CN101121746B

CN101121746B - 与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101121746B
Application number: CN200710118244XA
Authority: CN
Inventors: 马庆虎; 田斌
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2007-07-03
Filing date: 2007-07-03
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2027-07-03
Also published as: CN101121746A

Abstract

本发明公开了一种与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白及其编码基因与应用。该与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抵御植物病害侵袭相关的由(a)衍生的蛋白质。该蛋白的编码基因可用于培育抗病害转基因植物，特别是抗烟草花叶病和烟草寄生疫霉的转基因植物。

Description

与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

茉莉酸类物质是环戊酮类的衍生物，通过亚麻酸合成(Sembdner and Parthier，1993，Annu.Rev.Plant Physiol 54：328-332.1)。其主要的生理活性物质为茉莉酸(JA)及其甲酯(JM)。这两种化合物广泛存在于各种植物组织中，在快速生长的组织中含量比较高，如茎尖，根尖，未成熟的果实和幼叶等。最早证明茉莉酸具有信号传导作用是通过研究茉莉酸促进叶片的衰老(Mueller-Uri等，1988，Planta，176：241-247)。现在大量的证据表明茉莉酸在联系外界环境变化和细胞内代谢变化的信号传导过程中起重要作用，是一类新型的植物生长调节物质，特别是在植物的受伤反应和抵御病虫害的防御反应中发挥重要作用(Creelman，and Mullet，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：4114-41191)。在番茄中如果缺乏茉莉酸合成(茉莉酸合成缺失突变体)，将天蛾幼虫在这种植物上放养时，幼虫的生长量会增加四倍，反之在植物上喷洒茉莉酸不仅能降低有害毛虫的生长，而且还使寄生性黄蜂对毛虫的捕食增加两倍(Thaler，1999，Nature，399：686-688)。

茉莉酸作为一类植物生长调节物质，其作用主要是将各种信号传递到植物细胞中，并引起基因表达的改变，合成新的蛋白质和酶，从而发挥各种生理功能(Wasternack and Parthier，1997，Trends Plant Sci.，2：302-307)。因此研究受茉莉酸诱导的基因，阐明其编码的蛋白质，以及其生物学作用，对于了解茉莉酸的作用，更好的利用茉莉酸调节植物对病虫害的防御反应，具有非常重要的意义。在植物中已经确定受茉莉酸诱导而新合成的蛋白质包括蛋白酶抑制剂、病理相关蛋白、植保素合成酶，细胞壁蛋白、渗调素、脂肪氧化酶等，这些蛋白质和酶在植物抵御病虫害侵袭中也发挥着重要作用。对于禾本科重要粮食作物中有关茉莉酸诱导蛋白的研究还很少。至今，在国内外尚未见有关在小麦中发现与抵御病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白基因研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于小麦的与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白，名称为Ta-JA1，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抵御植物病害侵袭相关的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由304个氨基酸残基组成。在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占104个，亲水氨基酸占90个，碱性氨基酸占25个，酸性氨基酸占22个，该蛋白质的分子量为32.7KD，等电点为8.7。

序列表中的序列2分为两个结构域，自序列表中序列2的氨基末端第45至145位的氨基酸残基组成一个对病害反应的结构域，自序列表中序列2的氨基末端第170至300位的氨基酸残基组成一个植物凝集素(jacalin-related domain)的结构域，自序列表中序列2的氨基末端第164位的甘氨酸，285位的甘氨酸和295位的天门冬氨酸构成了与甘露糖结合的结合位点。

为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在(a)中的蛋白的氨基酸残基序列的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白编码基因可通过将序列表中序列1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因，其核苷酸序列是编码序列表中序列2的蛋白质的多核苷酸。

所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因，具体可为如下1)或2)或3)的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第58位至972位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述与抵御植物病害侵袭相关蛋白的DNA分子。

所述的杂交条件具体可为，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min。

序列表中的序列1由1158个脱氧核糖核苷酸组成。序列表中序列1的自5′末端第58位至972位脱氧核糖核苷酸为编码序列。序列表中的序列1，5’端未翻译区包括57个碱基，3’端未翻译区包括186个碱基(其中包括17个碱基组成的PolyA)，编码区由915个碱基(从58位到972位)组成，其中A占27.43％(251个)，C占23.50％(215个)，G占25.36％(232个)，T占23.72％(217个)，A+T占51.15％(468个)，C+G占48.85％(447个)。在国际基因序列数据库(GenBank\EMBL\DDBJ)中的基因同源性分析表明，Ta-JA1基因是小麦中未曾报道的新基因。

含有上述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因重组细胞系和转基因重组菌均属于本发明的保护范围。

所述含有上述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因的重组表达载体包括可将Ta-JA1基因翻译成活性蛋白质的表达质粒(如将所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因插入pET-29b(Novagen公司，USA)的多克隆位点得到的重组质粒，具体如pET-Ta-JA1)，以及可以转化植物细胞的植物表达载体(如将所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因插入pBI121(Clontech公司，USA)的多克隆位点得到的重组质粒。具体如pTa-JA1，该载体含有CaMV 35S启动子和Kan^R选择基因标记。

pET-Ta-JA1是将所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因插入植物表达载体pET-29b的HindIII和NotI位点间得到的重组表达载体。

pTa-JA1是将所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因插入植物表达载体pBI121(Clontech，USA)BamHI和EcoRI位点间得到的重组表达载体。

重组植物表达载体可以通过农杆菌、基因枪法或花粉管通道转化植物细胞，从而提高其抵御病害侵袭的能力。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗病害转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗病害转基因植物的方法，是将所述与抵御植物病害侵袭的茉莉酸诱导相关蛋白的编码基因导入植物中，得到抗病害转基因植物。

所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因可通过如下方法导入植物中：将所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因插入植物表达载体得到含有所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因的重组表达载体，用所述重组表达载体转化植物细胞，将转化的植物细胞培育成植株。

所述重组表达载体具体可为将所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因插入pBI121(Clontech，USA)的多克隆位点得到的重组质粒，具体如pTa-JA1。pTa-JA1是将所述与抵御植物病害侵袭相关蛋白的编码基因插入植物表达载体pBI121(Clontech，USA)HindIII和NotI位点间得到的重组表达载体。

抗病性检测实验表明，转入与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因的烟草对烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)和烟草寄生疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae)引起的病害表现出明显的抗性。

附图说明

图1为含有Ta-JA1基因的重组表达质粒pET-Ta-JA1的物理图谱

图2为含有Ta-JA1基因的重组植物表达载体pTa-JA1的物理图谱

图3为Ta-JA1基因在大肠杆菌中的体外表达

图4为转Ta-JA1基因烟草的PCR检测

图5为转Ta-JA1基因烟草的RT-PCR检测

具体实施方式

应当指出的是，在本发明技术领域的一般技术人员应用本发明的Ta-JA1基因或含有Ta-JA1基因表达质粒，通过转基因生物技术，构建植物表达载体，用构建的植物表达载体转化植物细胞和将转化的植物细胞培育成植株，转化是通过农杆菌介导、基因枪法或花粉管通道，是能够实现本发明的，可开发出具有增强抵御病害能力的转基因植物。正如本发明的一个优选实施例所表明的那样，利用转基因获得烟草新品系，增强其抵御病害侵染的能力。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白Ta-JA1及其编码基因的获得

1、与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白Ta-JA1基因探针的分离及序列分析

将小麦(Triticum aestivum L)品种邯4564(河北省邯郸市种子公司)种植于温室中，正常浇水和施肥，至生长到2-3个节间，采集根、茎、叶组织，用TRI试剂(Molecular Research Center，Inc，Cincinnati，USA)提取总RNA，用PolyAT

mRNA Isolation试剂盒(Promega公司，Madison，USA)分离Poly(A)⁺RNA，用紫外分光光度计分析RNA的含量和纯度。

反转录合成cDNA第一条链：Poly(A)⁺RNA 1ug，5μmol/L引物5’-GACTCGAGTCGACATCGA(T)₁₇-3’，0.5mmol/L dNTP，50单位RNasin，65℃保温10分钟，在冰上冷却后，加入200 U SuperScript^TM II RNase H^-ReverseTranscriptase(Gibco)，42℃保温1小时，加EDTA至终浓度10mM，并于95℃保温10分钟，在冰上冷却。

以反转录合成的cDNA第一条链为模板，利用引物J1和J2进行第一轮PCR。J1：5’-GGnwsnAAyCArAAyCAr-3’，J2：5’-GACTCGAGTCGACATCG-3’。其中，n为A或T或C或G；w为A或T；s为C或G；r为G或A；y为T或C。条件为：3μLcDNA反应液，1μmol/L引物，0.4mmol/L dNTP，2.5U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)，于95℃变性5分钟，50℃复性2分钟，72℃延伸40分钟，然后进行40个循环(95℃1分钟，55℃1分钟，72℃3分钟)，最后72℃延伸10分钟。

以第一轮PCR为模板，利用引物J3和J4进行第二轮PCR。J3：5’-AThTGyGAyGGnCCnwsnCC-3’，J4：5’-AAnGGnCCrTAnGTyTTnAC-3’。其中，n为A或T或C或G；w为A或T；s为C或G；r为G或A；y为T或C；h为A或C或T。条件为：使用1μL第一轮PCR反应液，于95℃变性5分钟，其它反应同第一轮。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，采用

DNA Isolation试剂盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)纯化电泳产物。纯化后连接在pGEM-TEasy载体上(Promega公司，Madison，USA)。连接条件为16℃12小时。转化受体菌为E.coli DH5α，感受态细胞的制备采用CaCl₂处理方法(Sambrook，J.等(eds)，Molecular cloning：A labora tory manual，2^nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。将连接产物加入到感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激90秒，加入LB液体培养基，37℃保温45分钟，涂布在含氨苄青霉素(100ug/ml)和X-Gal(20ug/ml)的LB平板上，37℃培养过夜。白色克隆接种于LB液体培养基上(含氨苄青霉素100ug/ml)，37℃培养过夜，提取质粒，进行酶切分析后，以ABI 377DNA序列分析仪进行序列分析，确定Ta-JA1基因探针。

序列分析的结果表明，所分离的Ta-JA1基因探针具有623个核苷酸，是序列1的自5′末端第229位至851位脱氧核糖核苷酸。

2、Ta-JA1基因的筛选和序列分析

以小麦茎Poly(A)⁺RNA为模板，以ZAP载体(Stratagene公司，La Jolla，CA，USA)合成cDNA，方法按照Stratagene公司实验流程进行，经过体外包装，构建成小麦茎的cDNA文库。取50ng探针DNA，加50uCi³²P-dCTP进行标记，37℃保温1小时，加EDTA至终浓度10mM终止反应。探针通过Sephadex G-50柱后，于100℃煮沸10分钟，立即在冰上冷却，进行杂交。

取50000pfu铺平板，并将其转移到硝酸纤维素膜上，于0.5M NaOH加1.5M NaCl变性2分钟，1.5M NaCl加0.5M Tris-HCl(pH8.0)复性5分钟，0.2M Tris-HCl(pH7.5)加2×SSC漂洗30秒，将膜夹在两层Whatman滤纸中，80℃真空烘烤2小时，之后加入杂交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，100μg/mL鱼精DNA，50％甲酰胺)，42℃保温2小时，加入标记的探针，42℃杂交过夜，经过6×SSC加0.1％SDS室温下洗两次，每次30分钟，再用0.1x SSC加0.1％SDS于65℃洗两次，每次20分钟，之后于-80℃下放射自显影，确定阳性克隆后，将噬菌斑取下，于SM溶液中4℃提取过夜，再按同样的程序进行两轮筛选。

对于获得的阳性噬菌斑，按Stratagene公司提供的方法将其转化为质粒DNA，经过酶切分析后，采用ABI 377DNA序列分析仪进行序列分析。

测得的DNA序列如序列表中的序列1所示，将其命名为Ta-JA1。

3、Ta-JA1基因编码蛋白质的翻译

人工合成一对引物：

5’-引物：5’-CACAAGCTTATGGCCAATTTCCAGATAAC-3’，

3’-引物：5’-AATTGAATGCGGCCGCTTAGAGAGGGTGCACGTAG-3’。

在引物两端分别引入HindIII及NotI酶切位点，以步骤2得到的含有Ta-JA1基因的质粒为模板，PCR扩增核苷酸序列是序列1的自5′末端第58位至972位脱氧核糖核苷酸的片段，扩增条件为：10ng DNA，1μmol/L引物，0.4mmol/LdNTP，2.5U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。于95℃变性5分钟，然后进行30个循环(95℃1分钟，55℃1分钟，72℃1.5分钟)，最后72℃延伸10分钟。

PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，采用

DNA Isolation试剂盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)纯化电泳产物，用HindIII及NotI双酶切后，连接在载体pET-29b(Novagen公司，USA；Cat No.69872-3)上得到重组表达载体pET-Ta-JA1(图1)。酶切鉴定和序列分析证明重组表达载体pET-Ta-JA1完整和正确。pET-Ta-JA1转化大肠杆菌BL21感受态细胞，转化细胞冰浴30分钟后，42℃热激50秒，加入LB液体培养基，37℃保温45分钟，涂布在含卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上。将抗性菌落于LB液体培养基(含卡那霉素50ug/ml)中37℃震荡培养过夜，再进行1/100稀释后，37℃震荡培养2小时，加入IPTG至终浓度1mM，继续培养3小时，12000g离心10分钟，收集菌体，菌体加入100ul裂解液(50mM Tris-HCl pH6.8，100mM二硫苏糖醇，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，100℃煮沸5分钟，菌体蛋白按常规方法进行SDS-PAGE电泳(凝胶浓度12％)，以常规电转移法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上(转移时间4小时)，膜在磷酸生理盐缓冲液(加0.05％Tween20，5％脱脂奶粉)洗涤过夜，然后加入S-Tag抗体(Novagen，USA)，震荡2小时，再用磷酸生理盐缓冲液(加0.05％Tween20)洗涤6次，每次10分钟，再加入过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(Bio-Rad，USA)，在磷酸生理盐缓冲液(加0.05％Tween20)中保育1小时，用磷酸生理盐缓冲液(加0.05％Tween20)洗涤6次，每次10分钟，加入显色剂(ECL，Amersham)进行显色，以没有连接Ta-JA1基因的空白质粒pET-29b为对照，结果见图3。从图中显示Ta-JA1基因能在细菌中表达出预期的蛋白质，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

4、Ta-JA1蛋白的结构和功能分析

对Ta-JA1所编码的蛋白质进行结构和构象分析，结果表明这种蛋白主要有β折片(extend strand)和无规则的卷曲(random coil)组成，很少有α螺旋结构。整个蛋白质分为两个结构域，自序列表中序列2的氨基末端第45至145位的氨基酸残基组成一个对病害反应的结构域，自序列表中序列2的氨基末端第170至300位的氨基酸残基组成一个植物凝集素(jacalin-related domain)的结构域，自序列表中序列2的氨基末端第164位的甘氨酸，285位的甘氨酸和295位的天门冬氨酸构成了与甘露糖结合的结合位点。Ta-JA1蛋白质的这些特点，使其可以在对病害侵袭做出反应的同时，发挥其抵御病害在植物细胞中进一步扩散的功能。

实施例2、小麦组织中Ta-JA1基因表达产物的检测与茉莉酸的诱导

采用Northern blot杂交检测小麦品种邯4564(河北省邯郸市种子公司)不同组织中的Ta-JA1基因的表达产物，分别从小麦的根、茎、叶组织中提取总RNA，按常规方法在1.4％琼脂糖/甲醛变性凝胶电泳上分离，以20x SSC按毛细管法转移到尼龙膜上(转移时间12小时)，尼龙膜夹在两层Whatman滤纸中，80℃真空烘烤2小时，将膜放在杂交瓶中，之后加入杂交液(6x SSC，5x Denhardt，0.5％SDS，100μg/mL鱼精DNA，50％甲酰胺)10ml，42℃预杂交2小时，加入标记的实施例1中制备的Ta-JA1基因探针，42℃杂交过夜，经过6x SSC加0.1％SDS室温下洗两次，每次30分钟，再用0.1x SSC加0.1％SDS于65℃洗两次，每次10分钟，于-80℃下放射自显影一周。显影后的膜加入0.1x SSC加0.1％SDS于95℃洗两次，每次15分钟，之后加入含有18S rRNA探针(18S rRNA探针作为对照使杂交信号标准化)的杂交液，42℃杂交过夜。将膜取出，按相同的程序洗膜，于-80℃下放射自显影1小时。对杂交的信号经过Phosphor Image扫描，并与rRNA信号标准化，得到小麦不同组织中Ta-JA1相对表达量，如表2所示：

结果显示Ta-JA1基因在正常小麦植株中只在茎中表达，在根和叶中不表达。

表2.小麦不同组织中Ta-JA1基因的表达量(以茎为100)

组织	叶	茎	根
组织	叶	茎	根	相对表达量	0	100	0

将小麦品种邯4564的种子萌发，取萌发14天的幼苗，转移到含有50mM茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，Sigma公司，USA)的培养皿中，光照26℃处理10小时，收获幼苗，以没有处理的幼苗为对照，按前述方法进行Northern blot杂交检测，结果如表3所示：

表3.茉莉酸对小麦Ta-JA1基因的诱导(以诱导后为100)

处理	对照	诱导
处理	对照	诱导	相对表达量	4	100

结果显示茉莉酸能够明显诱导Ta-JA1基因的表达，表明Ta-JA1属于小麦中的一类茉莉酸诱导蛋白。

实施例3、Ta-JA1在转基因烟草中的抗病作用

人工合成一对引物：

5’-引物p1：5’-GTCGGATCCACTAGTCACCATGGCCAATTT-3’，

3’-引物p2：5’-CGCGAATTCAATACACACCGAAAATGAGAGC-3’。

在引物两端分别引入BamHI及EcoRI酶切位点，以实施例1步骤2得到的含有Ta-JA1基因的质粒为模板，PCR扩增核苷酸序列是序列1的自5′末端第48位至1014位脱氧核糖核苷酸的片段，扩增条件为：10ng DNA，1μmol/L引物，0.4mmol/LdNTP，2.5 U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。于95℃变性5分钟，然后进行30个循环(95℃1分钟，55℃1分钟，72℃1.5分钟)，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，采用

DNA Isolation试剂盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)纯化电泳产物，用BamHI及EcoRI双酶切后，连接到含有CaMV 35S启动子和Kan^R选择基因标记载体pBI121(Clontech公司，USA)BamHI及EcoRI位点间，得到重组植物表达载体pTa-JA1(图2)。酶切鉴定和序列分析证明重组表达载体pTa-JA1完整和正确。

将pTa-JA1载体转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，转化细胞用液氮速冻5分钟后，37℃热激10分钟，加入LB液体培养基，28℃保温45分钟，涂布在含卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上。将抗性菌落于LB液体培养基(含卡那霉素50ug/ml)中28℃震荡培养过夜，再进行1/100稀释后，28℃震荡培养3小时。取生长良好的烟草品种W38(Nicotiana tabacum cv Wisconsin 38)(云南省玉溪中烟种子公司)叶片，切去叶片边缘和叶中脉，将叶片的其余部分切成0.5-1cm²的小块。将切好的烟草叶片浸入MS基本培养基(Sigma公司，USA，Cat No.M9274)悬浮的农杆菌菌液中浸染5-8分钟，确保叶片切伤的边缘与菌液完全接触。用无菌滤纸将浸染过的叶片上多余的菌液吸干。将感染的烟草叶片叶腹面向下放在不含有抗生素的固体MS基本培养基上，26℃黑暗中共培养两天。将暗培养两天的烟草叶片转入分化培养基(MS+6-苄基腺嘌呤(2mg/L)+萘乙酸(0.2mg/L)+卡那霉素(100mg/L)+羧苄青霉素(500mg/L))，26℃持续光照培养。待芽长至2-3厘米长时，将芽切下转入MS+卡那霉素(100mg/L)培养基上生根，生根后的烟草转到温室生长。

所获得的转基因烟草经过PCR检测，PCR反应体系为25μl，包括10×Reactionbuffer，10mM dNTPs，10μM p1，10μM p2，2U/μl Taq酶以及烟草基因组DNA。反应循环条件为94℃，变性4min；然后94℃，变性1min，55℃，退火1min，72℃，延伸1min，共35个循环；最后72℃，延伸10min。反应结束后，进行电泳检测。同时，以烟草品种W38(Nicotiana tabacum cv Wisconsin 38)作为对照。结果在转基因烟草中能够扩增出预期的1Kb基因片段，而对照(CK)中没有此片段，表明Ta-JA1基因已经整合到烟草基因组中，共获得6株PCR阳性的转pTa-JA1烟草，即T1-T6(图4)。进一步对6株PCR阳性转pTa-JA1烟草进行RT-PCR分析，RT反应体系为20μl，包括2μl RNA样品，1μl oligo(dT)₁₈，4μl 5×Reactionbuffer，1μl RNase inhibitor，2μl dNTP mix(10mmol/L)，42℃保育5min后，加入4μl AMV(5U/μl)以及6μl无RNase水，42℃保育60min后，70℃保育10min。其后取1μl进行PCR反应，反应条件同上。RT-PCR分析结果表明Ta-JA1基因在6株PCR阳性转pTa-JA1基因烟草(即T1-T6)中获得正确的表达(图5)。图4和图5中，CK为烟草品种W38(Nicotiana tabacum cv Wisconsin38)。

同时，以转入pBI121的烟草品种W38(Nicotiana tabacum cv Wisconsin 38)作为对照。

攻毒实验设四个处理：转入pBI121烟草的烟草花叶病毒攻毒处理(对照)、转入pTa-JA1基因RT-PCR阳性的烟草(5个株系)花叶病毒攻毒处理、转入pBI121烟草的烟草黑胫病攻毒处理(对照)、转入pTa-JA1基因RT-PCR阳性烟草的烟草(6个株系)寄生疫霉攻毒处理。各处理每个株系均设三次重复。每个重复3株。取正常生长两月龄的转基因烟草叶片，人工接种烟草花叶病毒(Tobacco MosaicVirus，中国普通病毒保藏中心，保藏号为2.0030)或烟草寄生疫霉(Phytophthoraparasitica var.nicotianae，中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为30377)。

烟草花叶病毒采用机械摩擦接种，把金刚砂均匀的抖在健康烟叶上，用移液枪把烟草花叶病毒100μl滴在烟叶上，用手轻轻摩擦让病毒接种在健康烟叶上让其发病，正常培养至10天后观察发病症状，并用ELISA方法检测叶片中烟草花叶病毒浓度。ELISA方法如下：

取烟草的嫩叶用5mM碳酸盐缓冲液研磨充分，3000rpm低速离心15分钟后取上清液，按照不同比例稀释后加到酶联板上，每孔加200μl，加盖后4℃过夜，倒尽酶联板上的溶液，洗涤3次，每次3分钟，加入烟草花叶病毒抗体(Agdia Inc.公司，Indiana，USA)，每孔185μl，37℃保温1小时。洗涤3次，每次3分钟。加入不同稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体(Promega公司，Madison，USA)，每孔165μl，37℃保温1小时。洗涤3次，每次3分钟。加1％四甲基联苯胺二盐酸(用二甲基亚砜配成)，每孔150μl，室温反应30分钟后加1mol/L H₂SO₄终止反应，测O.D₄₅₀值，以转入pBI121烟草进行同样烟草花叶病毒攻毒处理为对照，结果见表4。表4数据表明，各转基因烟草株系(T1至T5)病毒积累明显低于对照烟草，表明转基因烟草具有抗烟草花叶病毒的能力。

表4转Ta-JA1基因烟草抗烟草花叶病毒测定

烟草寄生疫霉培养用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：称取200克马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000毫升煮沸半个小时，纱布过滤，再加10-20克葡萄糖和20克琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，灭菌后备用。用无菌的镊子或打孔器从保存的试管菌种中取一块含菌丝的琼脂块置于PDA固体培养基平板表面，然后将PDA平板倒置于25℃生化培养箱中培养10天进行活化。将培养好烟草寄生疫霉的平板用打孔器打成直径为5毫米大小的菌丝块，用牙签将菌丝块接种到预先用针刺伤的离体烟草叶片表面，用牙签在叶片两边分别扎孔，每边2个孔，每张叶片接种2点于同一侧，彼此相隔约2厘米左右，另一侧用针刺。接种后放入培养皿内，用吸水纸保湿，置于16小时光照8小时黑暗交替的25℃光照培养箱中，24小时后开始记录病情，观察并统计发病病斑数及病斑大小。病症分级按如下标准：

1级(+)：无症状或表示病斑小于0.5厘米，扩展慢；

2级(++)：病斑大小介于0.5-1厘米；

3级(+++)：病斑大小介于1.0-1.5厘米，各接种点之间相互不愈合；

4级(++++)：病斑大于1.5厘米，各接种点之间相互愈合。

结果如表5所示，表明转Ta-JA1烟草(T1至T6)比对照烟草(转入pBI121烟草)表现出明显的抗病特征，病斑少而且病斑均小于对照烟草。

表5转Ta-JA1基因烟草对烟草寄生疫霉的抗性分析

因此，在各种植物组织中过量表达这种与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白Ta-JA1，可以明显增强这些组织抵御病害侵袭的能力，包括病毒病和真菌病害。所以此基因和蛋白质在禾本科作物的抗病害育种方面具有重要意义。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1158

<212>DNA

<213>小麦(Triticum aestivum L)

<400>1

atctcataag cctacaacat cccttgaacc agagccccac ccaactcact agtcaccatg 60

gccaatttcc agataactcc ccgcgcagcg ttcgtggaga gcaatgagct caacttccgc 120

agcctgtacc ttttccacac tccccttggt tcaaaccaga atcagtcagg cataatagac 180

tcgaatgtta ctaccggttt gggtgcgaca gtcgttaaca actggccgat atgtgatggc 240

cctagccccg gcgccaccgt tattgcgcgt gcacaaggcc tgcatatcta tgccggtaac 300

tggcagaata ctttcagcat aacattcgag gttgaaaggt ttaagggatc aacgcttcaa 360

gtgatgggga tatccgtcga agaaggtgag tgggctattg ttggtgggac aggacagttc 420

gctatggcga tcggtgtcat ctacaaaaag ttccatgaac aaaggagcga tggtaacatc 480

atagaactca ctgtccatgg attttgtccc atgctgaaag gttcacagag ccttcgcaca 540

aaggttggac catggggtgg aaatggaggc tcagataaag acatcgtcga ggcaccaaga 600

cgtctagaga gcatcacagt tagcagcggc actatcattg attcaatcaa attttcttat 660

gtcgaccaag ctggtcagaa gcgcactgtt ggaccctggg gaggttctgg aggaaaacaa 720

aatacgttcg tactcggcac ttctgagttt gtgaaggaag tttctggaac attcggcctt 780

tatggcagag acaaccacaa cataataaca tcactgaaat ttgtcaccaa cgtgaagaca 840

tacgggcctt tcggacaagc gaagggaacc actttcacca taccagtgca aaagaatagc 900

agcatcgtgg gcttcttcgg acgcagtggg atatatctcg atgcacttgg tgtctacgtg 960

caccctctct aagctactag ctagcggcta atgctctcat tttcggtgtg tatttctcaa 1020

tcaatttgaa taagcggaag agatctagta gacttttctc ttgtctagaa gatcctatca 1080

agccgcccaa ctggcttttt tatttacctt tgttgtgatg aataaaagta tcggttttta 1140

t aaaaaaaaa aaaaaaaa 1158

<210>2

<211>304

<212>PRT

<213>小麦(Triticum aestivum L)

<400>2

Met Ala Asn Phe Gln Ile Thr Pro Arg Ala Ala Phe Val Glu Ser Asn

1 5 10 15

Glu Leu Asn Phe Arg Ser Leu Tyr Leu Phe His Thr Pro Leu Gly Ser

20 25 30

Asn Gln Asn Gln Ser Gly Ile Ile Asp Ser Asn Val Thr Thr Gly Leu

35 40 45

Gly Ala Thr Val Val Asn Asn Trp Pro Ile Cys Asp Gly Pro Ser Pro

50 55 60

Gly Ala Thr Val Ile Ala Arg Ala Gln Gly Leu His Ile Tyr Ala Gly

65 70 75 80

Asn Trp Gln Asn Thr Phe Ser Ile Thr Phe Glu Val Glu Arg Phe Lys

85 90 95

Gly Ser Thr Leu Gln Val Met Gly Ile Ser Val Glu Glu Gly Glu Trp

100 105 110

Ala Ile Val Gly Gly Thr Gly Gln Phe Ala Met Ala Ile Gly Val Ile

115 120 125

Tyr Lys Lys Phe His Glu Gln Arg Ser Asp Gly Asn Ile Ile Glu Leu

130 135 140

Thr Val His Gly Phe Cys Pro Met Leu Lys Gly Ser Gln Ser Leu Arg

145 150 155 160

Thr Lys Val Gly Pro Trp Gly Gly Asn Gly Gly Ser Asp Lys Asp Ile

165 170 175

Val Glu Ala Pro Arg Arg Leu Glu Ser Ile Thr Val Ser Ser Gly Thr

180 185 190

Ile Ile Asp Ser Ile Lys Phe Ser Tyr Val Asp Gln Ala Gly Gln Lys

195 200 205

Arg Thr Val Gly Pro Trp Gly Gly Ser Gly Gly Lys Gln Asn Thr Phe

210 215 220

Val Leu Gly Thr Ser Glu Phe Val Lys Glu Val Ser Gly Thr Phe Gly

225 230 235 240

Leu Tyr Gly Arg Asp Asn His Asn Ile Ile Thr Ser Leu Lys Phe Val

245 250 255

Thr Asn Val Lys Thr Tyr Gly Pro Phe Gly Gln Ala Lys Gly Thr Thr

260 265 270

Phe Thr Ile Pro Val Gln Lys Asn Ser Ser Ile Val Gly Phe Phe Gly

275 280 285

Arg Ser Gly Ile Tyr Leu Asp Ala Leu Gly Val Tyr Val His Pro Leu

290 295 300

Claims

1.一种培育抗病害转基因植物的方法，是将与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因导入植物中，得到抗病害转基因植物；

所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白，是由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

所述病害为由烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)和/或烟草寄生疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae)引起的病害；

所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因通过如下方法导入植物中：将所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因插入植物表达载体得到含有所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因的重组表达载体，用所述重组表达载体转化植物细胞，将转化的植物细胞培育成植株；

所述植物为烟草。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因的重组表达载体为将所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为pTa-JA1；

所述pTa-JA1是将所述与抵御植物病害侵袭相关的茉莉酸诱导蛋白的编码基因插入植物表达载体pBI121的BamHI和EcoRI位点间得到的重组质粒。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述烟草为烟草品种W38(Nicotianatabacum cv Wisconsin 38)。