CN105753954B - 水稻hox12基因的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻HOX12基因在调节水稻穗茎长的应用。本发明提供了如下1)‑3)中任一种物质在调控植物穗茎长度、茎节长度、穗茎赤霉素含量和/或株高中的应用:1)蛋白HOX12;2)编码蛋白HOX12的DNA分子;3)含有编码蛋白HOX12的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌;本发明的实验证明,水稻HOX12基因通过RNA干扰表达得到的RNA干涉转基因植株变高、穗茎变长,且水稻穗茎内源GA1和GA4的含量增加,表明HOX12参与调控水稻株高和穗茎长性状,为HOX12基因在水稻种质资源的遗传改良育种中作用重大。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域,尤其涉及水稻HOX12基因的应用。
背景技术
同源异型结构域一亮氨酸拉链(HD-ZIP)蛋白是植物特有的一类转录因子,具有调节植物发育进程和应答外界环境胁迫信号的作用(Ruberti等,1991;Schena and Davis,1992;Ariel等,2007;Elhiti and Stasolla,2009)。HD-ZIP蛋白由高度保守的HD(Homeodomain)结构域和Leu zipper(ZIP)元件组成,前者与DNA特异结合,后者介导蛋白二聚体的形成。根据结构域的保守性、空间结构的差异性、与DNA结合的特异性以及生物学功能,可以将众多的HD-ZIP基因分为HD-ZIPⅠ-Ⅳ四个亚家族(Ariel等,2007;Agalou等,2008)。不同的亚家族成员具有不同的生物学功能,有的参与多种激素途径的交叉互作,有的与激素途径关键基因及下游基因互作来发挥作用。
HD-ZIPI家族转录因子亚家族基因表达受干旱、高盐、ABA和冷害等环境的诱导,这类基因参与激素信号途径,通过与激素途径基因和下游基因互作来调控植物细胞扩增、分裂和分化,从而提高植物耐逆性。从模式植物拟南芥和水稻对HD-ZIP转录因子结构和功能的研究来看,HD-ZIP亚家族不同成员具有较高的系统发育相似性,但是表现出不同的时空表达模式。尽管感知同样的环境胁迫因子,但是不同成员在同样的环境胁迫下的调控方式并不相同。拟南芥HD-Zip I亚家族基因HaHB-4过表达表现出明显的延缓衰老的症状。过表达HaHB-4基因抑制了乙烯合成基因ACO和乙烯下游基因ERF2、ERF5的表达(Manavella等,2006)。拟南芥ATHB7和ATHB12的过表达生长表现出干旱条件下典型的表型,表现在茎干生长被抑制,GA20氧化酶1表达量下降,该酶在赤霉素(Gibberellins,GA)刺激的细胞延伸中起作用(Son等,2010)。番茄中HD-Zip I基因LeHB-1通过调控LeACO基因的表达影响乙烯对果实成熟过程的调控(Lin等,2008)。大麦中的HD-Zip I类基因Vrs1与大麦的六棱穗状花序有关(Komatsuda等,2017)。玉米中的HD-Zip I类基因grassy tillers1基因负责侧芽休眠,同时还抑制侧枝生长(Whipple等,2011)。水稻HD-Zip I基因Oshox22的过量表达转基因植株对ABA敏感性增加,且增加了ABA含量,而突变体oshox22-1较之野生型水稻,内源ABA含量下降(Zhang等,2012)。
发明内容
本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。
本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在调控植物穗茎长度、茎节长度、穗茎赤霉素含量和/或株高中的应用:
1)蛋白HOX12;
2)编码蛋白HOX12的DNA分子;
3)含有编码蛋白HOX12的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌;
所述蛋白HOX12为如下(1)或(2):
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
编码蛋白HOX12的DNA分子为是如下1)至5)中任一所述的DNA分子:
1)序列表中序列1所示的DNA分子;
2)序列表中序列3所示的DNA分子;
3)序列表中序列1第212-931位核苷酸;
4)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子;
5)与1)或2)或3)所限定的DNA分子至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
本发明另一个目的是提供抑制或者降低蛋白HOX12活性的物质的新用途。
本发明提供了抑制或者降低蛋白HOX12活性的物质在培育穗茎、茎节、穗茎赤霉素含量和/或株高提高的植物中的应用。
上述应用中,所述抑制或者降低蛋白HOX12活性的物质为干扰或沉默蛋白HOX12编码基因表达的物质。
上述应用中,所述干扰或沉默蛋白HOX12编码基因表达的物质为如下1-3)中任一种:
1)RNA,其为序列4第521-832位核苷酸编码的RNA;
2)DNA,其包括正向片段和反向片段;
所述正向片段的核苷酸序列为序列4第521-832位核苷酸,所述反向片段的核苷酸序列为正向片段核苷酸序列的反向互补序列;
3)含有2)所示DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
上述应用中,所述调控植物穗茎长度、茎节长度和/或株高为提高或降低植物穗茎长度、茎节长度、穗茎赤霉素含量和/或株高。
上述应用中,所述赤霉素为G1和/或G4;
所述植物为单子叶植物或双子叶植物;
所述单子叶植物具体为水稻。
本发明第三个目的是提供一种培育穗茎长度、茎节长度、穗茎赤霉素含量和/或株高提高的转基因植物的方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:抑制或者降低目的植物中蛋白HOX12活性,得到转基因植物;
所述转基因植物的穗茎长度、茎节长度、穗茎赤霉素含量和/或株高高于所述目的植物。
上述方法中,所述抑制或者降低蛋白HOX12活性的物质为干扰或沉默蛋白HOX12编码基因表达的物质;
所述干扰或沉默蛋白HOX12编码基因表达的物质具体为如下1-3)中任一种:
1)RNA,其为序列4第521-832位核苷酸编码的RNA;
2)DNA,其包括正向片段和反向片段;
所述正向片段的核苷酸序列为序列4第521-832位核苷酸,所述反向片段的核苷酸序列为正向片段核苷酸序列的反向互补序列;
3)含有2)所示DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
上述方法中,所述赤霉素为G1和/或G4;
所述植物为单子叶植物或双子叶植物;
所述单子叶植物具体为水稻。
本发明第四个目的是提供一种抑制或者降低蛋白HOX12活性的物质。
本发明提供的抑制或者降低蛋白HOX12活性的物质,为上述应用中任一所述物质。
本发明的实验证明,水稻HOX12基因通过RNA干扰表达得到的RNA干涉转基因植株变高、穗茎变长,且水稻穗茎内源GA1和GA4的含量增加,表明HOX12参与调控水稻株高和穗茎长性状,为HOX12基因在水稻种质资源的遗传改良育种中作用重大。
附图说明
图1为HOX12过表达水稻株系中HOX12基因表达量的实时定量荧光PCR检测结果。
图2为HOX12过表达水稻株系#7和#12的植株表型。
图3为融合蛋白HOX12-GFP在水稻原生质体中的亚细胞定位(第二排)。第一排为蛋白GFP在水稻原生质体中的亚细胞定位。其中,从左至右第一列为明视场下的结果;第二列为暗视场下的绿色荧光;第三列为重叠视野;标尺=10μm。
图4为HOX12基因在不同器官和组织中实时定量PCR的结果。
图5为HOX12基因在不同非生物逆境及激素条件下的实时荧光定量PCR检测结果。A为低温、高盐和干旱处理下HOX12基因实时荧光定量PCR检测结果;B为HOX12基因在ABA处理不同时间实时荧光定量PCR检测结果;C为在生长素、赤霉素和茉莉酸处理2小时HOX12基因实时荧光定量PCR检测结果。
图6为HOX12基因的RNAi水稻株系中HOX12基因实时定量荧光PCR检测结果。
图7为HOX12基因的RNAi水稻株系表型。A为野生型水稻中抑制HOX12基因株系Ri-2和Ri-5的表型。标尺=10cm。B为Ri-2和Ri-5株系的穗茎表型。标尺=5cm。
图8为HOX12基因的RNAi水稻茎节长度统计图。
图9为HOX12基因的RNAi水稻穗茎长度统计图。
图10为HOX12基因的RNAi水稻穗茎中赤霉素含量结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、HOX12基因及其编码蛋白的克隆
提取野生型日本晴幼苗的RNA,反转录得到cDNA作为模板,用正向引物F15'ACAGACTCGGACACCACCG 3'和反向引物R15'TATTCTAAACACATATACTTACAAAGACA 3')进行PCR扩增,得到1167bp的PCR产物。
经过测序,1167bp的PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸,开放阅读框为序列1第212-931位核苷酸所示的基因为HOX12,编码的蛋白命名为HOX12,该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。序列3为HOX12基因的基因组DNA。
实施例2、HOX12基因及其编码蛋白在调节水稻穗茎长的应用
一、过表达HOX12基因
1、重组表达载体pCAMBIA2300-Actin-HOX12的构建
提取野生型日本晴幼苗的RNA,反转录得到cDNA作为模板,用引物1与引物2进行PCR扩增,得到987bp的HOX12基因。
HOX12-F引物1:5'-GGTACCAGTCTCAAAGAAAGCACAAAGGT-3'(下划线部分为KpnI酶切位点,在序列1中的第68-90位)
HOX12-R引物2:5'-GGATCCTTGATACTACTAATAAACACCACCACT-3'(下划线部分为BamHI酶切位点,在序列1中的第1027-1054位)
将上述PCR产物用KpnI和BamH I双酶切得到的酶切产物与经过同样双酶切的pCAMBIA2300-Actin载体(记载于“Wang,K.J.,Tang,D.,Wang,M.,Lu,J.F.,Yu,H.X.,Liu,J.F.,Qian,B.X.,Gong,Z.Y.,Wang,X.,Chen,J.M.,Gu,M.H.and Cheng,Z.K.(2009)MER3isrequired for normal meiotic crossover formation,but not for presynapticalignment in rice.J Cell Sci,122,2055-2063.”一文)骨架大片段相连,得到重组质粒。将重组质粒送样测序,该质粒为将序列表中序列1第68-1054位核苷酸替换pCAMBIA2300-Actin载体的Kpn I和BamH I之间的DNA片段得到的质粒,命名为pCAMBIA2300-Actin-HOX12,为重组表达载体,其中启动HOX12基因转录的启动子为水稻内源的Actin1启动子。
2、过表达HOX12的转HOX12水稻的制备
将重组表达载体pCAMBIA2300-Actin-HOX12转入农杆菌AGL1中得到重组菌AGL1/pCAMBIA2300-Actin-HOX12(提取质粒测序验证阳性)。
将重组菌AGL1/pCAMBIA2300-Actin-HOX12用农杆菌介导的方法转化日本晴水稻愈伤组织,具体如下:
挑取AGL1/pCAMBIA2300-Actin-HOX12单菌落,接种于10ml的YEB液体培养基中(含卡那霉素50mg/L,利福平50mg/L),28℃,180rpm摇床培养2-3天。取4ml菌液,4,000rpm离心3min,倒去上清液,加入少量AAM培养基重新悬浮细胞,然后加入20ml的AAM培养基(含0.1mM乙酰丁香酮As),28℃,150rpm摇床避光培养1-2h,培养至OD600=0.4左右。挑选生长状态良好、颗粒状日本晴水(以下也称为野生型水稻)稻愈伤组织浸入农杆菌培养液中,28℃,150-200rpm摇20min,将愈伤倒出,用无菌滤纸吸干多余菌液,将愈伤平铺在含多层滤纸的无菌平皿中,超净台上吹干(愈伤分散不结块),然后将愈伤组织转移到NB共培养基上,黑暗条件下培养2-3天。将愈伤转至150mg/L G418(庆大霉素衍生物,毒理机制与卡那霉素相同)以及400mg/L头孢霉素的NB培养基上筛选3-4周(一筛)。将成活的愈伤组织转入二筛培养基(含200mg/L G418及200mg/L头孢霉素的NB培养基)上筛选3周。将抗性愈伤组织转入分化培养基上(200mg/L G418)进行分化,再生植株在含200mg/LG418的壮苗培养基上生根后(约3-4周)转移至温室中,得到T0代转HOX12水稻。
上述转化中所用的培养基如下:
共培养培养基:NB继代培养基+As(0.1mM/L)+葡萄糖(10g/L),pH 5.2。
农杆菌侵染水稻愈伤组织AAM培养基:AA大量元素+AA微量元素+AA氨基酸+
MS维生素+水解酪蛋白(500mg/L)+蔗糖(68.5g/L)+葡萄糖(36g/L)+As(0.1mM),pH5.2。
NB基本培养基:N6大量元素+B5微量元素+B5有机成分+铁盐+水解酪蛋白(300mg/L)+脯氨酸(500mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(8g/L),pH 5.8;
诱导愈伤及继代培养基:NB基本培养基+2,4-D(2mg/L);
预分化培养基:NB基本培养基+6-BA(2mg/L)+NAA(1mg/L)+ABA(5mg/L);
分化培养基:NB基本培养基+6-BA(3mg/L)+NAA(1mg/L);
壮苗培养基:1/2MS无机盐+NAA(0.5mg/L)+MET(0.25mg/L)。
农杆菌培养基(YEP):10g/L胰化蛋白胨+10g/L酵母提取物+5g/L氯化钠(固:+15g/L琼脂)。
采用同样的方法将空载体pCAMBIA2300-Actin转化日本晴水稻愈伤组织,得到T0代转空载体水稻。
3、转HOX12水稻的分子鉴定
1)PCR初步鉴定
提取T0代转HOX12水稻的基因组DNA,用新霉素磷酸转移酶(NPT II)引物F1和R1(引物序列如下)进行PCR鉴定,得到340bp的为PCR阳性T0代转HOX12水稻。
F1:5’-TGCTCGCTCGATGCGATGTT-3’;
R1:5’-CTCTGATGCCGCCGTGTTCC-3’。
2)转录水平分析
提取PCR阳性T0代转HOX12水稻株系#7和#12总RNA,反转录得到cDNA作为模板,用如下引物进行实时定量荧光PCR,检测各材料中HOX12基因在转录水平上的表达量。实验重复3次,结果取平均值。以野生型水稻为对照。
实时定量荧光PCR使用Bio-Rad CFX96进行。PCR反应体系(20μl)按照产品使用说明书进行SYBR Green Real-Time PCR Master Mix reagent(Toyobo)具体体系如下:10μlSYBR Green Real-Time PCR Master Mix,2μl上下游引物混合物(上下游引物浓度均为10μM),7μl RNase-free water,1μl cDNA模板。
具体反应程序如下:酶热激活95℃30s,1个循环;变性95℃5s,延伸60℃30s,共40个循环。
其中,扩增HOX12基因的引物序列为:
HOX12上游引物:5'-GCGCCGACGGAGGATTAA-3'
HOX12下游引物:5'-AGGGCAACACGACTGATGAT-3'
以UBQ2作为内参基因,扩增内参UBQ2的引物序列为:
UBQ2上游引物:5'-GAGCCTCTGTTCGTCAAGTA-3';
UBQ2下游引物:5'-ACTCGATGGTCCATTAAACC-3'。
数据的处理采用Comparative Ct的方法,即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数,ΔCt=Ct(HOX12)-Ct(ACTIN1),以2-ΔCt的值衡量基因转录水平,对各材料中HOX12基因的表达进行分析比较。
各实验材料中HOX12基因表达量的实时定量荧光PCR检测结果如图1所示,HOX12基因的表达均为相对值,可以看出:相比未转基因的野生型水稻日本晴(WT),PCR阳性T0代转HOX12水稻株系#7和#12中HOX12基因的表达量在转录水平上显著提高。PCR阳性T0代转HOX12水稻株系#7和#12为阳性T0代转HOX12水稻,命名为HOX12-OX#7和HOX12-OX#12。
采用同样的方法检测T0代转空载体水稻,结果与野生型水稻无显著差异。
4、转HOX12水稻的表型分析
田间表型如图2所示。可以看出,与野生型水稻日本晴相比,HOX12-OX#7和HOX12-OX#12的株高降低,且包穗。随着HOX12基因表达量升高,转基因植株矮化越明显;当HOX12基因表达非常高时,转基因植株严重矮化,穗发育受到严重抑制,甚至不能生长。
野生型水稻日本晴和T0代转空载体水稻结果无显著差异。
二、HOX12蛋白的转录激活活性和表达模式
1、HOX12蛋白的转录激活活性
提取10天大小日本晴水稻幼苗的总RNA,反转录得到cDNA为模板,进行PCR扩增,扩增HOX12的全长ORF(去除终止密码子),所用引物为:
GFP-HOX12-F:5′-GGTACCAGTCTCAAAGAAAGCACAAAGGT-3′
GFP-HOX12-R:5′-GGATCCGCTGAATTGGTCGTAGACCC-3′
将扩增得到的目的片段经酶切回收后与空载体pCAMBIA35S-GFP进行连接,使HOX12与GFP融合,测序鉴定正确后,分别将含有融合载体pCAMBIA35S-HOX12-GFP和空载体转入水稻原生质体中,室温下正常培养12h后,在激光共聚焦显微镜下观察结果。结果如图3,从图中可以看出,HOX12蛋白特异的定位在水稻细胞核中。
2、HOX12基因表达模式及诱导表达
取野生型水稻品种日本晴不同器官或组织,以及同一器官不同时期样本,分别提取其RNA,反转录得到cDNA为模板,进行实时定量荧光PCR,方法同前,实验设三次重复。
HOX12基因在不同器官或组织,以及同一器官不同时期中的表达情况如图所示,纵轴表示各器官和组织中HOX12基因与UBQ2基因的表达量之比。
结果如图4所示,图中为HOX12基因在根、茎、叶、叶鞘、茎节和幼穗中的表达情况。结果表明,HOX12基因在幼穗中的表达量较高。
3、在逆境的表达水平
分别用不同植物激素:10μM赤霉素(GA3),10μM生长素(IAA),10μM细胞分裂素(6-BA),50μM茉莉酸(JA),10μM脱落酸(ABA),以及不同的非生物逆境:低温(4℃),干旱(200MmMannitol),高盐(200mMNaCl)(以上试剂均购自Sigma公司),对生长14天的野生型品种日本晴幼苗进行处理,以水处理作为对照(Mock)。处理后提取其RNA,反转录后利用定量PCR技术进行检测HOX12基因的表达,方法同前,实验设三次重复。
结果如图5所示,A为低温、高盐、干旱处理,B为ABA处理,C为IAA、GA3和JA处理。可以看出,不同处理条件下,在根中HOX12基因特异受植物激素ABA、IAA、GA3和JA诱导,也受到逆境环境高盐诱导。在茎中,HOX12基因特异受植物激素ABA、GA3和JA诱导,也受到逆境环境低温、高盐、干旱诱导。
三、RNA干扰HOX12基因表达
1、重组表达载体HOX12-RNAi的构建
提取野生型日本晴幼苗的RNA,反转录得到cDNA作为模板,以Ri-F和Ri-R为引物进行PCR扩增,得到300bp的DNA片段,命名为HOX-Ri(序列4第521-832位核苷酸)。
Ri-F GGATCCACACCACCGGTCACTTG(序列1第11-27)
Ri-R GTCGACCTTCTTCTGCTCGCCAC(序列1第294-310)
用限制性内切酶BamH I和Sal I双酶切以上所得300bp的DNA片段,胶回收酶切片段,与经过BamH I和Sal I双酶切的pUCRNAi载体(记载于“Wang,K.J.,Tang,D.,Wang,M.,Lu,J.F.,Yu,H.X.,Liu,J.F.,Qian,B.X.,Gong,Z.Y.,W ang,X.,Chen,J.M.,Gu,M.H.andCheng,Z.K.(2009)MER3is required for normal meiotic crossover formation,butnot for presynaptic alignment in rice.J Cell Sci,122,2055-2063.”一文)骨架大片段相连,得到中间载体pURi-1。之后用限制性内切酶Xho I和BglII双酶切以上所得300bp的DNA片段,胶回收酶切片段,与经过Xho I和BglII双酶切的中间载体pSRi-1骨架大片段相连,得到中间载体pURi-2。最后用限制性内切酶Xho I和Pst I双酶切中间载体pURi-2,胶回收酶切片段,与经过Sal I和PstI双酶切的pCAMBIA2300-Actin载体骨架大片段相连,得到重组质粒。
将所述重组质粒送样测序,该质粒为将序列表中序列4所示DNA片段替换pCAMBIA2300-Actin载体的SalI和Pst I之间的DNA片段得到的质粒,命名为HOX12-RNAi,其中启动序列4所示DNA片段转录的启动子为水稻内源的Actin1启动子。
序列4所示DNA片段包括正向片段、内含子和反向片段,其中正向片段的核苷酸序列为序列4第521-832位核苷酸,内含子的核苷酸序列为序列4第521-832位核苷酸,反向片段的核苷酸序列为正向片段核苷酸序列的反向互补序列。
序列4所示DNA片段在植物细胞中转录产生带发夹结构的dsRNA,引发RNAi,从而抑制目的基因的表达。
2、RNA干扰HOX12的转HOX12-RNAi水稻的制备
将重组表达载体HOX12-RNAi转入农杆菌AGL1中得到重组菌AGL1/HOX12-RNAi(提取质粒测序验证阳性)。
按照前面转HOX12水稻的制备方法将重组菌AGL1/HOX12-RNAi转化日本晴水稻愈伤组织,得到T0代转HOX12-RNAi水稻。
T0代转HOX12-RNAi水稻播种直到得到T3代转HOX12-RNAi水稻。
T0代转空载体水稻播种直到得到T3代转空载体水稻。
3、转HOX12-RNAi水稻的分子鉴定
1)PCR初步鉴定
提取T3代转HOX12-RNAi水稻的基因组DNA,用新霉素磷酸转移酶(NPT II)引物F1和R1(引物序列如下)进行PCR鉴定,得到340bp的为PCR阳性T0代转HOX12-RNAi水稻。
F1:5’-TGCTCGCTCGATGCGATGTT-3’;
R1:5’-CTCTGATGCCGCCGTGTTCC-3’。
2)转录水平分析
提取PCR阳性T3代转HOX12-RNAi水稻水稻株系Ri-1、Ri-2、Ri-5和Ri-6总RNA,反转录得到cDNA作为模板,用前面T0代转HOX12水稻株系中的引物进行实时定量荧光PCR,检测各材料中HOX12基因在转录水平上的表达量。实验重复3次,结果取平均值。以野生型水稻(WT)为对照。
结果如图6所示,可以看出,相比未转基因的野生型水稻日本晴(WT),PCR阳性T3代转HOX12-RNAi水稻株系Ri-1、Ri-2、Ri-5和Ri-6中HOX12基因的表达量在转录水平上显著降低。
采用同样的方法检测T3代转空载体水稻,结果与野生型水稻无显著差异。
4、转HOX12-RNAi水稻的表型分析
1)转HOX12-RNAi水稻的表型
将T3代转HOX12-RNAi水稻株系Ri-2和Ri-5、野生型水稻日本晴和T3代转空载体水稻播种,大田生长120天。每个株系16株,实验重复3次,结果取平均值。
观察表型,如图7所示;可以看出,与野生型水稻日本晴相比,T3代转HOX12-RNAi水稻株系Ri-2和Ri-5的水稻株高和穗茎长度增加。
测量水稻各个茎节长度和穗茎长度,结果如图8和图9所示,图8为各个茎节长度,图9为穗茎长度,可以看出,与野生型水稻日本晴相比,T3代转HOX12-RNAi水稻株系Ri-2和Ri-5的水稻穗茎和茎节长度均增加;HOX12的表达量越低,水稻穗茎的穗茎越长。Ri-2和Ri-5穗茎分别为野生型的3.1倍和3.9倍。
野生型水稻日本晴和T3代转空载体水稻结果无显著差异。
2)转HOX12-RNAi水稻的赤霉素含量
检测T3代转HOX12-RNAi水稻株系Ri-2和Ri-5、野生型水稻日本晴和T3代转空载体水稻穗茎中赤霉素含量,方法见Chen,M.,Fu,X.,Liu,J.,Ye,T.,Hou,S.,Huang,Y.,Yuan,B.,Wu,Y.,and Feng,Y.(2012).Highly sensitive and quantitative profiling ofacidic phytohormones using derivatization approach coupled with nano-LC–ESI-Q-TOF-MS analysis.J.Chromatogr.B Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.905:67-74。
结果如图10所示,可以看出,HOX12-RNAi转基因水稻Ri-5株系穗茎中GA1和GA4的含量比野生型高。
Claims (8)
1.如下1)-3)中任一种物质在调控植物穗茎长度和/或穗茎赤霉素含量中的应用:
1)蛋白HOX12;
2)编码蛋白HOX12的DNA分子;
3)含有编码蛋白HOX12的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌;
所述蛋白HOX12为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
所述植物为水稻。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述调控植物穗茎长度和/或穗茎赤霉素含量为提高或降低植物穗茎长度和/或穗茎赤霉素含量。
3.抑制或者降低蛋白HOX12活性的物质在培育穗茎和/或穗茎赤霉素含量提高的植物中的应用;
所述抑制或者降低蛋白HOX12活性的物质为干扰或沉默蛋白HOX12编码基因表达的物质;
所述干扰或沉默蛋白HOX12编码基因表达的物质为如下1)-3)中任一种:
1)序列4所示核苷酸编码的RNA;
2)序列4所示的DNA;
3)含有2)所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌;
所述植物为水稻。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用,其特征在于:所述赤霉素为GA1和/或GA4。
5.一种培育穗茎长度和/或穗茎赤霉素含量提高的转基因植物的方法,为抑制或者降低目的植物中蛋白HOX12活性,得到转基因植物;
所述转基因植物的穗茎长度和/或穗茎赤霉素含量高于所述目的植物;
所述植物为水稻。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述抑制或者降低蛋白HOX12活性为干扰或沉默蛋白HOX12编码基因表达;
所述干扰或沉默蛋白HOX12编码基因表达是通过如下1)-3)中任一种物质实现的:
1)序列4所示核苷酸编码的RNA;
2)序列4所示的DNA;
3)含有2)所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其特征在于:所述赤霉素为GA1和/或GA4。
8.一种抑制或者降低蛋白HOX12活性的物质,为权利要求3所述应用中任一所述物质。
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CN103013995A (zh) * | 2011-09-28 | 2013-04-03 | 华中农业大学 | 一种控制水稻株高和穗颈长的基因及应用 |
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---|---|---|---|---|
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CN103013995A (zh) * | 2011-09-28 | 2013-04-03 | 华中农业大学 | 一种控制水稻株高和穗颈长的基因及应用 |
CN103305524A (zh) * | 2012-03-08 | 2013-09-18 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 作物穗型调节基因及其应用 |
WO2015054000A2 (en) * | 2013-10-09 | 2015-04-16 | Monsanto Technology Llc | Interfering with hd-zip transcription factor repression of gene expression to produce plants with enhanced traits |
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