番号 1 1に示す、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付カロされていて、かつ前記ァミノ酸配列と 80 %の相同性を有するぺプチド断片、からなることを特徴とする。

また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（a)、又は (b)、すなわち、 _t

( a )配列表の配列番号 1 2に示す、ァミノ酸配列番号 1一 70で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、

(b)当該配列番号 1 2に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 80 %の相同性を有するぺプチド断片、からなることを特徴とする。

( a )配列表の配列番号 1 3に示す、ァミノ酸配列番号 1一 185 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片、

(b)当該配列番号 1 3に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 80 %の相同性を有するぺプチド断片、からなることを特徴とする。

また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（a)、又は (b)、すなわち、

( a )配列表の配列番号 14に示す、ァミノ酸配列番号 1一 314で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片、

― Ό― ( b )当該配列番号 1 4に示す、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、力つ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、力、らなることを特徴とする。

また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の）、又は

( b ) 、すなわち、

( a )配列表の配列番号 1 5に示す、アミノ酸配列番号 1—121 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片、

( b )当該配列番号 1 5に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、力つ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片、からなることを特 ί敷とする。

( a )配列表の配列番号 1 6に示す、ァミノ酸配列番号 1—200 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片、

( b )当該配列番号 1 6に示す、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、からなることを特 ί敷とする。

また、本発明のプローブは、請求項 1 0〜1 8項のいずれか 1項に記載のぺプチド断片からなることを特徴とする。

また、本発明の生物時計の制御に関与する遺伝子のスクリーニング方法は、請求項 8、 9、又は 1 9項のいずれか 1項に記載のプローブを用いたことを特徴とする。

また、本発明の生物時計の制御に関与する遺伝子のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、スクリーニングを、 in situハイブリダイゼーション法、サザンハイプリダイゼーション法、全塩基配列決定からなる群から選択される少なくとも 1種を用いて行なうことを特徴とする。また、本発明のペプチド断片の好ましい実施態様において、前記ペプチド断片が、細胞の核における特定の遺伝子の転写、概日リズムの発振と安定ィ匕を制御することを特徴とする。

また、本発明のペプチド断片の好ましい実施態様において、前記ペプチド断片が、 GARPフアミリーに属する DNA結合モチーフを有することを特徴とする。また、本発明の生物時計制御用組成物は、請求項 1 0〜1 8項のいずれか 1項に記載のぺプチド断片を含有することを特徴とする。

また、本発明のベクターは、請求項 1〜7項のいずれか 1項に記載の DNA又は RNAを含有していることを特徴とする。

また、本発明の形質転換体は、請求項 1〜7項のいずれか 1項に記載の DNA又は RNAを発現可能に保持することを特徴とする。

また、本発明のペプチドの生産方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含む、ことを特徴とする。

また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の）、又は ( b ) 、すなわち、

( a )配列表の配列番号 8に示す、ァミノ酸配列番号 1—210 で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、

( b )当該配列番号 8に示す、ァミノ酸配列番号 1一 210で示されるァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付カ卩されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、からなる。

また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（a )、又は ( b ) 、すなわち、

( a )配列表の配列番号 8に示す、アミノ酸配列番号 1—143 で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、

( b )当該配列番号 8に示す、ァミノ酸配列番号 1一 143で示されるァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、力らなる。

また、本発明のプローブは、請求項 2 8又は 2 9項に記載のペプチド断片からなる。

また本発明の生物時計の制御に関与するぺプチド断片のスクリ一二ング方法は、請求項 3 0記載のプローブを用いることを特徵とする。

本発明によれば、 7遺伝子の相同遺伝子 OsPCLlをイネゲノムからも単離できたので、イネにおいてもシロイヌナズナと同様な操作が可能となるという有利な効果を奏する。さらに、尸 7遺伝子の相同遺伝子の cDNAをジャガイモ、トマト、タバコ、モロコシ、マツにおいても見出した。これらの本発明の核酸、及びぺプチド断片によれば、それぞれの植物において時計遺伝子として機能していると容易に推定され、本発明の PCL1遺伝子または PCL1相同遺伝子および PCL1類似遺伝子を人為的に操作することで、光周的花成を含めた高等植物の様々な生理現象 ·生理活性を制御するために基本的な研究材料を提供し得るという有利な効果を奏する。

また、本発明によれば、時計遺伝子のコードする時計タンパク質のアミノ酸配列が明らかとなったので、時計タンパク質の活性を制御する農薬を開発することで、任意の時期に効率的に植物の生理活性を制御する道も開かれるという有利な効果を奏する。これによつて、農産物の生産性向上や品種改良などを効率的に進めることが可能となる。

図面の簡単な説明

図 1は、連続明条件下または連続喑条件下における cL?変異体の GI'.： ΖίΤ生物発光パターンを示す。野生型株 G-38 (青）、 7- 7変異体（赤）、変異体（茶）の 6 : : ΖίΤ生物発光を連続明条件下（a) または連続暗条件下（b) で測定した。図中の白抜きのバーと黒塗りのバーは、それぞれ喑期と明期を表している。図中のプロットは各％個体の平均値土標準偏差である。

図 2は、明暗サイクル条件下または温度サイクル条件下における pell変異体の J: 生物発光パターンを示す。野生型株 G- 38 (青）と _C 7- 7変異体（赤）の J: : Z T生物発光を 12時間喑期 /12時間喑期の明暗サイクル（a ; 12L12D) または 12時間 22°C/12時間 17°Cの温度サイクル（b ; 22°C17°C) を与えながら測定した。図中の白抜きのバーと黒塗りのバーは、それぞれ喑期と明期を表して!/、る。図中の黄色レ、バーと水色のバーは、それぞれ 22°Cの期間と 17°Cの期間を表している。図中のプロットは各 96個体の平均値土標準偏差である。

図 3は、 7変異体の葉の就眠運動を示す。野生型株 G - 38 (青）と _CJ / 変異体（赤）の葉の就眠運動を連続明条件下で測定した。図中の白抜きのバーは暗期を表している。測定開始時の子葉の Y軸方向の位置を 0としてプロットした。図 4は、 c 変異体における CAB2、 TOCl、 ELF4、 CCA1、 Z ダの遺伝子発現のノザンブロット解析を示す。連続明条件下における野生型株 G - 38 (青）と pcll-l 変異体（赤）の細胞内の J mRNA (a) 、 CAB2 mRNA (b) 、 TOCl mRNA (c) 、 ELF4 mRNA (d) 、 CCA1 mRNA (e) 、 LHV mRNA (f) レベルのノザンプロット解析を行つた。

図 5は、 c 変異体の光周的花成を示す。野生型 Co/- 株及ぴ G- 38株、 pell 異体 pcll-l及ぴ pell- 2を 16時間明期 /8時間暗期（16L8D；薄緑）の長日条件下または 10時間明期 /14時間暗期（10L14D ;濃緑）の短日条件下で培養して、花成時期を決定した。

図 6は、 PCL1遺伝子のマップベースクローニングと PCL1遺伝子の構造を示す。図 7は、 PCL1タンパク質の構造を示す。 PCL1タンパク質の構造と PCL1タンパク質、 ARR1タンパク質、 ARR10タンパク質の GARPモチーフのアミノ酸残基のァライメントを示した。 PCL1タンパク質に対して一致するアミノ酸残基を赤線で囲んだ。図 8は、 PCL1タンパク質の細胞内局在の様子を示す。 (a, c， e) 蛍光顕微鏡で観察した GFPの蛍光。（b， d, e) は光学顕微鏡で観察した細胞の像。（a, b) GFP のみを発現させた場合。（c， d) PCL1-GFP1融合タンパク質を発現させた場合。 (e, f) GFP-PCL1融合タンパク質を発現させた場合。図 9は、 PCL1タンパク質と PCL1類似タンパク質および相同タンパク質との比較を示す。シロイヌナズナ iArabidopsis thaliana の PCL1タンパク質、シロイヌナズナ iArabidopsis thaliana)の PCL1類似タンパク質 PCLL、ィネ Oryza sativa) の PCL1相同タンパク質 OsPCLl、タバコ Nicotiana benthami の PCL1相同タンパク質 NbPCLl、トマト ycopersicon esculen turn) の PCL1相同タンパク質 LePCLl、ジャガイモ Solanum tuberoswi) の PCL1相同タンパク質 StPCLl、マツ {Pinus taeda)の PCL1相同タンパク質 PtPCLlの各ァミノ酸配列のマルチプルァライメントを示した。一致するアミノ酸残基にはアスタリスク（*) を、類似するアミノ酸残基にはドット（.）を付した。ギャップはバー（-）で示した。 GARPモチーフはアミノ酸残基の上に赤線を付した。 PCL1アミノ酸配列中で赤文字で示したアミノ酸残基は、 cJ 変異と ? ^変異で停止コドンに変わっているアミノ酸残基である。

図 1 0は、尸 7遺伝子発現のノザンブロット解析を示す。連続明条件下における野生型株 G-38 (青）と -⁷変異体（赤）の細胞内の/⁷ CL/ mRNAのレベルをノザンブロット解析した。

図 1 1は、尸：： ΖίΤ生物発光リズムを示す。野生型株 G- 38 (青） pcU- 異体（赤）の/⁷ ： Ζ£Τ生物発光を連続明条件下（a) または連続暗条件下（b) で測定した。図中の白抜きのバーと黒塗りのパーは、それぞれ喑期と明期を表している。図中のプロットは各 48個体の平均値土標準偏差である。

図 1 2は、 ¾Z7-ox植物体の GI：生物発光パターンおよび葉の就眠運動を示す。 (a, b) 野生型株 G-38 (青）と / ¾Z7 - or植物体（緑）の：^ T生物発光を連続明条件下（a) または連続暗条件下（b) で測定した。図中の白抜きのバーと黒塗りのバーは、それぞれ暗期と明期を表している。図中のプロットは、それぞれ 96個体（a) または 48個体（b) の平均値土標準偏差である。（c) 野生型株 G-38 (青）と尸植物体（緑）の葉の就眠運動を連続明条件下で測定した。測定開始時の子葉の Y軸方向の位置を 0としてプロットした。図中の白抜きのバ一は暗期を表している。図中のプロットは各 12個体の平均値土標準偏差である。図 1 3は、 PCLl-o 植物体における内在 PCL1遺伝子発現のノザンブロット解析を示す。連続明条件下における野生型株 G-38 (青）、変異体（赤）、 PCLl-ox 植物体（緑）の細胞内の内在尸遺伝子由来の 7 mRNAのレベルをノザンブロット解析した。

図 1 4は、植物の生物時計のモデル図を示す。本発明で発見した遺伝子制御様式を赤線で、既知の遺伝子制御様式を青線で示した。矢印は遺伝子発現の促進を、横線は遺伝子発現の抑制を表している。 /⁷ 7遺伝子発現の負の自己フィードバックループは時計発振に必須であり、これが植物時計の中心振動体である。

図 1 5— 1は、尸遺伝子と PCL1タンパク質 Uirabidopsis thaliand) の配列を示す図である。

図 1 5— 2は、 PCL1遺伝子と PCL1タンパク質 lrabidopsis thaliana) の配列を示す図である。

図 1 5 _ 3は、 PCL1遺伝子と PCL1タンパク質、Arabidopsis thaliana) の配列を示す図である。

図 1 5— 4は、 PCL1遺伝子と PCL1タンパク質、Arabidopsis thaliana) の配列を示す図である。

図 1 6—1は、尸遺伝子と PCLLタンパク質 irabidopsis thaliana) の配列を示す図である。

図 1 6— 2は、 i¾ZZ遺伝子と PCLLタンパク質 Arabidopsis thaliana) の配列を示す図である。

図 1 6— 3は、遺伝子と PCLLタンパク質、Arabidopsis thaliana) の配列を示す図である。

図 1 6— 4は、尸遺伝子と PCLLタンパク質、Arabid。psis thaliana) の配列を示す図である。

図 1 7 _ 1は、尸 7遺伝子と OsPCLlタンパク質 Oryza sativ ) の配列を示す図である。

図 1 7— 2は、（¾尸 7遺伝子と OsPCLlタンパク質 Oryza sativa) の配列を示す図である。

図 1 7— 3は、遺伝子と OsPCLlタンパク質 0ryza sativa) の配列を示す図である。

図 1 ⁷— 4は、尸遺伝子と OsPCLlタンパク質 Oi za sativa) の配列を示す図である。

図 1 8— 1は、遺伝子と NbPCLlタンパク質 Nicotiana benthatnina の配列を示す図である。

図 1 8— 2は、 7\¾尸 _ 遺伝子と NbPCLlタンパク質 Nicotiana benthamina) の配列を示す図である。

図 1 8— 3は、 7\¾尸ゾ遺伝子と NbPCLlタンパク質 Nicotiana benthamina) の配列を示す図である。

図 1 9は、 7遺伝子と NtPCLlタンパク質 Nicotiana tabacimi) の配列を示す図である。

図 2 0—1は、 Ze ¾Z7遺伝子と LePCLlタンパク質 ycopersicon esculentum) の配列を示すである。

図 2 0— 2は、尸 7遺伝子と LePCLlタンパク質 ycopersicon esculentum) の配列を示すである。

図 2 1— 1は、 5ΐ尸 7遺伝子と StPCLlタンパク質、Sol画 m tuberosum) の配列を示す図である。

図 2 1— 2は、尸 7遺伝子と StPCLlタンパク質 ^Solamm tuberosuni) の配列を示す図である。

図 2 1 _ 3は、 StPCLl遺伝子と StPCLlタンパク質 Solammi tuberosum) の配列を示す図である。

図 2 2は、 PCLL ： ZZT生物発光リズムを示す。野生型の PCLL:： IMCW レポータ一株の生物発光を連続明（a) または連続暗（b) で測定した。図中の白抜きのバ一と黒塗りのバーは、それぞれ暗期と明期を表している。図中のプロットは各 96 個体の平均値土標準偏差である。

図 2 3は、 ¾2 -ox植物体の /: : ΖίΤ生物発光パターンを示す。 or植物体の :：ΖίΤ生物発光を連続明で測定した。図中の白抜きのパーは明期を表している。図中のプロットは、それぞれ 96個体の平均値土標準偏差である。

発明を実施するための最良の形態

まず、本発明の核酸について説明すると、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（a )、又は（b ) 、すなわち、

( b )前記塩基配列番号 1—2846の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有する核酸、力らなる。当該核酸は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、後述するように、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。なお、本明細書において、

「遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子」とは、塩基配列において 10個以下、好ましくは 7個以下、更に好ましくは 3個以下の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列を有する遺伝子を意味する。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号 1に示す遺伝子とハイプリッドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。 ·

( b )前記塩基配列番号 1一 4554の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 8 0 %、好ましくは 9 0 %、より好ましくは、 9 5 % の相同性を有する核酸、からなる。当該核酸は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号 2に示す遺伝子とハイプリッドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（a )、又は（b )、すなわち、

( b )前記塩基配列番号 1一 4700の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 8 0 %、好ましくは 9 0 %、より好ましくは 9 5 % の相同性を有する核酸、からなる。本発明の遺伝子は、イネのゲノム由来の遺伝子である。遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号 3に示す塩基配列において 10個以下、好ましくは 7個以下、更に好ましくは 3 個以下の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列を有する遺伝子を意図する。当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号 3に示す遺伝子とハイプリッドを形成する。

( a )配列表の配列番号 4に示す、塩基配列番号 1—1505 で示される塩基配列からなる核酸、

( b )前記塩基配列番号 1一 1505の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %の相同性を有する核酸、からなる。当該核酸は、タバコ由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。また、当該遺伝子は、ストリンジヱントな条件下で、配列表の配列番号 4に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。

( b )前記塩基配列番号 1—400 の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 8 0 %の相同性を有する核酸からなる。当該核酸は、別の系統のタバコ由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号 5に示す遺伝子とハイプリッドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。

( b )前記塩基配列番号 1一 641 の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 8 0 %の相同性を有する核酸、力らなることを特徴とする。当該核酸は、トマト由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号 6に示す遺伝子とハイブリツドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。

( b )前記塩基配列番号 1一 1400の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。。当該核酸は、ジャガイモ由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。また、当該遺伝子は、ストリンジヱントな条件下で、配列表の配列番号 7 に示す遺伝子とハイプリッドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。

次に、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片について説明する。本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（a )、又は（b )、すなわち、

( a )配列表の配列番号 8に示す、ァミノ酸配列番号 1一 323で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、

( b )当該配列番号 8に示す、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、からなる。当該ペプチド断片は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されていて、かつ、前記アミノ酸配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有するぺプチド断片をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。なお、本明細書において、「アミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付カ卩されたアミノ酸」とは、ァミノ酸配列にぉレ、て 10 個以下、好ましくは 7個以下、更に好ましくは 3個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付カ卩された配列を有するァミノ酸配列を意味する。かかるァミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。

( b )当該配列番号 9に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、力らなる。当該ペプチド断片は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されていて、かつ、前記アミノ酸配列と 8 0。好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有するぺプチド断片をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド探索用のプローブとして利用することができるからである。またかかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。

( b )当該配列番号 1 0に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片、からなる。当該ぺプチド断片は、イネ由来のものである。本発明のぺプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有するぺプチド断片をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するぺプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。力かるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。

( a )配列表の配列番号 1 1に示す、ァミノ酸配列番号 1一 312 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片、

( b )当該配列番号 1 1に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、からなる。本発明のペプチド断片は、タバコ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と

8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有するァミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。

( b )当該配列番号 1 2に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、別の系統にかかるタバコ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプロ一プとして利用することができるからである。力、かるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。

( b )当該配列番号 1 3に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片、からなる。本ぺプチド断片は、トマト由来のものである。本発明のぺプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。

( a )配列表の配列番号 1 4に示す、ァミノ酸配列番号 1一 314で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片、

( b )当該配列番号 1 4に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、力つ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、ジャガイモ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有するァミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するぺプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。力かるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。

( a )配列表の配列番号 1 5に示す、ァミノ酸配列番号 1—121 で示されるアミノ酸配列からなるぺプチド断片、

( b )当該配列番号 1 5に示す、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、マツ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されていて、かつ、前記アミノ酸配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するぺプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。力かるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。

( b )当該配列番号 1 6に示す、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、力つ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、モロコシ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するぺプチド断片探索用のプローブとして^ ¾用することができるからである。力かるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。

( a )配列表の配列番号 8に示す、アミノ酸配列番号 1—210 で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、

( b )当該配列番号 8に示す、ァミノ酸配列番号 1一 210で示されるァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記ァミノ酸配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するぺプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるァミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（a )、又は ( b ) 、すなわち、

( b )当該配列番号 8に示す、ァミノ酸配列番号 1一 143で示されるァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するペプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付カロされていて、かつ、前記ァミノ酸配列と 8 0 %、好ましくは、 9 0 %、より好ましくは 9 5 %の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付カ卩されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するぺプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるァミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。これらの配列は、本発明のぺプチド断片を比較して理解することができるように、ホモ口ジ一が非常に高く、この領域が生物時計としての機能に極めて重要な領域であることを導き出すことが出来る。したがって、これらの重要領域を、例えばプローブとして使用して、さらなる生物時計の解明にも役立たせることができる。ここで、本発明の核酸、及びぺプチド断片の精製、単離方法について説明する。上記核酸、及びペプチド断片は、特に限定されるものではないが、以下の手順によって、精製、単離することができる。

一度の測定で多検体の高等植物の生物発光リズムを全自動で測定して測定データの解析を行うために、生物発光測定装置 2種類 (Okamoto et al. , Anal. Biochem.

340 : 187-192 (2005)； Okamoto et al. , Plant Cell Environ. 28 : 1305-1315 (2005)；特開 2004-267058 ; 特開 2005-143371)とリズム角军析プログラム（Okamoto et al.，

Anal. Biochem. 340： 193-200 (2005) ; 特許第 3787631号）から構成される生物発光リアルタイムモニタリング ·スクリーニングシステムを用いることができる。これらを用いて、例えば、シロイヌナズナの時計関連遺伝子であり遺伝子発現が概日リズムを示すことが知られているシロイヌナズナの 6J遺伝子 (Fowler et al. , EMBO J. 18 : 4679-4688 (1999) ; Park et al.， Science 285 : 1579- 1582 (1999) ) のプロモーター領域と改良型ホタルルシフェラーゼ遺伝子； p_romega 社）

{LUC (登録商標）、 Promega (登録商標） ) のコード領域を接続した生物発光レポーター遺伝子カセット i . : LUC)を作製し、これを野生型シロイヌナズナのゲノムへ遺伝子移入し、生物発光レポーター株 (G-38株）を作出した。作出した発光レポーター株 G- 38の種子を ethyl methanesulfonate (EMS)で変異原処理し、変異原処理から 2世代目の植物体（M₂植物体） 5万個体の生物発光リズムを測定してリズム変異体をスクリ一二ングし、この結果、生物発光リズムが完全に消失した無周期変異体を 5個分離した。これらの無周期変異体は、連続明条件下と連続暗条件下のいずれにおいても GI'.： ZZT発光レポーター遺伝子の生物発光リズムが無周期であり、さらに、葉の就眠運動リズムも無周期であり、そして、これらの無周期変異はいずれも劣性一遺伝子変異であり、 3つの相補性群 PHYT0CL0CK 1 {PCL1) , PCL2, 尸に分類できた。尸ム PCL2, 尸遺伝子は、いずれも植物の時計遺伝子をコードしていると推測された。尸遺伝子の一つである尸 7遺伝子は、マップベースクローニング法によって以下の手順で特定した。変異体の F₃ホモ個体、ェコタイプ Col- 0) と野生型 L 株とを交配し、第 2世代 (F₂) の種子を得た。 F₂植物体を培養し、 6J: : £T発光レポーター遺伝子の生物発光を連続明条件下で測定し、 pc -i変異をホモで持っているホモ個体を選択した。そして、 TAIRウェブサイト（http：〃 www. arabidopsis. org/)で公開されている Col - 0 と Lerの間の多型マーカー（CAPSマーカー及ぴ SSLPマーカー）及ぴ Monsanto Arabidopsis Polymorphism Collectionからリリースされた SNP多型マーカーを利用して変異と多型マーカーとの組換え率を算出した。組換え率がより小さくなる多型マーカーは物理的に/⁵ 7遺伝子により近いので、様々なマーカーとの組換え率を調查することで PCL1遺伝子の染色体上の位置を決定した。その結果、 PCL1遺伝子の物理的位置を第 3染色体上の SNP マーカー F18L15-1 (Monsanto Arabidopsis Polymorphism Collectionの SNP番号 CER468139力ら CER468143を含む）と CAPSマーカー T0PP5の間の約 150kbに位置づけた。この約 150kbの領域における野生型 Cb - 株及び G- 38株と無周期変異体 7 - 7及ぴの塩基配列を決定して比較したところ、 TAIR ウェブサイトのデーターベースに整理番号 At3g46640として整理されている遺伝子上に pcll-1と 7 - の両者で塩基置換が発見できたので、これを PCL1遺伝子であると結論した。 PCL1遺伝子の構造は、 RIKEN (RARGE ; http： //rarge. gsc. riken. go. jp/)及び TAIRウェブサイトで公開されている完全長 cDNAの塩基配列とゲノム DNA配列とを比較することで決定した。タンパク質のァミノ酸配列は、ゲノム DNA又は cDNAの塩基配列から容易に推定することができる。

なお、核酸の塩基配列は、常法により、例えば、ダイターミネータ一法などを用いて決定することができる。また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列から類似タンパク質又はホモ口グタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を予測し、その予測に基づいて様々なオリゴヌクレオチド合成して、これらを PCRプライマ一として PCR法でゲノム DNA又は cDNA等から増幅することができる。さらに、本発明のタンパク質のァミノ酸配列から類似タンパク質又はホモログタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を予測し、その予測に基づいて様々なォリゴヌクレォチド合成して、これらを各種ハイブリダイゼーション法に利用することで遺伝子を同定することができる。

次に、本発明のプローブについて説明する。

本発明のプローブの使用方法としては、上述の核酸を単離したい生物種のゲノム DNA、ゲノム DNAライブラリ一、 cDNAライブラリ一、 RNAなどを直接又は PCR 法で増幅し高分子膜にプロットして固定した後、本発明のプローブをハイプリダィズさせればよい。または、上述の核酸を単離したい生物種の細胞を固定し、細胞内の染色体へ直接本発明のプローブをハイブリダイズさせればよい。ハイプリダイズの方法は、常法により特に限定されるものではないが、例えば、サザンブロッテイング法、 in situ ハイブリダィゼーシ.ヨン法、塩基配列決定法、コロニ一ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、ノザンハイブリダイゼーション法などを挙げることができる。 in situハイブリダイゼーシヨン法は、迅速かつ、的確にスクリーニングすることができるという観点から望ましい。 in situハイプリダイゼーション法には、蛍光 in situハイブリダイゼーシヨン法（以下、 FISH法という）、ラジオアイソトープ in situハイブリダィゼーション法等がある。 RI施設を要求されないという観点から、 FISH法が望ましレ、。

FISH法の概略は、例えば、スライドグラス上に染色体標本を調製し、これに標識プローブをハイプリダイズし、直接検鏡するのが一般的である。

また、本発明のプローブのハイブリダィズに使用される支持体としては、薄膜、粉末、粒状物、ゲル、ビーズ、繊維等の他、分散液、ェマルジヨン等を挙げることができる。これらは適当なカラムに充填して使用してもよい。こららのうち薄膜が好ましく、例えば二トロセルロース膜、ナイ口ン膜が好ましい。

ここで、本発明のプローブに使用される標識の例を説明する。標識の例として当業者に周知のものを使用することができ、特に限定されないが、例えば、 ^{3 2}P、 ^{3 5}Sなどの射性原子、ビォチン基、アジピン基、または酵素類、蛍光標識等などのほか、抗原抗体系を利用する場合には、抗原を含んでいても良い。これらも本発明の範囲に包含される。なお、核酸プローブの場合、プローブの塩基長は、用いるスクリーニング方法により異なり、特に限定されるものではない。

上述のペプチド断片は、また、好ましい実施態様において、前記ペプチド断片が、細胞の核における特定の遺伝子の転写、概日リズムの発振と安定化を制御する。これは、本発明者らの鋭意研究により、本発明の核酸が、生物時計の制御に関与している遺伝子の 1つであることが明らかとされたことからである。本発明の遺伝子は、生物時計の中核をなすものであり、同時に他の遺伝子に対して、転写因子としても作用し、生物の概日リズムの発振と安定ィヒを行っている。

また、本発明のペプチド断片の好ましい実施態様において、前記ペプチド断片が、 GARPフアミリーに属する DNA結合モチーフを有する。当該 DNA結合モチーフを介して他の遺伝子へ結合し、転写因子として機能することによって概日リズムを形成していると考えられる。

また、本発明の生物時計制御用組成物は、本発明のペプチド断片または DNA断片または腿断片を含有し、細胞の生物時計機能活性を促進または抑制するものであり、生物時計制御用糸且成物の様態に制約はない。本発明の生物時計制御用組成物の対象は、生物個体や培養細胞、細胞抽出物、無細胞系の生物時計の in vitro 再構築系などである。

また、本発明のベクターは、上記本発明の核酸（DNA又は RNA) を含有する。また、本発明の形質転換体は、上記本発明の核酸（DNA又は RNA) を発現可能に保持する。そして、本発明のペプチドの生産方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含む。

以下、本発明の組換えベクターの作製について説明する。

本発明の組換えべクターは、本発明の生物時計に関与する遺伝子を適当なべクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中で本発明の生物時計に関与する遺伝子から発現された生物時計に関与するタンパク質を生産させうるものであればどのようなものでも用いることが出来る。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウィルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、 URA3、 n'a ?のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシン、テトラサイクリン、クロラムフエ二コール、ハイグロマイシン B、パスタ（登録商標）などの薬剤に対する耐性遺伝子などが挙げられる。また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することの出来るプロモーター又はその他の制御配列（例えばェンハンサー配列、ターミネータ一配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、 GAL1プモーター、 amyBプモーター、 _Zacプロモーター、 tscプロモーター、 trcプロモ一ター、 C¾ プロモーター等が挙げられる。

また、本発明の形質転換体は、宿主を本発明の組換えべクタで形質転換することにより得られる。宿主としては、本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産することが出来るものであれば特に限定されず、例えば、タバコ培養細胞 BY-2 ゃシロイヌナズナ培養細胞、タバコ植物体、シロイヌナズナ植物体などの植物系細胞、昆虫の培養細胞、動物細胞、分裂酵母や出芽酵母などの酵母、ァスペルギノレス · ソーャゃァスペルギルス .ォリゼー、ァスぺノレギルス ·二ガー、ァカパンカビ等の糸状菌類、大腸菌やバチルス、藍色細菌などの細菌であってもよい。形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことが出来る。植物系細胞の場合は、例えば、ァグロパクテリアを介した形質転換法（Horsch et al. , Science 227 : 1229-1231 (1985)； Hooykaas and Schilperoort, Plant Mol. Biol. 19 : 15-38 (1992)； Clough and Bent, Plant J. 16 : 735 - 743 (1998) ) などを用いることが出来る。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウム法（Ausubel et al.， Current protocols in molecular biology. Greene Publishing Assoc and Wiley-Interscience, New- York (1987) ; Methods Mol. Cell. Biol. 5 : 255-269 (1995) ) などを用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレンダリコール及ぴ塩ィヒカルシゥムを用いる、 Mol. Gen. Genet. 218： 99-104 (1989)の方法を用いることが出来る。細菌を用いる場合は例えば、自然形質転換法 (Ausubel et al.， Current protocols in molecular biology. Greene Publishing Assoc and Wiley- Interscience, New York (1987)； Onai et al.， Mo丄. Genet. Genomics 271 : 50—59 (2004) ) や塩ィヒカノレシゥム法（Ausubel et al.， Current protocols in molecular biology. Greene Publishing Assoc and Wiley - Interscience, New York (1987) )、電気穿孑し法 (Ausubel et al.， Current protocols in molecular biology. Greene Publishing Assoc and Wiley - Interscience, New York (1987)； Methods Enzymol. 194： 182-187 (1990) ) などを用いることができる。

本発明の生物時計に関与するタンパク質の製造方法は、本発明の形質転換体を培養し、得られる培養物から生物時計に関与するタンパク質を採取することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組換えべクタ一中の発現制御配列によつて適当なものを選ぶ。例えば、宿主が植物系培養細胞であり、発現制御配列がプロモーターである場合、例えば、ショ糖を含む培地で細胞を培養することにより、本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産させることができる。また、例えば、宿主が植物体であり、発現制御配列が C^/ プロモーターである場合、例えば、植物体を土壌で培養することにより、本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産させることができる。また、例えば、宿主が酵母であり、発現制御配列がプロモーターである場合、例えば、ラフイノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトースとラフイノースを炭素源とする液体最少培地に希釈 ·接種し、培養することにより、本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産させることができる。また、例えば、宿主がァスペルギルス ·ソーャであり、発現制御配列が a/zひ Wプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産させることができる。また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現制御配列が lacプロモーターである場合、 IPTGを含有する液体培地で培養することにより本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産させることができる。本発明の生物時計に関与するタンパク質が宿主細胞内または菌体表面に生産された場合は、宿主細胞を培地から分離し、その細胞を適当に処理することにより本発明のタンパク質を得ることができる。例えば、細胞内に生産された場合、細胞を物理的又は酵素的に破碎した後、遠心分離および各種クロマトダラフィ一等を使用して本発明の生物時計に関与するタンパク質を分離 ·精製することができる。培養液中に本発明の本発明の生物時計に関与するタンパク質が生産された場合は、遠心分離 ·ろ過等により菌体を除去することにより本発明のタンパク質を得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、本発明の生物時計に関与するタンパク質を更に純度の高いものとして精製することもできる。

本発明の生物時計に関与するタンパク質は、無細胞系のタンパク質合成系を使用して in vitroで合成することも出来る。無細胞系のタンパク合成系の例としては、例えば、コムギ胚芽抽出液由来の無細胞タンパク質合成システムである PR0TEI0S (東洋紡）（PR0TEI0S (登録商標） ) などを挙げることができる。また、本発明の生物時計に関与するタンパク質のァミノ酸配列の一部を in vitroで人工的にぺプチド合成することもできる。こうした本発明の生物時計に関与するタンパク質の in vitroタンパク質合成おょぴぺプチド合成も本発明に含まれる。本発明の生物時計に関与するタンパク質には、精製の際にァフィ二ティーク口マトグラフィーを用いるためのタグ配列を付カ卩して生産してもよい。このようなタグ配列の例としては、例えば、 GSTタグゃ Hisタグ、 Mycタグなどを挙げることができる。

本発明は、高等植物の生物時計の中枢を構成する時計遺伝子 PHYT0CL0CK 1 {PCLDとそれがコードするタンパク質 PCL1、及び遺伝子の応用に関するものである。本発明の尸 7遺伝子が破壌されたシロイヌナズナでは、調査した全ての概日リズムが失われており、光周的花成が野生型の長日性に対して日長不感受性を示した。したがって、本発明の _ /遺伝子を人為的に操作することで、光周的花成を含めた高等植物の様々な生理現象 ·生理活性を制御することが可能であると考えられる。

実施例

ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されることを意図するものではない。以下の実施例は、本発明の一実施態様を説明するための用いたものであり、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨及び範囲を逸脱しない限り、いかなる変更等を排除するものではない。

実施例 1

本発明者らは、モデル高等植物であるシロイヌナズナ rabidopsis thaliana) にお!/、て、シロイヌナズナの 6 遺伝子のプ口モーターと改変型ホタルルシフエラーゼ遺伝子 {LUC) のコード領域を接続した /: :^ T発光レポーター遺伝子の生物発光リズムを指標として、概日リズムに異常を示すリズム変異体を網羅的にスクリーニングし、無周期変異体を 5個分離した。これらの無周期変異体は、連続明条件下と連続喑条件下のいずれにおいても 67: 発光レポーター遺伝子の生物発光リズムが無周期であり、さらに、葉の就眠運動リズムも無周期であった。そして、これらの無周期変異はいずれも劣性一遺伝子変異であり、 3つの相補性翁 PHYTOCLOCK 1 {PCLl) , PCL2, に分類できた（Onai et al. , Plant J. , 41：1-11 (2004) ) ₀ 無周期変異の原因遺伝子の一つである尸 7遺伝子をマップベースクロ一ユング法でクローニングした。 7遺伝子は、先に述べた高等植物の時計遺伝子の条件を全て満たしていたので、植物の真の時計遺伝子であり、また、尸 7遺伝子のコードするタンパク質は、植物の時計タンパク質であると結論した。 PCL1 遺伝子の相同遺伝子はイネ、タバコ、トマト、ジャガイモ、モロコシ、マツにも存在しており、植物一般に時計遺伝子として機能していることが容易に推定できる。本発明は、植物細胞の核における特定の遺伝子の転写、概日リズムの発振と安定ィ匕を制御して！/、る植物の時計遺伝子 PCL1とその相同遺伝子および類似遺伝子、より詳細には、 GARPファミリーに属する DNA結合モチーフを有することを特徴とする植物の時計タンパク質 PCL1とその相同タンパク質およぴ類似タンパク質、それらをコードする DNA及び R A、さらには PCLlタンパク質と PCL1相同タンパク質および PCL1類似タンパク質の組成物、 PCL1タンパク質と PCL1相同タンパク質および PCL1類似タンパク質の発現を可能とするベクタ一及び形質転換体、 PCL1 タンパク質と PCL1相同タンパク質および PCL1類似タンパク質の生産方法に関する。

実施例における植物体、培養条件、概日リズムの測定方法

G ： LUCW レポータ一遺伝子をもつシロイヌナズナ iArabidopsis thai i ana) の生物発光レポーター株 G- 38は、ェコタイプが Coト。でり、特に記載がない限りこれを野生型として使用した。シロイヌナズナの無周期変異体 0/7-_ と pell- 2 は、生物発光レポーター株 G - 38から分離された無周期変異体であり、本発明者らの報告（Onai et al. , Plant J.， 41 : 1-11 (2004) )において、それぞれ 23- 15D9 と 32-5E2として分離された変異体である。無周期変異体 /7 - 7と pell- 2は、いずれも野生型 G- 38と戻し交配後の第 4世代 (F₄)のホモ個体を使用した。シロイヌナズナは、特に言及しない限り、 22. 0 ± 0. 3°C、 1. 5% (w/v) ショ糖を含む MS (Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15 : 473-497 (1962) )固体培地上で本発明者らの方法 (Onai et al. , Plant J. , 41 : 1-11 (2004) )に従って無菌的に生育させた。植物体培養時の照射光は、 70 mol/m²/_Sの白色光であった。

<連続明条件下または連続暗条件下における joo/ 変異体の GI： ZZT生物発光 > 一般に、概日リズムは連続明や連続暗などの一定環境下で自律的に継続する。そこで、まず、変異体の：生物発光が一定環境下で自律振動するのか否かを調べた。連続明おょぴ連続暗条件下における生物発光の測定は、本発明者らの方法（Onai et al.， Plant J. , 41 : 1-11 (2004) )に従って行った。 12時間明期 /12時間暗期の明暗サイクルまたは 12時間暗期 /12時間明期のサイク ■レを与えて生物時計をリセットした後、連続明または連続暗で生物発光を測定した。

野生型株 G - 38と /^L?変異体の GI:： £Τ生物発光パターンを図 1に示した。野生型株 G-38 は連続明と連続暗のいずれの条件下においても明瞭な生物発光リズムを示したが、変異体はどちらの条件下でも無周期であり、リズムを全く示さなかった。したがって、遺伝子は、 ": : Ζ£Τ生物発光リズムに必須であることが判明した。

実施例 2

<明暗サイクル条件下または温度サイクル条件下における pell変異体の J: : ZiT生物発光 >

一般に、概日リズムは明暗サイクルや温度サイクルに同調する。そこで、野生型株 G-38と 7 変異体の GI T生物発光が明暗サイクルおよび温度サイクルに同調するか否かを調べた。明暗サイクルおよび温度サイクル条件下における GI:： ΖίΤ生物発光の測定は、植物体に 12時間明期 /12時間喑期の明暗サイクル（明喑サイクル中の温度は 22°Cで一定）または 12時間 22°C/12時間 17°Cの温度サイクル（温度サイクル中は連続明）を与えながら行った。

明暗サイクル条件下における野生型株 G-38と _pcJ/変異体の GI'.： Ζ£Τ生物発光パターンを図 2aに、温度サイクル条件下における野生型株 G-38と Ζ7変異体の

GI: T生物発光パターンを図 2bにそれぞれ示した。明暗サイクル条件下において野生型株 G- 38は明瞭な生物発光リズムを示したが、変異体の発光パターンは明期に発光量が一定レベルのまま高く保たれ、暗期に発光量が低下するという矩形を示した。これは、 ^遺伝子が光誘導性の遺伝子であり、暗条件よりも明条件で発現量が高いことを反映しているにすぎず、変異体の生物発光は明暗条件下でリズムを示さないことを意味している。同様に、温度サイクル条件下においても野生型株 G- 38は明瞭な生物発光リズムを示したが、 cJ/変異体は 17°C よりも 22°Cで発光量が僅かに高い矩形の発光パターンを示した。これは、発光タンパク質として使用しているホタルルシフェラーゼの酵素活性が 17°Cよりも 22°Cで僅かに高いことを反映しているにすぎず、 pc^変異体の生物発光は温度サイタル条件下でリズムを示さないことを意味している。したがって、遺伝子は GI T生物発光リズムの明暗サイクルおよび温度サイクルに対する同調に必須であることが判明した。

実施例 3 < pell変異体の葉の就眠運動 >

高等植物においては、葉の上下運動（就眠運動）が概日リズムを示すことが広 S知りれている (Lumsden and Millar, Biological Rhytnms and Photoperiodism in Plants. Oxford: Bios Scientific Publisher (1998) )。 pell変異体の生物発光の無周期性が生物時計本体の異常によってもたらされているのであれば、：生物発光とは別の指標である葉の就眠運動リズムも無周期になっていると予想される。そこで、 Ζ7変異体の葉の就眠運動を測定した。葉の就眠運動の測定は、本発明者らの方法 (Onai et al. , Plant J. , 41 : 1-11 (2004) ) に従って行った。

野生型株と変異体の葉の就眠運動パターンを図 3に示した。野生型株は明瞭な就眠運動リズムを示したが、 c 変異体では就眠運動は観察されず無周期であり、リズムを全く示さなかった。したがって、尸 7遺伝子は葉の就眠運動リズムに必須であることが判明した。

実施例 4

く 7変異体における GI、 CAB2、 T0C1、 ELF4、 CCA1、 Z の遺伝子発現のノザンブロット解析 >

高等植物の生物時計に深く関与すると考えられている遺伝子として GIヽ T0C ELF4、 CCA1、 Z ] ^が発見されており、これらの遺伝子の mRNAレベルは概日リズムを示すことが知られている（Young and Kay, Nat. Rev. Genet. 2 : 702-715 (2001)； Salome and McClung, J. Biol. Rhythms 19 :425-435 (2004) )。また、光合成系の遺伝子である遺伝子も mRNAレベルが概日リズムを示すことが知られている (Millar and Kay, Science 267 : 1161— 1163 (1995) )。 c 変異体において、これらの遺伝子の mRNA レベルの概日リズムが損なわれているのか否かをノザンプロット解析で調べた。野生型株 G- 38 と cL?- 7変異体の細胞内の 6J遺伝子、 CAB2 遺伝子、 7ί 遺伝子、 ¾遺伝子、 0¾7遺伝子、 Ζ 遺伝子の mRNAレベルのノザンプロット解析は以下の手順で行った。まず、表面滅菌した野生型株 G-38 と pcll-1 変異体の種子を 1. 5% (w/v) ショ糖を含む MS (Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15 : 473-497 (1962) )固体培地に播種し、連続明、 22. 0 ± 0. 3。C の条件下で 11 日間培養し、 12時間明期 /12時間喑期の明暗サイクルを 3サイクル与えた後、連続明条件に戻した。植物体培養時の照射光は、 SO /i mol/mVsの白色光であった。 3サイクル目の暗期終了時、すなわち連続明開始時を 0時間目として、連続明開始時から 3時間間隔で各タイムボイントごとに 10個体の植物体をサンプリングして即座に液体窒素で凍結した。そして、 QIAGEN社製の RNeasy Midi Kit (Rneasy (登録商標）） 'を使用して、凍結した植物体から全 RNAを抽出した。 5 μ gの全 RNAをホルムアルデヒドを含んだ 1. 2%ァガロースゲルで電気泳動し、ナィ口ン膜に転写した。転写した全 RNAを ³²Pラベルした遺伝子特異的な DNAプローブとハイブリダイズさせ、各遺伝子の mRNA蓄積量を放射活性として検出した。

遺伝子、遺伝子、 Ζ /遺伝子それぞれに特異的な³² Ρラベル DNAプロ一ブは、牧野らの方法 (Makino et al. , Plant Cell Physiol. 43 : 58-69 (2002) )に従って調製した。 6J遺伝子特異的な ³²Pラベル DNAプローブは、 GenBank/EMBL/DDBJ データベースに登録番号 NC— 003070で登録されている塩基配列の 8, 064, 660から 8, 066, 052を野生型株 Col-0からクロ一二ングして調製した。遺伝子特異的な ³²P ラベル DNA プローブは、 GenBank/EMBL/DDBJ データベースに登録番号 NC_003070で登録されている塩基配列の 10, 474, 729から 10， 475, 025を野生型株 Coト 0からクローニングして調製した。 ELF4遺伝子特異的な ³²Pラベル DNAプローブは、 GenBank/EMBL/DDBJデータベースに登録番号 NC— 003070で登録されている塩基配列の 16, 741， 294から 16, 742, 019を野生型株 Co/- からクローニングして調製した。

ノザンブロット解析の結果を図 4に示した。野生型株 G-38においては、いずれの遺伝子の mRNAレベルも明瞭な概日リズムを示した。これに対して _/7変異体においては、いずれの mRNA レベルもリズムを示さなかった。また、 pc_Z7変異体においては、 6 mRNA、 CAB2 mRNA, T0C1 mRNA_s mRNAのレベルが野生型株の mRNAレベルと比較して上昇しており、逆に CCA1 raRNA、 Z^ mR Aのレベルは極端に低下していた。これらの結果は、 7遺伝子は、遺伝子、遺伝子、 T0C1 遺伝子、 /¾遺伝子のリズミックな概日発現に必須であり、また、遺伝子が "遺伝子、遺伝子、 <%7遺伝子、 ¾遺伝子の発現を抑制し、 0¾ 遺伝子との遺伝子の発現を促進することを示している。

実施例 5 < pell変異体の光周的花成 >

高等植物の光周的花成は生物時計によつて支配されていることが広く知られている (Sweeney, Rhythmic Phenomena in Plants 2nd ed. , Academic Press, San Diego (1987)； Lumsden and Millar, Biological Rhythms and Photoperiodisni in Plants. Oxford : Bios Scientific Publisher (1998) )。 7変異体が光周性を損なっているのか否かを調べた。光周的花成の測定は、大藤らの方法 (Ohto et al. , Plant Physiol. 127 : 252-261 (2001) )に従って、以下の手順で行った。野生型 CoZ- 株及び G- 38株、；？変異体 pc _/- 7及び jOc - の種子を吸水させた後、 4 °C、 2 日間暗黒下で静置し、土（バーミキユラィト）に播種した。そして、 22. 0±0. 5°C、長日条件下（16時間明期 /8時間喑期）または短日条件（10時間明期 /14時間喑期）で培養した。明期における植物体への照射光は、 100 i mol/m²/s の白色光であつた。花成時期は、植物体が 1. 5cmの高さまで抽台したときの植物体の全ての葉の数をカウントすることで定量ィ匕した。シロイヌナズナは長日植物であり、野生型では、長日条件で培養した場合よりも短日条件で培養した場合の方が、より多くの葉をつける。野生型株 Col—0と G - 38、 7変異体 pcll—1との花成時期の測定結果を図 5に示した。野生型株では長日条件下で葉の枚数が少なく、短日条件下で葉の枚数が多レ、という長日性を示したが、 pdl変異体では長日と短日のいずれの日長でもほぼ同数の葉の枚数であり、日長不感受性であった。すなわち、変異体は光周性を損なっていた。したがって、 ¾ 遺伝子は光周的花成に必須であることが判明した。

実施例 6く PCL1遺伝子のマップベースクローニングと PCL1遺伝子の構造 >

PCL1遺伝子のクローニングはマップベースクローニング法によって以下の手順で行つた。 pcll-1変異体の F₃ホモ個体（ェコタイプ Col - 0) と野生型 Ler株とを交配し、第 2世代（F₂) の種子を得た。 F₂植物体を培養し、 Gr. '. LUCW レ一ター遺伝子の生物発光を連続明条件下で測定し、 pcll-1変異をホモで持っているホモ個体を選択した。そして、 TAIR ウェブサイト (http：〃 www. arabidopsis. org/)で公開されている Coト 0ヒ Lerの間の多型マーカー (CAPSマーカー及び SSLPマーカー）及び Monsanto Arabidopsis Polymorphism Collectionからリリースされた SNP多型マーカーを利用して変異と多型マーカーとの組換え率を算出した。組換え率がより小さくなる多型マーカーは物理的に PCL1遺伝子により近いので、様々なマーカ一との組換え率を調査することで PCL1遺伝子の染色体上の位置を決定した。図 6に PCL1遺伝子のマップベースクローニングの模式図と _PCL1遺伝子の構造を示した。 PCL1遺伝子の物理的位置を第 3染色体上の SNPマーカー F18L15- 1 (Monsanto Arabidopsis Polymorphism Collectionの SNP番号 CER468139から CER468143を含む）と CAPSマーカー T0PP5 の間の約 150kbに位置づけた。この約 150kbの領域における野生型 C 7 - 株及ぴ

ところ、 TAIRウェブサイトのデーターベースに整理番号^ ί ¾·45 として整理されている遺伝子上に pcll-1と cJ/- の両者で塩基置換が発見できたので、これを PCL1 遺伝子であると結論した。 PCL1 遺伝子の構造は、 RIKEN (RARGE; http：〃 rarge. gsc. riken. go. jp/)及ぴ TAIR ウェブサイトで公開されている完全長 cDNAの塩基配列とゲノム DNA配列とを比較することで決定した。 PCL1遺伝子の塩基配列と推定される PCL1 タンパク質のァミノ酸配列を配列表の配列番号 1 に記載した。 pcll-1と Ζ - どちらの変異も、コード領域に停止コドンを生じるナンセンス変異であった。変異は配列表の配列番号 1に記載の塩基配列中の 605番目の塩基 Gが Αに置換した変異であり、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列中の 149番目のァミノ酸残基 Trpが停止コドンになってしまうことが分かる。 7- 変異は配列表の配列番号 1に記載の塩基配列中の 474番目の塩基 Cが Tに置換した変異であり、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列中の 106番目のアミノ酸残基 Ginが停止コドンになってしまうことが判明した。

実施例 7 く PCL1タンパク質の構造〉

推定される PCL1タンパク質の構造を図 7に示した。 PCL1タンパク質は 323ァミノ酸残基から成り、既知のタンパク質との相同性をもたない新規のタンパク質であった。し力し、タンパク質の中央部分（配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列の 143番目から 201番目のアミノ酸残基）に植物の転写因子に広く見られる DNA結合モチーフである GARPモチーフを発見した。シロイヌナズナのレスポンスレギユレ一ターである ARR1 タンパク質（Sakai et al. , Plant Cell Physiol. 39 : 1232—1239 (1998) )や ARR10タンパク質（Imamura et al.， Plant Cell Physiol. 40 : 733 - 742 (1999) )の GARPモチーフはその機能と構造が詳細に調べられている。 ARR1タンパク質と ARR10タンパク質は、核に局在して GARPモチーフを介して特定の DNAに結合することが知られている。また、 ARR10タンパク質の GARPモチーフのァミノ酸残基はへリックス-ループ -へックスの Myb様の立体構造を形成して DNAに結合することも知られている（Hosoda et al. , Plant Cell 14: 2015-2029 (2002) ) o PCL1ァミノ酸配列中の GARPモチーフは ARR1タンパク質や ARR10タンパク質の GARPモチーフに極めて似ていることから、 PCL1タンパク質は核に局在して GARPモチーフを介して DNAに結合し、特定の DNAに結合して転写制御を行つていると考えられる。 pclH條と - 変異は、ともに劣性変異であり、 GARP モチーフを欠いた不完全な PCL1 タンパク質を生じるナンセンス変異であることから、 pcll-1変異体と ^ 7- 変異体はともに pell欠損変異体であると考えられる。

実施例 8く PCL1タンパク質の細胞内局在 >

PCL1 タンパク質の細胞内局在は、丹羽らの方法（Niwa et al. , Plant J. 18 : 455-463 (1999) )を参考にして、 GFP-PCL1融合タンパク質及ぴ PCL卜 GFP融合タンパク質をタマネギの表皮細胞で一過的に発現させて、 GFP の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。対照として GFPのみをタマネギ表皮細胞で一過的に発現させて、 GFP の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、 GFP-PCL1 融合タンパク質及び PCL1-GFP B合タンパク質は核に局在していた（図 8 ) 。したがって、 PCL1タンパク質は細胞内で核に局在すると考えられる。

実施例 9 く PCL1類似タンパク質およぴ相同タンパク質の探索〉

PCL1 タンパク質の相同タンパク質および類似タンパク質を公的なデータベースで検索した。その結果、シロイヌナズナ {Arabidopsis thaliana) において PCLl 類似タンパク質をコードする遺伝子を、イネ Oryza sativ ) において PCLl相同タンパク質をコードする遺伝子を、タバコ Nicotiana benthandna

Nicotiana tabacum) 、卜マト {Lycopersicon esculentum) 、ンャガィモ {Soianum tuberosum) 、マツ Pinus taeda) 、モロコシ Sorghwi) において PCLl相同タンパク質をコードする cDNAを、それぞれ発見した。 PCL1タンパク質と PCL1類似タンパク質および PCL1相同タンパク質のァミノ酸配列を比較した結果を図 9に示した。シロイヌナズナにおいては、 TAIRウェブサイトのデータベースで整理番号 At5g59570 として整理されている推定遺伝子（配列表の配列番号 2の塩基配列）が PCL1タンパク質と有意に類似したタンパク質 (配列表の配列番号 9のアミノ酸配列）をコードしていた。本発明者らはこの遺伝子を尸 ( ? - " (尸と名付けた。また、イネのゲノム DNA配列上に PCL1タンパク質と相同なアミノ酸配列（配列表の配列番号 1 0のアミノ酸配列）をコードする推定遺伝子（配列表の配列番号 3の塩基配列）を発見し、これを本発明者らは尸 7遺伝子と名付けた。タパコ (Mcoti a benthamina) においては、不完全長である可能性があるが、 PCL1 タンパク質の相同タンパク質（配列表の配列番号 1 1のァミノ酸配列）をコードすると推定される cDNA (配列表の配列番号 4の塩基配列）を発見し、これを本発明者らは尸 7遺伝子と名付けた。別の系統のタバコ mcotiana tabacum) においても、不完全長ではあるが、 PCL1タンパク質の相同タンパク質（配列表の配歹 IJ番号 1 2のアミノ酸配列）をコードすると推定される cDNA (配列表の配列番号 5の塩基配列）を発見し、これを本発明者らは NtPCLl遺伝子と名付けた。トマト

{Lycopersicon esculentum) においては、不完全長ではあるが、 PCL1 タンパク質の相同タンパク質（配列表の配列番号 1 3のアミノ酸配列）をコードすると推定される cDNA (配列表の配列番号 6の塩基配列）を発見し、これを本発明者らは LePCLl遺伝子と名付けた。ジャガイモ Sola議 tuberosum) においては、不完全長である可能性がある力 PCL1タンパク質の相同タンパク質（配列表の配列番号 1 4のァミノ酸配列）をコードすると推定される cDNA (配列表の配列番号 7の塩基配列）を発見し、これを本発明者らは 7遺伝子と名付けた。マツ Pi薦 taeda) においては、不完全長ではあるが、、 PCL1 タンパク質の相同タンパク質

(配列表の配列番号 1 5のァミノ酸配列）をコードすると推定される cDNAを発見し、これを本発明者らは/ 遺伝子と名付けた。モロコシ、Sorghtmi) においては、不完全長ではあるが、 PCL1タンパク質の相同タンパク質（配列表の配列番号 1 6のアミノ酸配列）をコードすると推定される cDNAを発見した。

実施例 1 0く尸遺伝子発現のノザンプロット解析 >

これまでに時計遺伝子が発見されている生物種においては、ほとんどの時計遺伝子の発現が概日リズムを示す（Ishiura et al. , Science 281： 1519-1523； Dunlap, Cell 96： 271-290) ₀ そこで、遺伝子発現が概日リズムを示すのか否かをノザンプロット解析で調べた。野生型株 G-38と変異体の細胞内の尸 mR Aレベルのノザンプロット解析は以下の手順で行った。まず、表面滅菌した野生型株 G-38と pc_Z_/- 7変異体の種子を 1· 5% (w/v) ショ糖を含む MS (Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15 : 473-497 (1962) )固体培地に播種し、連続明、 22. 0土 0. 3°C の条件下で 11 日間培養し、 12時間明期 /12時間暗期の明暗サイクルを 3サイクル与えた後、連続明条件に戻した。植物体培養時の照射光は、 SO i mol/niVsの白色光であった。 3サイクル目の暗期終了時、すなわち連続明開始時を 0時間目として、連続明開始時から 3時間間隔で各タイムボイントごとに 10個体の植物体をサンプリングして即座に液体窒素で凍結した。そして、 QIAGEN社製の RNeasy Midi Kitを使用して、凍結した植物体から全 RNAを抽出した。 5 μ gの全 RNAをホルムアルデヒドを含んだ 1. 2%ァガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜に転写した。転写した全 R Aを ³²Pラベルした PCL1遺伝子特異的な DNAプローブとハイブリダィズさせ、 PCL1遺伝子の mRNA蓄積量を放射活として検出した。 PCL1遺伝子特異的な ³²Pラベル DNAプローブは、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列の 1，021 から 1，992を野生型株 - からクローニングして調製した。

ノザンブロット解析の結果を図 10に示した。野生型株 G- 38においては、 PCL1 遺伝子の mRNAレベルは主観的夕方にピークをもつ明瞭な概日リズムを示した。これに対して pcJ/変異体においては、尸 7 mRNAレベルは概日リズムを示さなかつた。したがって、 PCL1遺伝子発現は概日リズムを示し、自身のリズミックな概日発現に必須であることが判明した。

実施例 1 1く PCじ： ΖίΓ生物発光レポーター株の作出と生物発光リズム >

PCL1遺伝子の発現を生物発光として詳細にリアルタイムモニタリングするために、尸：生物発光レポーター株を以下の手順で作出した。まず、尸 7遺伝子のプロモーター領域（配列表の配列番号 1に記載の塩基配列の 1から 1, 020) と改良型ホタルルシフェラーゼ遺伝子； Promega社）のコード領域を接続した生物発光レポーター遺伝子カセッ H/¾L?: :Z / を作製し、これをバイナリーベクター pBIB—Hyg (Becker, Nucleic Acids Res. 18 : 203 (1990) )のクローニングサイトへ揷入して pBIB/尸 7:： ΖίΤを作製した。 Cloughと Bentの方法（Clough and Bent, Plant J. 16 : 735 - 743 (1998) )に従って、 pBIB/尸 7: :Z の T-DNA領域（ハィグロマイシン B耐性遺伝子 HPTと PCL を含む) をァグロバタテリァを介してシロイヌナズナの野生型株 - のゲノムへ遺伝子移入した。遺伝子移入された开質転換体は、 Weigel と Glazebrook の記載（Weigel and Glazebrook, ARABIDOPSIS-' A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2002) )に従って、ハイグロマイシン B耐 [■生植物体として選択し、さらに、 T- DNA がー遺伝子座へ挿入されたホモ植物体（T₃) を選択し野生型 PCL1:：生物発光レポーター株として使用した。

連続明およぴ連続喑条件下における野生型 par.： Lucwtレポ一タ一株の生物発光測定は、本発明者らの方法 (Onai et al. , Plant J. , 41 : 1-11 (2004) )に従つて行った。 12時間明期 /12時間喑期の明暗サイクルまたは 12時間暗期 /12時間明期のサイクルを与えて生物時計をリセットした後、連続明または連続暗で生物発光を測定した。

野生型尸：発光レポーター株の生物発光パターンを図 11 に示した。連続明条件下における野生型尸： ΖίΤ発光レポーター株の生物発光は、ノザンブ口ット解析による PCL1 mR Aの概日リズムと一致する明瞭な概日リズムを示した。また、生物発光量は連続明の場合と比較して約 3分の 1に低下したが、野生型 par.： £ 発光レポーター株の生物発光は連続暗条件においても明瞭な概日リズムを示した。これらの結果は、尸遺伝子の発現が連続明と連続暗いずれの条件下においても明瞭な概日リズムを示すことを意味している。

実施例 1 2

<尸過剰発現体尸 7"Όχの作出と尸 7-ΟΧ植物体の GI：生物発光パターンおよび葉の就眠運動 >

これまでに時計遺伝子が発見されている生物種にお！/、ては、ほとんどの時計遺伝子の発現が概日リズムを示し、この概日発現を破壊すると全ての概日リズムが消失してしまうことが広く知られている（Ishiura et al.， Science 281 : 1519-1523 ; Dunlap, Cell 96 : 271-290)。そこで、遺伝子を過剰発現する尸 7過剰発現体尸 - oxを作出して/ ¾X7遺伝子の概日発現を破壊した場合に、概日リズムが消失するの力否かを調べた。尸 7過剰発現体尸は以下の手順で作出した。まず、力リフラワーモザィクウィルスの 35Sプモーター CaMV35S,' GenBank/EMBL/DDBJデータベースに登録番号 AF485783で登録されている塩基配列の 4, 951から 5, 815)と PCL1遺伝子のコード領域（配列表の配列番号 1に記載の塩基配列の 997から 2， 001) を接続した PCL1過剰発現カセット CaMV35S : PCLl) を作製し、これをバイナリーベクター pBIB-Hyg (Becker, Nucleic Acids Res. 18 : 203 (1990) )のクローニングサイトへ揷入して：尸を作製した。 Cloughと Bentの方法（Clough and Bent, Plant J. 16 : 735 - 743 (1998) )に従って、 pBIB/ ^:： PCLlの T- DNA領域（ハイグロマイシン B而ォ性遺伝子 HPTと 35S ： PCL1 を含む）をァグロバクテリアを介してシロイヌナズナの野生型株 G - 38 {GI- : LUC 発光レポーター遺伝子をもつ野生型株）のゲノムへ遺伝子移入した。遺伝子移入された开$質転換体は、 Weigel と Glazebrook の記載（Weigel and Glazebrook, ARABIDOPbIS'- A Labor a tory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2002) )に従って、ハイグロマイシン B耐性植物体として選択し、さらに、 T - DNA がー遺伝子座へ挿入されたホモ植物体（T₃) を選択し、植物細胞内の PCLl mR Aレベルが上昇していることをノザンプロット解析で確認した後、尸過剰発現体尸 7 - oxとして使用した。

連続明および連続暗条件下における野生型株 G- 38 および PCL1 - ox植物体の 6 : 生物発光パターンを図 12a と図 12bに示した。生物発光の測定は、本発明者らの方法 (Onai et al.， Plant J.， 41 : 1-11 (2004) )に従って行つた。 12時間明期 /12時間喑期の明暗サイクルまたは 12時間暗期 /12時間明期のサイタルを与えて生物時計をリセットした後、連続明または連続暗で生物発光を測定した。野生型株 G - 38は連続明と連続暗のいずれの条件下にお!/、ても明瞭な生物発光リズムを示したが、尸 - ox植物体はどちらの条件下でも 3〜4日目まででにリズムが消失した。また、尸 7-ox植物体では野生型株 G-38と比較して /: : ΖίΤ 生物発光のレベルが常に低かった。すなわち、遺伝子の過剰発現は、 GI'. :LUC 生物発光リズムを破壊し、かつ GI:： ΖίΤレポーター遺伝子発現を抑制していた。野生型株と尸 CZ7 ox植物体の葉の就眠運動パターンを図 12cに示した。葉の就眠運動の測定は、本発明者らの方法 (Onai et al. , Plant J. , 41 : 1-11 (2004) ) に従って行った。野生型株は明瞭な就眠運動リズムを示したが、 ox植物体では就眠運動は 4日目までにリズムが消失した。すなわち、尸 7遺伝子の過剰発現は、葉の就眠運動リズムも破壌した。

これらの結果は、 PCL1遺伝子の概日発現を破壊すると概日リズムが消失することを示している。すなわち、尸ゾ遺伝子のリズミックな概日発現が概日リズム発振に必須である。

実施例 1 3く PCL1遺伝子発現の自己フィードバック制御 >

これまでに時計遺伝子が発見されてレ、る生物種にお!/、ては、時計遺伝子の発現が自身の遺伝子発現を制御する、すなわち自己フィードパック制御し、これによつてリズミックな概日発現を可能としている。そして、この自己フィードバックループが時計発振の本質であることが広く知られている（Ishiura et al.， Science 281： 1519-1523； Dunlap, Cell 96 : 271-290)。例えば、ショウジョゥバエや哺乳類の ¾rioi遺伝子、ァカパン力ビの r t/ 遺伝子や藍色細菌の kaiC 遺伝子、は自身の遺伝子発現を負のフィードパック制御している。そこで、 PCL1 遺伝子の発現が自己フィードバック制御されているのか否かを明らかにするため、 PCLl-o 植物体（内在の PCLA遺伝子とに加えて PCL1遺伝子過剰発現力セットである CaMV35S:： PCL1遺伝子を染色体上のエタトピックな部位に持つている植物体）において内在の/ ¾7Z 遺伝子発現をノザンプロット解析によって調べた。野生型株 G- 38、 pell変異体、そして PCLln植物体のノザンブロット解析は以下の手順で行った。まず、表面滅菌したそれぞれの種子を 1. 5% (w/v) ショ糖を含む MS (Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15： 473-497 (1962) )固体培地に播種し、連続明、 22. 0±0. 3°Cの条件下で 11日間培養し、 12時間明期 /12時間暗期の明暗サイクルを 3サイクル与えた後、連続明条件に戻した。植物体培養時の照射光は、 50 ; mol/m²/sの白色光であった。 3サイクル目の暗期終了時、すなわち連続明開始時を 0時間目として、連続明開始時から 4時間間隔で各タイムボイントごとに 10個体の植物体をサンプリングして即座に液体窒素で凍結した。そして、 QIAGEN社製の RNeasy Midi Kitを使用して、凍結した植物体から全 RNAを抽出した。 5 μ _βの全匪をホルムアルデヒドを含んだ 1. 2°/。ァガロースゲルで電気泳動し、ナイ口ン膜に転写した。転写した全 RNAを内在の PCL1遺伝子から転写された mRNA のみにハイブリダィズする R Aプローブとハイブリダイズさせ、内在尸遺伝子由来の mRNA蓄積量を放射活として検出した。内在の遺伝子由来の mRNAに特異的にハイブリダイズする RNAプローブは、 ³²Pを取り込ませながら試験管内合成した PCL1 mRNAの 3'非翻訳領域（配列表の配列番号 1に記載の塩基配列の 1， 992 から 2, 237) を使用した。

ノザンブロット解析の結果を図 13に示した。野生型株 G- 38においては、 PCL1 mRNAはリズミックに変動して明瞭な概日リズムを示したが、尸植物体においては、内在の尸 (X/遺伝子から転写される mRNAのレベルの概日リズムは 3日目で消失し、かつそのレベルは野生型と比較して低レベルであった。また、 pell 異体では、尸 mRNA レベルは野生型と比較して高く、概日リズムを示さなかつた。これらの結果は、尸 7遺伝子発現は自分自身の遺伝子発現を負に制御している、すなわち負の PCLA遺伝子発現制御は自己フィードバックループを形成しており、このフィードバックループが概日リズム発振に必須であることを示している。以上の結果、上述したような、高等植物における生物時計遺伝子として必要とされる条件である以下の 5つ、すなわち、（1)一遺伝子の機能喪失によって全ての概日リズムが失われる、（2)—遺伝子の機能喪失によって光周性が喪失する、（3) 遺伝子発現が連続明条件下および連続喑条件下で概日リズムを示す、（4)遺伝子の過剰発現は全ての概日リズムを破壊する、（5)自身の遺伝子発現をフィードバック制御する、を本発明の遺伝子が満足することが判明した。これらの条件を満たす遺伝子は、上述のように本発明が成されるまで発見されていなかった。

実施例 6において本発明者らは、シロイヌナズナのゲノムから概日リズムを支配する生物時計遺伝子尸 7をクローユングした。さらに、実施例：！〜 4と実施例 1 0において変異体では調べた全ての概日リズムが失われていた。したがつて、 7遺伝子は一遺伝子の機能喪失で全ての概日リズムが失われるので、上記条件（1 ) を満たしていることが判明した。

実施例 5において pell変異体では、光周的花成が長不感受性であった。したがって、 PCL1遺伝子は一遺伝子の機能喪失で光周性が喪失するので、上記条件

( 2 ) を満たしていることが判明した。

実施例 1 0と実施例 1 1において/ ¾7Z 遺伝子の発現は、連続明および連続喑条件下で概日リズムを示した。したがつて、 PCL1遺伝子は上記条件 ( 3 ) を満たしていることが判明した。

実施例 1 2と実施例 1 3におレ、て PCL1遺伝子の過剰発現は、調べた全ての概日 -リズムを破壊した。したがって、尸 7遺伝子は上記条件（4 ) を満たしていることが半 IJ明した。

実施例 1 3において _/遺伝子の機能喪失は自身の発現を上昇させ、過剰発現は自身の発現を抑制した。したがって、尸 7遺伝子は負の自己フィードバックによって自らの発現を制御しているので、上記条件 ( 5 ) を満たしていることが判明した。

以上から、尸 7遺伝子は植物の生物時計遺伝子として必要とされる条件を全て満たしていたので、植物の時計遺伝子であることが判明した。

また、実施例 7と実施例 8において PCIA遺伝子は、 GARPモチーフをもつ核局在のタンパク質をコードしていた。したがって、 PCL1タンパク質は植物細胞において核に局在して特定の DNAに結合し遺伝子発現を制御する転写因子として機能していると考えられる。実施例 9において PCL1 タンパク質の類似タンパク質およぴ相同タンパク質ををコードする遺伝子を多数の植物に見出した。これらのタンパク質は、時計タンパク質として機能していると容易に推測される。

本発明に基づく植物の生物時計のモデルを図 14に示した。 7遺伝子は負の自己フィードバックループを形成し、このフィードパックループが生物時計の本質であると考えられる。また、尸 7遺伝子は、既知の時計関連遺伝子である T0C1、 GI、の発現を促進的に、と Z の発現を抑制的に制御しており、これらの遺伝子発現ネットワークが概日振動を安定化させていると考えられる。

実施例 1 4く PCLL'.： Ζ Τ生物発光レポーター株の作出と生物発光リズム〉

シロイヌナズナの PCL1類似遺伝子 PCLLの発現を生物発光として詳細にリアルタイムモニタリングするために、 PCLL:：生物発光レポーター株を以下の手順で作出した。まず、尸 Z遺伝子のプロモーター領域と改良型ホタルルシフェラーゼ遺伝子のコード領域を接続した生物発光レポーター遺伝子カセット PCLL: : LUC)を作製し、これをパイナリ一ベクター pBIB_Hyg (Becker, Nucleic Acids Res. 18 : 203 (1990) )のクローニングサイトへ挿入して pBIB/H2 : : Z〃(^を作製した。 Cloughと Bentの方法 (Clough and Bent, Plant J. 16 : 735-743 (1998) ) に従つて、 ρΒΙΒ/ ¾2Ζ:： LUC D T-DNA領域（ハイグロマイシン Β而ォ性遺伝子 ΗΡΤと PCLL'.：を含む）をァグロバクテリァを介してシロイヌナズナの野生型株 Col-0 のゲノムへ遺伝子移入した。遺伝子移入された形質転換体は、 Weigel と Glazebrookの記載（Weigel and Glazebrook, ARABIDOPSIS: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2002) )に従って、ハイグロマイシン B耐性植物体として選択し、さらに、 T- DNAがー遺伝子座へ挿入されたホモ植物体（T₃) を選択し野生型 ¾Χ ： Ζ ^生物発光レポーター株として使用した。

連続明および連続暗条件下における野生型 PCLL:： LUCm レポーター株の生物発光測定は、本発明者らの方法 (Onai et al.， Plant J.， 41 : 1—11 (2004) ) に従つて行った。 12時間明期 /12時間暗期の明暗サイクルまたは 12時間暗期 /12時間明期のサイクルを与えて生物時計をリセットした後、連続明または連続暗で生物発光を測定した。

野生型尸： ίΤ発光レポーター株の生物発光パターンを図 22 に示した。連続明と連続暗のいずれの場合にお！、ても、野生型 PCLL:： LUC レポーター株の生物発光は、 PCL1:： ΖίΤ発光レポーター株の生物発光リズムと一致する明瞭な概日リズムを示した。これらの結果は、 PCLL遺伝子発現が PCL1遺伝子発現と全く同じパターンであることを意味している。

実施例 1 5く户 Z過剰発現体/ ¾7ZZ Xの作出と ox植物体の GI'.： ίΤ生物発光パターン >

実施例 1 1で示したように、 PCL1遺伝子を過剰発現すると、概日リズムが破壊されてしまう。 PCLL遺伝子が PCL1遺伝子と同一または極めて類似した機能を果たしている、すなわち時計遺伝子として機能している、と仮定すると、 PCLLの過剰発現も概日リズムに深刻な影響を与えると予想される。そこで、尸過剰発現体 PCLL - oxを作出して PCLL遺伝子の概日発現を破壊した場合に、概日リズムがどのような影響を受けるのかを調べた。 CZZ過剰発現体尸 oxは以下の手順で作出した。まず、カリフラワーモザイクウィルスの 35S プモーター CaMV35S GenBank/EMBL/DDBJデータベースに登録番号 AF485783で登録されている塩基配列の 4， 951から 5， 815)と PCLL遺伝子のコ一ド領域を接続して PCLL過剰発現力セット、CaMV35S'. : PCLL)を作製し、これをバイナリーベクタ一 pBIB_Hyg (Becker, Nucleic Acids Res. 18 : 203 (1990) )のクローニングサイトへ揷入して pBIB / 5:：尸 Zを作製した。 Cloughと Bentの方法（Clough and Bent, Plant J. 16 : 735 743 (1998) )に従って、 pBIBA¾"5:：尸の T- DNA領域（ハイグロマイシン B耐性遺伝子 HPTと 35S.'： PCLLを含む）をァグロバクテリアを介してシロイヌナズナの野生型株 G- 38 ( ： £Τ発光レポーター遺伝子をもつ野生型株）のゲノムへ遺伝子移入した。遺伝子移入された形質転換体は、 Weigel と Glazebrookの記載（Weigel and Glazebrook, ARABIDOPSIS A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2002) )に従って、ハイグロマイシン B耐性植物体として選択し、 PCLL過剰発現体 PCLL-oxとして使用した。連続明における尸 Z- ox植物体の GI：生物発光パターンを図 23に示した。 : : ΖΖΤ生物発光の測定は、本発明者らの方法 (Onai et al. , Plant J. , 41 : 1-11 (2004) ) に従って行った。 12時間明期 /12時間喑期の明暗サイクルを与えて生物時計をリセットした後、連続明で生物発光を測定した。その結果、尸 ox植物体の生物発光リズムは、徐々に減衰しながら 5日目までは野生型株と比較して約 2時間短周期を示し、その後、消失した。この結果は、尸遺伝子の概日発現を破壌すると、生物時計が正常に機能しなくなってしまうことを意味している。実施例 1 4と実施例 1 5の結果から、 PCLL遺伝子は PCL1遺伝子に塩基配列が類似しているだけではなく、発現パターンや機能も極めて類似していることが示された。したがって、 / ¾7 遺伝子は時計機能に重要な遺伝子であると言える。また、これらの結果から、本明細に記載した尸 Ζ遺伝子以外の尸 7類似遺伝子や、今後発見されると予想される尸類似遺伝子に関しても遺伝子と同様に、時計機能に重要な働きを持つことが強く示唆される。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（a)、又は（b)からなる生物時計の制御に関与する核酸。

( a )配列表の配列番号 1に示す、塩基配列番号 1一 2846で示される塩基配列からなる核酸。

( b )前記塩基配列番号 1—2846の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 80%の相同性を有する核酸。

2. 以下の（a)、又は（b)からなる生物時計の制御に関与する核酸。

( a )配列表の配列番号 2に示す、塩基配列番号 1一 4554で示される塩基配列からなる核酸。

(b)前記塩基配列番号 1一 4554の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 80%の相同性を有する核酸。

3. 以下の（a)、又は（b)からなる生物時計の制御に関与する核酸。

( a )配列表の配列番号 3に示す、塩基配列番号 1一 4700で示される塩基配列からなる核酸。

( b )前記塩基配列番号 1一 4700の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 80%の相同性を有する核酸。

4. 以下の）、又は（b)からなる生物時計の制御に関与する核酸。

(a)配列表の配列番号 4に示す、塩基配列番号 1一 1505で示される塩基配列からなる核酸。

(b)前記塩基配列番号 1一 1505の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 80%の相同性を有する核酸。

5. 以下の（a)、又は（b)からなる生物時計の制御に関与する核酸。

( a )配列表の配列番号 5に示す、塩基配列番号 1一 400 で示される塩基配列からなる核酸。

( b )前記塩基配列番号 1一 400 の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 80%の相同性を有する核酸。

6. 以下の（a)、又は（b)からなる生物時計の制御に関与する核酸。

( a )配列表の配列番号 6に示す、塩基配列番号 1—641 で示される塩基配列からなる核酸。

(b)前記塩基配列番号 1—641 の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と 80%の相同性を有する核酸。

7. 以下の（a)、又は（b)からなる生物時計の制御に関与する核酸。

( a )配列表の配列番号 7に示す、塩基配列番号 1一 1400で示される塩基配列からなる核酸。

(b)前記塩基配列番号 1一 1400の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と 80%の相同性を有する核酸。

8. 請求項 1〜 7項のいずれか 1項に記載の核酸からなるプロープ。

9. 生物における生物時計の制御に関与する遺伝子を探索用に使用することを特徴とする請求項 8記載のプローブ。

1 0.以下の（a)、又は（b)からなる生物時計の制御に関与するペプチド断片。

(a)配列表の配列番号 8に示す、アミノ酸配列番号 1—323 で示されるアミノ酸配列からなるぺプチド断片。

(b)当該配列番号 8に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 80 %の相同性を有するぺプチド断片。

1 1. 以下の（a)、又は（b)からなる生物時計の制御に関与するペプチド断片。

( a )配列表の配列番号 9に示す、ァミノ酸配列番号 1一 298 で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片。

(b)当該配列番号 9に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 80 %の相同性を有するぺプチド断片。

1 2. 以下の（a)、又は（b)からなる生物時計の制御に関与するペプチド断片。

( a )配列表の配列番号 1 0に示す、ァミノ酸配列番号 1一 238 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片。

( b )当該配列番号 1 0に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 8.0 %の相同性を有するぺプチド断片。

1 3 .以下の）、又は（b )からなる生物時計の制御に関与するペプチド断片。

( a )配列表の配列番号 1 1に示す、ァミノ酸配列番号 1—312 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片。

( b )当該配列番号 1 1に示す、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片。

1 4 . 以下の）、又は（b )からなる生物時計の制御に関与するペプチド断片。

( a )配列表の配列番号 1 2に示す、ァミノ酸配列番号 1一 70で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片。

( b )当該配列番号 1 2に示す、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片。

1 5 .以下の（a )、又は（b )からなる生物時計の制御に関与するペプチド断片。

( a )配列表の配列番号 1 3に示す、ァミノ酸配列番号 1一 185 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片。

( b )当該配列番号 1 3に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片。

1 6 . 以下の（a )、又は（b )からなる生物時計の制御に関与するペプチド断片。

( a )配列表の配列番号 1 4に示す、ァミノ酸配列番号 1—314 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片。

( b )当該配列番号 1 4に示す、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片。

1 7 . 以下の（a )、又は（b )からなる生物時計の制御に関与するペプチド断片。

( a )配列表の配列番号 1 5に示す、ァミノ酸配列番号 1—121 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片。 ( b )当該配列番号 1 5に示ず、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片。

1 8 . 以下の（a )、又は（b )からなる生物時計の制御に関与するペプチド断片。

( a )配列表の配列番号 1 6に示す、ァミノ酸配列番号 1—200 で示されるァミノ酸配列からなるぺプチド断片。

( b )当該配列番号 1 6に示す、ァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記ァミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片。

1 9 . 請求項 1 0〜1 8項のいずれか 1項に記載のペプチド断片からなるプロ一ブ。

2 0 . 請求項 8、 9、又は 1 9項のいずれか 1項に記載のプローブを用いた生物時計の制御に関与する遺伝子のスクリ一二ング方法。

2 1 . スクリーニングを、 in situハイブリダィゼーシヨン法、サザンハイブリダイゼーシヨン法、全塩基配列決定、コロニーハイブリダィゼーシヨン法、プラ一クハイブリダイゼーション法、ノザンハイブリダイゼーション法、サウスゥェスタン法からなる群から選択される少なくとも 1種を用いて行なう請求項 2 0記載の方法。

2 2 . 前記ペプチド断片が、細胞の核における特定の遺伝子の転写、概日リズムの発振と安定化を制御することを特徴とする請求項 1 0〜： 1 8項のいずれか 1項に記載のぺプチド断片。

2 3 . 前記べプチド断片が、 GARPファミリ一に属する DNA結合モチーフを有することを特徴とする請求項 1 0〜 1 8項のいずれか 1項に記載のぺプチド断片。

2 4 . 請求項 1 0〜1 8項のいずれか 1項に記載のペプチド断片を含有している植物の生物時計制御用組成物。

2 5 . 請求項 1〜7項のいずれか 1項に記載の DNA又は R Aを含有しているべクター。

2 6 . 請求項 1〜 7項の！/、ずれか 1項に記載の DNA又は RNAを発現可能に保持する形質転換体。

2 7 . 請求項 2 6記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項 1 0〜1 8のいずれか 1項に記載のぺプチド断片を生産する生産方法。

2 8 .以下の（a )、又は（b )からなる生物時計の制御に関与するペプチド断片。

( a )配列表の配列番号 8に示す、アミノ酸配列番号 1—210 で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片。

( b )当該配列番号 8に示す、ァミノ酸配列番号 1— 210で示されるァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片。

2 9 .以下の（a )、又は（b )力^なる生物時計の制御に関与するペプチド断片。

( a )配列表の配列番号 8に示す、ァミノ酸配列番号 1一 143 で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片。

( b )当該配列番号 8に示す、ァミノ酸配列番号 1一 143で示されるァミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と 8 0 %の相同性を有するぺプチド断片。

3 0 . 請求項 2 8又は 2 9項に記載のぺプチド断片からなるプロープ。

3 1 . 請求項 3 0記載のプローブを用いた生物時計の制御に関与するペプチド断片のスクリーニング方法。