CN102653765A

CN102653765A - 植物抗病基因和提高植物抗病性的方法

Info

Publication number: CN102653765A
Application number: CN2011100485189A
Authority: CN
Inventors: 戴小枫; 陈捷胤; 田李; 汪佳妮
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-03-01
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2012-09-05

Abstract

本发明提供了植物抗病基因和一种提高植物抗病性的方法。根据本发明提供的植物抗病基因，所述植物抗病基因为基因a或基因b，其中，所述基因a为编码由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列组成的蛋白质的基因，所述基因b为编码由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。根据本发明提供的提高植物抗病性的方法，该方法包括制备基因修饰植物，其特征在于，相对于野生型植物，所述基因修饰植物中，基因a和/或基因b的表达增加。本发明分离了上述植物抗病基因并利用这些植物抗病基因提高植物的抗病性。

Description

植物抗病基因和提高植物抗病性的方法

技术领域

本发明涉及植物抗病基因和提高植物抗病性的方法，具体地涉及植物抗病基因和一种提高植物抗病性的方法。

背景技术

植物在进化过程中形成对病原菌不同层次和水平的抗性机制，包括在物种水平上不能被病原菌侵染的非寄主抗性，在品种水平上表现出应答病原菌所有小种的小种非特异性抗性和一个植物品种只对一个病原菌小种产生的小种专化性抗性。

寄主植物自身含有抗病基因和感病基因，病原菌中存在相应的无毒基因和毒性基因，基因型控制的植物抗病性通常是由抗病基因与相应来源于病原菌(包括真菌、细菌、病毒等)的无毒基因相互作用所决定，而抗病基因与毒性基因、感病基因与无毒基因以及感病基因与毒性基因的互作则表现为感病。这种寄主与病原物之间的受体-配体识别模式能够激活一系列的信号传导，活化各类防卫相关基因的表达，导致寄主产生过敏反应，引起侵染部位组织或器官坏死，抑制病原菌的生长和扩散，最终使寄主表现出对病原菌的抗性。

因此，分离植物抗病基因并利用这些植物抗病基因提高植物的抗病性，对于依赖植物的生产活动十分重要。

发明内容

为了分离植物抗病基因并利用这些植物抗病基因提高植物的抗病性，本发明提供了植物抗病基因和一种提高植物抗病性的方法。

根据本发明提供的植物抗病基因，所述植物抗病基因为基因a或基因b，其中，所述基因a为编码由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列组成的蛋白质的基因，所述基因b为编码由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。

根据本发明提供的提高植物抗病性的方法，该方法包括制备基因修饰植物，其特征在于，相对于野生型植物，所述基因修饰植物中，基因a和/或基因b的表达增加；其中，所述基因a为编码由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列组成的蛋白质的基因，所述基因b为编码由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。

本发明分离了上述植物抗病基因并利用这些植物抗病基因提高植物的抗病性，特别是提高小麦、玉米、黑麦、水稻、燕麦、大麦、高粱、小米、大豆、油菜、向日葵、番茄、麻、棉花和拟南芥的抗立枯病、疫病、炭疽病、红粉病、稻瘟病、白粉病、锈病、黑斑病、角斑病、茎枯病、黑果病、黄萎病和枯萎病的抗病性。

具体实施方式

符合上述要求的基因a或基因b，也可以依据各自编码的蛋白质的氨基酸序列确定其碱基序列。符合上述要求的基因a或基因b，还可以根据其碱基序列通过全基因合成的方法得到，所述全基因合成的方法已为本领域公知且已有商业化定制服务提供，本发明在此不再赘述。

需要说明的是，“表达增加”的概念中，“表达”是指是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程；上述过程的强度增加即为表达增加，具体地，可以为转录得到的产物和翻译得到的产物增加。

其中，所述基因a或所述基因b的碱基序列没有特殊要求，可以为满足各自编码的蛋白质具有上述氨基酸序列条件的各种碱基序列；优选情况下，所述基因a的碱基序列如SEQ ID NO：3(cDNA全长)或SEQ ID NO：4(ORF)所示；所述基因b的碱基序列如SEQ ID NO：5(cDNA全长)或SEQ ID NO：6(ORF)所示，在该优选情况下，所述基因a或基因b能够通过从海岛棉(Gossypium barbadense)中克隆而直接得到。其中，所述海岛棉的产地和株系没有特别的要求，可以使用各种能够商购获得的海岛棉。

其中，所述基因a或所述基因b的表达增加程度没有特殊要求，可以为从无到有的增加，也可以在所述野生型植物中存在基因a和/或基因b的表达的情况下增加其在所述基因修饰植物中的表达，为了进一步提高植物的抗病性，优选情况下，所述野生型植物中存在基因a和/或基因b的表达，以mRNA的丰度计，相对于野生型植物，所述基因修饰植物中，基因a和/或基因b的表达至少增加2倍，更进一步优选基因a和/或基因b的表达至少增加5倍。

其中，制备所述基因修饰植物的方法没有特殊要求，只要能使所述基因修饰植物中，相对于野生型植物，基因a和/或基因b的表达增加即可，例如在具有基因a和/或基因b表达的野生型植物中，在基因a和/或基因b的启动子区插入能够用于植物的强启动子，例如文献(Yamaguchi-Shinozaki K等.Mol Gen Genet 236：331-340)已公开的Ubi启动子、CaMV35S、诱导型启动子rd29A和强组成型启动子E12，为了进一步方便且稳定地提高植物的抗病性，优选情况下，制备所述基因修饰植物的方法包括：使用所述基因a的过表达重组载体和/或所述基因b的过表达重组载体转化野生型植物。

其中，所述基因a的过表达重组载体和/或所述基因b的过表达重组载体没有特别的要求，只要能使外源基因在野生型植物中表达即可，例如可以为插入基因a和/或基因b的各种常规的植物表达载体，为了进一步方便且稳定地提高植物的抗病性，优选情况下，所述基因a的过表达重组载体和/或所述基因b的过表达重组载体为插入基因a和/或基因b的pCAMBIA载体、pPZP载体、pBI载体和pRTL2载体的一种或多种；需要说明的是，pCAMBIA载体、pPZP载体、pBI载体和pRTL2载体均可通过商购获得，其序列已为本领域公知，例如pCAMBIA载体可以为编号为pCAMBIA1200、pCAMBIA1300、pCAMBIA1380、pCAMBIA1390、pCAMBIA2200、pCAMBIA2300或pCAMBIA1303的载体；pPZP载体可以为编号为pPZP212、pPZP2121或pPZP212-GFP的载体；pBI载体可以为编号为pBI121、pBI121-GFP或pBI101的载体；pRTL2载体可以为编号为pRTL2、pRTL2-GFP、pRTL2-RFP或pRTL2-YFP的载体。更进一步优选所述基因a的过表达重组载体为插入基因a的pCAMBIA1303载体，所述基因b的过表达重组载体为插入基因b的pCAMBIA1303载体。

需要说明的是，当过表达重组载体中同时插入基因a和基因b时，可以在基因a和基因b的序列之间设置IRES(中间核糖体进入序列)以使基因a和基因b可以同时过表达。

其中，所述转化的方法没有特别的要求，可以为常规的各种将外源基因转入植物的方法，例如《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版)中所述的农杆菌介导的植物基因遗传转化法、基因枪法、花粉管通道介导的基因转化法、聚乙二醇介导的基因转化法、电穿孔法、注射法、脂质体介导法和碳化硅纤维介导DNA转移法等，为了进一步方便且稳定地提高植物的抗病性，优选情况下，所述转化的方法包括：将所述基因a的过表达重组载体和/或所述基因b的过表达重组载体导入农杆菌，得到含有所述基因a的过表达重组载体和/或所述基因b的过表达重组载体的阳性农杆菌克隆，并且将阳性农杆菌克隆与所述野生型植物接触。所述将载体导入农杆菌的方法和所述将将阳性农杆菌克隆与所述野生型植物接触的方法均为本领域公知且通用的方法，本发明在此不再赘述。

本发明所述的植物可以为小麦、玉米、黑麦、水稻、燕麦、大麦、高粱、小米、大豆、油菜、向日葵、番茄、麻、棉花和拟南芥中的一种或多种。

本发明所述的抗病性可以为抗立枯病、疫病、炭疽病、红粉病、稻瘟病、白粉病、锈病、黑斑病、角斑病、茎枯病、黑果病、黄萎病和枯萎病的抗病性。

实验证明，本发明提供的方法可以有效地用于抵抗由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的黄萎病。

以下，通过实施例进一步说明本发明，但本发明的范围并不限于以下实施例中。

实施例

按照《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版)中所述的方法提取海岛棉(棉籽购于中国农业科学院植保所)的7日龄幼苗的总RNA，并按反转录试剂盒(ProtoScript TM First Strand cDNA Synthesis Kit)的说明制备cDNA-RNA杂合分子。

使用引物对a(订购自Invitrogen公司，上游引物a1(SEQ ID NO：7)，5’-GGATCCTGGGGACTTTTTGTTTTATG-3’；下游引物a2(SEQ ID NO：8)，5’-GGTCACCTAGAAAAGGAAAATGGTTGC-3’；)和引物对b(订购自Invitrogen公司，上游引物b1(SEQ ID NO：9)，5’-GGATCCCATTCATCTTTCAATAGCCTC-3’；下游引物b2(SEQ ID NO：10)，5’-GGTCACCAATACAAGGAAAGAGATAGC-3’；)在5’和3’末端分别创建BamH I限制酶切位点和BstE II限制酶切位点并通过PCR从上述cDNA-RNA杂合分子中分别扩增得到基因a的DNA分子片段和基因b的DNA分子片段。经DNA自动测序仪测得上述得到的扩增得到基因a的DNA分子片段和基因b的DNA分子片段的序列，阅读上述基因a的DNA分子片段的序列可见其中包含SEQ ID NO：4所示的碱基序列，对照密码子表可知SEQ ID NO：4所示的碱基序列编码由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列组成的蛋白质；阅读上述基因b的DNA分子片段的序列可见其中包含SEQ IDNO：6所示的碱基序列，对照密码子表可知SEQ ID NO：6所示的碱基序列编码由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质；然后按照《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版)中所述的方法，分别将分别扩增得到基因a的DNA分子片段和基因b的DNA分子片段分别插入到pCAMBIA1303质粒(购自澳大利亚CAMBIA公司)的Bgl II限制酶切位点和BstE II限制酶切位点之间(BamH I限制酶与Bgl II限制酶为同尾酶)，得到基因a的过表达重组载体和基因b的过表达重组载体，经DNA自动测序仪测得基因a的过表达重组载体和基因b的过表达重组载体的序列分别含有如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6所示的序列。

按照《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版)中所述的方法，将得到的基因a的过表达重组载体和基因b的过表达重组载体分别导入农杆菌(菌株为LBA4404，购于中国农业科学院植保所)中，得到阳性农杆菌克隆a和阳性农杆菌克隆b。

将阳性农杆菌克隆a接种于含50mg/ml卡那霉素和25mg/ml利福平的YEB培养液(YEB培养液的制备方法见《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版))中，28℃下振荡培养2天；得到活化的菌液a和菌液b；然后按1∶400的体积比将活化的菌液转接到200ml含50mg/ml卡那霉素和25mg/ml利福平的YEB培养液中，28℃下，振荡培养至OD600为1.5-3.0后离心分别收集菌体。用浸泡溶液(浸泡溶液由5体积％的MS培养基(MS培养基按照《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版)中所述的方法配制)，10重量％的蔗糖(分析纯，购自Sigma公司)，0.03体积％的表面活性剂(Silwet L-77，购自Sigma公司)和余量的水组成)重新悬浮菌体并稀释至OD600约为0.8-1.0，得到含有阳性农杆菌克隆a的转化液。用阳性农杆菌克隆b替换上述阳性农杆菌克隆a，按照上述方法得到含有阳性农杆菌克隆b的转化液。

分别将待转化的拟南芥植株倒置并完全浸泡在含有阳性农杆菌克隆a的转化液和含有阳性农杆菌克隆b的转化液中维持30s，然后取出浸泡后的拟南芥植株弱光条件下放置过夜；然后继续培养直至获得成熟拟南芥种子。

按《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版)中所述的方法用潮霉素筛选3代后，分别得到用所述基因a的过表达重组载体转化了的拟南芥株系a和用所述基因b的过表达重组载体转化了的拟南芥株系b。

用定量PCR分别检测拟南芥株系a植株中基因a的表达量、拟南芥株系b中基因b的表达量以及野生型拟南芥中基因a和基因b的表达量。结果证明，野生型拟南芥的全植株cDNA样品中不能扩增得到基因a和基因b的特异性片段，因此，野生型拟南芥中未见基因a和基因b的表达；拟南芥株系a的全植株cDNA样品中能够扩增得到基因a的特异性片段，因此拟南芥株系a中具有基因a的表达；拟南芥株系b的全植株cDNA样品中能够扩增得到基因b的特异性片段，因此拟南芥株系b中具有基因b的表达。

测试例

将大丽轮枝菌(Verticillium dahliae，购自美国ATCC，商品号为26289^TM)接种于PDA固体培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)上，25℃下培养4-5天后，用灭菌水冲洗PDA固体培养基平板以洗脱孢子，得到孢子浓度为5×10⁷cfu/ml的大丽轮枝菌孢子悬浮液。

将野生型拟南芥、实施例得到的拟南芥株系a和拟南芥株系b的4周龄幼苗的根部分别浸入20ml的上述大丽轮枝菌孢子悬浮液中1min(以灭菌水代替大丽轮枝菌孢子悬浮液作为对照)；然后将浸泡后的幼苗在相对湿度70％的条件下保持2天后继续培养4周，观察植株的鲜重、高度和病害程度，再培养2周后测定植株干重。结果如下：

接种大丽轮枝菌之后，野生型拟南芥几乎致死，植株生长延缓且呈现干枯、严重矮化，分蘖能力丧失，无法结实，植株干重较对照相比降低了86.6重量％，株高下降了61.5％。拟南芥株系a和拟南芥株系b的分蘖能力恢复正常，生长延缓得到明显改善，株高相对正常，种子结实正常。拟南芥株系a的干重较对照相比降低了47.5重量％-55.6重量％，株高下降了22.5％-33.7％，拟南芥株系b的干重较对照相比降低了52.2重量％-58.8重量％，株高下降了36.1％-41.4％。

由此可见，拟南芥株系a和拟南芥株系b与野生型拟南芥相比，对大丽轮枝菌导致的黄萎病的抗性明显增强。

通过本发明的上述公开并结合本领域的公知常识，本领域技术人员很容易理解，采用本发明的方法也能提高小麦、玉米、黑麦、水稻、燕麦、大麦、高粱、小米、大豆、油菜、向日葵、番茄、麻或棉花抗立枯病、疫病、炭疽病、红粉病、稻瘟病、白粉病、锈病、黑斑病、角斑病、茎枯病、黑果病、黄萎病和枯萎病的抗病性。

Claims

1.植物抗病基因，所述植物抗病基因为基因a或基因b，其中，所述基因a为编码由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列组成的蛋白质的基因，所述基因b为编码由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。

2.根据权利要求1所述的植物抗病基因，其中，所述基因a的碱基序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示；所述基因b的碱基序列如SEQID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

3.一种提高植物抗病性的方法，该方法包括制备基因修饰植物，其特征在于，相对于野生型植物，所述基因修饰植物中，基因a和/或基因b的表达增加；其中，所述基因a为编码由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列组成的蛋白质的基因，所述基因b为编码由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述基因a的碱基序列如SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4所示；所述基因b的碱基序列如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述野生型植物中存在基因a和/或基因b的表达，相对于野生型植物，所述基因修饰植物中，基因a和/或基因b的表达至少增加2倍。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其中，制备所述基因修饰植物的方法包括：使用所述基因a的过表达重组载体和/或所述基因b的过表达重组载体转化野生型植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述基因a的过表达重组载体为插入基因a的pCAMBIA载体、pPZP载体、pBI载体和pRTL2载体中的一种或多种，所述基因b的过表达重组载体为插入基因b的pCAMBIA载体、pPZP载体、pBI载体和pRTL2载体中的一种或多种。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述基因a的过表达重组载体为插入基因a的pCAMBIA1303载体，所述基因b的过表达重组载体为插入基因b的pCAMBIA1303载体。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述转化的方法包括：将所述基因a的过表达重组载体和/或所述基因b的过表达重组载体导入农杆菌，得到含有所述基因a的过表达重组载体和/或所述基因b的过表达重组载体的阳性农杆菌克隆，并且将阳性农杆菌克隆与所述野生型植物接触。

10.根据权利要求3所述的方法，其中，所述植物为小麦、玉米、黑麦、水稻、燕麦、大麦、高粱、小米、大豆、油菜、向日葵、番茄、麻、棉花和拟南芥中的一种或多种；所述抗病性为抗立枯病、疫病、炭疽病、红粉病、稻瘟病、白粉病、锈病、黑斑病、角斑病、茎枯病、黑果病、黄萎病和枯萎病中的一种或多种的抗病性。