CN114480300A - 一种提高球孢白僵菌毒力的真菌病毒及其传毒方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高球孢白僵菌毒力的多聚病毒科双链RNA真菌病毒，其包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；以及所述多聚病毒科双链RNA真菌病毒用于提高球孢白僵菌的毒力的用途。本发明还提供了含有所述多聚病毒科双链RNA真菌病毒的球孢白僵菌菌株。

Description

一种提高球孢白僵菌毒力的真菌病毒及其传毒方法
技术领域
本发明涉及一种能够提高球孢白僵菌(Beauveria bassiana)杀虫毒力的新型多聚病毒科双链RNA真菌病毒，含有所述病毒的球孢白僵菌菌株及其应用。
背景技术
球孢白僵菌寄主范围广，是防治作物害虫的生物防治剂。球孢白僵菌广泛应用于作物病虫害的生物防治，其主要依靠分生孢子实现其内生性及直接作用于靶标有害生物。研究表明，球孢白僵菌毒力与菌丝生长速度、生长环境、培养基营养等密切相关。近期研究表明，真菌病毒能够影响球孢白僵菌的毒力。
研究表明，来源于世界各地近五分之一以上的球孢白僵菌分离物含有双链RNA病毒。主要包括Totiviridae，Partitiviridae， Polymycoviridae三个科，以及未分类的含有最小基因组的 Narnaviridae。目前，已经报道的球孢白僵菌中双链RNA病毒少量属于Totiviridae，部分属于含有2-4条双链RNA的Partitiviridae，而 Polymycoviridae由4条以上双链RNA构成，但未见含有RNA缺陷型病毒。
在双链RNA病毒对寄主球孢白僵菌的影响研究方面，有研究表明，含有Polymycoviridae病毒科病毒的球孢白僵菌菌株菌落生长速度及生物量低于不含病毒的菌株，及多具体病毒导致了寄主球孢白僵菌生长速度和生物量的降低；在内生病毒对球孢白僵菌杀虫活性研究方面，有报道Partitiviridae病毒降低球孢白僵菌杀虫活性，多聚体病毒对球孢白僵菌毒力的影响未见报道。同时，真菌病毒主要传毒方法为培养基对峙培养，未见其他传毒方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种与球孢白僵菌对害虫毒力和生长速度、孢子萌发率、菌体干重以及芽生孢子浓度呈正相关的真菌内生多聚体双链RNA病毒，及利用昆虫虫体进行传毒的方法，以期用于球孢白僵菌防治害虫过程中提高毒力的目的。
所述病毒内生于分离自吉林省靖宇县玉米田间亚洲玉米螟幼虫僵虫的球孢白僵菌菌株BbOFJY中。该菌株吉林省农业科学院保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，2021年5月24日中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收到并登记入册，菌种保藏号为CGMCC No. 22429，分类命名球孢白僵菌Beauveria bassiana，保藏人地址是吉林省长春市净月经济技术开发区生态大街1363号，保藏单位的地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物所。
在一个实施方案中，本发明提供了一种多聚病毒科双链RNA真菌病毒，其包含SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种多聚病毒科双链RNA真菌病毒，其由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明提供了一种使用多聚病毒科双链 RNA真菌病毒而提高球孢白僵菌杀虫毒力的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种防治植物害虫的方法，包括利用昆虫虫体使所述多聚病毒科双链RNA真菌病毒感染球孢白僵菌的方法。
通过将上述病毒利用新的传毒方法转移到球孢白僵菌中，成功创制了高毒力新菌株，从而提高球孢白僵菌对害虫毒力，降低生产和防治成本。
在另一个方面，本发明提供了一种球孢白僵菌菌株，其含有所述多聚体双链RNA真菌病毒。
在一个实施方案中，所述菌株的保藏号为CGMCC No.22429。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以本申请说明书为准。下面描述优选的方法和材料，但是与本文所述那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而非旨在限制。
附图说明
图1为dsRNA提取结果的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为BbPmV-4病毒基因组结构图。
图3为病毒基因组5'端和3'端区域的多重序列比对结果。
图4为脱毒菌株dsRNA(A)及RT-PCR(B)检测图。
图5为病毒对球孢白僵菌在PDA培养基上的菌落形态(A)及生长速率(B)影响图。
图6病毒对球孢白僵菌在察氏培养基上的菌落形态(A)及生长速率(B)影响图。
图7病毒对球孢白僵菌产孢量(A、B)12h孢子萌发率(C)及 16h孢子萌发率(D)的影响。
图8病毒对球孢白僵菌干重的影响。
图9病毒对球孢白僵菌芽生孢子产孢量的影响。
图10传毒菌株的双链RNA提取检测
图11传毒菌株的病毒RT-PCR检测
图12对害虫毒力的LT50测定
具体实施方式
实施例1球孢白僵菌双链RNA基因的分离及鉴定
1.1球孢白僵菌菌株双链RNA的分离
1)在无菌研钵中将干燥的菌丝研磨成粉状；
2)每0.2g样品中加入2×GPS缓冲液：500μL；Trizol：500 μL；氯仿：500μL；10％SDS：150μL。混合均匀后室温下振荡10 min；
3)12000r/min，4℃离心10min，将上清液转移至新的无菌2 mL离心管中；
4)向溶液中加入0.05g纤维素粉，并按照每1000μL溶液，加入180μL无水乙醇比例添加无水乙醇；
5)冰浴0.5h使纤维素粉充分吸收dsRNA，12000r/min，4℃离心2min，弃上清；
6)加入600μL洗脱液，充分混匀并于冰上静置1min，12000 r/min，4℃离心2min，弃上清；
7)重复步骤6；
8)加入650μL的1×STE溶液，振荡5min，冰上静置3min；
9)12000r/min，4℃离心5min，将上清液转移至1.5mL无菌离心管中并加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混合，-20℃静置1小时以上；
10)4℃，12000r/min离心10min，弃上清；
11)加入600μL的75％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000r/min离心2 min，弃上清；
12)重复步骤11；
13)4℃，12000r/min离心1min，用移液器将残留液体吸除；
14)37℃下，真空干燥3min，加入DEPC水溶解dsRNA。
1.2病毒基因组扩增
将127μg样品送至诺禾致源生物技术有限公司在Hiseq-PE150 平台进行转录组双端测序，每个方向的测序长度为150bp。测序完成之后，使用Spades(V3.13.1)软件分析转录组数据(Antipov et al.，2020)，并对序列进行拼接，最终得到6条dsRNA的部分序列。对拼接序列进行BLASTp比对，获得了dsRNA1、dsRNA2、 dsRNA3和dsRNA4的部分序列，注释结果未比对到关于dsRNA5和 dsRNA6的序列信息。dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3和dsRNA4序列需要进行末端克隆，dsRNA5和dsRNA6的序列需要进行随机克隆。
加接头连接反应。取dsRNA样品12μL，加入PC3-T7 loop(30 pmol/μL)接头或者RACE-oligo(30pmol/μL)接头1μL；DMSO溶液2μL，90℃金属浴加热5min，立即冰浴5min，依次加入以下药品：RNA酶抑制剂：1μL；10×T4 RNA ligase buffer：5μL；50％PEG6000：25μL；BSA：3μL；T4 RNA ligase：1μL，总体系50 μL，置于冰水混合物中使温度保持在4-16℃，反应24h。
取上一步反应产物，补加DEPC水使总体系达800μL，加300 μL氯仿抽提；4℃，12000r/min离心10min，吸取700μL上清液，加入5μL核酸助沉剂颠倒混匀，加入0.1倍体积3MpH＝5.2的 NaAC；加入等体积的异丙醇，-20℃下沉淀30min以上；4℃， 12000r/min离心10min，弃上清液；加入600μL 75％乙醇洗涤沉淀，离心2min，弃上清；室温干燥，用DEPC水溶解沉淀。
取纯化过的dsRNA进行反转录，若连接RACE-oligo接头加入反转录引物RACE1：3μL；纯化后dsRNA溶液11.5μL；DMSO溶液2μL，混匀后95℃处理3min，立即冰浴5min。连接PC3-T7 loop 接头存在发夹结构，无需反转录引物，加入纯化后dsRNA溶液14.5 μL；DMSO溶液2μL，混匀后95℃处理3min，立即冰浴5min。依次加入以下药品：5×Reverse TranscriptaseM-MLV Buffer：5μL；dNTP(10mM)：2μL；RNA抑制剂(40U/μL)：0.5μL； ReverseTranscriptase M-MLV(200U/μL)：1μL，总体系25μL。轻轻混匀，金属浴设置30℃反应10min，42℃反应1h，70℃反应 15min，4℃保存。利用如下体系进行巢式PCR。
PCR扩增体系
Figure RE-GDA0003501697210000061
PCR阴性对照cDNA为ddH2O，PCR程序设置为95℃预变性反应3min；94℃变性反应30s，55℃退火反应30s，72℃延伸反应 50s，30-35个循环；72℃延伸反应5min，16℃保存。电泳后利用 Omega DNA凝胶回收试剂盒进行巢式PCR产物回收，对回收的 PCR产物进行克隆及测序。首先，将胶回收产物4.5μL，pMD18-T Vector 0.5μL，Solution I 5μL混合均匀后放置于16℃金属浴反应1h 以上(长片段的PCR产物可延长连接时间可连接4-12h过夜)。- 80℃冰箱取出感受态细胞置于冰上，将10μL连接液加入50μL感受态细胞，冰浴30min。42℃水浴热激60s，立即冰浴3min，加入 400μL LB液体培养基，37℃摇床200r/min培养30min。吸取200 μL菌液涂于含有0.1mg/mL Amp的LB固体培养基上，37℃倒置培养12h。用无菌的牙签挑取单菌落，每个皿挑取8个，分别放入含有0.1mg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃摇床200r/min培养6 h。待菌液浑浊，进行菌液PCR检测，分别用M13F-47和M13R-48 以及特异性引物检测，将含有单一目的片段的菌液样品送至武汉金开瑞生物工程公司进行测序。
片段dsRNA5和dsRNA6随机克隆。将提取的RNA粗提液进行 DNase I和SI核酸酶处理，去除样品中的DNA和单链RNA (ssRNA)。酶解体系中依次加入RNA粗提液：26.5μL，10×DNaseI buffer：3μL，10×SI buffer：3μL，DNaseI(5U/μL)：0.4 μL，SI(180U/μL)：0.1μL，置于25℃反应1h，65℃金属浴反应 5min，4℃或者-20℃保存。SI核酸酶最适反应温度为23℃，DNaseI 最适反应温度为37℃，可放置室温同时反应。利用前述方法对 dsRNA5和dsRNA6电泳条带进行回收、纯化后，以纯化的dsRNA 为模板，RACE3RT(30pm/μL)为反转录引物进行反转录。反转录体系为：dsRNA含量需在50-100ng，加入1μL的RACE3RT(30 pm/μL)，加入2μL的DMSO，添加DEPC水至15μL，混匀后 95℃处理3min，立即冰浴5min。按前述方法进行反转录反应。向反转录产物中加入1M NaOH 2.5μL，65℃反应lh，室温下冷却，加入2.5μL的1M Tris-HCl(pH＝7.5-8.0)，2.5μL的1M HCl，65- 68℃复性lh，产物可直接作为cDNA进行PCR反应。
取上述cDNA进行补平以及PCR扩增反应。PCR扩增体系同 2.2.4.4，引物为RACE3(30pm/μL)。PCR程序设置为：95℃变性 5min，72℃延伸10min，完成补平反应。95℃预变性反应3min； 94℃变性反应30s，55℃退火反应30s，72℃延伸反应1min，30-35 个循环；72℃延伸反应5min，16℃保存，完成PCR扩增反应。使用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测发现扩增出为连续条带，选择与目的片段大小相近的部分，即250-1000bp的部分切胶回收，使用Omega DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物并连接载体进行测序。
1.3.病毒基因组序列比对鉴定
采用chromas(2.6.6.0)对测序结果进行分析，DNAMAN (version 9)进行序列拼接。设计特异性引物对dsRNA1、dsRNA2、 dsRNA3、dsRNA4、dsRNA5和dsRNA6进行PCR扩增检测全长序列，回收产物连接载体测序。通过NCBI的ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测dsRNAs的ORF (Open-Reading Frame)。利用BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列相似性搜索。通过NCBI保守结构域数据库(CDD)预测dsRNAs的保守结构域。利用MEGAX 使用ML法构建系统发育树，并进行1000次bootstrap分析。
1.4.结果
dsRNA提取结果的电泳图参见图1。经过上述测序后，发现病毒的全长基因组序列包含以下6个部分：dsRNA1、dsRNA2、 dsRNA3、dsRNA4、dsRNA5和，其核苷酸序列分别如SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6所示。以下更详细描述这些序列。
经过末端序列克隆以及随机克隆后得到dsRNA1、dsRNA2、 dsRNA3、dsRNA4、dsRNA5和dsRNA6的序列全长分别为2427 bp、2280bp、2015bp、1106bp、867bp和794bp。通过序列同源性分析发现，该病毒的dsRNA1序列与球孢白僵菌中已报道的BbPmV- 3的RdRp序列相似度最高为72.16％，其次是与BbPmV-2的RdRp 序列相似度较高为71.45％。因此初步判定其为一种新的多聚真菌病毒，并将其命名为Beauveria bassiana polymycovirus 4(BbPmV-4)。BbPmV-4的基因组由6个片段组成，在GenBank数据库中其核苷酸序列的登录号为MW385785-MW385790。BbPmV-4的基因组结构如图2所示，每一个片段编码一个开放阅读框，且六个片段的 5′末端和3′末端高度保守(图3)，与BbPmV-3的末端保守序列相似度较高，5′末端保守的序列 (GAANUNAAGNGUUNUUCUNCNCAAG)和3′末端保守的序列 (UUU)相同。命名为BbPmV-4。
dsRNA1编码的ORF1起始于27nt，结束于2333nt，编码768 aa。用BLASTp对数据库进行搜索，发现BbPmV-4的氨基酸序列与 BbPmV-2的相似度最高为79.43％(GenBankaccession number： CUS18599.1；query coverage＝100％；E-value＝0)，编码RdRp。在保守域数据库搜索比对，存在RT-like superfamily保守域 (GenBank accession number：cl02808；E-value＝4.44e-04)。
dsRNA2编码的ORF2起始于71nt，结束于2170nt，编码699 aa。用BLASTp对数据库进行搜索，发现BbPmV-4的氨基酸序列与 BbPmV-3的相似度最高为82.35％(GenBankaccession number： CAD7829824.1；query coverage＝91％；E-value＝0)，编码假定支架蛋白(putative scaffold protein)。在保守域数据库搜索比对显示不存在保守结构域。
dsRNA3编码的ORF3起始于52nt，结束于1905nt，编码617 aa。用BLASTp对数据库进行搜索，发现BbPmV-4的氨基酸序列与 BbPmV-3的相似度最高为74.39％(GenBankaccession number： CAD7829825.1；query coverage＝91％；E-value＝0)，编码甲基转移酶。在保守域数据库搜索比对，存在AdoMtr-MTases superfamily保守结构域(GenBankaccession number：cd02440；E-value＝2.02e- 06)。
dsRNA4编码的ORF4起始于111nt，结束于908nt，编码265 aa。用BLASTp对数据库进行搜索，发现BbPmV-4的氨基酸序列与 BbPmV-3的相似度最高为80.15％(GenBankaccession number： CAD7829826.1；query coverage＝71％；E-value＝9e-152)，编码PASrp。在保守域数据库搜索比对显示不存在保守结构域。
dsRNA5编码的ORF5起始于105nt，结束于713nt，编码202 aa。用BLASTp对数据库进行搜索，发现BbPmV-4的氨基酸序列与 BbPmV-3的相似度最高为61.76％(GenBankaccession number： CAD7829828.1；query coverage＝69％；E-value＝1e-33)，编码未知蛋白。在保守域数据库搜索比对显示不存在保守结构域。
dsRNA6编码的ORF6起始于111nt，结束于596nt，编码161 aa。用BLASTp对数据库进行搜索，发现BbPmV-4的氨基酸序列与 BbPmV-3的相似度最高为78.95％(GenBankaccession number： CAD7829826.1；query coverage＝50％；E-value＝2e-70)，编码PASrp。在保守域数据库搜索比对显示不存在保守结构域。
实施例2病毒BbPmV-4脱毒对白僵菌生物学特性的影响
2.1脱毒菌株的获得及分析
分离球孢白僵菌BbOFJY的单孢，接种在PDA平板放置26℃的恒温培养箱暗培养5d，切取菌丝尖端接种于新的PDA平板进行培养，连续切取菌丝尖端继代培养5代，检测分离出的菌株是否脱毒。提取菌株的dsRNA，并进行DNase I和S1核酸酶处理，利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，原始菌株为阳性对照，并利用RT- PCR检测菌株是否脱毒，以此获得脱毒菌株BbOFJYF。提取筛选后菌株菌丝进行dsRNA提取验证，进行初步筛选，得到无dsRNA菌株。对于初步筛选菌株进行总RNA提取，N6随机引物(10 pm/μL)为反转录引物。dsRNA含量需在50-100ng，N6(10 pm/μL)加入1μL，DMSO加入2μL，添加DEPC水至15μL，混匀后95℃处理3min，立即冰浴5min。以所得cDNA为模板，利用引物对于病毒特异性序列进行PCR扩增。RT-PCR为阳性的表明已经成功获得脱毒菌株，标记为BbOFJYF。
BbPmV-4检测引物
Figure RE-GDA0003501697210000111
PCR程序如下：
Figure RE-GDA0003501697210000112
2.2菌株生长速率及菌落形态特征
将BbOFJY、BbOFJYF菌株接种于PDA培养基，置于温度为 26℃的恒温培养箱暗培养10d，用无菌水配制孢悬液，充分混匀并用血球计数板计数，稀释浓度至5×104个/mL，滴加2μL孢子悬液即n＝100个孢子至平板中央，每组10个重复，同时接种于察氏培养基以及PDA培养基，每个平板为25mL培养基。置于26℃恒温培养箱培养，从长出菌落开始采用十字交叉法测量菌落直径并记录15天，同时观察球孢白僵菌菌落颜色、基质颜色、形态特征。该实验重复两次。使用IBM SPSS Statistics 26软件对数据进行方差齐性检测及描述性统计，通过Duncan’s方法进行多重比较及显著性分析。
2.3产孢量及孢子萌发率测定
BbOFJY、BbOFJYF菌株接种于PDA培养基，每个平板培养基为25ml。滴加2μL浓度为5×104个/ml孢子悬液，即n＝100个孢子于PDA培养基中央，放入26℃恒温培养箱中培养15天，每个菌株重复3次，将平板上孢子全部刮下，加入10mL 0.05％吐温-80充分混匀，置于显微镜下用血球计数板计数，计算平均每皿菌株的产孢量。
取培养15天的BbOFJY、BbOFJYF菌株用无菌水冲洗孢子，加入1×107个孢子到20mLSDY液体培养基中，26℃，200r/min条件下培养12h，16h，每组5次重复。吸取适量菌液滴在载玻片中央，置于显微镜下，观察并记录孢子的萌发情况，当芽管长度大于或等于孢子直径时视为萌发，每个处理在显微镜下观察时不少于100个孢子，重复镜检3次。
2.4菌体干重积累量测定
取培养15天的BbOFJY、BbOFJYF菌株用无菌水冲洗孢子，20 mL SDY液体培养基中加入2×107个孢子，26℃，200r/min条件下培养1、2、3、4、5天后，用双层滤纸过滤除去培养基，将滤纸及菌丝于80℃烘箱烘干，称重计数，每个处理3个重复。
2.5观察芽生孢子
取培养15天的BbOFJY、BbOFJYF菌株用无菌水冲洗孢子，在 20mL SDY液体培养基中加入5×107个孢子，26℃，200r/min条件下培养，记录24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、 120h时芽生孢的形态，每个处理3个重复，并记录孢子浓度。
2.6结果
2.6.1脱毒菌株验证
单孢分离的后代菌株取菌丝尖端进行继代培养5代后进行 dsRNA的提取，结果显示其中一个菌株不含dsRNA条带，未经 DNase 1和S1核酸酶处理显示有核酸，经过DNase 1和S1核酸酶处理后显示为空泳道(图4)，而原始菌株经过和未经过DNase 1和 S1核酸酶处理都显示有dsRNA条带。为了进一步证明该菌株已经脱毒，对该菌株采用RT-PCR进行检测，分别用两对引物进行检测分析，结果显示BbOFJY菌株分别扩增出了333bp和712bp大小的目标条带，BbOFJYF菌株对两对引物均呈阴性反应(图4-1B)。因此确定菌株BbOFJYF为脱毒菌株，以进行后续实验。
2.6.2菌株生长速率及菌落形态特征观察
将原始菌株BbOFJY和脱毒菌株BbOFJYF接种在PDA培养基上放置于26℃的恒温培养箱暗培养，培养9天后，菌落形态表现出显著的差异：原始菌株BbOFJY呈隆起的同心轮纹圈并且菌落疏松较薄，菌落边缘呈放射状且规则；而脱毒菌株BbOFJYF菌落呈现致密绒毛状，并且菌落较厚凹凸不平，菌落边缘不规则(图5)，菌落的生长直径在第3天时有了差异，组间数据分析显示差异极显著，随后在第6-15天，菌株BbOFJY的菌落直径都要显著高于菌株 BbOFJYF的菌落直径，且组内数据重复性较好，标准误差较小， BbPmV-4的存在能够促进菌株BbOFJY的生长。
原始菌株BbOFJY和脱毒菌株BbOFJYF接种在察氏培养基上放置于26℃的恒温培养箱暗培养，培养12天后，菌落形态表现出差异：原始菌株BbOFJY的菌落边缘呈放射状，较为规则，少有凸起；脱毒菌株BbOFJYF菌落边缘不规则，凹凸不平(图6)。且两种菌株在察氏培养基上生长速度都较为缓慢，整体生长速率都要低于在PDA平板上的生长速率，察氏培养基与PDA培养基相比营养较为贫瘠。原始菌株BbOFJY和脱毒菌株BbOFJYF菌株在察氏培养基上的生长速率差异极为显著，BbPmV-4的存在能够促进菌株 BbOFJY的生长。
2.6.3产孢量及孢子萌发率测定
将接种于PDA培养基的BbOFJY、BbOFJYF菌株，放入26℃恒温培养箱中培养15天，图7A为菌株刮后的平板，仍可以看到菌株 BbOFJY的同心轮纹圈以及规则的菌落边缘，菌株BbOFJY不规则的菌落边缘。加入0.05％吐温-80至10ml，充分混匀，菌株BbOFJY平均每皿的产孢量为5.08×107个，菌株BbOFJYF平均每皿的产孢量为7.06×107个，差异较为显著(图7B)。菌株BbOFJY的菌落形态较为疏松但是产孢量却显著低于菌株BbOFJYF，对菌株鲜重进行了分析发现，菌株BbOFJYF的菌丝鲜重略高于菌株BbOFJY，但差异并不显著，可能与菌株BbOFJYF的菌落较为致密呈绒毛状有关。
取上述培养15天的BbOFJY、BbOFJYF菌株，用无菌水冲洗孢子，加入1×107个孢子到20mL SDY培养基中，26℃，200r/min条件下分别培养12h、16h后统计孢子萌发率发现：12h孢子萌发率均较低，菌株BbOFJY的孢子萌发率为37.29％，菌株BbOFJYF的孢子萌发率为32.79％，且两个菌株之间孢子萌发率差异不显著 (P>0.05)(图7C)；16h时大部分的孢子都已经萌发，菌株 BbOFJY的孢子萌发率为90.32％，菌株BbOFJY-F的孢子萌发率为 73.95％，菌株BbOFJY的孢子萌发率显著高于菌株BbOFJYF的孢子萌发率(P<0.001)(图7D)。培养12h以及16h后菌株BbOFJY的孢子萌发率均要高于菌株BbOFJYF的孢子萌发率。
2.6.4菌体干重积累量测定
分别加入两种菌株2×107个孢子到20mL SDY液体培养基中， 26℃，200r/min条件下培养1、2、3、4、5天后，对菌体干重进行测量，统计分析发现菌株BbOFJY及菌株BbOFJYF菌体的增长量不同，1-4天时菌株BbOFJYF的菌体增长量要高于菌株BbOFJY，但是差异不显著，第5天时菌株BbOFJY的菌体增长量要高于菌株 BbOFJYF，差异仍不显著。两个菌株随着培养时间的延长菌体干重都呈上升的趋势，且整体来看菌株BbOFJYF的上升趋势更缓慢(图 8)。
2.6.5芽生孢子浓度
分别加入5×107个孢子到20ml的SDY、TKI液体培养基中， 26℃，200r/min条件下培养，记录24h、36h、48h、60h、72h、 84h、96h、108h、120h时芽生孢子与深层孢子的浓度与形态。菌株BbOFJY和菌株BbOFJYF的芽生孢子浓度整体上呈上升趋势，且菌株BbOFJY的芽生孢子浓度从48h以后均高于菌株BbOFJYF，在 72h、84h和120h时菌株芽生孢子浓度差异较为显著，在108h时菌株芽生孢子浓度差异显著(图9)。
实施例3球孢白僵菌病毒菌种间传播及对球孢白僵菌毒力的影响
3.1球孢白僵菌病毒菌种间传毒
分别将含病毒菌株BbOFJY与含有抗草铵膦基因的工程菌株 BbOFDH1-5(CGMCCNo.15673)活化，在PDA培养基上26℃暗培养 10d后，刮取培养及表面分生孢子，将两个菌株的分生孢子用无菌水分别配置成107个孢子/ml的孢子悬液并充分混匀，将活柞蚕蛹浸渍在孢子悬液10秒后取出，26℃培养7-10天，待柞蚕蛹表面长出球孢白僵菌分生孢子后，刮取分生孢子100微升(浓度为103个孢子 /ml)涂布在含有草铵膦抗性的察氏培养基表面(草铵膦浓度200ng\μl) 上进行培养15d。
3.2传毒菌株病毒检测
将3.1中在含有草铵膦抗性的培养基表面产生的分生孢子进行单孢分离，随机分离20个单孢，接种于灭菌的PDA培养基上，暗培养15天。将长出的菌落再次在培养基上26℃暗培养10d，连续继代培养2次，将收集的菌丝提取双链RNA；将总RNA进行反转录，以所得cDNA为模板，利用2.1中引物及扩增程序对于病毒特异性序列进行PCR扩增。RT-PCR为阳性的表明病毒已经成功导入受体菌株BbOFDH1-5，随机选取其中1株阳性菌株，标记为BbOFDH1-5- V，用于毒力测定。
3.3球孢白僵菌对玉米螟幼虫的毒力检测
将接种于PDA培养基的菌株BbOFDH1-5和BbOFDH1-5-V，放入26℃恒温培养箱中培养15天，将菌体刮下溶于0.05％Tween-80 中，用无菌六层擦镜纸滤掉菌丝后，将过滤后的孢子液浓度稀释1.0×108个/mL。
选取玉米螟2龄幼虫，每20头虫1个重复，每浓度重复3次，以无菌0.05％Tween-80为对照。将虫体逐头浸入不同浓度的2ml球孢白僵菌孢子悬浮液中20s(20头可更换一次孢子悬液)，在24孔饲养板中正常饲养，饲养条件为光周期14L∶10D、温度26℃、相对湿度75％，每天观察死亡情况，用解剖针碰触虫体，虫体无任何反应即为死，记录每天昆虫死亡数量，以对照组幼虫死亡率低于20％记为有效。待不同处理供试昆虫死亡率达到90％以上后，建立回归方程，计算不同处理的致死中时间。
3.4结果
3.4.1传毒菌株病毒检测
总计分离20个单孢，13个菌株初步筛选时携带病毒，继代培养 2次后进行双链RNA提取，表明8个菌株仍然含有双链RNA(图 10)，通过RT-PCR验证，表明该8个菌株病毒稳定遗传(图 11)。
3.4.2毒力测定
1.0×108个/mL孢子浓度处理下，对照组幼虫死亡率为10％， BbOFDH1-5处理组幼虫LT50为6.25天，而BbOFDH1-5-V处理组幼虫LT50为5.21天，表明真菌多聚体双链RNA病毒BbPmV-4导入受体菌株后能够缩短杀虫时间，即提高菌株毒力。

Claims (6)

1.一种多聚病毒科(Polymycoviridae)双链RNA真菌病毒，其包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
2.一种多聚病毒科双链RNA真菌病毒，其由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成。
3.根据权利要求1或2所述的多聚病毒科双链RNA真菌病毒用于提高球孢白僵菌的毒力的用途。
4.一种防治植物害虫的方法，包括使权利要求1或2所述的多聚病毒科双链RNA真菌病毒感染球孢白僵菌的步骤。
5.一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株，其含有根据权利要求1或2所述的多聚病毒科双链RNA真菌病毒。
6.根据权利要求5所述的菌株，其保藏号为CGMCC No.22429。
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