SI24489A - Kompozicija in metoda za zaščito rastlin - Google Patents

Abstract

13 beljakovinskih ekstraktov iz gob in 1 beljakovinski ekstrakt iz micelija so pokazali protibakterijsko aktivnost proti R. solanacearum pokazala v različnih testih. Poleg tega je proteinska frakcija A. phalloides tudi popolnoma inhibirana rast bakterij. Ekstrakti in frakcije so prikazali ne le močno protibakterijsko aktivnost, ampak so tudi bolj pogosto prikazali baktericiden učinek kot bakteristatičen. In vivo testiranje petih izbranih ekstraktov na rastlinah paradižnika in krompirja je pripeljalo dozaključkov, da ekstrakti C. geotropa, S. variegatus in T. saponaceum zavirajo pojav bolezenskih znamenj in upočasni bakterijsko venenje tako na rastlinah paradižnika kot krompirja. Ekstrakti gob so tako pomembno orodje za zaviranje bolezni, ki jih povzroča bakterija R. solanacearum. Poleg tega zaviranje 12 R solanacearum sevov kot tudi R. mannitolilytica in E. coli zelo pomembno potrjuje širok spekter delovanja gobjih proteinskih ekstraktov, ki je koristen na področjih medicine, biotehnologije,bioremediacije/biorazgradljivosti in kmetijstva.

Description

KOMPOZICIJA IN METODA ZA ZAŠČITO RASTLIN

OPIS IZUMA

Področje izuma

Predloženi izum se nanaša na metode za zmanjševanje, izkoreninjenje ali preprečevanje okužbe rastlin in površin s patogenimi bakterijami, z uporabo proteinskih ekstraktov višjih gliv iz rodu Basidiomycetes, njihove proteinske frakcije in sestavke, ki vsebuje biološko aktivni peptid ali protein.

Ozadje problema

Iskanje novih protimikrobnih učinkovin je nujno, saj se pojavljajo novi patogeni mikroorganizmi oziroma patogeni mikroorganizmi, ki okužujejo človeka, živali in rastline razvijajo odpornost proti kemičnim snovem, ki so trenutno na voljo. Vse večje težave povzročajo odpornih sevi bakterij, ne samo v bolnišnicah, ampak tudi tistih, ki povzročajo bolezni na rastlinah, saj povzročajo velike izgube pridelka tako na poljih, kot tudi pri skladiščenju. Eden od teh primerov je rastlinska patogena bakterija Ralstonia solanacearum (Smith, 1896) , ki povzroča bakterijsko venenje in veliko gospodarsko škodo na številnih gostiteljskih rastlinah, vključno z nekaterimi najpomembnejšimi poljščinami, kot so krompir, paradižnik, banane, tobak, ingver in jajčevci. Ta bakterija je lahko tudi prosto živeča kot saprofit v zemlji ali v vodi, zato je namakanje vode običajno vzrok za njeno razširjanje. Patogen lahko širi tudi z okuženim orodjem, semeni, žuželkami in preko korenin. Kljub obsežnim študijam o bakteriji R. solanacearum in njenem pomenu v kmetijstvu, trenutno ne obstaja učinkovito biološko ali kemično sredstvo za njen nadzor ali izkoreninjenje. Poleg slednje obstajajo še druge pomembne rastlinske patogene bakterije, kot sta Ervvinia amylovora in Dickeya dadantii, ki povzročata velike izgube pridelka. Trenutno sredstvo za zatiranje bolezni, ki jih povzročajo zgoraj naštete bakterije ni na voljo.

Zaradi visokih cen proizvodnje in dragih postopkov registracije kemično sintetiziranih spojin, naravne snovi in naravni izdelki postajajo vse bolj in bolj zanimivi za komercializacijo. Približno 60 % od 260 encimov na trgu izviraj iz gliv, čeprav le pet od teh izvira iz višjih gliv. Primer beljakovine izolirane iz gob, ki je komercialno dostopna je encim 6-fitaza iz Peniophora lycii, ki se uporablja kot krmni dodatek, ki poveča privzem fosforja in mineralov v črevesju neprežvekovalcev. Hidrofobini so še ena pomembna skupina proteinov, ki jih najdemo samo v kraljestvu gliv. Njihova značilnost je, da spremenijo površinsko napetost s spremembno hidrofilnosti oziroma hidrofobnosti površine, kar jim daje veliko možnosti za različne biotehnološke in medicinske aplikacije. V procesih beljenja, proizvodnji smol in papirja, za katerega so že na voljo glivni encimi (ksilanaze, lipaze in amilaze), bi lahko koristila tudi

raznolikost encimov iz višjih gliv. Različne hidrolaze se uporabljajo v organski sintezi, vključno nitrilaze, esteraze, amidaze, proteaze in lipaze, vendar nobena ne izhaja iz višjih gliv. Številne oksidoreduktaze iz gob igrajo pomembno vlogo v biosintezi in z njo povezanimi aplikacijami in vključujejo lakaze, peroksidaze in tirozinaze. Tirozinaze omogočajo tudi možnost za pretvorbo monofenolov v difenole, ki se uporabljajo pri proizvodnji antioksidantov kot aditivi za živila ali zdravil. Poleg tega se glivične tirozinaze iz aspergilov uporablja v proizvodnji L-DOPA iz L -tirozina za uporabo pri zdravljenju zgodnje Parkinsonove bolezni in srčnih bolezni. Tirozinaze iz višjih gliv ponujajo možnost za proizvodnjo hidrogelov, ki bi se lahko uporabljali za proizvodnjo umetnih tkiv, pa tudi v proizvodnji lepil, matrik za dostavo drog in kožnih nadomestkov. Uporaba beljakovin iz gob je bila objavljena v preglednem članku Erjavec et al. (2012).

Iz patenta USA, 2011/0136758 je znano, da imajo polisaharidi, pridobljeni iz nekaterih bazidiomicect, fungicidno in nematicidno aktivnost. Poleg tega je znano, da je lahko sestavek ekstrakta bazidiomicet uporaben za imunsko modulacijo, kot je opisano v US 2006/ 0.263.384.

1) Erjavec J, Kos J, Ravnikar M, Dreo T, Sabotič J (2012) Proteins of higher fungi from forestto application. Trends in Biotechnology 30: 259-273.

2) Pohleven J, Brzin J, Vrabec L, Leonardi A, Čoki A, Štrukelj B, Kos J, Sabotič J (2011) Basidiomycete Clitocybe nebularis is rich in lectins with insecticidal activities. 2011/05/11: 1141-1148. 10.1007/s00253-011-3236-0.

3) Sabotič J, Popovič T, Puizdar V, Brzin J (2009) Macrocypins, a family of cysteine protease inhibitors from the basidiomycete Macrolepiota procera. FEBS Journal 276: 4334-4345.

4) Stasyk, T., Lutsik-Kordovsky, M., VVernstedt, C., Antonyuk, V., Klyuchivska, O., Souchelnytskyi, S., Hellman, U. and Stoika, R. (2010). A new highly toxic protein isolated from the death cap Amanita phalloides is an L-amino acid oxidase. FEBS Journal 277, 1260-9.

5) Fungal tyrosinases: new prospects in molecular characteristics, bioengineering and biotechnological applications. Journal of Applied Microbiology, 100, (2) 219232

6) Lindequist, U., Niedermeyer, T.H.J., & Julich, W.D. 2005. The Pharmacological Potential of Mushrooms. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2, (3) 285-299

7) Xu, X., Yan, H., Chen, J., & Zhang, X. Bioactive proteins from mushrooms. Biotechnology Advances In Press, Corrected Proof. 2011.

8) MACROCYPIN P-201100304

9) MUSHROOM EXTRACTS HAVING ANTICANCER ACTIVITY US 20060057157 A1

10) L-AMINO ACID OXIDASE WO 1994025574 A1

Definicije

V okviru predloženega izuma imajo našteti izrazi naslednji pomen:

Bazidiomicete ali Basidiomycota je eden od dveh velikih debel, ki skupaj z deblom Ascomycota, tvorijo podkraljestvo Dikarya, pogosto imenovan kot višje glive v kraljestvu gliv.

Izraz gobe v predloženi prijavi uporabljamo namesto izraza »bazidiomicete«, material iz gob se nanaša na kakršenkoli material, plodno telo, micelij, ekstrakt, tkivo, itd pridobljen iz bazidiomicet predloženega izuma. V opisu izuma se izraza gobe in bazidiomicete uporabljata izmenično.

Proteinski ekstrakt, kot ga uporabljamo v predloženi prijavi se nanaša na ekstrakt, pridobljen iz posebnih vrst bazidiomicet, kot je definirano v tem zahtevku, iz posebnih ekstraktov, dobljenih iz plodnih teles in/ali micelija. Proteinski ekstrakt v tem izumu vsebuje beljakovine ali beljakovinam podobne snovi. Proteinska frakcija je del proteinskega ekstrakta in specifičnega proteina, ki ga lahko izoliramo tako iz proteinskega ekstrakta koti tudi proteinske frakcije. Proteinski ekstrakt lahko obsegaj proteinske komplekse ali konstrukte ali konjugate katerih del je protein. Postopki za pridobivanje izvlečkov so opisani spodaj in primeri so na voljo v podpoglavju eksperimentov.

Proteinska frakcija, kot ga uporabljamo v predloženi prijavi je frakcija, dobljena iz proteinskega ekstrakta, ki je bogatejša v proteinih v primerjavi s proteinskim ekstraktom zaradi postopkov čiščenja kot je npr. kromatografija.

Izolirana proteinska komponenta se nanaša na protein, ki je bil izoliran iz proteinskega ekstrakta ali proteinske frakcije v tem izumu, s pomočjo metod, ki so znani strokovnjakom s področja, kot npr. kromatografijo, ali protein, ki je bil določen v proteinskem ekstraktu ali proteinska frakcija predloženega izuma in je bil izdelan z metodo rekombinantnih proteinov. Izolirana proteinska komponenta je lahko protein ali peptid, ki ima biološko aktivnost in ga lahko opišemo tudi kot biološko aktivni protein ali peptid. Primeri so encimi in lektini.

Izraza protein in peptid uporabljamo izmenično.

Rastlinske patogene bakterije se nanaša na bakterije, ki vplivajo ali škodujejo rastline, na primer ki povzročajo venenje in / ali da so škodljiva za rast ali donos rastlin, zlasti rastline, ki jih gojimo v kmetijstvu ali vrtnarstvu.

Izraz rastlina vključuje celotno rastlino, kot tudi rastlinska tkiva ali dele rastlin. Rastline so pretežno poljščine, kot so krompir ali zelenjava.

Okolje se nanaša na okolico, ki obdaja rastlino ali predmet, ki ga ščitimo. Okolje, ki je obdelano s kompozicijo predloženega izuma je zlasti območje, ki je nagnjeno k okužbam s patogenimi bakterijami ali je onesnaženo. Okolje obsega tla okoli rastlin kot tudi namakalne vode.

Zemlja so tla, v kateri se pridelujejo rastline in kjer patogene bakterije lahko živijo.

Izraz površina zajema trde površine, kot tudi površino objekta, kot orodje ali površino rastlinskih delov, kot so korenine.

Donos je opredeljen kot merljiva ekonomska vrednost pridelka. Ta se lahko opredeli v smislu količine in / ali kakovosti.

Izraz zmanjšuje v smislu predloženega izuma se nanaša na sredstvo ali sestavek, ki zmanjšuje in zato zmanjša negativni učinek povzročen s patogenimi bakterijami npr. z zmanjšanjem števila patogenih bakterij, ki okužujejo pridelek, tla, okolje, površine itd, ali upočasni napredovanje bolezni.

Izraz izkoreninjenje v kontekstu tega izuma pomeni, da patogene bakterije, s katerimi so okužene rastline, okolje, tla ali površine, so izničene ali uničene na primer tako, da njihovo razmnoževanje ni več mogoče.

Izraz »preprečiti« v kontekstu tega izuma pomeni, da z dodajanjem kompozicije v smislu predloženega izuma, nobena patogena bakterija ne more naseliti tretirane površine ali rastline. To je mogoče doseči z neposrednim učinkom kompozicije tega izuma ali s povečanjem obramba gostitelja.

Bakterijska vrsta R. solanacearum sestavlja kompleks, ki obsega štiri filotipe (I do IV), ki ustrezajo geografskim poreklom. Filotipi so določene z filogenetsko analizo sekvenc. Vsaka skupina vsebuje več biovarjev glede na njihove biokemične lastnosti in 5 ras določenih na podlagi razlik v gostiteljskih rastlinah (Fegan in Prior, 2005, Budenhagen, 1962). Vsak filotip vsebuje več sekvevarjev, to je skupin sevov z visoko ohranjenimi zaporedji znotraj območja genoma.

Podroben opis izuma

Izumitelji so ugotovili, da proteinski ekstrakt pridobljen iz ene izmed specifičnih vrst gob ali delcev ali njihovih sestavnih delov, kot je definirano zgoraj, ima antibakterijsko delovanje, zlasti aktivnost proti rastlinskim patogenim bakterijam. Ne glede na teorijo se domneva, da so biološko aktivni proteini ali peptidi, ki so v beljakovinskih ekstraktih, odgovorni za učinek. S karakterizacijo proteinskih komponent v ekstraktu so ugotovili da ima ~ 180 kDa proteinski kompleks antibakterijsko aktivnost. Nadaljnje analize potrdijo najmanj eno aktivno sestavino, kot je L - aminokislinska oksidaza. To je bilo že znano, da Amanita phalloides, zelo strupena goba, vsebuje L - aminokislinsko oksidazo. Sedaj je bilo ugotovljeno, da posebne vrste gob, kot je definirano zgoraj, obsegajo biološko aktivne proteine ali peptide, od katerih je ena L aminokislinska oksidaza, ki ima aktivnost proti patogenim bakterijam, zato se lahko uporabi za zaščito rastlin. Kot je razvidno iz slike 10, imajo L- aminokislinske oksidaze prisotne v zmeseh tega izuma antibakterijsko aktivnost; specifičnost različnih L- aminokislinskih oksidaz se lahko razlikujejo.

Vidik tega izuma je metoda za zmanjšanje, odpravljanje ali preprečevanje okužbe rastlin ali površin s patogenimi bakterijami, z uporabo na rastlinah ali površinah ali v okolju sestavek, ki obsega proteinski ekstrakt iz Basidiomycet izbranih iz Amanita phalloides, Amanita muscaria, Amanita virosa, Boletus luridiformis, Clitocybe geotropa, Gomphidius glutinosus, Tricholoma saponaceum, Hypholoma sp., Agaricus moelleri, Albatrellus ovinus, Bovista nigrescens, Suillus variegatus, Tricholoma ustale ali proteinske frakcije ali njenega sestavnega dela.

Predloženi izum zagotavlja sestavek, ki je učinkovita proti patogenim bakterijam in obsega antibakterijsko aktivno komponento. V eni od izvedb sestavek obsega vsaj proteinski izvleček iz bazidiomicet izbranih izmed Amanita phalloides, Amanita muscaria, Amanita virosa, Boletus luridiformis, Clitocybe geotropa, Gomphidius glutinosus, Tricholoma saponaceum, Hypholoma sp., Agaricus moelleri, Albatrellus ovinus, Bovista nigrescens, Suillus variegatus, Tricholoma ustale. Ta ekstrakt je mogoče dobiti iz gob in / ali njihovega micelija. Tako se lahko trosnjake kot tudi micelij ali oboje uporabi za pridobivanje ekstrakta. Ekstrakt lahko nadalje očistimo ali ločimo da bi dobili proteinske frakcije ali aktivne sestavine, kot so encimi. V nadaljnjih izvedbah pričujočega izuma se lahko proteinske frakcije ali aktivne komponente uporabljajo v tem sestavku v smislu predloženega izuma.

Ekstrakt predloženega izuma lahko dobi z nabiranjem gobjega materiala, t.j. trosnjakov in/ali micelija posebnih zgoraj opisanih bazidiomicet. Ekstrakt se lahko pridobi kot je dobro znano strokovnjaku, na primer z uporabo topila ali pufra za ekstrakcijo ali z ločevanjem tekočine iz trdnega materiala. Veliko različnih topil ali pufrov, ki so znani strokovnjaku, se lahko uporabi za pripravo ekstraktov in frakcij, dokler je topilo ali pufer biološko kompatibilen in lahko ekstrahira beljakovinske snovi. Ekstrakte z visoko vsebnostjo proteinov se lahko proizvaja z gojenjem gob in vitro.

V eni izvedbi lahko proteinski ekstrakt in/ali del proteina dobimo z zamrzovanjem materiala iz gob pri temperaturi med -20°C in -80°C, odtajanjem zamrznjenega materiala in ločevanjem tekočine od trdnih snovi, na primer s stiskanjem odtajane mase. V drugi izvedbi lahko gobji material mehansko zdrobimo, homogeniziramo ali biološko razgradimo in dobljeni material lahko ekstrahiramo s topilom ali pufrom ali material pa lahko material ločimo v tekoče in trdne frakcije.

Tekočina ali ekstrakt pridobljen zgoraj je proteinski ekstrakt uporabljen v predloženem izumu, ki vsebuje biološko aktivno snov. Ekstrakt lahko nadalje očistimo z dializo na primer proti destilirani vodi, pri čemer so odstranjene molekule z nizko molekulsko maso. Preferenčno je mejna masa pod 4000 Da, na primer okoli 3000 Da. Ekstrakt se lahko uporablja v tekoči obliki ali pa jih lahko posušimo, na primer z liofilizacijo. Za shranjevanje se prednostno uporablja ekstrakt v suhi obliki, kot je liofilizirani obliki. Kadar jih uporabljamo za zaščito rastlin se posušen ekstrakt lahko ponovno vzpostavi, kot je dobro znano strokovnjaku. Vodni medij, prednostno pufer, še zlasti izotonični pufer, kot Tris - HCI, se lahko uporablja za pripravo. Pufer ima prednostno skoraj nevtralen pH, na primer v območju od 6 do 8, prednostno 6,8-7,6. Proteinski ekstrakt ali rekonstituiran ekstrakt se lahko uporablja kot koncentrat in koncentracija proteinov v končnem sestavku se lahko prilagodi, kot je dobro znano, na primer z uporabo pufra, kot je Tris - HCI pufer. Uporabna koncentracija proteina je v razponu od 0,1 do 10 mg/ml, prednostno 0,2 do 5,0 mg/ml. Lahko uporabimo tudi višje koncentracije.

Proteinski ekstrakt se lahko nadalje očisti, da dobimo frakcijo, ki je obogatena z beljakovinami - proteinska frakcija. Proteinske frakcije lahko pripravimo, kot je znano strokovnjaku. Metode za ločevanje ali izolacije proteinov v ekstraktu, so dobro znane v stroki, kot je kromatografija, na primer gelska kromatografija ali ionsko izmenjalna kromatografija. Proteinska frakcija ali izolirana proteinska komponenta imata to prednost, da je vsebina bolj določena in bolje kompatibilna.

Kot je opisano zgoraj se predpostavlja, da je, vsaj del aktivne snovi v beljakovinskem ekstraktu ali proteinski frakciji vsaj en biološko aktiven peptid ali protein, kot je Laminokislinska oksidaza.

Iz proteinske frakcije se aktivni proteini lahko izolirajo, na primer L-aminokislinska oksidaza. Aktiven protein ima ugodne lastnosti, in da se omogoči proizvodnja visokih količinah, se lahko pridobi tudi v očiščeni obliki, pridobljenega iz gobjega materiala ali z rekombinantno proizvodnjo proteina v E. coli, ali katerega koli drugega proizvodnega organizma, ki je dobro znan strokovnjaku.

Proteinski ekstrakt, kot je zgoraj ali proteinska frakcija ali proteinska komponenta, se lahko uporabljajo, kot je pridobljena. To lahko steriliziramo, če je to potrebno za preprečitev kontaminacije, na primer z uporabo sterilne filtracije.

Za shranjevanje beljakovinskega ekstrakta, frakcije ali posušenega praška preferenčno uporabljamo zamrzovanje. Za kratek čas shranjevanja je uporabna temperatura v območju od -20 do -40 ° C. Za dolgotrajno shranjevanje je bolje uporabiti temperaturo skladiščenja v območju od -60 do -80 ⁰ C.

Nadaljnji vidik predloženega izuma je postopek za pridobivanje proteinskih ekstraktov iz gob, kot je definirano zgoraj in v zahtevku 1, z nabiranjem plodnih teles in/ali micelija bazidiomicet, zamrzovanjem materiala pri temperaturi med -20 ° C in - 80 ° C, tajanjem materiala, ločevanjem na tekoče in trdne delce, in vračanjem tekočine kot proteinskega ekstrakta.

V nadaljnji izvedbi je proteinski ekstrakt osnova za izolacijo aktivnih proteinov, kot so encimi in lektini, na primer L-aminokislinska oksidaza. Izolacijo je mogoče doseči z uporabo kromatografskih metod, kot je znano strokovnjaku.

Nadaljnji vidik predloženega izuma je sestavek za zaščito pridelka, ki obsega proteinski ekstrakt, proteinsko frakcijo, komponento in/ali encim v smislu predloženega izuma beljakovin in kmetijsko primerno pomožno snov.

Sestavek lahko obsega kmetijsko ali vrtnarsko sprejemljivo raztopino, nosilec, polnilo, podaljševalec ali adjuvans.

Sestavek za zaščito pridelka lahko dodatno obsega en ali več nadaljnjih biološko aktivnih sredstev, kot so herbicidi, pesticidi, fungicidi, rastni faktorji ali gnojila.

Kompozicija za zaščito rastlin predloženega izuma lahko vsebuje ali proteinski ekstrakt, kot je opisano zgoraj, ali proteinske frakcije ali izolirane proteine, kot so encimi in lektini.

Posamezne proteine lahko dobimo tudi s kromatografijo ali metodami elektroforeze metode, na primer gelsko kromatografijo in ionsko izmenjalno kromatografijo ali nativno PAGE.

Ugotovljeno je bilo, da je oziroma so proteinski ekstrakt, proteinska frakcija ali izolirani aktivni protein ali encim aktiven proti rastlinskim patogenim bakterijam, ki jih je sicer težko nadzorovati. Po drugi strani, ekstrakt ne poškoduje rastlin, tako da ga je mogoče uporabiti za boj proti bakterijam.

Ekstrakt predloženega izuma je učinkovit proti pomembnim rastlinskim patogenim bakterijam, kot so tiste iz rodov Ralstonia, Ervvinia, Dickeya, Pectobacterium, Xanthomonas, Agrobacterium in Escherichia. Zlasti se lahko kompozicija predloženega izuma uporablja za zmanjšanje, odpravo ali preprečitev okužbe z Ralstonia solanacearum, Ervvinia amylovora, Dickeya dadantii, Ralstonia mannitolilytica in Escherichia coli. Te bakterije okužujejo pomembne kmetijske in vrtnarske rastline, kot so krompir, paradižnik, banane, tobak, ingver in jajčevci.

Ugotovljeno je bilo, da je proteinski ekstrakt, proteinska frakcija ali izoliran biološko aktiven protein, pridobljen iz Agaricus moelleri, Amanita phalloides ali Tricholoma saponaceum zlasti aktivna proti bakteriji Escherichia coli. Zato se kompozicija predloženega izuma, ki obsega proteinski ekstrakt, proteinsko frakcijo ali izoliramo biološko aktiven protein, pridobljen iz Agaricus moelleri, Amanita phalloides ali Tricholoma saponaceum med drugim uporablja za zmanjševanje, izkoreninjenje ali preprečevanje okužbe z E.coli.

Poleg tega je bilo ugotovljeno, da je proteinski ekstrakt, proteinska frakcija ali izoliran biološko aktiven protein, pridobljen iz Amanita phalloides zlasti aktiven proti R. mannitolilytica. Zato kompozicija tega izuma, ki obsega proteinski ekstrakt, proteinsko frakcijo ali izoliran biološko aktivni protein, pridobljen iz Amanita phalloides med drugim uporablja za zmanjševanje, izkoreninjenje ali preprečevanje okužbe z R. mannitolilytica.

Ugotovljeno je bilo, da je L-aminokislinska oksidaza, izolirana iz Amanita phalloides ali Clitocybe geotropa posebej aktivna proti R. solanacearum. L-aminokislinska oksidaza izolirana iz Amanita phalloides ali Clitocybe geotropa se tako uporablja za zmanjševanje ali odpravljanje okužbe z R. solanacearum na rastlinah, v okolju rastlin ali na površinah ali za preprečevanje okužbe z R. solanacearum.

Ugotovljeno je bilo, da so proteinski ekstrakti, pridobljeni iz Clitocybe geotropa, Suillus variegatus in Tricholoma saponaceum posebej aktivni proti bakterijskemu venenju, ki ga povzroča R. solanacearum. Zato se proteinski ekstrakti pridobljeni iz Clitocybe geotropa, Suillus variegatus in Tricholoma saponaceum uporabljajo pri metodah in kompozicijah predloženega izuma in še zlasti za zatiranje R. solanacearum.

Kompozicija predloženega izuma je koristna za zdravljenje okolja v katerem rastline rastejo, zemlje, vode ali površine rastlin kot tudi trdih površin. Tako je zagotovljen postopek za zmanjševanje, izkoreninjenje ali preprečevanje okužbe s patogenimi bakterijami v okolju rastlin ali na površinah, z nanašanjem kompozicije, ki obsega proteinski ekstrakt ali proteinske frakcije ali biološko aktivno sestavino, kot je definirano zgoraj za okolje rastlin, tla, površine rastlinskih delov ali trdih površin. Kompozicijo predloženega izuma lahko apliciramo na površine okuženih s patogenimi bakterijami, za znižanje ali odpravo bakterij ali pa se lahko uporabljajo za zaščito neonesnažene površin pred okužbo z bakterijami. Poleg tega se lahko kompozicije predloženega izuma uporabljajo za razkuževanje okolja rastlin, tal ali površin.

Gobji material predloženega izuma je še posebej uporaben za zaščito pridelkov, vključno krompirja, paradižnika, jajčevcev, tobaka, banan in ingverja, prednostno rastlin iz družine Solanaceae. Pogosteje gojene rastline te družine, so rastline iz rodu Solanum, zlasti paradižnik - S. Iycopersicum, krompir - S. tuberosum in jajčevci - S. melongena.

Poleg tega je bilo ugotovljeno, da lahko gobji material predloženega izuma uporabimo tudi za zdravljenje divjih gostiteljskih rastlin, zlasti gostiteljske rastline razhudnikovk pa tudi divje gostitelji iz družine Urticaceae. To je zelo pomembno, saj so divje gostiteljske rastline potencialni vir širjenja bolezni, zlasti kadar poteka namakanje. Primeri divjih gostiteljev so Solanum dulcamara, Solanum nigrum in Urtica dioica.

Proteinski ekstrakt, proteinske frakcije in izolirane proteinske komponente predloženega izuma so bile testirane na njihov učinek na rast rastlin. Ugotovljeno je bilo, da ne njihov ekstrakt ali njihove učinkovine niso imeli negativnega učinka na rast rastlin, ki jih ščitijo. Ekstrakti so bili preizkušen v primerjavi z negativnimi in pozitivnimi kontrolnimi rastlinami in ni bilo moč opaziti niti pozitivnega niti negativnega

vpliva na rast rastlin. Tako je očitno, da so kompozicije v smislu predloženega izuma biološko kompatibilne z rastlinami in niso škodljive za njihovo rast.

Nadalje je bila testirana protibakterijska aktivnost in vitro ter in vivo. Nekateri ekstrakti so pokazali manjšo aktivnost, kadar so bili uporabljeni na rastlinah. Pri drugih ekstraktih je bil učinek na rastlinah boljši kot in vitro. Ne glede na teorijo se predpostavlja, da imajo ekstrakti, ki so bolj učinkoviti in vivo kot in vitro vpliv na obrambni sistem rastline. Uporaba teh ekstraktov je bolj zaželena, saj krepijo naravni obrambni sistem rastlin rastline, ki se zato bori proti patogeni bakteriji sama in je zato potrebna uporaba minimalne količina aktivne učinkovine.

Preizkušanje vpliva beljakovinskih ekstraktov na rastlinsko patogeno bakterijo Ralstonia solanacearum se je izkazalo za zelo uspešno. V začetnih presejalnih testih je bilo aktivnih in vitro skoraj 18% ekstraktov iz različnih vrst gob. Prvič smo testirali delovanje ekstraktov proti 12 sevom R. solanacearum, ki zajemajo različne filotipe. Medtem ko je šest ekstraktov popolnoma inhibiralo rast R. solanacearum in vitro, je bilo več variabilnosti inhibicije opaziti pri ekstraktih iz Agaricus moelleri, Tricholoma ustale, Albatrellus ovinus in Clitocybe nebularis - od nič inhibicije do popolne inhibicije bakterijskega razmnoževanja. Ker se ekstrakti med testiranjem niso spremenili, se domneva, da so nekateri sevi bakterije R. solanacearum bolj občutljivi kot drugi, vendar niso opazili nobene povezave filotipi ali razvrstitvijo v biovarje. Ralstonia mannitollilytica je bila občutljiv na ekstrakte gob predloženega izuma, saj ima zelo podobno DNA zaporedje kot R. solanacearum. Poleg tega smo E. coli testirali, ker se pogosto uporablja kot proizvodni organizem rekombinantnih proteinov iz gliv. Ekstrakti T. saponaceum, A. phalloides in A. moelleri so popolnoma inhibirali E. coli in vitro. Na splošno velja, da je širok spekter aktivnosti proti sevom R. solanacearum velika prednost, saj lahko aktivni protein izoliramo in uporabimo kot sredstvo za zaščito rastlin ali katero drugo aplikacijo.

Clitocybe geotropa je bila zelo učinkovita in vitro in in vivo proti različnim sevom in zlasti proti 12 sevom Ralstonia solanacearum. Zato so ekstrakti Clitocybe geotropa, proteinske frakcije ali proteinske komponente iz njih priporočeni za uporabo kot sredstvo za zaščito rastlin.

Izum je podrobneje razložen s pomočjo primerov. Primeri se ne smejo razlagati kot omejevanje izuma ali področja.

PRIMER 1

Materiali in metode

Bakterijska kultura in priprava inokuluma

Ralstonia solanacearum (Smith, 1896) Yabuuchi et al. 1996 (rasa 3, biovar 2), sev NCPBB 4156, je bila v glavnem uporabljajo v poskusih, kakor tudi drugi sevi R. solanacearum ter Escherichia coli in Ralstonia mannitolilytica (glej Tabelo 3). Bakterije se gojijo pri 28 ⁰ C na trdnem gojišču, ki vsebuje kvasni ekstrakt, pepton, glukozo in agar - YPGA vsebuje 5 g / L kvasnega ekstrakta, 5 g / L proteoznega peptona, 10 g / L glukoze, 12 g / L AGA, s pH naravnanim na 7,2-7,4. kot tudi na Kelmanovem tetrazolij mediju (Kelman, 1954) z namenom opazovanja tipične morfologije kolonij. Bakterijska suspenzija za rast v tekočem YPGA je bila pripravljena v 0,01 M fosfatnem pufru s soljo (PBS), ki vsebuje 1,071 g /1 Na2HPO4, 0,4 g / I NaH2PO4 χ 7H2O, 8 g / I NaCI in s pHuaravnanim na 7,2. Koncentracija bakterij v in vitro in in vivo testi je bila ocenjena z merjenjem OD pri 595 nm z uporabo McFarland standarda. Koncentracija živih bakterij (CFU/mL) je bila določena z nanosom redčitev na YPGA medij in štetjem CFU po 48ih urah.

Glivna kultura

Miceliji Clitocybe geotropa micelij smo izolirali iz svežih plodov teles, nabranih v naravi. Micelij gojimo v tekoči SMY mediju, ki vsebuje 10 g saharoze, 10 g sladnega ekstrakta, 4 g kvasnega ekstrakta in 1000 ml ddH2O brez uravnavanja pH. Koščki micelija, ki so zrasli na trdnem SM gojišču (vsebuje 10 g agar), smo prenesli v 200 ml tekočega SMY medija v erlenmajerici. Inkubirali smo jih 6 tednov pri sobni temperaturi, v temi in brez stresanja. Micelij smo zbrali in shranili pri -20 ° C.

Priprava ekstraktov

Ves gobji material (vrste iz dveh debel Basidiomycota in Ascomycota) smo nabrali v naravi, označili in zamrznili pri -20 ° C ali -80 ⁰ C. Od 150 gob, je bilo 141 identificiranih do vrste in 9 do rodu. Gobje ekstrakte pripravimo s homogenizacijo odtajanih trosnjakov in centrifugiranjem pri 16000 g 5 min da odstranimo netopne snovi. Proteinsko ekstrakcijo iz surovega ekstrakta smo izvedli z obarjanjem z acetonom z dodatkom 4 volumnov hladnega (-20°C) acetona in 40 minutno inkubacijo na ledu. Po centrifugiranju pri 10000 g in 4 ⁰ C smo pelet posušili na zraku pri 4 ⁰ C in shranili pri -20 ° C. Ekstrakt micelija pripravimo s homogenizacijo v tekočem dušiku z uporabo terilnice in shranimo pri -20 ° C. Pred uporabo smo proteinske ekstrakte raztopili v 0,05 M Tris - HCI pufru, ki vsebuje 0,1 M NaCI, pH 7,4, centrifugirali pri 16000g 5 min, da smo odstranili netopne snovi, filtrirali preko sterilnega 0,20 um filter ( Millex ® - LG ) za preprečevanje okužb in zamrznili pri -20 ⁰ C za kratkoročno shranjevanje ali -80 ° C za dolgotrajno shranjevanje. Približno vsebnost beljakovin v ekstraktih smo določili z uporabo Bio -Rad proteinov (Bio -Rad, ZDA), po priporočilih proizvajalca.

In vitro presejalni test

Za opazovanje vpliva ekstraktov gob v tekočem mediju, smo privzeli test rasti v mikrotitrskih ploščicah s 96 luknjicami (dno U -oblike, Golias, Labortehnika). Mešanica je vsebovala: 75 pl_ YPG medija ( glej YPGA medij, samo brez dodanega agarja ), 75 pL suspenzije Ralstonia solanacearum (10⁷ celic / ml), 42,5 pL 0,01 M PBS in 7,5 μΙ_ ekstrakta gobe. Pozitivna kontrola, negativna kontrola in kontrola sterilnosti ekstrakta so bili prisotni na vsaki plošči. Pozitivne kontrole so vsebovale 75 75 pL suspenzije Ralstonia solanacearum, 75 μΙ_ YPG medija in 50 μΐ_ 0,01 M PBS. Negativne kontrole vsebujejo 75 μΙ_ YPG medija in 125 pL 0,01 M PBS, medtem ko kontrole sterilnosti ekstrakta vsebujejo 75 pL YPG medija, 117,5 pL 0,01 M PBS in 7,5 pL ekstrakta gob. Vsak vzorec in kontrola je bil prisoten v dveh ponovitvah, kontrola sterilnosti ekstrakta pa v eni luknjici. Plošče smo inkubirali v termo stresalniku (PST - 60HL - 4, BIOSAN) pri 28 ⁰ C in 400 rpm 72 ur. Zaviranje rasti smo spremljali spektrofotometrično z več meritvami OD595 (Tecan GENIOS) v 24 urah. Po 24 urah je bilo 30 ml odpipetiranih iz vsake luknjice, na sveže YPGA gojišče, da smo ocenili ali je učinek baktericiden (bakterije ne rastejo po prenosu ) ali bacteristatičen (bakterije rastejo po prenosu). Izhodni podatki so bili zbrani s programsko opremo Magellan, V. 6.2.

Rezultati

In vitro presejalni test protibakterijske aktivnosti olivnih ekstraktov

Gobji trosnjaki so bili zbrani v slovenskih gozdovih v obdobju več sezon in identificirani do vrste (Tabela 1). Povprečna vsebnost beljakovin je pokazala variabilnost med različnimi izvlečki in je bila med 5,9 ± 2,6 mg/mL. Pri prvem pregledu delovanja ekstraktov gob proti Ralstonia solanacearum Z 30 (NCPPB 4156), je bila presejalni test v mikrotitrski ploščici optimiziran za zagotovitev zanesljivih in ponovljivih rezultatov. Tekoče PGA gojišče in inkubacija pri 28 ° C so primerni za preizkušanje inhibicije bakterije R. solanacearum, R. mannitolilytica in E. coli. Absorbanco smo merili 24 ur, saj je bila določena v predhodnih poskusih, kot najbolj informativna časovna točka za določanje antibakterijske aktivnosti (zaviralne lastnosti) ekstraktov. Skupaj smo testirali 150 vzorcev iz 94 različnih vrst, 148 gobjih ekstraktov in 2 ekstrakta micelija. Od 150 ekstraktov, je14 vzorcev (13 ekstrakti gob in 1 ekstrakt micelija C. geotropa) zaviralo rast R. solanacearum in vitro (Tabela 1). Ti ekstrakti so kazali različne stopnje zaviranja rasti R. solanacearum Z30 v primerjavi z dinamiko rasti pozitivne kontrole: popolno zaviranje (Amanita phalloides, Amanita muscaria, Amanita virosa, Boletus luridiformis, C. geotropa, ekstrakt micelija C. geotropa, Gomphidius glutinosus, Tricholoma saponaceum, Hypholoma sp), delno zaviranje (Agaricus moelleri, Albatrellus ovinus, Bovista nigrescens, Suillus vanegatus, Tricholoma ustale) ali nobenega zaviranja (Clitocybe nebularis, Ramaria flava). Stopnja inhibicije reprezentativnih ekstraktov je prikazana na Sliki 1.

Za 20 vrst gob smo analizirali protibakterijsko aktivnost več kot enega ekstrakta iste vrste (Tabela 1). 8 Tricholoma saponaceum ekstraktov je popolnoma inhibiralo R. solanacearum in 1 pa je kazal delno inhibicijo (8 /1). Podobne rezultate smo opazili pri ekstraktih C. geotropa (9/ 3) in ekstraktih A. phalloides (7 /3). To ni nepričakovano, saj so poročali, da se lahko sestava in vsebnost beljakovin in drugih snovi zelo razlikuje in je odvisna od rastišča, vremenskih razmer (razpoložljivost vode, temperatura) in starosti plodnega telesa.

Tabela 1: Presejalni test v mikrotitrskih ploščicah: in vitro smo testirali 150 ekstraktov iz 94 vrst višjih gliv (gob), ki zastopajo 26 družin

CD c

4—» »N

O co

TO

Ό

CO CO 2 Λ1 CO

TO TO C TO Φ Π3

Ό TO ^C O

Tl <d «5 ”to ro c -σ ·° -σ τι

TO

Ό

CD CD = Ό Ό _$3 TO 0 Ό Ό <o

TO

Ό ”ra .g Ό 73

CD 'o7_ —

<0

CO

TO

X)

O

CT

TO

CO

CD

C >N

O

CD =3

JD (D z 2 c

CD

C >N

CD

JO

O

O)

CD >

0)0) TO 0) 0) 0) TO 0)

C C Ό C C C □ C

0) TO 0) 0) 0) C Ό C C C

TO “D

0) 0) 0) 0) TO C C C C Ό

0)

C to to

C C cv ε

.£ T3 δ TO TO

TO l·— O 2 TO

E o

o

TO

E

TO TO c υ TO TO

- S ² S.TO TO TO P Q- TO p ε

Si u .c

TO C .3 5?

TO TO ε

o o

S n⁵ .C p. c

CD

Ό

0)

C

V) •S co

Φ ε

TO o

TO

O

C

TO >. TO

E c o TO Ό 05 «

TO

CO

0) c

ε to

TO TO TO ε ε ε o o o o o o -c -c -c U .TO TO

CD CD O C Ό <M ε

C §

TO ε

o o

-c

TO .52 P

TO o 2 c:

„ δ s-g _ o •C <0

CD 0) 0) 0) 0) O C C C C

TO

TO .8

TO TO O 2:

ε to

TO TO

O

C C TO TO O) 05 <N

CO

Φ

Od to 42 2 TO ε

£.§>

Is

S- s.

,9 05 O -j

CO δ

Φ c:

_ S <\J -ffi

CO 0) .3 Cp p c

TO -C -Q U TO TO 3 3 ε ε h—- k- l·*· l·- K— h- h* l·—

CQ CQ -J	X X g Φ
TO	o •2
TO
TO
O	δ
2	g-
2 o	E o
co	O

<0

CO o

.c =3

O)

CO .3 §

-S t

δ

o.

fC'

0)

C

TO

TO

Ό

TO £ -D C

0)

C

0) 0) TO TO

C C T3 O

0) TO C Ό o

o

Φ

o. co co

O * i Si o p š k

Φ 5

-J <

CD

C

TO ^Φ

TO

TO

O ·§

C

TO ε

co c:

Φ o

co

Ž.CD

5S r s o TO

I ε

TO TO TO c C TO TO ε ε c

cm

-.Sto ™ O) p

-c

o.

c

TO ε

TO TO r***c c TO TO ε ε 'τ ςο co

1§ o δ

-Q O) TO TO 3 3

CO

8S °2 TO TO TO

3

3 3 3 CO <Z) C0 CO

TO ♦—

TO

S”

TO

C δ

j§ •i <0

0) cd

0) o

‘5 co

0)

Φ

O

Φ c:

δ

CD co s

c:

Φ

E o š

CD

-2 φ .c δ

L? φ h- cd φ o -2 ε

TO £ c TO O

TO

O &

O

O. g ” o TO O 2 TO TO 5 TO P S 45 cS 2 o o φ

φ φ

o cd

I

0) « ^ω d) C <s CD Ϊ Ί3 >» ^c TO

Ό

0) 0) 0) 0) 0) c c c c c

TO

C

TO

O

TO

TO δ

TO

TO

O

TO

C

TO

C δ

o υ

TO 3 §·

Φ 3 2 δ φ co 3 c;

CD co .3

CD .C

Έ

O

0) c

0) c

φ g _E >§ i o

t o

δ

TO ε

o 2 iS

TO δ

o

TO ε

o

TO

X3

TO

I o

o iS

CD TO TO

Ό Ό Ό

0)

C

TO .O

-G

CD &

•c

CD

C

CD 0) C C

C Ҥ

TO 3 .C C Š5 O d-o

-C 3 n, -52 P $£ g

Φ CD

CJ

CD .C δ

.φ

LL

O.

TO

O O -c: -c & & o o c. c.

SS X 3:

(D

Ό (D

Ό (Ο

Ό (0 Φ Ό Ό φ φ φ c -σ c (β φ Ή C

Φ

C

Φ

Ό

Φ σ

φ ο

φ φ φ φ d) φ c c c c c c ε

=3

T3 c:

Φ £

E (O c:

Φ o

co to

Φ

Φ

CL (/>

<0

Ci.

§

Φ §

CO

O y>

co co o

E § t 3 ,φ .Φ c: c:

φ φ ε ε φ φ ££ Ct

Φ 2 o. co φ 3 3 .c S o co

Φ

3.

CL (/) co

Φ £

CO CO 3 3

Φ Φ «3 3

Φ

Φ

Φ o

s co

Φ

Φ

CD

CO

CD

O

CO

-C t

Φ

Φ

Φ φ

£ φ

φ φ

ϋ φ

I

Φ =3 co .2 ε

Φ <o o

φ

-j co co .o .3 *= -2 O 3 <0 CO .3 3 3 3 Φ JO *+w

O o φ Φ -J 3

CL (/) (0 o

φ —j

Φ Φ Φ Ό D C

CO

Φ ε

Φ

CO

Φ

O (O

Φ

Φ

CO co co

55. o o o -c -c -c 8-8-88 2 2 §?§!§?

III ,C S o CD § i> 8 fc to c

CD

U to e

E

IP c

CD

O.

CD .O) c ^c -p

Φ

Φ o

Φ &

—J s

·§ o

0Q ΤΓΤΓ

X

3.

s

CD & ® 8 5

Φ o

Φ φ

S φ

φ φ

ε .φ

Φ φ

φ φ

o •2 co co

K .O)

O

S φ

φ co

K s

Φ o

;§

Φ co

Φ čo co

Φ (9- Φ

V} Φ Φ o o

«3

Φ iS co

Φ

O .ε §

O φ

J2 φ

O <0

Φ φ

p ε ε -=³

E

E g

Q)

Φ

Φ

Φ

O

Φ

O Φ 9 -3 E

O

O co <

Φ

Φ C c

Ό

Φ

T5 φ 45 Ό

Φ

D

S φ o X φ Φ φ Φ 3 3

5

O) CO CO CD E E

U. U. U. φ φ Φ 3 3 3 3 3 3 P 3 P φ

φ φ

o φ

Φ Φ (Π Φ D O -q O

Φ Φ c -σ co

-σ

CD CD CD CD C C C c cu

CO .3

Φ

Φ 3. .3 Φ

P

-Q O

E 3, .8 čd 5 'c o. § §

Φ

Φ

Φ o

Φ £

.3

CO

Φ ε

o o

-3 Φ cl φ S φ

Φ <Z)

CL

CO

CO

E o

o 8 .C Φ 3. P S 3 3* γρτ

Φ

X φ

φ inhibicijaf R. solanacearum v in vitro testih

E co

O «Ό is

E

CD co o -Q 'c cg g E co co E E o o o o -c -c .cj .o t (2

E co aS p CD 4= £ O C tD t O) co φ O.

§,£ o .co

Φ 3 § -Q φ O) 3 φ Φ

3

O 3 co

S 8 ^c o o

S <2 co *S O Φ ϋ

CD ^u -Q CO =§ t o od ii o o S o o

o

Φ

O)

Φ '-'J 3 Φ

2 3 3. Φ Φ -J —J

3 2 2

Φ .3

2 <0 O)

Φ - 3 .co .co Φ 3. 3. V φ φ -J —J & 'p to 8 p >2 io 3 co -Q co co E E >

p

Φ

Ό

C

Φ >O

O

O

D

O c

co

N

0) >

ro φ

Ό .Ω o

Έ jo φ

<n o

CL co

D 'E' co .c □

o cl o

E co ω

Φ c

Φ c _ φ >N D) =>

Ξ O

-q «Λ

Φ* O. C co co 'cl

E o

t_ c

co

2SČ CO — >1N

KI L- — >N

D

W 1 ω E « i_ >

φ

LΦ φ£

O >

> '*= co

Φ c

o tn o __ φ

>N O ZJ CL >N C

W o >W

L- co	E
CL	co
xz	CL
co	.c
c	co
—	c
ω	53
co	«
L—	co
CO	L—
c	co
	c
c
CO	c
L·.	co
w
Φ	«
H—»	Φ

> Ql Ol S- i_ i_

PRIMER 2

Materiali in metode

Test patogenosti na paradižniku

Rastline paradižnika (L. esculentum cv. Moneymaker) so bili uporabljene v in vivo testu v rastlinjaku. Pred inokulacijo smo rastline posadili v substrat kjer so rasle pri 21 °C v svetlobi in v temi z 90 pmol m'² s¹ fotonskega obsevanja (L36VV/77 luč, Osram, Nemčija) in 16h fotoperiodi. Rastline smo inokulirali v fazi dveh do treh pravih listov z z mešanico R. solanacearum in ekstrakti gob. Rastline smo inokulirali s koncentracijo bakterij 10⁵ cfu/ml, ki smo jo v prejšnjih poskusih potrdili kot najnižjo koncentracijo, ki povzroča značilne simptome na vseh rastlinah. Ekstrakti gob, ki so zavirali rast R. solanaceraum in vitro so bili dodani R. solanacearum suspenziji v razmerju 1:10. Rastline negativne kontrole smo inokulirali z 0,01 M PBS in pozitivne kontrolne rastline samo s suspenzijo R. solanacearum brez ekstrakta. Z uporabo sterilne igle (Icogamma plus 0.6mm x 25mm, Novico, Italija) smo stebli vbodli med kličnima listoma, po naslednjem postopku: na konici sterilne igle smo izbrizgali kapljico in prebodli steblo. Ko je igla prebodla steblo, smo na drugi strani naredili še eno kapljico suspenzije in iglo potegnili nazaj. Z vsako suspenzijo bakterije in ekstrakta smo inokulirali vsaj 40 rastlin, 42 pozitivne kontrolne in 20 rastlin negativne kontrole. Rastline, smo opazovali vsaj 14 dni, pri 28°C dnevni temperaturi in 20°C nočni temperaturi, pri 90 pmol m'² s'¹ fotonskega obsevanja in 16h fotoperiodi. Rastline smo spremljali vsaj 14 dni, stopnjo bolezenskih znamenj (simptomov) smo ocenjevali po številčnih razredih VVinsteada in Kelmana (1952), in sicer: 0 (brez simptomov), 1 (eno list uvel), 2 (2-3 listi uveli), 3 (vsi listi razen vrha rastline uveli), 4 (vsi listi in vrh uvel), 5 (rastlina mrtva).

Test patogenosti na krompirju

Mikropropagirane rastline krompirja Solanum tuberosum (cv. Desiree) smo gojili v tkivni kulturi 4 tedne, preden smo jih posadili v lončke z zemljo. Po rasti 14 dni v zemlji pri 22°C dnevne temperature, 20°C nočne temperature in pri osvetlitvi 90 pmol m² s'¹ fotonskega obsevanja in 16-h fotoperiodi, smo rastline inokulirali s suspenzijo bakteri in ekstrakti 1 cm nad podlago (zemljo) in inkubirali pri 25°C dnevni in nočni temperaturi ter osvetlitvi 90 pmol m'² s'¹ fotonskega obsevanja in 16-h fotoperiodi. Z vsako suspenzijo bakterij in ekstraktov smo inokulirali 42 rastlin, prav tako 42 rastlin pozitivne kontrole (samo R. solanaearum) in 20 rastlin negativne kontrole (0.01 M PBS). Rastline smo spremljali vsaj 14 dni, stopnjo bolezenskih znamenj smo ocenjevali po številčnih razredih VVinsteada in Kelmana (1952), in sicer: 0 ( brez simptomov ), 1 (eno list uvel), 2 ( 2-3 listi uveli), 3 (vsi listi razen vrha rastline uveli), 4 (vsi listi in vrh uvel), 5 (rastlina mrtva).

Kvantifikacija R. solanacearum v rastlinah z uporabo real-time PCR

Koncentracijo R. solanacearum smo spremljali z uporabo metode PCR v realnem. Rastlinsko tkivo smo vzorčili pred in po tem, ko so opazili simptome. Tkivo stebla paradižnika smo vzorčili tako, da smo odrezali 5 mm dolge odseke nad točko inokulacije pri prvem in drugem nodiju. Vzorčili smo rastline, ki so kazale različne stopnje simptomov, in sicer najmanj 3 rastline na simptom. Če so samo 3 rastline ali manj kazale določeno stopnjo bz, jih nismo vzorčili in vključili v qPCR analizo. Čeprav so bile rastline, ki prikazujejo različne stopnje simptomov vzorčene enakomerno med skupinami, lahko rastline, ki niso bile vzorčene (glej Materiali in metode), povzročijo manj kot 5% odstopanja v odstotkih uvelih rastlin, zaradi nižjega skupnega števila rastlin.

Vzorce rastlinskega tkiva smo razrezali na pol in shranili v 1,5 ml Eppendorf mikrocentrifugirkah. V sterilnih pogojih smo dodali 500 μΙ_ 0,01 M PBS dodan, zmešali in inkubirali 10 minut pri sobni temperaturi. Po inkubaciji smo 400 pL suspenzije shranili v mikrocentrifugirkah pri -20°C do uporabe. V teh vzorcih smo nato ugotavljali prisotnost DNA R. solanacearum z uporabo PCR v realnem času (TaqMan) PCR. Na osnovi preliminarnih poizkusov (podatki niso prikazani), za uspešno pomnoževanje tarčne DNA ni bila potrebna izolacija bakterijske DNA ali segrevanje vzorcev. Protokol, ki smo ga uporabili v našem poskusu, vključno s začetnimi oligonukleotidi in sondami, so razvili Weller in sod., 2000. 10 ml reakcije so bile izvedene v ploščah 384 luknjicami (MicroAmp, Applied Biosystems). PCR mešanica za detekcijo realnem času tako R. solanacearum (16S rDNA gena) in citokrom oksidaznega gena (COX), je vsebovala 5,0 pl_ TaqMan master mixa JP6251 (Applied Biosystems, 2002), 0,9 pL 10 pmol / pL RS- IF, RS - II - R ali COX F, COX -R, 0,2 pL 10 pmol / pL L RS- P ali COX - P, 1 pL deionizirane vode in 2 pL vzorca. Poleg vzorcev iz testa patogenosti, smo na vsako ploščico nanesli standardne krivulje R. solanacearum in COX ter NTC (kontrola brez tarče). Za pomnoževanje in merjenje fluorescence smo uporabili aparaturo ABI Prism Sequence Detection System 7900 HT. Cikli so potekali po naslednjem protokolu: 2 min pri 50 ° C, 10 min pri 95 ° C, čemur je sledilo 45 dvostopenjski ciklov 15 sekund pri 95 ⁰ C in 1 minuto pri 60 ⁰ C. Podatki so bili zbrani v programski opremi SDS 2.2.3, ter izvoženi in analizirani s programom Microsoft Excel. Bakterijska koncentracija je bila določena z uporabo R. solanacearum standardne krivulje v koncentracijah 100 celic/ml do 10⁸ celic/ml.

Analiza podatkov

Za ovrednotenje napredka bolezni na rastlinah, smo izračunali AUDPC vrednost (ang. Area Under Disease Progress Curve, območje pod krivuljo napredovanja bolezni) z uporabo R-statistical (Agricolae paket, Madden in sod., 2007). Postopek izračuna povprečno intenziteto bolezni med vsakim parom sosednjih časovnih točk in zato količinsko resnosti bolezni po času. Druge podatke smo analizirali z uporabo bodisi Microsoft Excel ali R-statistical.

Rezultati

Test patogenosti na rastlinah paradižnika in krompirja

Ralstonia solanacearum povzroča bakterijsko venenje na različnih gostiteljskih rastlinah. Rastline paradižnika, ki se najpogosteje uporabljaj kot testne rastline za testiranje patogenosti R. solanacearum, vendar pa je krompir primarni gostitelj R. solanacearum v evropskem prostoru, zato smo v naši raziskavi prav tako vključili rastline krompirja za testiranje in vivo učinka gobjih ekstraktov na bakterijo R. solanacearum. Pet ekstraktov, ki so bili aktivni v in vitro presejalnih testih so bili uporabljeni v testih patogenosti na rastlinah paradižnika in krompirja (tabela 2).

Ekstrakte A. phalloides, B. nigrescens, C. geotropa, S. variegatus in T. saponaceum, ki so inhibirali R. solanacearum in vitro smo tik pred inokulacijo zmešali s suspenzijo R. solanacearum S tem smo zmanjšali vpliv ekstrakta na začetne koncentracije R. solanacearum. Stopnja simptomov, ki smo jih opazili na rastlinah paradižnika in krompirja (Lycopersion esculentum cv. Moneymaker in Solanum tuberosum cv. Desiree ), inokulirani z mešanico R. solanacearum in ekstraktov je bila nižja v primerjavi s tistimi iz pozitivnih kontrolnih rastlin. Na rastlinah negativne kontrole krompirja in paradižnika nismo opazili simptomov.

Simptomi smo pri rastlinah pozitivne kontrole opazili 4 dni po inokulaciji (dpi) (57% rastlin kaže simptome) (slika 4). 4 dpi je venelo 57% oziroma 71% rastlin paradižnika ko-inokuliranima z ekstraktoma A. phalloides in B. nigrescens, kar je pripeljalo do zaključka, da ekstrakta A. phalloides in B. nigrescens ne zavirata bolezni, ki jih povzročajo bakterije R. solanacearum na rastlinah paradižnika. Rastline paradižnika, ko-inokulirane z S. variegatus in T. saponaceum so začele veneti 4 dpi, vendar je venelo le 11 % in 27% rastlin. 14 dni po inokulaciji je kazalo simptome 95% in 100 % rastlin ko-inokuliranih z S. variegatus in T. saponaceum, vendar pa je število popolnoma uveli rastlin (razred 5) bistveno nižje v primerjavi s pozitivno kontrolo. Podobno je bilo tudi pri C. geotropa ko-inkuliranih rastlinah, saj je 4 dpi le 22% rastlin kazalo simptome. 15 dpi je 98 % rastlin ko-inokuliranihs C. geotropa kazalo bolezenska znamenja.

Zaradi obetavnih rezultatov na rastlinah paradižnika, smo poskus ponovili na rastlinah krompirja. Napredovanje bolezni je pri paradižniku potekalo hitreje v primerjavi s krompirjem. Simptome smo prvič opazili pri rastlinah pozitivne kontrole 4 dpi in sicer je 9 % rastlin krompirja kazalo simptome (slika 3). Intenzivnost simptomov je bil ocenjen kot 1 in/ali 2 po številčnih razredih VVinstead in Kelman. Prav tako so se 4 dpi pojavili simptomi pri rastlinah ko-inokuliranih z T. saponaceum, vendar je venelo le 3% rastlin (1 stopnja). Simptomi na rastlinah krompirja ko-inokuliranih s C. geotropa in S. variegatus so se pojavili 5 dpi, takrat je 15% in 24% rastlin kazalo simptome, medtem ko je 5 dpi venelo že 57% rastlin pozitivne kontrole. Počasnejše napredovanje bolezni se je nadaljevalo pri rastlinah krompirja ko-inokuliranih z ekstrakti, in sicer je 14 dpi venelo 44%, 67% in 63% rastlin ko-inokuliranih z C.

inokuliranih z C. geotropa , S. variegatus in T. saponaceum v primerjavi s 92 % rastlin pozitivne kontrole.

Rezultati testov patogenosti na paradižniku in krompirj nas privedejo do zaključka, da ekstrakti C. geotropa, S. variegatus in T. saponaceum upočasnijo napredovanje bolezni in zmanjšajo intentziteto simptomov, pri čemer so bolj učinkoviti na rastlinah krompirja kot na rastlinah paradižnika.

Tabela 2: AUDPC smo izračunali za rastline paradižnika in krompirja ko-inokuliranimi z gobjimi ekstrakti. Vrednosti AUDPC so izražene relativno, glede na AUDPC pozitivne kontrole (% PC).

in vitro testi testa patogenosti paradižnik krompir cv. Desiree

Ime gobjega ekstrakta	inhibicija	baktericiden/ bakteristatičen	aktiven (da/ne)	AUDPC vrednost (%PC)	aktiven (da/ne)	AUDPC vrednost (%PC)
Amanita phalloides	+++a	C	ne	114	nt	nt
Bovista nigrescens	+c	S	ne	94	nt	nt
Clitocybe geotropa	+++	C	da	80	da	48
Suillus variegatus	++b	S	da	68	da	75
Tricholoma
	+++	C	da	76	da	63

saponaceum ^a+++ inhibicija bakterij - bakterije se ne razmnožujejo (x < 15 % OD₅₉₅ vrednosti pozitivne kontrole) ^b++ inhibicija bakterij - razmnoževanje bakterij je precej počasnejše, kot pri pozitivni kontroli (15% < x < 60 % OD₅₉₅ vrednosti pozitivne kontrole) ^c+ inhibicija bakterij - razmnoževanje bakterij je nekoliko počasnejše, kot pri pozitivni kontroli (60% < x < 84 % OD595 vrednosti pozitivne kontrole)

S bakteristatičen učinek ekstrakta - bakterije ponovno rastejo, ko jih prenesemo na sveže gojišče

C baktericidni učinek ekstrakta- bakterije ne rastejo po prenosu na sveže gojjišče nt ni testirano

Število zdravih rastlin krompirja se sklada z AUDPC vrednostmi (tabela 2). Tako A. phalloides kot B. nigrescens nista zmanjšala celokupne intenzitete bolezni (AUDPC vrednosti 114% in 94 % PC), kljub temu, da sta zavirala rast R. solanacearum in vitro. Zato smo jih izključili iz testa patogenosti na rastlinah krompirja. C. geotropa, T. saponaceum in S. variegatus so celokupno zmanjšali intenziteto bolezni na rastlinah paradižnika in krompirja Zanimivo je, da Suillus variegatus ni povsem inhibiral R. solanacearum in vitro, vendar pa je zaviral napredovanje bolezni in vivo podobno kot T. saponaceum ki je popolnoma inhibiral bakterije in vitro in imeli baktericiden učinek.

Ekstrakti C. geotropa in T. saponaceum sta popolnoma inhibirala bakterije in vitro in in in vivo. Ekstrakti T. saponaceum, S. vahegatus in C. geotropa so zavirali bolezen, tako na paradižniku kot krompirju, vendar pa je bilo 15 dpi manj obolelih rastlin krompirja, kot paradižnika. V primerjavi s pozitivno kontrolo in glede na vrednosti AUDPC so bili ekstrakti bolj učinkoviti na krompirju kot na paradižniku. Čeprav je imel ekstrakt S. variegatus le zmerno inhibitorno aktivnost in vitro, pa je zaviral pojav in napredovanje bolezenskih znamenj tako pri paradižniku kot tudi krompirju rastlin. Ti rezultati so potrdili tudi opažanja drugih raziskovalcev, in sicer da in vivo in in vitro protimikrobni aktivnosti nista vedno povezani. Iz tega sledi, da je potrebno zgodaj vključiti testiranje inhibitornih substanc in vivo, ne le zaradi opazovanja zaviralnega učinka, vendar tudi z vidika vzpodbujanja rasti in drugih pozitivnih učinkov na rastline. Prav tako je treba vse ekstrakte, ki kažejo vsaj delno inhibitorno aktivnost in vitro upoštevati kot potencialno sredstvo za varstvo rastlin. Po drugi strani, baktericiden učinek in vitro še ne pomeni, da bo protein ali ekstrakti učinkovit tudi in vivo, kot je se je izkazalo pri A. phalloides. Kljub temu so lahko taki ekstrakti še vedno uporabni za aplikacije, kot so površinska sterilizacija ali dezinfekcija voda.

Večino testov patogenosti za R. solanacearum se opravi na rastlinah paradižnika, ki jih enostavno gojimo in so dovzetne za okužbe. Pri izvajanju testov patogenosti na rastlinah paradižnika, smo uporabili dve sorti paradižnika (cv. Roma in cv. Moneymaker). Ker ni bilo opaziti razlike med kultivarji, se je nadaljevalo delo na cv. Moneymaker, saj se rutinsko uporablja v diagnostiki. Preizkusili smo tudi ali ekstrakti sami po sebi vplivajo na rast rastlin. V primerjavi z negativnimi in pozitivnimi kontrolami nismo opazili ne negativnega in ne pozitivnega učinka na rast (Slika 6).

Načini inokulacije lahko igrajo pomembno vlogo pri ocenjevanju učinkovitosti sredstva za zaščito rastlin. Ko smo bakterijsko suspenzijo in ekstrakt zmešali pred inokulacijo, bi lahko nekatere bakterije uničili še preden bi vstopile v rastlino. Vendar pa kljub temu nekoliko nižja koncentracija ne bi imela vpliva na razvoj bolezni sicer bi to opazili pri rastlinah ko-inokuliranih z A. phalloides, ki so imeli močan protibakterijski učinek in vitro. Večina bakterij je tako preživeli in je ob vstopu v steblo prišla v idealno okolje za razmnoževanje. Nasprotno se ekstrakt ob vstopu v rastlino razredči in do neke mere izgubi stik z bakterijo. Kljub temu, pa smo opazili, da nekateri ekstrakti zaviranje nastanek in napredovanje bolezni, zaradi česar lahko sklepamo, da vplivajo na obrambni sistem rastline. Na splošno je tak učinek zelo pomemben in pogosto bolj zaželen, kot neposreden vpliv na bakterijo, saj v primerjavi z neposrednim vplivom na bakterijo povzroča večjo splošno odpornost na več različnih povzročiteljev bolezni. Za pojasnitev mehanizma delovanja in interakcij med rastlino, patogenom in gobijm ekstraktom, bi bilo potrebno analizirati izražanje genov, na primer s pomočjo sekvenciranja naslednje generacije (NGS), ang. next generation sequencing).

Kvantitativna določitev koncentracije R. solanacearum v tkivu paradižnika je bila določena s qPCR (Slika 11). Ker je metoda je zelo občutljiva, smo rastlinsko tkivo vzorčili v zgodnjih dni po okužbi, da bi lahko odkrili nizko koncentracijo bakterij, še preden bi lahko opazili simptome na rastlinah. Tako bi videli ali je počasnejše napredovanje bolezni posledica manjše koncentracije bakterij v rastlinskem tkivu. To v našem primeru ne drži v celoti, saj je bila koncentracija R. solanacearum v rastlinskem tkivu zelo visoka in se ni bistveno razlikovala, če smo rastlino inokulirali samo z R. solanacearum ali je bil dodana tudi ekstrakt. Kljub temu pa smo opazili večje razlike v bakterijskih koncentracijah pri rastlinah ko-inokuiliranih z R. solanacearum in ekstrakt gob, v primerjavi s pozitivnimi kontrolnimi rastlinami. Koncentracijo R. solanacearum v tkivu paradižnika tkiva smo določili z qPCR (Slika 11). V vseh inokuliranih skupinah rastlin so bile koncentracije bakterij zelo visoka in so presegale 10⁶ celic/ml, še preden smo opazili simptome. Z napredovanjem simptomov, se bakterijska koncentracija v rastlini bistveno povečala. Bakterijska koncentracija je bila nižja v drugem nodiju v primerjavi v primerjavi s prvim nodijem, v vseh inokuliranih rastlinskih skupinah. Zanimivo je, da nismo zaznali bakterije v drugem nodiju pri stopnji simptomov 2, 3 in 5, ki smo jih ko-inokulirali s T. saponaeum. Podobne rezultate smo dobili pri rastlinah ko-inokuliranih z A. phalloides, kjer je bila koncentracija bakterij manjša ali bakterij sploh nismo zaznali pri stopnji simptomov 0, 1 in 2. Ti rezultati kažejo, da bi ekstrakta T. saponaceum in A. phalloides lahko omejila gibanje bakterij preko še neznanega mehanizma delovanja.

Tabela 3: In vitro vpliv izbranih gobjih ekstraktov po 24ih urah na R. solanacearum, R. mannitolilytica in E. coli.

siiujojipijni snje/og

o

O

O

O

to

O

O

O

O

to

O

O

U

+++

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+++

+ + +

+++

+ + +

+ +

esoM e)peLuy

to

o

o

o

to

to

to

to

to

to

O

o

o

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+++

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

sepioi/egd ejiueiuv

o

c

c

1 c

c

1 c

c

c

C

M—» C

c

c

c

+++

c

c

•4—< C

4~> C

C

c

» c

c

C

c

C

+ + +

sepionegd e)jUBLuy

o

o

o

o

o

o

to

o

o

o

o

o

o

+++

+ + +

+ + +

: +++

+ + +

+++

+ + +

+ + +

+ + +

+++

+ + +

+ + +

+ + +

uinaoeuodes euioioqoiJ±

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

+ + +

Μ- Η- +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+++

+++

+++

+++

+ + +

+ + +

+ + +

Ime zbirke

NCPPB 4156/CFBP 3857

NCPPB 215/LMG 2296 (RA 1.64)

NCCPB 3989/CFBP 4613

CFBP 6783

NCCPB 4005/CFBP 4616 ,

CFBP 6438

CFBP 7038

NCPPB 3987/CFBP 6446

CFBP 3257

NCPPB 1500/LMG 17144 (RA 1.72)

CFBP 6925

NCPPB 3996/CFBP 2928 (RA 3.20)

CFBP 6737/LMG 6866 (F 5.35)

Gostiteljska rastlina

Solanum tuberosum

Lycopersicon esculentum

Solanum tuberosum

Heliconia caribea

I Zingiber (Ginger)

Musa sp. cv. plantain

Solanum nigrum

Solanum tuberosum

Solanum tuberosum

Solanum tuberosum

Musa x paradisiaca L. cv. saba

Lycopersicon esculentum

contaminated autoclave fluids

Ime bakterije

R. solanacearum

R. solanacearum

R. solanacearum

R. solanacearum

R. solanacearum

R. solanacearum

R. solanacearum

R. solanacearum

R. solanacearum

R. solanacearum

R. solanacearum

R. solanacearum

R. mannitolilytica

Oznaka seva

NIB Z 30

NIB Z 1625

NIB Z 1693

NIB Z 1759

NIB Z 1691

NIBZ 1779

NIBZ 1727

NIB Z 1734

NIB Z 1760

NIB Z 1626

NIB Z 1732

NIB Z 1629

NIB Z 1631

• »

na	C	4-4 C	4-4 c	C	C	4-4 c	C
1	4-4 c	c	c	4-4 c	4-4 c:	4-4 c	4-4 c
na	4—· c	4-4 c	4-4 c	4-4 c	4-4 C	4-4 c	Έ
1	4-4 c	4-4 c	4-4 C	4-4 c	4-4 C	4-» C	4-4 c
4-4 C	4-4 c	4-4 c	4-4 C	c	4-4 c	4-4 c	4-4 C
+ +	+ +	+ + +	+ + +	+ +	+++	+++	+++
ω	c	c	4-4 C	4-4 c	c	4-4 c	4-4 c
+++	4-4 c	4—» c	4-4 c	c	4-4 c	c	4-4 C
o	4-4 c	4-4 c	4-4 C	4-4 c	4-4 c	4-4 C	4-4 c
+ + +	4-* c	4-4 c	4-4 c	4-4 c	4-4 C	4-4 C	4-4 C
GSPB48	NCPPB 402/CFBP 2048			NCPPB 683/CFBP 1232	NCPPB 416/CFBP 2535	NCPPB 2437/CFBP 2413	NCPPB 4168/LMG 3690
	Dhrysanthemum morifolium	Solanum tuberosum		Pyrus communis	Prunus salicina
E. coli	D. dadantii	P. atrosepticum	P.carotovorum subsp. carotovorum	Erwinia amylovora	Xanthomonas arboricola pv. pruni	A. tumefaciens	I- I Enterobacter sp.
NIB Z 703	NIB Z 8	NIB Z 620	NIB Z 623	NIB Z 3	NIB Z 6	NIB Z 664	NIB Z 1701

• a «

Tabela 3: In vitro vpliv izbranih gobjih ekstraktov po 24ih urah na R. solanacearum, R. mannitolilytica in E. coli (nadaljevanje).

sijeinqdu oqAoomo	ra c	co	ra c	ra c	CO	ra c	ra c	ra c
1	+	1	1	+ +		1	1
snuiAO snn9J)eqiv	co	co	CO	co	co	co	co	ra c
+++	+ + +	+++	+ + +	+ +	+	+ +	1
a/eisn eLuoioqoij±	co	(O	co	co	co	co	co	co
+++	+ + +	+ +	+ +	+ +	+	+	+
IJdlldOUl snoijeBv	ω	co	co	co	co	co	co	co
+	+ + +	+ +	+ +	+ +	+ +	+	+
snsougn/B snipiqdujOQ	o	o	o	o	o	o	o	o
+++	+ + +	+++	+ + +	+ + +	+ + +	+++	+ + +
edoj)Od6 aqAoofjio	o	o	o	υ	o	o	o	o
+++	+++	+ + +	+++	+ + +	+ + +	+++	+ + +
Ime zbirke	NCPPB 4156/CFBP 3857	NCPPB 215/LMG 2296 (RA 1.64)	NCCPB 3989/CFBP 4613	CFBP 6783	NCCPB 4005/CFBP 4616	CFBP 6438	CFBP 7038	NCPPB 3987/CFBP
Gostiteljska rastlina	Solanum tuberosum	Lycopersicon esculentum	Solanum tuberosum	Heliconia caribea	Zingiber (Ginger)	Musa sp. cv. plantain	Solanum nigrum	Solanum tuberosum
Ime bakterije	R. solanacearum	R. solanacearum	R. solanacearum	\ R. solanacearum	R. solanacearum	R. solanacearum	R. solanacearum	R. solanacearum
Oznaka seva	NIB Z 30	NIBZ 1625	NIB Z 1693	NIBZ 1759	NIB Z 1691	NIB Z 1779	NIB Z 1727	NIB Z 1734

	-	na	na	na	I na	4-4 c	4-4 C	C	4-4 C
	-	1	1	1	1	4-4 c	4-4 C	4-4 C	4-4 c
	na	co	co	co	1 na	na	4-4 C	4-4 C	4-4 C
	1	+ +	++	+ +	1		4-« C	4-4 C	4-4 c
	na	na	na	co	co	na	4-» C	c	4-4 c
	1	1	1	Τ- Η-	+	1	44 c	4-4 c	c
	co	co	co	co	co	co	4_» c	c	c
	+ +	+	+	+ +	+	+ + +	4—» C	<4-4 C	4-4 c
	o	co	o	o	o	na	c	4—» C	4-4 c
	+ + +	+ + +	+++	+++	1 +++	1	4-4 c	4-4 C	c
	o	o	o	o	O	na	4-4 C	4-4 C	*4 C
	+ + +	+++	+ + +	+ + +	| +++	1	4-4 C	4-4 C	4-4 C
6446	CFBP 3257	NCPPB 1500/LMG 17144(RA 1.72)	CFBP 6925	NCPPB 3996/CFBP 2928 (RA 3.20)	1 CFBP 6737/LMG 6866 (F 5.35)	GSPB 48	NCPPB 402/CFBP 2048
	Solanum tuberosum	Solanum tuberosum	Musa x paradisiaca L. cv. saba	Lycopersicon esculentum	contaminated autoclave fluids		Dhrysanthemum morifolium	Solanum tuberosum
	R. solanacearum	R. solanacearum	R. solanacearum	R. solanacearum	R. mannitolilytica	E. coli	D. dadantii	P. atrosepticum	P.carotovorum subsp. carotovorum
	NIB Z 1760	NIB Z 1626	NIB Z 1732	NIBZ 1629	NIBZ 1631	NIB Z 703	NIB Z 8	NIB Z 620	NIB Z 623

			4-»			4-»			4—4
C			c			C			c
-w			4—·			4-4			4-1
C			c			C			C
4						-J—4
c			c			c			c
4-«			4—'			4—4			4-4
c			c			c			c
4-4			4—»			4-4			4-4
c			c			c			c
4—»			4—*			4-»			4—4
c			c			C			c:
			4-»			4-J			4—4
c			c			C			c
4—»			4—4			4-4			4-4
c			c			C			c
4—4						4—4
c			c			C			c
4-4			4-·			4-«			4-4
c			c			C			c
4—»			4-4			4—4
c			c			C			c
4—<			4-4			4-4			4-4
c			c			C			c
							CL
	CL			CL			CO			0
co	CO LL		co	CO LL		co	Ll O		co
CL	o		CL	O		CL		CL
Q_		CM	Q_	ΙΌ	CL	r-	co	0-	00	O
o	co 00	σ> CM	o	co	CO m	o	co Xj-	•M-	o	co	o <n
z	co		z	M·	CM	z	CM	CM	z	M	CO
.co c:
		co
3 G			icin
F			Φ
o			co
O			co
<0			3
s			c
k			δ
CL			0-
Ervvinia	i .o		homonas	ricola pv.		mefaciens			robactersp.
co		Xant	arbo	prun	S <			Ente
									O
						co			N.
CO			CO			o			T—
N			N			N			N
CO			CO			CO			CO
Z			Z			Z			Z

	Φ 2 c o x Φ c > 4—» N O CL	a? o l— 4—» C o x Φ c t> 4-4 N O Ω.
	‘•£3 CZ) O c Ό 2	CZ) O c Ό Φ
	>	L_ >
	in σ> m Q	m o> in o
	O	o
	O CO	00
	VI	VI
	X	X
	v	v
φ o	θ'· m	XP er o
4—4 c	^3·	co
o	·—
X	o	o
Φ c	4-4 c	L— 4-< C
> 4-J	o X	o x
N	o
o	C	c
Q_	>	>
	-t-j
'«£3 CZ) o c	N O CL	N O a.
Ό	Ώ	Ώ
E	CL	CL
>	4—4 o	4—4 o
to 0) in O o	X	X
φ“ >CZ) a?	φ~ >CZ) a?
CČ	c CZ)	c CZ)
m	Φ >o o	Φ >o o
VI	CL	CL
	—.	O
	Φ	X
o	O Φ	O
‘a? B'	o.	_x Φ
>N	Φ	c
O C	Ώ	Φ
E	Φ 4-^	Ώ
N	X	Φ
Φ l— Φ C	Φ X) Φ	4—4 x Φ JO
Φ CZ) Φ	E' Φ > Φ	Φ ‘c* Φ
'CZ	>N Q	Φ
Φ	c	>N
S Φ JO I	E N E	O C E N
1		Φ
	1	l_
Ώ Φ	Ώ	1
S Φ	Φ S	Ώ Φ
JO	Φ	x
.φ	JO	φ
Φ
'o	E*	φ
2
jz c:	JO le	o Lo
”	c	j:
+		c
+	+
+ (0	+	+ o

φ >ο >CZ)

Ο

σ) φ

>Ν φ

>

ω ω

c

Ο

Ε φ

ω

Φ c

Φ

Φ ο

L.

4-*

C ο

_Χ Φ C > 4—> Ν ο ο.

CZ) ο

c σ

φ

Ο

Ο

ΛΙ

Φ δ'

Ο

-X θ' ji?

to φ

ιΟ c

>

ο c

ο

ο.

φ

Ώ φ

-*—4 .X φ

_Ω

I φ

φ

L_ to φ

_χ φ

c >ο

C

Φ >Ο

4>4

Φ to φ

>ο >ω δ⁵

Ο) φ

’Ν

Φ >

(Λ

Φ

C

CZ)

Ο

C

Φ

Ο α_ ο

Φ cz)

Ε φ

c φ' ‘C

-SŽ

-X

Φ

-Ω

Ζ -2 c ·£ — φ C . ω

S

-X

Ε

4·^ (Ζ)

-X

Φ

X

Φ

C >0 c

σ ο

'ι_

Φ

X

Φ

JO c

*·* c

na podatki niso na voljo

PRIMER 3

Rezultati

Aktivnost proti različnim sevom R. solanacearum

Potem ko smo opazili inhibitorno aktivnost izbranih gobjih ekstraktov proti R. solanacearum sev NIB Z 30 in vitro in in vivo, smo preizkusili ali ekstrakti kažejo aktivnost tudi proti drugim filotipom R. solanacearum. Aktivnost 10 gobjih ekstraktov smo testiralii proti 12 različnim sevom bakterije R. solanacearum, ki predstavljajo različne filotipe in biovarje. Poleg tega smo jih testirali tudi proti frakciji Amanita phalloides, ki je bila aktivna v prejšnjih testih. Poleg filotipov R. solanacearum smo vključili tudi R. mannitolilytica, ki je bila izolirana iz okužene tekočine po avtoklaviranju, saj ima najvišjo podobnost nukleotidnega zaporedja z R. solanacearum (Coenye et al, 2003), medtem ko smo E. coli izbrali kot nepovezano Gram negativno bakterijo in potencialni produkcijski organizem za rekombinantne glivne proteine. Poleg tega je R. mannitolilytica oportunistična humana patogena bakterija, ki je povzročila več izbruhov bolezni v bolnišnicah v zadnjih letih.

Stopnja inhibicije je bila določena po tem izračunu odstotka rasti (A595) v primerjavi s pozitivno kontrolo (% PC). Ekstrakti, ki so popolnoma inhibirali rast bakterije, niso dosegli več kot rasti 15% PC, medtem ko so ekstrakti, ki niso zavirali rasti bakterij imeli vrednosti v mejah variacije pozitivne kontrole (vsaj 84% PC). Ekstrakti, ki so delno zavirale rast R. solanacearum, smo razdelili v 2 dodatni skupini, tiste med 15% in 60% PC in tisti med 60% in 84% PC. Ekstrakti Amanita phalloides in Tricholoma saponaceum so povsem zavirali rast vseh sevov bakterije R. solanacearum kot tudi R. mannitolilytica in E. coli, kar kaže na bolj splošen mehanizem delovanja. Poleg teh dveh, so Amanita virosa, Boletus luridiformis, Clitocybe geotropa in Gomphidius glutinosus povsem zaviral vse testirane vrste Ralstonia, ne pa tudi E. coli. Več variacij inhibicije smo opazili pri Agaricus placomyces var. terricolor, Tricholoma ustale in Albatrellus ovinus, ki so imeli v vseh primerih bakteristatičen vpliv na bakterije. Zanimivo A. moelleri ni povsem inhibiral večine sevov R. solanacearum, razen Z1625 in Z1754, vendar pa je inhibiral E. coli. Ekstrakta Clitocybe nebularis in Ramaria flava sta bila najmanj učinkovita. Ugotovili smo, da v našem primeru ni bilo nobene povezave med stopnjo aktivnosti in uvrstitvijo v filotipe Poleg tega, so od 6 ekstraktov, ki so popolnoma inhibirali vse seve Ralstonia, 4 od njih so iz užitnih vrst, od katerih 2 je treba pred zaužitjem predhodno skuhati.

PRIMER 4

Materiali in metode

Izolacija biološko aktivnih proteinov

Biološko aktivno proteinsko frakcijo smo izolirali iz Amanita phalloides in Clitocybe geotropa z uporabo gelske in ionsko-izmenjalne kromatografije. Ekstrakt smo pripravili kot je opisano v primeru 1, in se uporablja za gelske kromatografije z uporabo Sephacryl S-200, uravnoteženo v 0,02 M Tris-HCI, pH 7,5 z 0,3 M NaCI. Frakcije, ki kažejo antibakterijsko delovanje (slika 9a) zberemo, koncentriramo z ultrafiltracijo, pri čemer je cut-off molekulske mase 10 kDa in dializiramo proti 0,03 M BisTris, pH 6,5. Vzorec nato nanesemo na DEAE-Sephacel ionsko izmenjalno kolono, uravnoteženo v 0,03 M BisTris, pH 6,5. Vezane proteine smo eluirali z gradientom 0-0,4 M NaCI v istem pufru. Inhibitorne frakcije zberemo in koncentriramo z ultrafiltracijo.

Karakterizacija proteinov

Analiza proteinskih frakcij, ki so inhibirale bakterije, je bila narejena z SDS-PAGE, BlueNative PAGE (Novex NativePAGE), Bis-Tris Gel sistem (Invitrogen) in izolelektričnim fokusiranjem (Phast sistem, predpripravljeni pH 3-9 gradient geli - GE Healthcare ter Novex pH 3-7 IEF Gel sistem (Invitrogen). Analiza N -terminalnega zaporedja je bila izvedena na posameznih lisah z Edmanovo razgradnjo in uporabo avtomatiziranega sekvenatorja aminokislinskega zaporedja s tekočim impulzom Procise (Applied Biosystems). Ta je povezan z analizatorjem 120 A analizator po ločitvi proteinov s SDS-PAGE in elektroblotingom na polivinildien difluoridno membrano in barvanjem s Coomassie Brilliant Blue 250. Za identifikacijo posameznih lis smo proteine analizirali s SDS-PAGE, lise izrezali, jih razgradili s tripsinom in analizirali maso peptidov s pomočjo masne spektrometrije (ESI-MS/MS). Iskanje po podatkovnih bazah smo izvedli z Mascot interno uporabo strežnika MS/MS Ion Search. Potencialno N-glikozilacijo proteinskih frakcij smo analizirali s pomočjo rekombinantne N - Glycolidaze F (Roche), po priporočilih proizvajalca.

Analiza L-aminooksidazne aktivnosti

L- aminokislinko oksidazno aktivnost smo analizirali, kot je opisano v Kishimoto in Takahashi (2001). Aktivnost smo testirali v mikrotitskih ploščicah pri 37 ⁰ C. 10 ul vzorca smo zmešali z 90 ul substrata reakcijske zmesi v fosfatnem pufru, pH 7,4 in dodali 5 mM L-amino kislino, 2 mM O-fenilendiamin, 0,81 U/ml hrenove peroksidaze. Reakcijo smo ustavili z dodatkom 50 ul 2M H2SO4 in izmerili absorbanco pri 492 nm z uporabo 630 nm kot referenčno valovno dolžino. Alternativno lahko merimo absorbanco pri 420 nm tekom poskusa. Inhibicijo z askorbinsko kislino smo testirali v končnih koncentracijah v območju od 0,1 mg/ml do 5 mg/ml. pH optimum je bil določena z uporabo citratno fosfatnega pufra (pH 2,6 - pH 7,6), fosfatnega pufra (pH 6 - pH 9) in (bi) karbonatnega pufra (pH 9 - pH 11).

Rezultati

Izolacija proteinske frakcije s protibakterijsko aktivnostjo iz ekstrakta Clitocybe geotropa smo izvedli z gelsko in ionsko izmenjevalno kromatografijo. Najmočnejšo liso smo dobili z uporabo BlueNative PAGE, in sicer molekulske mase 180-200 kDa (slika 8). Liso smo izrezali in eluirali iz gela ter potrdili njeno protibakterijsko aktivnost in vitro. Z analizo SDS-PAGE smo ugotovili, da gre za proteinski kompleks, ki je sestavljen iz proteinske lise velike ~ 58 kDa in 5-6 šibkejši lis (Slika 8). Analiza masne spektrometrije ~ 58kDa lise je liso opredelila kot dihydrolipoamide dehidrogenazo (ABA73359) kot najbolj zanesljiv zadetek. To je potrdila tudi analiza masne sprektrometrije pik izrezanih iz 2D gelske elektroforeze. Določeno je bilo Nterminalno zaporedje, vendar nismo našli podobnosti z drugimi proteini v podatkovnih bazah.

Izolacija proteinske frakcije s protibakterijsko aktivnostjo iz ekstrakta Amanita phalloides smo izvedli z gelsko in ionsko izmenjevalno kromatografijo. Po analizi z SDS-PAGE in izoelektričnim fokusiranjem smo v frakcijah s protibakterijsko aktivnostjo opazili ~ 60 kDa liso, ki je na nativnem PAGE kazala približno molekulsko maso 200 kDa in pl 6,5 (Slika 9). Za ~ 200 kDa liso smo po izpiranju izrezane lise iz gela potrdili protibakterijsko delovanje in vit. N -terminalno zaporedje je bilo določeno z degradacijo po Edmanu, vendar nismo našli podobnosti z drugimi proteini v podatkovnih bazah. Protein je N-glikoziliran. Po deglikozilaciji s pomočjo rekombinantne N glikozidaze F smo - 60 kDa liso izrezali iz SDSPAGE, razrezali s tripsinom ter pripravili vzorec za analizo z masno spektrometrijo. Protein je bil identificiran kot toxophallin (ADA58360), ki je oksidaza L-amino kislin in je bila potrjena z encimskimi testi. L-aminokislinka oksidazna aktivnost je bila potrjena tudi v C. geotropa (frakcije 18), ki smo jo dobili z gelsko kromatografijo (Slika 8).

Frakcije, ki smo jih izolirali iz A. phalloides in C. geotropa kažejo L-aminokislinko oksidazno aktivnost z različnimi specifičnosti za L-amino-kisline (Slika 10). Amino kislina L-levcin je optimalen substrat za obe. Encimska aktivnost je bila v obeh primerih preprečena z dodatkom askorbinske kisline. pH optimum za encimsko aktivnost je pri pH 5 za C. geotropa in pri pH 6 za A. phalloides. Poleg tega, tako imata obe širok razpon pH delovanja, saj je pri obeh prisotna več kot 50% encimska aktivnost v območju pH 3 do pH 10.

OPIS SKIC IZUMA

Slika 1 prikazuje učinke reprezentativnih proteinskih ekstraktov gob s protibakterijskim delovanjem proti R. solanacearum Z30 in vitro. Določene so bile tri stopnje zaviranja: popolno zaviranje rasti bakterij (vrednost v mejah variacije negativne kontrole), delno zaviranje rasti bakterij (bakterij rastejo počasneje v primerjavi s pozitivno kontrolo) in ni zaviranja rasti bakterij (vrednost v mejah variacije pozitivne kontrole).

Slika 2 (AD) kaže napredovanje bolezenskih znamenj na krompirju cv. Desiree inokuliranih z bakterijo R. solanacearum in različnih ekstrakti gob 1. do 14. dan po inokulaciji. Simptomi so bili ocenjeni s številčnimi ocenami po VVinsteadu in Kelmanu (1952): 0 (brez simptomov), 1 (en list ovenel), 2 (2-3 listi oveneli), 3 (vsi listi razen vrha rastline oveneli) 4 (vsi listi in vrh rastline ovenel), 5 (smrt rastline). Slika 2A prikazuje rezultate, pridobljene z ekstraktov iz Suillus variegatus, slika 2B prikazuje dobljene rezultate z ekstraktov iz Tricholoma saponaceum, slika 2C prikazuje dobljene rezultate z ekstraktom iz Clitocybe geotropa in slika 2D prikazuje rezultate za pozitivno kontrolo.

Slika 3 (AF) kaže napredovanje simptomov na paradižniku cv. Moneymaker inokuliranih z bakterijo R. solanacearum in različnih ekstrakti gob 3-14 dni po inokulaciji . Simptomi so bili ocenjeni s številčnimi ocenami po VVinsteadu in Kelmanu (1952): 0 (brez simptomov), 1 (en list ovenel), 2 (2-3 listi oveneli), 3 (vsi listi razen vrha rastline oveneli) 4 (vsi listi in vrh rastline ovenel), 5 (smrt rastline). Slika 3A prikazuje dobljene rezultate z ekstraktom iz Amanita phalloides·, slika 3B prikazuje dobljene rezultate z ekstraktom iz Bovista nigrescens·, slika 3C prikazuje dobljene rezultate z ekstraktom iz Suillus variegatus·, slika 3D prikazuje dobljene rezultate z ekstraktom iz Tricholoma saponaceum·, slika 3E kažejo rezultati, pridobljeni z ekstraktom iz Clitocybe geotropa in sliki 3F prikazuje rezultate za pozitivno kontrolo.

Slika 4 prikazuje rezultate SDS-PAGE in Blue-Native PAGE za ekstrakt C. geotropa in nekaterih njegovih frakcij. Izolacijo protibakterijskega proteina iz C. geotropa ekstrakta izvedemo z gelsko in ionskih izmenjevalno kromatografijo. Frakcij analizirane z SDS-PAGE (levo) in Blue-Native PAGE (desno): stolpec 1, standard, stolpec 2, ekstrakt C. geotropa·, stolpec 3, frakcije 71-85 ionsko izmenjevalna kromatografija na DEAE-Sephacel™ pri pH 6,5: stolpec 4, frakcija 18 po gelski kromatografiji na Sephacryl S-200; stolpec 5, frakcije 86-105 ionsko izmenjevalna kromatografija na DEAE-Sephacel™ pri pH 6,5.

Slika 5 (AC) prikazuje rezultate SDS-PAGE in Blue-Native PAGE za Amanita phalloides. Protibakterijski protein izoliramo iz ekstrakta A. phalloides z uporabo gelske kromatografije. Slika 5Α): gelska kromatografija in analiza protibakterijske aktivnosti v frakcijah. Slika 5Β): SDS-PAGE in 5C); izoelektrično fokusiranje in analiza frakcij iz gelske kromatografije (A). Števila nad stolpci nad (B) in (C) ustrezajo frakcijam v (A); Stolpec M označuje molekulska masa markerja v (B) in pl markerja v (C).

Μ • · • ·

Slika 6 (ΑΒ) prikazuje rezultate analize specifičnosti L-amino oksidazne aktivnosti (LAO) proteinskih frakcij Amanita phalloides (6A) in Clitocybe geotropa (6B). Specifičnost LAO aktivnosti proteinskih frakcijij A. phalloides (zgornja slika) in C. geotropa (spodnja slika). Frakcije smo redčili 5-krat. Redčitev je bila določena kot najprimernejša v prejšnjih eksperimentih (ni prikazano). V test so bile vključene vse L-amino kisline in urea za negativno kontrolo. pH pufra je bil 7,5 in teste smo izvedli pri 37 ° C. Rezultati za A. phalloides so prikazani po 30 minutah inkubacije in C. geotropa po 60 minutah inkubacije. Vrednosti smo normalizirali na Leu, ki je optimalen substrat za obe oksidazi.

Slika 7 (AB) kaže koncentracijo R. solanacearum v tkivu paradižnika pri različnih stopnjah simptomov (0-5). Bakterijski koncentracija je bila določena v prvem (A) in v drugem nodiju (B).

Claims (23)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Metoda za zmanjšanje, izničenje, ali preprečevanje okužbe rastlin ali površin s patogenimi bakterijami ali za zmanjšanje ali preprečevanje bakterijskega venenja z aplikacijo na rastlino, v okolico rastline, vodo, ali zemljo, ali na površino, kompozicije, ki vsebuje proteinski ekstrakti iz Basidiomycet izbranih iz Amanita phalloides, Amanita muscaria, Amanita virosa, Boletus luridiformis, Clitocybe geotropa, Gomphidius glutinosus, Tricholoma saponaceum, Hypholoma sp., Agaricus moelleri, Albatrellus ovinus, Bovista nigrescens, Suillus vahegatus, Tricholoma ustale ali njihove proteinske frakcije ali njihovega izoliranega proteina.
2. 2. Metoda zahtevka 1 kjer je patogena bakterija izbrana iz enega izmed naslednjih rodov: Ralstonia, Ervvinia, Dickeya, Pectobacterium, Xanthomonas, Agrobacterium, Enterobacter in Escherichia.
3. 3. Metoda zahtevka 2, pri čemer je patogena bakterija izbrana med Ralstonia solanacearum, Ralstonia mannitolilytica, Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, Dickeya dadantii, Pectobacterium subsp. atrospecticum, Ervvinia amylovora,Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Xanthomonas arboricola pv. pruni, Enterobacter sp.
4. 4. Metoda enega od prejšnjih zahtevkov, pri čemer je patogena bakterija Ralstonia solanacearum, Ralstonia mannitolilytica or Escherichia coli.
5. 5. Metoda enega od prejšnjih zahtevkov, pri čemer je rastlina poljščina, predvsem rastlina iz družine Solanaceae or Urticaceae.
6. 6. Metoda enega od prejšnjih zahtevkov, pri čemer je rastlina rastlina iz rodu Solanum.
7. 7. Metoda zahtevka 5, pri čemer je rastlina izbrana izmed S. Iycopersicum, S. tuberosum, S. melongena,
8. 8. Metoda zahtevka 5, pri čemer je rastlina Solanum dulcamara, Solanum nigrum, ali Urtica dioica.
9. 9. Metoda enega od prejšnjih zahtevkov, pri čemer se ekstrakt pridobi iz plodnih teles Basidiomycetes in/ali iz micelija Basidiomycetes.
10. 10. Metoda enega od prejšnjih zahtevkov, pri čemer se uporabi proteinska frakcija ali proteinski ekstrakt.
11. 11. Metoda enega od prejšnjih zahtevkov, pri čemer proteinska frakcija vsebuje vsaj L-aminokislinsko oksidazo (LAO).
12. 12. Metoda enega od prejšnjih zahtevkov, pri čemer se kompozicija nanese na trdno površino okuženo s patogenimi bakterijami z namenom zmanjšanja ali eliminacije bakterij ali na neokuženo trdno površino z namenom preprečitve okužbe.
13. 13. Metoda enega od prejšnjih zahtevkov, pri čemer se kompozicija nanese v zemljo in/ali namakalno vodo.
14. 14. Metoda za pridobivanje proteinskih ekstraktov z nabiranjem plodnih teles in ali micelijem gliv debla Basidiomycota, zamrzovanje materiala pri temperature med -20°C in -80°C, mletje materiala, ločevanje tekočih in trdnih delcev, pridobitev tekočine kot proteinski ekstrakt.
15. 15. Metoda trditve 14, pri čemer je proteinski ekstrakt ali proteinska frakcija obdelana z dializo in/ali korakom sušenja.
16. 16. Metoda trditev 14 ali 15, pri čemer je naslednji korak, da se proteinski ekstrakt dodatno čisti z namenom pridobitve proteinske frakcije.
17. 17. Kompozicija za zaščito rastlin, ki vsebuje proteinski ekstrakt iz plonih teles in/ali micelija Basidiomicet izbranih iz Amanita phalloides, Amanita muscaria, Amanita virosa, Boletus luridiformis, Clitocybe geotropa, Gomphidius glutinosus, Tricholoma saponaceum, Hypholoma sp., Agaricus moelleri, Albatrellus ovinus, Bovista nigrescens, Suillus variegatus, and Tricholoma ustale ali njihove proteinske frakcije ali biološko aktivnega protein, kot je na primer L-aminokislinska oksidaza ali kot dodatna možnost tudi vsaj en kmetijsko ali vrtnarsko sprejemljivo pomožno snov, podaljševalec, topilo, nosilec, polnilo in/ali adjuvans.
18. 18. Kompozicija glede na trditev 17, pri čemer ekstrakt vsebuje L-aminokislinsko oksidazo.
19. 19. Kompozicija glede na trditev 17, pri čemer ekstrakt vsebuje L vsebuje Laminokislinsko oksidazo izolirano iz Clitocybe geotropa or A. phalloides.
20. 20. Kompozicija glede na trditev 17 ali 18, ki vsebuje enega ali več biološko aktivnih agensov, na primer herbicida, pesticide, fungicida, vzpodbujevalca rasti rastlin ali gnojilo.
21. 21. Proteinski ekstrakt iz Basidiomycetes pridobljen z metodo enega izmed zahtevkov 14 to 16.
22. 22. Metoda enega izmed zahtevkov 1 do 11 pri čemer je kompozicija za nanos, kompozicija glede na enega izmed zahtevkov 17 do 20.
23. 23. Uporaba kompozicije enega izmed zahtevkov 17 do 21 za izničenje, zmanjšanje ali preprečevanje okužbe z Ralstonia solanacearum.

    co