CN105567702B

CN105567702B - 红掌SOC转录因子AaSOC及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN105567702B
Application number: CN201610083300.XA
Authority: CN
Inventors: 马广莹; 史小华; 邹清成; 金亮; 朱开元; 刘慧春; 詹菁
Original assignee: ZHEJIANG PROVINCE XIAOSHAN COTTON AND FLAX RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: ZHEJIANG PROVINCE XIAOSHAN COTTON AND FLAX RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2016-02-06
Filing date: 2016-02-06
Publication date: 2018-08-17
Anticipated expiration: 2036-02-06
Also published as: CN105567702A

Abstract

本发明公开了一种红掌SOC转录因子AaSOC及其编码基因与应用。所述转录因子AaSOC的完整预测氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码基因如SEQ ID NO：2所示。本发明首次从红掌中克隆SOC类调控花期的转录因子，即AaSOC；本发明通过与拟南芥等不同物种同类SOC转录因子序列比对，发现其序列具有保守性；通过转基因实验，发现该基因具有明显的促进转化株提早开花的能力，证明其是一个非常有应用价值的转录因子。本发明提供的技术方案，对于研究红掌开花机理、培育矮化、早花品种，意义重大。

Description

红掌SOC转录因子AaSOC及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种来源于红掌的一个SOC转录因子AaSOC及其编码基因与应用方法。

背景技术

红掌（Anthurium andraeanum）是世界性盆栽和鲜切花花卉。在我国高档盆花种植中占有相当重要的地位。然而，同其他大宗花卉一样，我国在红掌育种上也是出于较为落后的阶段，主要是因为我们没有掌握足够的种质资源。

不管是杂交育种还是转基因等生物技术育种，育种时间的缩短对于育种价值不言而喻。红掌分子育种刚刚起步，调控花期的众多转录因子尚未被发掘。

SOC类转录因子在不同物种上均具有显著的促进幼苗开花的功能，为了更好的研究红掌本身该类基因的功能以及培育极早开花的转基因红掌，十分有必要获得红掌自身的SOC类基因资源，本发明既可在红掌中应用，也可以在其他物种，例如烟草等植物中显著缩短育种年限，使转基因植株极早开花。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供来红掌SOC转录因子AaSOC及其编码基因与应用。

一种红掌SOC转录因子AaSOC，所述转录因子AaSOC的完整预测氨基酸序列如SEQID NO：1所示；编码基因如SEQ ID NO：2所示。

进一步包括至少90%同源且具有相同功能的所述转录因子AaSOC的衍生物，所述的衍生物包括氨基酸序列或核酸序列。

一种含有所述红掌SOC转录因子AaSOC的编码基因的重组载体。

一种含有所述的重组载体的重组基因工程菌。

一种根据所述的重组载体的重组基因工程菌的构建方法，构建含有转录因子AaSOC的编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至农杆菌菌株EHA105中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有转录因子AaSOC的编码基因的重组基因工程菌的菌体细胞。

一种根据所述的红掌SOC转录因子AaSOC的应用，通过过量表达，促进转化株提早开花。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明首次从红掌中克隆SOC类调控花期的转录因子，即AaSOC；本发明通过与拟南芥等不同物种同类SOC转录因子序列比对，发现其序列具有保守性；通过转基因实验，发现该基因具有明显的促进转化株提早开花的能力，证明其是一个非常有应用价值的转录因子。

本发明提供的技术方案，对于研究红掌开花机理、培育矮化、早花品种，意义重大。

附图说明

图1是红掌转录因子AaSOC与其他物种同源基因的多序列比对结果；

图2是超量表达红掌转录因子AaSOC导致转基因烟草显著提早开花的实物照片，其中A部分为转基因烟草（左1、2）与对照开花时间和植株长势之比较。B、C部分为转基因烟草现蕾初期生长表现。

具体实施方式

本发明提供一种红掌SOC转录因子AaSOC，所述转录因子AaSOC的完整预测氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过超量表达证明该转录因子具有促进植物提前开花的功能，这对红掌本身，亦或是其他物种而言，都是一个重要的培育早花性状的基因资源。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还涉及所述转录因子AaSOC的编码基因，所述转录因子AaSOC的编码基因具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列90%以上同源性，优选所述转录因子AaSOC的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。由于核苷酸序列的特殊性，任何如SEQ ID NO：2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

本发明涉及含有所述转录因子AaSOC的编码基因的载体。

本发明还涉及一种含有所述转录因子AaSOC的编码基因的重组基因工程菌。所述重组基因工程菌的构建方法为：构建含有转录因子AaSOC的编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至农杆菌菌株EHA105中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有转录因子AaSOC的编码基因的重组基因工程菌的菌体细胞。

本发明还提供所述转录因子AaSOC的编码基因在培育极早开花的植物中的应用。

本发明的要点之一在于提供了SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明所提供的转录因子AaSOC是从红掌中获得的，它属于具有显著促进早花功能的众多转录因子家族中的一员。通过反转录RT-PCR，获得了该基因的完整编码框，随后构建超量表达载体并异源转化烟草，发现该转录因子具有明显的促进转基因植物提早开花结果的能力。

本发明进行基因信息克隆的技术手段为同源克隆技术和RACE技术，这是公开已久的基础手段。但是我们的创新与申请保护之处却是围绕AaSOC转录因子所使用和获得的核苷酸与氨基酸序列信息。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1来源于红掌的转录因子AaSOC的获得

于2014年8月取6年生红掌品种“阿拉巴马”的幼嫩苞片和叶片为材料，采用Invitrogen公司生产的Trizol试剂提取总RNA，然后使用Promega公司生产的反转录试剂盒对总RNA进行处理、反转录合成cDNA，以此为模板。采用同源克隆法，设计保守的兼并引物对P1-TCTCCCCGCGCGGCAAGC（SEQ ID NO：3），, P2-GAATAATTGATTCTTCT（SEQ ID NO：4），用上述模板进行扩增，该反应程序为95 ℃ 1 min, 94 ℃50 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 36个循环，72 ℃5 min，所用试剂（LATaq酶）均购自大连宝生物公司，扩增体系：LAtaq酶（5 U/µl）0.5 µl，10×LAtaq buffer Ⅱ5 µl，dNTP mixture 8 µl，template 1 µl，PI 1 µl，P2 1µl，灭菌蒸馏水32.5 µl。经过PCR扩增获得296 bp的中间片段。

以上述PCR扩增获得296 bp的中间片段为参考，设计3’ RACE和5’RACE引物;以红掌幼嫩花芽为组织材料，按照述方法提取总RNA，参照CLONTECH公司RACE试剂盒说明书（Cat. No(s). 634858）分别进行3’RACE和5’RACE模板合成，备用。具体是，3’RACE用到的引物对：3’f—CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

（SEQ ID NO：5），

3’r—GCTATCTGCGGCATATGAATAAC（SEQ ID NO：6），扩增体系：LAtaq酶（5 U/µl）0.5µl，10×LAtaq buffer Ⅱ5 µl，dNTP mixture 8 µl，template 1 µl，3’f 1 µl，3’r 1 µl，灭菌蒸馏水32.5 µl。反应程序为95 ℃1 min, 94 ℃25 s, 68 ℃1 min, 72 ℃1 min，36个循环，72 ℃5 min，通过PCR扩增获得中间序列及下游片段。

5’RACE用到的引物对：5’f—AACTGACACTCTATTTCATGCA（SEQ ID NO：7），, 5’r—CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（SEQ ID NO：5），(接头序列，与3’f引物同来自试剂盒)，反应体系参照3’RACE，扩增程序为95 ℃1 min, 94 ℃25 s, 66 ℃1min, 72 ℃1 min, 36个循环，72 ℃5 min，经过PCR扩增获得中间序列及上游片段。

将AaSOC基因的上游片段和下游片段测序后进行序列拼接，拼接方法为手动拼接，如“123, 234拼接变成1234”一样，即可获得完整编码框（CDS），经过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html在线分析，该编码框有216个氨基酸，具有明显的起始和终止密码子，说明该基因的完整性。分析推测的氨基酸序列，该基因编码216个氨基酸残基，与已知的但双子叶植物的同类基因氨基酸组成相似度高，且具有典型的MADS-box基因共同的结构域组成，认定其为红掌的一个SOC转录因子。其中，AaSOC与其他物种同源基因的多序列比对结果如图1所示。

因此，将获得的编码框（CDS）命名为转录因子AaSOC是可行的。通过公共平台NCBI网站中ORFinder软件的应用，获得了转录因子AaSOC的编码框区域，并得到了预测的氨基酸组成信息。该基因编码区的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

需要说明的是，引物P1，P2是用来获得中间片段的保守序列，是根据SOC转录因子的序列特征设计出来；引物3’r，5’f是根据中间片段信息设计的用于扩增两端未知序列的引物，以上四条引物均由发明者提出，属于发明内容。引物3’f，5’r为同一序列，属于通用引物，来自商用试剂盒，在本发明起辅助作用。

实施例2含转录因子AaSOC编码基因的重组基因工程菌的制备

利用特异引物对：GSPf-- ctggtaccATGGTGAGGGGGAAGACA (SEQ ID NO：8，含Kpn1酶切位点)，GSPr—gctctagaTCATTTTTCTCTGCCTTGGGT（SEQ ID NO：9，含Xba1酶切位点），以实施例1中获得的高质量反转录第一链产物cDNA为模板进行PCR反应，体系参照上述RACE反应体系，反应程序为：95 ℃1 min，94 ℃50 s，66 ℃1 min，72 ℃1.5 min，36个循环，72 ℃5 min。将获得的PCR产物回收后进行Kpn1、Xba1双酶切，酶切体系按照TAKARA公司内切酶说明书进行。酶切后的基因片段与同样酶切回收的表达载体pCAMBIA2300（M）（载体为分子生物学基础材料，各实验室均有保存，本载体为本实验室前人保存）中，测序验证，测序结果需与SEQ ID NO.2完全一致。然后将阳性质粒电击导入农杆菌菌株EHA105（实验室保存，亦可商业购买）中，获得含转录因子AaSOC编码基因的重组基因工程菌，即含有超量表达载体的农杆菌菌株EHA105。

实施例3含转录因子AaSOC编码基因在制备极早花植物中的应用

用实施例2制备的含有超量表达载体的农杆菌菌株EHA105侵染普通烟草无菌苗叶片，采用通用叶盘法转化（材料与方法严格参照Horsch RB, Fry JE, Hoffman NL,Eicholtz D, Rogers SG, Fraley RT (1985) A simple and general method fortransferring genes into plants. Science 227:1229–1231）。经过分化、再生、筛选，获得含有转录因子AaSOC编码基因的抗性烟草植株。生根后移栽入温室，进行性状鉴定和分析。

转基因抗性植株在移栽后，长势与野生型及对照（空载体转化株）均表现出明显的差异，主要体现在植株矮小，高度变矮，长势变慢，叶片面积缩小，植株浓绿，开花显著提前。与野生型植株的比较分析见图2。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省萧山棉麻研究所

<120> 红掌SOC转录因子AaSOC及其编码基因与应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> Anthurium andraeanum

<400> 1

Met Val Arg Gly Lys Thr Arg Met Gln Arg Ile Glu Asn Ala Ala Ser

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

Phe Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

35 40 45

Ser Pro Arg Gly Lys Leu Tyr Glu Phe Ser Ser Asn Ser Met Pro Lys

50 55 60

Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Arg His Met Asn Asn Thr Asn Thr Asn Ser

65 70 75 80

Ala Pro Thr Asp Gln Ser Met Gln Pro Trp Asn Ser Glu Ala Ala Asn

85 90 95

Met Met Lys Lys Ile Glu Phe Leu Gln Asp Tyr Lys Arg Lys Leu Leu

100 105 110

Gly Glu Ser Leu Gly Ser Cys Ser Thr Gly Glu Leu His Glu Ile Glu

115 120 125

Cys Gln Leu Glu Arg Ser Leu Gln Asn Val Arg Glu Lys Lys Asn Gln

130 135 140

Leu Phe Lys Glu Gln Ile Thr Ser Leu Lys Glu Lys Glu Arg Met Leu

145 150 155 160

Met Glu Glu Asn Leu Ser Leu Arg Glu Gln Ala Gln Gln His Gln Pro

165 170 175

Lys Pro Ser Glu Thr Val Thr Tyr Asp Asn Asp Ser Gly Asn Thr Glu

180 185 190

Val Glu Thr Glu Leu Phe Ile Gly Arg Pro Gly Thr Gly Arg Ser Pro

195 200 205

Cys Arg Thr Gln Gly Arg Glu Lys

210 215

<210> 2

<211> 651

<212> DNA

<213> Anthurium andraeanum

<400> 2

atggtgaggg ggaagacacg gatgcaaagg atagagaacg cggcgagccg gcaggtcacc 60

ttctccaagc gcaggaacgg cctcctgaag aaggccttcg agctgtccgt tctctgcgac 120

gccgaggtcg ccctcatcgt cttctccccg cgcggcaagc tctacgagtt ctccagcaac 180

agcatgccaa agacaattga tcgctatctg cggcatatga ataacaccaa cacaaacagt 240

gcgccaacag atcaaagtat gcagccatgg aattctgaag ctgcaaacat gatgaagaag 300

attgaatttc ttcaagacta caaaaggaag ctgctggggg aaagtttggg atcatgttca 360

actggggaac tgcatgaaat agagtgtcag ttggaacgta gcctgcaaaa tgttagagag 420

aagaagaatc aattattcaa ggagcagatt acatcgctga aggaaaagga gaggatgctg 480

atggaggaga atttatcatt gcgtgaacag gcgcaacaac atcaaccaaa accaagtgaa 540

acagtcacct atgacaatga cagcgggaac acggaagtag agacggaact cttcatcgga 600

agaccaggaa caggaagatc cccctgtaga acccaaggca gagaaaaatg a 651

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1

<400> 3

tctccccgcg cggcaagc 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P2

<400> 4

gaataattga ttcttct 17

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'f

<400> 5

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'r

<400> 6

gctatctgcg gcatatgaat aac 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5'f

<400> 7

aactgacact ctatttcatg ca 22

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GSPf

<400> 8

ctggtaccat ggtgaggggg aagaca 26

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GSPr

<400> 9

gctctagatc atttttctct gccttgggt 29

Claims

1.一种红掌SOC转录因子AaSOC，其特征在于，所述转录因子AaSOC的完整预测氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码基因如SEQ ID NO：2所示。