WO2014184410A1 - Cepa de lactobacillus plantarum para el control del fuego bacteriano - Google Patents

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WO2014184410A1
WO2014184410A1 PCT/ES2014/070394 ES2014070394W WO2014184410A1 WO 2014184410 A1 WO2014184410 A1 WO 2014184410A1 ES 2014070394 W ES2014070394 W ES 2014070394W WO 2014184410 A1 WO2014184410 A1 WO 2014184410A1
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lactobacillus plantarum
strain
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strains
plantarum
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PCT/ES2014/070394
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Emilio MONTESINOS SEGUÍ
Anna Bonaterra Carreras
Gemma ROSELLÓ PRADOS
Jesús FRANCÉS ORTEGA
Laura MONTESINOS BARREDA
Esther BADOSA ROMAÑO
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Universitat De Girona
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/853—Lactobacillus
    • Y10S435/857—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to the field of phytosanitary products, specifically a new strain of Lactobacillus plantarum and its use in the biological control of bacterial fire in pome fruit trees and ornamental plants.
  • IPM integrated pest management
  • Bacterial fire control is carried out by treating plants with antibiotics (for example, streptomycin or tetracycline) or by copper-derived compounds (Bordeaux broth, oxychloride, oxide or copper hydroxide).
  • antibiotics for example, streptomycin or tetracycline
  • copper-derived compounds Bodeaux broth, oxychloride, oxide or copper hydroxide.
  • the efficacy of antibiotic treatments in the control of bacterial fire is limited by the development of plasmid resistance in E. amylovora.
  • cupric compounds have a negative environmental impact due to their toxicity and accumulation in the environment.
  • the new legislative framework for phytosanitary products in the European Union regulated by Directive 2009/128 / EC and Regulation (EC) 1 107/2009 of the European Parliament and of the Council on the sustainable use and marketing of pesticides has as its main objective the reduction of the risk of the use of phytosanitary products through an integrated management of pests and diseases, and the protection of the environment,
  • pesticide products for the biological control of bacterial fire that include in their active substances strains of various bacteria such as Pseudomonas fluorescens A506, Pantoea vagans C9-1, P. agglomerans E325, P. agglomerans P10c, Bacillus subtilis QST713, and B. subtilis BD170 (Johnson, K. and Stockwell, VO, "Management of fire blight: a case study in microbial ecology", Annu. Rev. Phvtopathol. 1998, vol. 36, pp. 227-248).
  • strains of various bacteria such as Pseudomonas fluorescens A506, Pantoea vagans C9-1, P. agglomerans E325, P. agglomerans P10c, Bacillus subtilis QST713, and B. subtilis BD170 (Johnson, K. and Stockwell, VO, "Management of fire blight: a case study in microbial ecology", Annu
  • pantokines production of secondary metabolites such as pantokines or
  • cycloolipopeptides examples of these biopesticides are Pantoea vagans C9-1, P. agglomerans E325, P. agglomerans P10c, Bacillus subtilis QST713, and B. subtilis BD170.
  • these secondary metabolites have some toxicity (Ongena M, et al, "Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol", Trends Microbiol 2008, vol. 16, pp. 15- 125).
  • a second aspect is related to biosecurity, which is taken into account by the authorities responsible for the approval of products for human consumption, including phytosanite products (EPA in the USA, EFSA in Europe), specifically in relation to the possible opportunistic or non-opportunistic pathogenicity of some bacterial species such as Pseudomonas
  • the industrial preparation of formulations involves the processing of the cultures obtained by fermentation, to obtain long-lasting dehydrated products.
  • Such processes require drying stages that significantly affect the viability of microorganisms, limiting the process performance, especially in Gram-negative bacteria such as Pseudomonas and Pantoea, which are more sensitive to thermal and dehydration treatments than Gram-positive ones.
  • the inventors have isolated a new strain of lactic acid bacteria (BAL) that is very efficient in controlling bacterial fire and overcomes the limitations mentioned above.
  • BAL lactic acid bacteria
  • the bacterium of the invention is a strain belonging to the species Lactobacillus plantarum that has been isolated from plants from crop fields and natural environments of Mediterranean climate.
  • the invention relates to the strain of Lactobacillus plantarum TC92 or mutants thereof.
  • the strain Lactobacillus plantarum TC92 of the invention isolated from tomato plants of the Girona region (Catalonia) was deposited by the applicant (University of Girona) according to the Budapest Treaty on 13.03.2013 in the Spanish Type Culture Collection (CECT), located in the Pare Cientific Universitat de Valencia, Building 3 CUE. Professor Agust ⁇ n Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia), Spain.
  • the Lactobacillus plantarum strain was deposited with the identification reference TC92 and received the accession number CECT 8297 after the International Deposit Authority declared the strain viable.
  • the invention also relates to both Lactobacillus plantarum TC92 strains. "Mutants" are understood to mean bacteria that are obtained using the L.
  • the mutants have antagonistic activity against at least one other phytopathogenic bacteria such as Pseudomonas syringae, and other type bacteria such as E. coli, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis.
  • phytopathogenic bacteria such as Pseudomonas syringae
  • other type bacteria such as E. coli, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis.
  • the presence of genes related to the synthesis of plantahcinas can be determined by pairs of primers defined by the sequences SEQ ID NO: 3-26 as described in Example 1.
  • the antagonistic activity can be determined as described in Example 2.
  • the ability to colonizing and surviving in plants of the Rosaceae family can be determined as described in Example 3.
  • the ability to inhibit E. amyiovora infections can be determined as described in Examples 4 and 5.
  • strain of the invention refers not only to the strain L. plantarum TC92, but also to mutants thereof.
  • the strain of the invention has several advantages that make it especially suitable for use in integrated pest control.
  • integrated pest control (or “integrated pest management”) has the usual meaning in the field of agronomy, where it is understood as a strategy that uses a wide variety of complementary methods: physical, mechanical , chemical, biological, genetic, legal and cultural for pest control. These methods are applied in three stages: prevention, observation and application. It is an ecological method that aims to reduce or eliminate the use of chemical synthesis pesticides and minimize the impact on the environment. There is also talk of ecological or biological control of pests. Thus, in the present invention the terms “pest control”, “biological pest control” are used interchangeably and refer to the integrated pest control.
  • BALs in general, and the species Lactobacillus plantarum in particular, are safe and suitable for use in human consumption. Consequently, the strain of the invention is suitable for use in agriculture.
  • BALs are considered as GRAS by the FDA in the United States and as QPS by EFSA in the European Union.
  • the strain of the invention is highly effective in preventing bacterial fire caused by bacteria E.
  • the invention relates to the use of the strain
  • Lactobacillus plantarum TC92 as a pesticide in plants.
  • the term "pesticide” is understood with its usual meaning in the field of agronomy as a product intended to kill, repel, regulate or interrupt the growth of living beings considered pests. It is clear that, due to the nature of the Lactobacillus plantarum TC92 strain, in the present invention it is understood that “pesticide” is a biological or ecological pesticide, also called a biopesticide. In the scope of the present invention the term “pesticide” would have the same meaning as the term “phytosanitary”.
  • the strain Lactobacillus plantarum TC92 is used for the control of bacterial fire in plants of the Rosaceae family.
  • the strain of the invention is used in the control of bacterial fire in fruit and ornamental plants,
  • pear trees preferably pear trees, apple trees, quinces, medlars, fire thorns, serbals, mostajos, acerolos, guillomos, albar thorns and durillos.
  • the high antagonistic activity of the strain of the invention is partly a consequence of the production of peptide and non-peptide compounds that inhibit the growth of pathogenic bacteria, among which is E. amyiovora.
  • E. amyiovora One of these compounds is a very active plantaricin encoded by the plnEF gene.
  • many strains of L plantarum contain the plnEF gene, not all of them show antagonistic activity against E. amyiovora.
  • Example 1 it is shown that many of the L plantarum plnEF + strains (which possess the synthesis gene of the plantaricin EF), have no relevant antagonistic activity against E. amyiovora or against other bacteria. Instead, in FIG. 1 it can be seen that the strain of L.
  • TC92 plantarum of the invention exhibits a prominent spectrum of antagonism against E amyiovora, in addition to other bacteria. Said surprising antagonistic effect is also reflected in Examples 5 and 6, where the effectiveness of the in vivo strains to inhibit E amyiovora infections in plants of the Rosaceae family is demonstrated.
  • Example 1 it is also shown that the strain of the invention has the ability to produce other type of plantaricinas besides the one that codifies the gene plnEF, like those encoded by the genes plnJ, plnK, plnM, plnN, plnO, plnP, and plnl.
  • the strain of the invention has a high capacity to colonize and survive in plant organs to protect against bacterial fire. This amazing ecological aptitude is very important for the biological control of the pest.
  • another aspect of the invention relates to a method for obtaining cells of the strain of the invention comprising: (i) inoculating the strain of the invention in an appropriate culture medium, (i) subjecting the culture medium inoculated from step (i) under conditions conducive to the growth of the strain of the invention until reaching a cell concentration greater than 1 x 1 0 * 9 CFU / ml, (iii) separating the cells from the culture medium, and (iv) collect the cells derived from step (iii).
  • This procedure is suitable for obtaining the strain of the invention with good viability and maintaining the advantageous properties for use as a pesticide in plants.
  • the strain of the invention can be inoculated in the medium at a final concentration between 1 and 5%.
  • the culture to be inoculated is in exponential growth phase.
  • Culture media suitable for the growth of the strain of the invention are synthetic media, such as MRS (from Man, Rogosa and Sharpe), SL (selective lactobacillus) and APT (all purpose medium), plant media such as molasses (for example of sugarcane, beet) or means of animal origin such as dairy by-products (whey).
  • Suitable conditions for the growth of the strain are temperatures between 25 and 35 ° C, pH between 5 and 7, and oxygen concentration between 15 and 30%.
  • the growth of the strain of the invention preferably occurs under stirring. The cell growth will slow when reaching, preferably, a
  • Example 7 An example of the detailed method of obtaining cells of the strain of the invention is reflected in Example 7.
  • the process for obtaining cells of the strain of the invention comprises carrying out a step (v), after step (iv), where the cells are subjected to dehydration conditions.
  • Dehydration can be carried out by a lyophilization process.
  • the concentrated material can be dehydrated by drying by fluidized bed.
  • Another option is to dehydrate the concentrated material by atomization.
  • another advantageous feature of the strain of the invention is that it exhibits a high resistance to the dehydration processes that are customary in obtaining microorganisms on an industrial scale.
  • an inert osmoprotective ingredient can be added to the cell concentrate.
  • the method for obtaining cells of the strain of the invention comprises resuspending the cells obtained in step (iv) in a suitable buffer to give rise to a suspension.
  • compositions that also include additives suitable for the agricultural use for which they are designed.
  • additional aspects of the invention relate to pesticidal compositions comprising the strain Lactobacillus plantarum TC92 or mutants thereof together with agriculturally acceptable compounds and to the use of these compositions in the control of bacterial fire in plants of the Rosaceae family.
  • the compositions of the invention can be solid (including, for example, concentrated dehydrated bacteria) or liquid (including concentrated suspensions of bacteria).
  • the pesticidal compositions of the invention may contain compounds to improve the adhesion of the strains in the plants to be treated, phyto-fortifying compounds, nutrients, humectants, stabilizers, osmoprotectors, antioxidants, sunscreens,
  • compositions or combinations thereof.
  • Some compounds to improve adhesion are jellies, starches, pectins, alginates and various types of gums such as xanthan. Many of these compounds are also humectants.
  • Sunscreens include dyes such as Congo red.
  • Phyto-fortifiers are compounds that can help crops develop vigor or tolerance against pathogens or adverse environmental conditions such as, for example, analogs of jasmonic acid and certain plant stimulants such as harpinas, chitosans, and laminarins. In particular the compositions
  • Pesticides of the invention contain at least one osmoprotector as an additive.
  • osmoprotective compounds are betaines, amino acids and trehalose.
  • compositions of the invention may also contain an additional pesticidal agent.
  • the composition of the invention comprises at least one additional pesticide.
  • additional pesticidal agents may be non-biological pesticidal agents, for example, antibiotics or copper derivatives.
  • the advantage of compositions containing biological pesticides such as the strain of the invention in combination with traditional pesticides is that the amount of antibiotic or compound derived from copper that comes into contact with the medium is reduced, reducing contamination.
  • biological and traditional pesticides can act in a complementary manner increasing the effectiveness of the
  • compositions for pest control In compositions comprising antibiotics and / or copper compounds it is advantageous to use a Lactobacillus plantarum TC92 mutant resistant to said compounds.
  • Antibiotics can be selected from the group consisting of streptomycin, tetracycline and kasugamycin.
  • the additional pesticidal agent is another bacterial strain effective in controlling bacterial fire.
  • the bacterial strains effective in the control of bacterial fire in addition to the strain of the invention, the Lactobacillus plantarum TC54 strain, or mutants thereof, and the Lactobacillus plantarum PM41 1 strain, or mutants thereof, stand out.
  • the composition of the invention comprises Lactobacillus plantarum TC92, Lactobacillus plantarum TC54 and Lactobacillus plantarum PM41 1 together with additives suitable for agricultural use.
  • Lactobacillus plantarum TC92 Like the Lactobacillus plantarum TC92 strain, the inventors have found that the Lactobacillus plantarum TC54 and Lactobacillus plantarum PM41 1 strains, as well as mutants thereof, have advantageous properties for use as pesticides in the biological control of bacterial fire. These strains are safe, have high activity
  • the present invention also relates to a strain of Lactobacillus plantarum TC54, mutants thereof, and a strain Lactobacillus plantarum PM41 1, mutants thereof.
  • Other aspects refer to the use of each of these strains as pesticides in plants, particularly in the control of bacterial fire in plants of the Rosaceae family.
  • Other aspects relate to pesticidal compositions comprising at least one of these strains together with agriculturally acceptable compounds and the use of these compositions in the control of bacterial fire.
  • the invention also relates to a method for obtaining Lactobacillus plantarum TC54 and / or Lactobacillus plantarum PM41 1 cells analogous to that described for Lactobacillus plantarum TC92.
  • the invention also contemplates mutants derived from strains TC54 and PM41 1. Such mutants must possess the above-mentioned properties for mutants of strain TC92.
  • the invention in another aspect relates to an extract of the strain Lactobacillus plantarum TC92 or a mutant thereof obtainable by means of
  • a method comprising: (i) inoculating the strain Lactobacillus plantarum TC92 or a mutant thereof in an appropriate culture medium, (i) subjecting the culture medium inoculated with the eiapa (i) to conditions conducive to the growth of the strain Lactobacillus plantarum TC92 or a mutant thereof until reaching a cell concentration greater than 1 ⁇ 10 * 9 CFU / ml, (iii) separating the cells from the culinary medium of the eiapa (i), (iv) collecting free excision of cells, and (v) subject the excision of the eiapa (iv) to a concentration process.
  • Culture media, inoculation conditions and growth conditions suitable for the strain of the invention for the extraction of the excision are the same as those described above for the process for obtaining cells from the bacilli age.
  • the growth of the cells will be slowed down in the sionary phase, more preferably after 18-30 hours.
  • suitable concentration processes are dehydration (lyophilization, afomization), filiation,
  • the excitement of The invention can be subjected to a fractionation process to separate the most active fractions.
  • the fractionation comprises a treatment with tncloro acetic acid and / or reverse phase cation exchange chromatography.
  • Extracts of the strain Lactobacillus plantarum TC92 or a mutant thereof can be used directly in the biological control of bacterial fire although, preferably, they will be part of a pesticidal composition together with other agriculturally acceptable compounds. Therefore, additional aspects of the invention provide a pesticidal composition comprising the extract of the invention and agriculturally acceptable compounds, as well as the use of said compositions for the control of bacterial fire.
  • Lactobacillus plantarum PM41 1 and / or its mutants, or of compositions comprising them, are also useful for the control of bacterial fire. Said extracts are obtained analogously to that described for obtaining the extract of strain TC92.
  • the invention relates to a method of biological control of bacterial fire in plants of the Rosaceae family which comprises the treatment of plants with the strain of the invention or a composition comprising said strain and / or extract of the strain of the invention defined above or a composition comprising said extract.
  • FIG. one Dendrogram corresponding to the dissimilarity coefficient of 62 L. plantarum strains positive for plnEF genes, according to their profile of in vitro antagonism in LBP and MRS agar, against Erwinia amylovora (Ea), Escherichia coli (Ec), Pseudomonas syringae (Ps ), Staphylococcus aureus (Sa) and Bacillus subtilis (Bs).
  • the symbols of inhibitory activity for each indicator bacterium mean: ++, inhibition halos greater than 10 mm in both culture media; +, inhibition halos less than 10 mm in both culture media; d, inhibition halos only in a culture medium; -, no inhibition halos are observed.
  • the three main groupings are indicated at the level of dissimilarity of 0.70 (G1, G2, G3), as well as the position of strains TC92, TC54 and PM41 1 in the dendrogram (arrows).
  • FIG. 2 Dendrogram corresponding to the dissimilarity coefficient of 41 strains of L. plantarum that exhibit inhibitory activity against Erwinia amylovora, classified according to the level of inhibition of the culture supernatant (S) and according to the ability to protect against bacterial fire infections in flowers (Fl), fruits (Fr) and pear leaves (H). In the latter case, two experiments were performed.
  • the symbols indicate in the case of the inhibitory activity of crop supernatants (S): +++, intense, ++, moderate, +, light.
  • the symbols indicate in the case of protection against infections: ++, in both experiments significant effects; +, significant effects in an experiment; -, without effect in any of the experiments.
  • the arrow indicates the position of strains TC54, TC92 and PM41 1.
  • FIG. 3 Growth kinetics (solid circles) of Lactobacillus plantarum TC92 and PM41 1 in MRS broth at 25 ° C and evolution of pH (empty circles) and the antimicrobial activity of supernatants against Erwinia amylovora (triangles).
  • X time (hours). And, concentration of viable (Log10 CFU / ml).
  • Z inhibitory activity (arbitrary units).
  • FIG. 4 Multiplication and survival of the Lactobacillus plantarum strains TC54 (solid circles), TC92 (empty circles) and PM41 1 (triangles) in pear and apple blossoms, under conditions of relative humidity (RH) high (90%) and low (fifty%).
  • RH relative humidity
  • A pear, high RH
  • B apple tree, high RH
  • C pear, low HR
  • D apple tree, low HR.
  • X days after inoculation.
  • population level Log10 CFU / flower). The values are the means of three replicates and the error bars represent 95% of the confidence interval of the average.
  • FIG. 5 Effect of treatments with Lactobacillus plantarum strains TC54, TC92 and PM41 1 on the susceptibility to infections by Erwinia amylovora in flowers (A) immature fruits (B) and leaves (C) of Passe Crassane pear tree.
  • the intensity of infections is compared with an untreated control (NT) and with a control treated with the reference antibiotic streptomycin (Str).
  • the values are the means of three replicates and the error bars represent 95% of the confidence interval of the average. The same letters on the bars indicate that the treatments do not differ significantly according to the Tukey test (P ⁇ 0.05). And, intensity of infections (%).
  • FIG. 6 Effect of treatments with Lactobacillus plantarum strains TC54, TC92 and PM41 1 on the intensity of bacterial fire infections in Conference pear plants.
  • the intensity of the infections was determined one week after the inoculation of Erwinia amylovora.
  • Two independent experiments (A, B) were performed. The results are compared with an untreated control (NT) and with a control treated with the antibiotic streptomycin (Str). The values are the means of three replicates and the error bars represent 95% of the confidence interval of the average. The same letters on the bars indicate that the treatments do not differ significantly according to the Tukey test (P ⁇ 0.05). And, intensity of infections (%).
  • FIGURE 7 Effect of treatments with Lactobacillus plantarum TC92C and PM41 1 C cells and with 1/10 diluted culture extracts (TC92S and
  • FIGURE 8 Polymorphic DNA random amplification pattern (RAPD) for different primers: P3, P4, P7, M13, Inv-A, 512Fb and XD9.
  • M 1 Kb Plus ladder (Invitrogen); 1, L. plantarum TC54; 2, L. plantarum TC92; 3, L. plantarum PM41 1; 4, L. plantarum CECT 223; 5, L. plantarum ATCC 8014; 6, L. plantarum CECT 4528; 7, L. plantarum CECT 5785; 8, L. plantarum LNG921 1 (WCSF1).
  • RAPD Polymorphic DNA random amplification pattern
  • Example 1 Isolation and characterization of strains Lactobacillus plantarum TC92, Lactobacillus plantarum TC54 and Lactobacillus plantarum PM41 1
  • the conditions were 4 min at 95 ° C, 35 cycles of 1 min at 94 ° C, 1 min at 53 ° C, and 1 min at 72 ° C, with a final extension stage of 10 min at 72 ° C followed from a stop at 4 ° C.
  • the amplified products were separated by 1.5% agarose gel electrophoresis in 1 X Tris-acetate EDTA (TAE) for 45 min at 90 V and visualized with Sybr Safe (SYBR®Safe Invitrogen Life Technologies, CA).
  • TAE 1 X Tris-acetate EDTA
  • SYBR®Safe Invitrogen Life Technologies, CA Sybr Safe
  • the 16S rDNA gene (regions V1 to V3) was partially sequenced.
  • a PCR was carried out on the DNA extracted from the cultures with primers 27f (SEQ ID NO: 1) and 1492r (SEQ ID NO: 2) under standard conditions (La ⁇ e, DJ, "Nucleic acid techniques in bacterial systematics ", Stackebrandt, E., and Goodfellow, M., eds., John Wiley and Sons, New York, NY, 1991, pp. 1 15-175).
  • the PCR products were purified, conveniently concentrated and sequenced by a 3730XL sequencer (Macrogen, Seoul, Korea).
  • the sequences obtained were analyzed and aligned by BioEdit Sequencing Editor, and the homology determined by the BLAST program in the NCBI database.
  • the sequences of the most representative strains are
  • strain Lactobacillus plantarum TC92 No. JX440375 16S
  • strain Lactobacillus plantarum TC54 No. EU074830.1
  • strain Lactobacillus plantarum TC54 No. EU074830.1
  • the 62 isolates of L plantarum that possessed the plnEF genes were tested for in vitro antimicrobial activity against six indicator bacteria (E. amylovora PMV6076, P. syringae EPS94, L. mesenteroides CM160, E coli ATCC5954, S. aureus ATCC9144 and B EPS2017 subtilis), using the technique of colony replication in lactose-purple bromocresol agar overlay (LBP) and modified MRS (MRS0.2). Growth inhibition halos in the indicators were determined after 48 h at 23 ° C.
  • indicator bacteria E. amylovora PMV6076, P. syringae EPS94, L. mesenteroides CM160, E coli ATCC5954, S. aureus ATCC9144 and B EPS2017 subtilis
  • Inhibition diameter results were normalized and used to perform a hierarchical aggregation analysis using the Jaccard coefficient of dissimilarity with the UPGMA algorithm (NTSYS, Singer, USA). 3 aggregates are observed different depending on the pattern of antibacterial activity at a similarity level of 0.7, with the G2 group being the most active (FIG. 1). The remaining two other groups showed low activity or only against one or two indicator bacteria. Although all strains of L. plantarum plnEF + (which have the plantaricin synthesis gene EF) could be expected to exhibit antagonistic activity against E. amylovora or against other phytopathogenic bacteria, this is not so since 19 strains are not active or they are only slightly.
  • strains TC54, PM41 1 and TC92 Only in group 2, most strains show a broad spectrum of antagonism, especially strains TC54, PM41 1 and TC92. This may be due to the fact that said gene is not expressed in some strains or that the active strains have additional mechanisms that influence their antagonistic capacity against bacteria. It is well known that bacteriocin-producing lactic acid bacteria are very effective against bacteria of the same species and against other Gram positive (such as themselves), but scarcely against Gram negative bacteria. However, some plnEF + strains of the invention, contrary to expectations, have a greater antagonism against E. amylovora and P. syringae (Gram negatives) than against Gram positives (B. subtilis, S. aureus, L. monocytogenes). Surprisingly, none of the strains showed activity against L. mesenteroides CM160.
  • the fruits were injured with a punch (3 wounds per fruit) while the leaves were made a transverse incision in the central nerve. All plant material was inoculated with isolates that showed in vitro antagonistic activity against E amylovora, including strains TC54, TC92 or PM41 1 to 10 * 8 CFU / mL (0.4-1 mL per flower, leaf or fruit) using a
  • micropulverizer The material was incubated in plastic containers transparent that were arranged in chambers of controlled environment at 25 ° C, high relative humidity (RH) and 16 h light-8 h darkness. After 24 h, the flower hipantios and the wounds of the fruits or leaves were inoculated with a suspension of E. amylovora EPS101 at 10 * 7 CFU / mL. The treated material was incubated in the above conditions for 5 days and the incidence and severity of the disease (infections) was determined. The analysis of the resulting dendrogram according to its antagonistic capacity and infection inhibition reveals that there is a very remarkable diversity among isolates (FIG. 2). The unique nature of strains TC54, TC92 and PM41 1, which are grouped in aggregates in the lower part of the dendrogram, are surprisingly confirmed because they show superior efficacy to the others.
  • plnB genes SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6
  • plnC SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8
  • plnD SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10
  • plnJ SEQ ID NO: 1 1 and SEQ ID NO: 12
  • p / n SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14
  • pin M SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16
  • plnN SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18
  • plnO SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20
  • plnP SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22
  • plnl SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24
  • strains TC92, TC54 and PM41 1 can be differentiated by PCR from other strains by typing said plantaricin synthesis genes, giving a specific positive pattern for all of them. Furthermore, said study confirms that the strains of the invention have the potential to produce other types of bacteriocins, in addition to that encoded by the plnEF gene, such as those encoded by the genes plnJ, plnK, plnM, plnN, plnO, plnP , and pin I.
  • Table 1 A and 1 B Characteristics of the Lactobacillus plantarum strains TC92, PM41 1 and TC54 regarding the presence of genes that are involved in the synthesis of plantaricins, compared to other strains of various origins and reference strains deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT). +, presence; -, absence; s, PCR amplification of less intensity than the positive control; nd, not determined.
  • Said study was carried out by culturing the strains in MRS medium under the conditions described above, DNA extraction, and performing PCRs by specific primers known in the state of the art.
  • the following primers were used: SEQ ID NO: 27 (P3, Tailliez P, et al, "Molecular diversity and relationships with Lactococcus lactis as revealead by rendomly amplified polymorphic DNA (RAPD)". System. Appl. Microbiol., 1998, vol .21, pp. 530-538), SEQ ID NO: 28 (P4), SEQ ID NO: 29 (P7) and SEQ ID NO: 30 (M13) (D ⁇ Cagnio R, et al.
  • PCR mix consisted of a total volume of 50 ⁇ containing 1x buffer, 200 ⁇ dNTPs, 1.5 mM MgCl2, 0.5 ⁇ primer and 3.75 U taq polymerase (Invitrogen) and 4 ⁇ DNA (25 ng / ⁇ ).
  • the conditions for amplification were for primer SEQ ID NO: 30 M13 of (i) denaturation at 94 ° C for 3 min, (i) 35 cycles of denaturation at 94 ° C for 1 min, 40 ° C for 20 s , with a ramp up to 72 ° C at 0.6 ° C / if (i ⁇ ) a final extension at 72 ° C for 2 min.
  • primers SEQ ID NO: 27 P3 and SEQ ID NO: 28 P4 the conditions were (i) denaturation at 94 ° C for 3 min, (i) 30 cycles of denaturation at 94 ° C for 1 min, 36 ° C for 2 min and an extension at 72 ° C for 2 min.
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • Strains TC92 and TC54 although they are not differentiated according to their pattern of RAPDs, can be differentiated according to their antagonistic activity against different pathogens (see FIG 1) and, in particular, by their inhibitory activity against Erwinia amylovora (FIG 2). As can be seen in the examples that follow, these strains also showed differences in their ability to colonize and survive in apple and pear blossoms (see FIG 4) and their ability to inhibit bacterial fire infections (see FIG 5).
  • Example 2 Study of the antagonistic activity of L. plantarum extracts
  • the pH and the antibacterial activity of the extract was determined as indicated. It is observed that the cultures grow exponentially until 20h after inoculation in fresh medium, subsequently entering the stationary phase, reaching very high cell concentrations of 5 x 10 * 9 CFU / mL.
  • the inhibitory activity of the extracts begins with the stationary phase and increases with the decrease in pH. However, once it stabilizes at acidic values (pH 3.6-4.0) at 8 pm, the antibacterial activity against E.
  • amyiovora continues to increase up to 60-80 h from the beginning of the crop.
  • the nature of the antibacterial activity of the crop extracts was also determined by studying the effect of: (1) neutralizing the extracts to see if they were inhibitory acids, (2) by heat treatment to denature possible active proteins, and ( 3) with protease treatment to confirm its peptide nature.
  • the extracts were adjusted to values of 2, 3, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 7 and 8.
  • the concentrated filtrates were subjected to 50, 70, 90 or 121 ° C for 30 min.
  • protease susceptibility a proteinase K digestion was performed.
  • the inhibitory activity assay was performed with the ELISA microwell system by adding the treated crude extracts to cultures of E.
  • amyiovora compounds of acidic nature and compounds of thermostable peptide nature.
  • amyiovora 6076 and E coli ATCC1 1775 It was concluded that an important part of the activity against both bacteria is due to products of a peptide nature, a group of these are not retained in the chromatographic column, while another is retained and eluted with methanol.
  • Example 3 Colonization of plant organs by strains of L.
  • strains TC92, TC54 and PM41 1 were studied. This property is very important to protect the main routes of entry of E. amylovora infections in plants.
  • the plates were incubated at 25 ° C for 48 h and the colonies were counted by an automatic counting system.
  • the population dynamics of the three strains were similar in both apple and pear trees. Significant differences in population levels were observed between conditions of humidity. Under high HR population levels increased in the three strains 10 times two days after inoculation, maintaining levels
  • Example 4 Inhibitory capacity of bacterial fire infections in plant organs.
  • the intensity of the infections was determined according to: 0, without symptoms; 1, presence of exudate in the wound; 2, presence of exudate and necrosis around the wound; and 3, progression of necrosis through the leaf surface.
  • the severity was normalized to the maximum value obtained in the experiment and was expressed in relative percentage (0-100).
  • the inhibitory effect of bacterial fire in the 3 strains was significant compared to untreated controls, and in general, did not differ significantly from the reference antibiotic (FIG. 5).
  • the TC92 and TC54 strains differed significantly from the untreated control in all the organs studied, while PM41 1 was only effective in leaves and flowers. The average efficiencies were between 67 and 78% in leaves, and 45-75% in flowers.
  • Example 5 Preventive treatment of bacterial fire in fruit plants using L. plantarum strains TC92, TC54 and PM41 1.
  • Example 6 Effect of the extracts of L. plantarum TC92 and L. plantarum PM41 1 on the inhibition of bacterial fire infections in leaves.
  • Example 3 To demonstrate the protective capabilities of extracts from strains TC92, and PM41 1, an infection inhibition test was performed on Conference pear leaves. For each strain a "bat" culture was prepared as in Example 3. The cell suspensions were obtained from a sample taken at 20 h of culture and the concentration was adjusted to 1 x 10 * 8 CFU / mL as in example 3. The crop extracts were prepared as indicated in Example 2 from a culture sample taken at 70 h in which the antibacterial activity was maximal. The plant material was obtained from a commercial plantation near Girona, where no bacterial fire had been detected in the past.
  • the young leaves were disinfected with sodium hypochlorite, then a transverse incision was made in the main nerve, and they were inoculated with cell suspensions of strains TC92 and PM41 1 to 10 * 8 CFU / ml by immersion in the suspension or with extracts of the same strains diluted to 1/10.
  • the leaves were incubated in a 25 ° C controlled environment chamber and relative humidity control, with 16 h of fluorescent light and 8 h of darkness, and after 24 h, they were inoculated with 10 ⁇ of an E suspension Amylovora EPS101 at 10 * 7 CFU / mL.
  • the inoculated material was incubated under the conditions described above and the intensity of the infections was determined at 6 and 9 days. Design
  • the loss of activity of the extracts over time could be minimized by an adequate formulation of the extract, for example, by adding compounds suitable for agricultural use that favor the preservation of antimicrobial substances or by increasing the concentration of the extract.
  • Example 7 Industrial scale production and preparation of formulations to extend the shelf life of L. plantarum TC92.
  • the optimal fermentation conditions can be used, which are detailed below by means of a CSTR-type bioreactor in liquid medium, although fermentation techniques based on solid medium can also be used, all methods Standard used in the microbiological industry.
  • a 5-liter Braun Biostat fermenter was used in MRS medium at 30 ° C, pH 6.0, p0 2 20% with ramp, and stirring at 100 rpm.
  • An exponential culture of strain L. plantarum TC92 was inoculated at 1% and the operational parameters of the bioreactor were monitored, ending the stationary phase growth at 12 h, achieving cell concentrations between 5-8 x 10 * 9 CFU / ml .
  • the culture was then centrifuged continuously at 8000 rpm and 10 l / h and the cells were collected aseptically by an SA-1 Westfalia-Separator centrifuge.
  • the biomass was concentrated about 10-12 times, being resuspended in phosphate buffer, obtaining about 0.5 liters of concentrate 4-8 x 10 * 10 CFU / ml.
  • an inert osmoprotective ingredient (15% lactose) was added to the concentrate and it was dehydrated in a Virtis Lyophilizer under standard conditions for 36 h, obtaining about 40-50 g of dry weight (15% active matter), with an activity of 2 -4x10 * 1 1 CFU / g ps
  • a product is obtained with a cell viability close to 100%, stable and easy to store and handle, which at operating doses of 10 8 CFU / ml allows to prepare about 100 liters of product ready to be applied in crop plants to be protected.
  • the material was packaged in vacuum-sealed bags, which, stored at 4 ° C, maintain their useful life for more than a year.

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Abstract

La presente invención se refiere a la cepa Lactobacillus plantarum TC92, así como mutantes de la misma, y al uso de dicha cepa como plaguicida en el control del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae. Aspectos adicionales de la invención se refieren a métodos de obtención de la cepa L. plantarum TC92, composiciones plaguicidas que comprenden dicha cepa y un extracto de L. plantarum TC92con actividad antagonista frente a E. amylovora que es útil para el control del fuego bacteriano. Por último la invención se refiere a un método de control biológico del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae que comprende tratar estas plantas con la cepa L. plantarum TC92o el extracto de L. plantarum TC92.

Description

Cepa de Lactobacillus plantarum para el control del fuego bacteriano
La presente invención se refiere al campo de los fitosanitarios, concretamente a una nueva cepa de Lactobacillus plantarum y a su uso en el control biológico del fuego bacteriano en frutales de pepita y plantas ornamentales.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Entre el 38 y el 42% de las pérdidas de producción de los cultivos a nivel mundial se deben a agentes bióticos (plagas, enfermedades y malas hierbas). Para controlar dicha problemática, la agricultura convencional utiliza productos fitosanitarios (insecticidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas), obtenidos mediante síntesis química. Sin embargo, el impacto de un uso masivo de productos fitosanitarios sintéticos en el medio ambiente y en la salud de los consumidores ha ocasionado una reorientación de la protección de los cultivos hacia un manejo integrado de plagas (MIP), que supone una estrategia que usa una gran variedad de métodos complementarios: físicos, mecánicos, químicos, biológicos, genéticos, legales y culturales, para el control de las plagas. El MIP aspira a reducir o eliminar el uso de fitosanitarios sintéticos y de minimizar el impacto al medio ambiente.
En el campo de las enfermedades de las plantas, el fuego bacteriano de los frutales de pepita y plantas ornamentales afines, causado por Erwinia amylovora, es una de las enfermedades más antiguas, distribuida por todo el mundo y que causa grandes pérdidas económicas. El control del fuego bacteriano se realiza mediante el tratamiento de las plantas con antibióticos (por ejemplo, estreptomicina o tetraciclina) o bien mediante compuestos derivados de cobre (caldo bordelés, oxicloruro, óxido o hidróxido de cobre). Sin embargo, en muchos países, en concreto en la Unión Europea, el uso de antibióticos en agricultura no está autorizado. Además, la eficacia de los tratamientos con antibióticos en el control del fuego bacteriano está limitada por el desarrollo en E. amylovora de resistencia plasmídica. Por otro lado, los compuestos cúpricos presentan un impacto ambiental negativo debido a su toxicidad y acumulación en el medio ambiente.
En este sentido, el nuevo marco legislativo de los productos fitosanitarios en la Unión Europea regulado por la directiva 2009/128/CE y el Reglamento (CE) 1 107/2009 del Parlamento Europeo y del Consejo relativos al uso sostenible y comercialización de los plaguicidas, tiene como objetivo principal la reducción del riesgo del uso de productos fitosanitarios a través de una gestión integrada de plagas y enfermedades, y de la protección del medio ambiente,
estableciendo que los medios de lucha fitosanitaria deberán ser
preferentemente biológicos y físicos.
Por lo tanto queda claro que existe una presión legislativa y una tendencia en agricultura hacia el uso de medios de protección no basados en plaguicidas de síntesis química. Así, en las nuevas técnicas de protección de plantas se prefiere el uso de productos biológicos, mayoritariamente microorganismos y extractos naturales juegan un papel importante. En el caso del control de las enfermedades causadas por bacterias, como el fuego bacteriano de los frutales y plantas ornamentales, la escasa disponibilidad de productos químicos y sus limitaciones de uso ha estimulado el desarrollo de agentes bioplaguicidas de control biológico como ingredientes activos.
Actualmente a nivel mundial se dispone de algunos productos plaguicidas para el control biológico del fuego bacteriano que incluyen en sus materias activas cepas de diversas bacterias como Pseudomonas fluorescens A506, Pantoea vagans C9-1 , P. agglomerans E325, P. agglomerans P10c, Bacillus subtilis QST713, y B. subtilis BD170 (Johnson, K. y Stockwell, V.O., "Management of fire blight: a case study in microbial ecology", Annu. Rev. Phvtopathol. 1998, vol. 36, pp. 227-248). En Europa sólo se ha autorizado hasta el momento la cepa de Bacillus subtilis QST713 (Bonaterra A et al, "Prospects and limitations of microbial biopesticides for control of bacterial and fungal pomefruit tree diseases", Trees 2012, vol. 26, pp. 215-226).
Sin embargo, la tecnología actual de control del fuego bacteriano basada en bioplaguicidas microbianos no está exenta de problemas relacionados con (1 ) la producción de metabolitos secundarios por parte de la mayoría de las cepas, (2) dudas respecto a su bioseguridad, (3) falta de una adecuada aptitud ecológica para la colonización de las plantas, (4) eficacia menor que la de los antibióticos, y (5) dificultades técnicas en la producción de formulados con una vida útil larga, comparable a la de los productos fitosanitarios convencionales. En primer lugar, vahos de los bioplaguicidas descritos para control biológico del fuego bacteriano exhiben un mecanismo de acción consistente en la
producción de metabolitos secundarios como las pantocinas o
ciclolipopéptidos. Ejemplos de estos bioplaguicidas son Pantoea vagans C9-1 , P. agglomerans E325, P. agglomerans P10c, Bacillus subtilis QST713, y B. subtilis BD170. Sin embargo, se ha encontrado que, en algunos casos, estos metabolitos secundarios presentan cierta toxicidad (Ongena M, et al, "Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol", Trends Microbiol 2008, vol. 16, pp.1 15-125).
Un segundo aspecto está relacionado con la bioseguridad, que tienen en cuenta las autoridades responsables de la aprobación de productos de consumo humano, incluyendo productos fitosanita os (EPA en USA, EFSA en Europa), concretamente en relación con la posible patogenicidad oportunista o no oportunista de algunas especies bacterianas como Pseudomonas
fluorescens y Pantoea agglomerans, que han sido citadas como causantes de infecciones y sepsis hospitalarias, consideración que puede ser un obstáculo en la autorización de cepas de estas especies para su uso como agente plaguicida. En la UE, las cepas Pseudomonas fluorescens A506, Pantoea vagans C9-1 , P. agglomerans E325 y P. agglomerans P10c no han sido consideradas como QPS ("Qualified presumption of safety" en inglés, que significa presunción cualificada de seguridad, un término similar al conocido GRAS, "generally recognized as safe", que significa generalmente reconocido como seguro), y por lo tanto no están autorizadas para el control biológico del fuego bacteriano.
En otros casos se tiene evidencia de que la capacidad para colonizar y sobrevivir en los órganos del huésped a proteger no es eficiente, lo que requiere aplicaciones a elevada concentración o formulaciones complejas de dichos agentes para conseguir un efecto significativo de control de la
enfermedad.
Además, aunque se trata de productos biológicos que presentan ventajas sobre otros productos plaguicidas de síntesis, el hecho de tratarse de organismos vivos implica que las condiciones ambientales y del huésped influyen en su actividad biológica, lo que hace que su eficacia sea en general variable y significativamente inferior a la de los antibióticos de referencia.
Finalmente, la preparación industrial de formulados implica el procesamiento de los cultivos obtenidos por fermentación, para obtener productos deshidratados de larga duración. Dichos procesos requieren etapas de secado que afectan significativamente a la viabilidad de los microorganismos, limitando el rendimiento del proceso, en especial en bacterias Gram negativas como Pseudomonas y Pantoea, las cuales son más sensibles a los tratamientos térmicos y de deshidratación que las Gram positivas.
En vista de las limitaciones mencionadas, queda claro que es deseable proporcionar medios más eficientes para el control biológico del fuego bacteriano en árboles frutales y plantas ornamentales.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han aislado una nueva cepa de bacteria del ácido láctico (BAL) que es muy eficiente en el control del fuego bacteriano y que supera las limitaciones anteriormente citadas. La bacteria de la invención es una cepa perteneciente a la especie Lactobacillus plantarum que ha sido aislada a partir de plantas procedentes de campos de cultivos y entornos naturales de clima mediterráneo.
Así, en un primer aspecto la invención se refiere a la cepa de Lactobacillus plantarum TC92 o m ufantes de la misma.
La cepa Lactobacillus plantarum TC92 de la invención, aislada de plantas de tomate de la región de Girona (Cataluña) fue depositada por el solicitante (Universitat de Girona) de acuerdo con el Tratado de Budapest el 13.03.2013 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), situada en el Pare Cientific Universitat de Valencia, Edificio 3 CUE. Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia), España. La cepa de Lactobacillus plantarum fue depositada con la referencia de identificación TC92 y recibió el número de acceso CECT 8297 después de que la Autoridad Internacional de Depósito declarara como viable dicha cepa. La invención también se refiere a m ufantes de las cepas Lactobacillus plantarum TC92. Se entiende por "mutantes" bacterias que se obtienen utilizando como producto de partida la cepa L. plantarum TC92 de la invención y que se caracterizan por mantener las propiedades de dicha cepa depositada, en cuanto a la capacidad antagonista frente a bacterias fitopatógenas, biosegundad y aptitud ecológica en la colonización de las plantas. Un "muíante" L. plantarum TC92 se entiende también según la presente invención como una "vanante" de L. plantarum TC92. El experto en la materia entenderá que usando la cepa de la invención como material de partida es posible obtener de forma rutinaria, por ejemplo mediante mutagénesis o mutación espontánea dirigida, mutantes que conserven las características y ventajas pertinentes descritas en la presente memoria. Los métodos para obtener mutantes de una cepa bacteriana concreta son conocidos en la técnica. Un ejemplo puede encontrarse en (Sambrook, J. y Russell, D.W. "Molecular cloning: a laboratory Manual", Capítulo 13, "Mutagénesis", Cold Spring Harbor, 3a Ed., 2001 ). Las propiedades fundamentales que deben poseer los mutantes de las cepas de la invención son:
(i) actividad antagonista frente a Erwinia amylovora,
(ii) presencia de los genes pin A, pin B, pin C, pin D, plnJ, plnK, plnM, plnN, plnO, plnP, plnEF y plnl relacionados con la síntesis de plantahcinas,
(iii) capacidad de colonizar o sobrevivir en la flor, hojas y frutos de las plantas pertenecientes a la familia Rosaceae, y
(iv) capacidad de inhibir infecciones por E. amylovora en flores, frutos y hojas de plantas de la familia Rosaceae.
Preferentemente los mutantes tienen actividad antagonista frente al menos otra bacteria fitopatógena como Pseudomonas syringae, y de otras bacterias tipo como E. coli, Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis.
La presencia de los genes relacionados con la síntesis de plantahcinas puede determinarse mediante parejas de cebadores definidos por las secuencias SEC ID NO: 3-26 tal y como se describe en el Ejemplo 1 . La actividad antagonista puede determinarse según se describe en el Ejemplo 2. La capacidad de colonizar y sobrevivir en plantas de la familia Rosaceae puede determinarse según se describe en el Ejemplo 3. La capacidad para inhibir infecciones de E. amyiovora puede determinarse según se describe en los Ejemplos 4 y 5.
En la presente invención el término "cepa de la invención" se refiere no sólo a la cepa L. plantarum TC92, sino también a mutantes de la misma.
La cepa de la invención posee varias ventajas que la hacen especialmente adecuada para su uso en el control integrado de plagas. En la presente invención el término "control integrado de plagas" (o "manejo integrado de plagas") tiene el significado habitual en el campo de la agronomía, donde se entiende como una estrategia que usa una gran variedad de métodos complementarios: físicos, mecánicos, químicos, biológicos, genéticos, legales y culturales para el control de plagas. Estos métodos se aplican en tres etapas: prevención, observación y aplicación. Es un método ecológico que aspira a reducir o eliminar el uso de plaguicidas de síntesis química y a minimizar el impacto en el medio ambiente. Se habla también de control ecológico o biológico de plagas. Así, en la presente invención los términos "control de plagas", "control biológico de plagas" se usan indistintamente y se refieren al control integrado de plagas.
Para empezar, las BALs en general, y la especie Lactobacillus plantarum en particular, son seguras y adecuadas para su uso en consumo humano. En consecuencia, la cepa de la invención es adecuada para su uso en agricultura. Las BALs están consideradas como GRAS por la FDA en Estados Unidos y como QPS por la EFSA en la Unión Europea.
Además de su reconocida bioseguridad, la cepa de la invención es altamente efectiva en la prevención del fuego bacteriano causado por la bacteria E.
amyiovora en las plantas de la familia Rosaceae. Por lo tanto esta cepa es útil para el control biológico de esta plaga y puede usarse como agente plaguicida. Tal y como se muestra en los Ejemplos más abajo, la efectividad de la cepa de la invención para el control del fuego bacteriano se debe principalmente a su elevada actividad antagonista frente a E. amyiovora y a su sorprendente aptitud ecológica para colonizar y sobrevivir en los órganos aéreos de la plantas como hojas, frutos y flores. Por lo tanto, en otro aspecto la invención se refiere al uso de la cepa
Lactobacillus plantarum TC92 como plaguicida en plantas.
En la presente invención el término "plaguicida" se entiende con su acepción habitual en el campo de la agronomía como un producto destinado a matar, repeler, regular o interrumpir el crecimiento de seres vivos considerados plagas. Queda claro que, debido a la naturaleza de la cepa Lactobacillus plantarum TC92, en la presente invención se entiende que "plaguicida" es un plaguicida biológico o ecológico, también denominado bioplaguicida. En el ámbito de la presente invención el término "plaguicida" tendría el mismo significado que el término "fitosanitario".
En una realización particular de la invención la cepa Lactobacillus plantarum TC92 se usa para el control del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae. En otra realización particular, la cepa de la invención se usa en el control del fuego bacteriano en plantas frutales y ornamentales,
preferentemente perales, manzanos, membrilleros, nísperos, espinos de fuego, serbales, mostajos, acerolos, guillomos, espinos albar y durillos.
La elevada actividad antagonista de la cepa de la invención es en parte consecuencia de la producción de compuestos peptídicos y no peptídicos que inhiben el crecimiento de bacterias patógenas, entre las que se encuentra E. amyiovora. Uno de estos compuestos es una plantaricina muy activa codificada por el gen plnEF. Aunque muchas cepas de L plantarum contienen el gen plnEF, no todas ellas muestran actividad antagonista frente a E. amyiovora. En este sentido, en el Ejemplo 1 se muestra que muchas de las cepas de L plantarum plnEF+ (las cuales poseen el gen de síntesis de la plantaricina EF), no tienen actividad antagonista relevante frente a E. amyiovora o contra otras bacterias. En cambio, en la FIG. 1 se puede observar que la cepa de L.
plantarum TC92 de la invención exhibe un espectro de antagonismo destacado frente a E amyiovora, además de frente a otras bacterias. Dicho efecto antagonista sorprendente también queda reflejado en los Ejemplos 5 y 6, en donde se demuestra la efectividad de las cepas in vivo para inhibir infecciones de E amyiovora en plantas de la familia Rosaceae. En el Ejemplo 1 también queda demostrado que la cepa de la invención tiene la capacidad de producir otro tipo de plantaricinas además de la que codifica el gen plnEF, como las codificadas por los genes plnJ, plnK, plnM, plnN, plnO, plnP, y plnl.
Por otro lado, tal y como se demuestra en el Ejemplo 3, la cepa de la invención tiene una elevada capacidad para colonizar y sobrevivir en órganos de las plantas a proteger contra el fuego bacteriano. Esta sorprendente aptitud ecológica es muy importante para el control biológico de la plaga.
De cara a su uso como plaguicida en plantas es importante obtener grandes cantidades de células viables de la cepa de la invención, para lo que es ventajoso disponer de un método escalable a nivel industrial que proporcione concentrados de células viables de fácil manejo y que conserven su viabilidad durante los periodos de almacenaje.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de células de la cepa de la invención que comprende: (i) inocular la cepa de la invención en un medio de cultivo apropiado, (¡i) someter el medio de cultivo inoculado de la etapa (i) a condiciones propicias para el crecimiento de la cepa de la invención hasta alcanzar una concentración celular superior a 1 x 1 0*9 UFC/ml, (iii) separar las células del medio de cultivo, y (iv) recoger las células derivadas de la etapa (iii). Este procedimiento es adecuado para la obtención de la cepa de la invención con buena viabilidad y manteniendo las propiedades ventajosas para su uso como plaguicida en plantas.
La cepa de la invención puede inocularse en el medio a una concentración final entre el 1 y el 5%. Preferentemente el cultivo a inocular se encuentra en fase de crecimiento exponencial. Medios de cultivo adecuados para el crecimiento de la cepa de la invención son medios sintéticos, como MRS (de Man, Rogosa y Sharpe), SL (lactobacillus selectivo) y APT (all purpose médium), medios de origen vegetal como melazas (por ejemplo de caña de azúcar, remolacha) o medios de origen animal como subproductos lácteos (suero). Condiciones adecuadas para el crecimiento de la cepa son temperaturas entre 25 y 35 °C, pH entre 5 y 7, y concentración de oxígeno entre 15 e 30%. El crecimiento de la cepa de la invención se produce preferentemente bajo agitación. El crecimiento de celular se frenará al alcanzar, preferentemente, una
concentración celular entre 3x 1 0*9 y 8x 1 0*9 UFC/ml, más preferentemente entre 4*10*9 y 6*10*9. Un ejemplo del procedimiento detallado de obtención de células de la cepa de la invención está reflejado en el Ejemplo 7.
En una realización particular, el procedimiento para la obtención de células de la cepa de la invención comprende llevar a cabo una etapa (v), después de la etapa (iv), donde las células se someten a condiciones de deshidratación. La deshidratación se puede llevar a cabo mediante un proceso de liofilización. Alternativamente se puede deshidratar el material concentrado por secado mediante lecho fluidizado. Otra opción es deshidratar el material concentrado mediante atomización. En este sentido otra característica ventajosa de la cepa de la invención es que exhibe una elevada resistencia a los procesos de deshidratación que son habituales en la obtención de microorganismos a escala industrial. Con el fin de mejorar la viabilidad de las células antes de llevar a cabo el proceso de deshidratación se puede añadir al concentrado de células un ingrediente osmoprotector inerte.
En otra realización particular, el procedimiento para la obtención de células de la cepa de la invención comprende resuspender las células obtenidas en la etapa (iv) en un tampón adecuado para dar lugar a una suspensión
concentrada de células.
Con vistas a su uso en el control de plagas, los agentes plaguicidas suelen ser formulados en composiciones que incluyen también aditivos adecuados para el uso agrícola para el cual están diseñados. Así, aspectos adicionales de la invención se refieren a composiciones plaguicidas que comprenden la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o mutantes de la misma junto con compuestos aceptables a nivel agrícola y al uso de estas composiciones en el control del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae. Las composiciones de la invención pueden ser sólidas (incluyendo, por ejemplo, concentrado de bacterias deshidratadas) o líquidas (incluyendo suspensiones concentradas de bacterias).
"Compuestos adecuados para el uso agrícola" se refiere a aquellos
compuestos y/o materiales que son adecuados para su uso en agricultura. En general dichos compuestos deben ser no tóxicos para el ser humano y preferentemente deben ser respetuosos con el medio ambiente. En una realización particular, las composiciones plaguicidas de la invención pueden contener compuestos para mejorar la adherencia de las cepas en las plantas a tratar, compuestos fitofortificantes, nutrientes, humectantes, estabilizantes, osmoprotectores, antioxidantes, protectores solares,
compuestos tamponadores o combinaciones de los mismos. Algunos compuestos para mejorar la adherencia son gelatinas, almidones, pectinas, alginatos y diversos tipos de gomas como xantanos. Muchos de estos compuestos son también humectantes. Entre los protectores solares se incluyen colorantes como rojo Congo. Los fitofortificantes son compuestos que pueden favorecer que los cultivos desarrollen vigor o tolerancia frente a patógenos o a condiciones ambientales adversas como, por ejemplo, análogos del ácido jasmónico y ciertos estimuladores de defensas en las plantas como harpinas, quitosanos, y laminarinas. En particular las composiciones
plaguicidas de la invención contienen al menos un osmoprotector como aditivo. Ejemplos de compuestos osmoprotectores son betaínas, aminoácidos y trealosa.
Estrategias dirigidas a la mejora fisiológica de la cepa de la invención también pueden emplearse para incrementar la viabilidad de las células de la cepa de la invención en la composición plaguicida y posterior efectividad en el control de la plaga. Estrategias de este tipo han sido descritas para otras bacterias bioplaguicidas (Cabrefiga et al, "Improvement of fitness and efficacy of a fire blight biocontrol agent via nutritional enhancement combined with
osmoadaptation". Applied and Environmental Microbiology, 201 1 , vol. 77, pp. 3174-3181 )
Las composiciones de la invención también pueden contener un agente plaguicida adicional. En una realización, la composición de la invención comprende al menos un plaguicida adicional. Dichos agentes plaguicidas adicionales pueden ser agentes plaguicidas no biológicos, por ejemplo, antibióticos o derivados del cobre. La ventaja de las composiciones que contienen plaguicidas biológicos como la cepa de la invención en combinación con plaguicidas tradicionales es que se reduce la cantidad de antibiótico o compuesto derivado del cobre que entra en contacto con el medio, reduciendo la contaminación. Además, los plaguicidas biológicos y los tradicionales pueden actuar de forma complementaria incrementando la efectividad de la
composición para el control de la plaga. En las composiciones que comprenden antibióticos y/o compuestos de cobre resulta ventajoso utilizar un muíante de Lactobacillus plantarum TC92 resistente a dichos compuestos. Los antibióticos pueden seleccionarse del grupo que consiste en estreptomicina, tetraciclina y kasugamicina.
En una realización particular, el agente plaguicida adicional es otra cepa bacteriana con efectividad en el control del fuego bacteriano. Entre las cepas bacterianas con efectividad en el control del fuego bacteriano destacan, además de la cepa de la invención, la cepa Lactobacillus plantarum TC54, o mutantes de la misma, y la cepa Lactobacillus plantarum PM41 1 , o mutantes de la misma. Preferentemente la composición de la invención comprende Lactobacillus plantarum TC92, Lactobacillus plantarum TC54 y Lactobacillus plantarum PM41 1 junto con aditivos adecuados para el uso agrícola.
Al igual que la cepa Lactobacillus plantarum TC92, los inventores han encontrado que las cepas Lactobacillus plantarum TC54 y Lactobacillus plantarum PM41 1 , así como mutantes de las mismas, tienen propiedades ventajosas para su uso como plaguicidas en el control biológico del fuego bacteriano. Estas cepas son seguras, poseen una elevada actividad
antagonista frente a E. amylovora y son capaces de colonizar y sobrevivir en las plantas de la familia Rosaceae. Así, la presente invención también se refiere a una cepa de Lactobacillus plantarum TC54, mutantes de la misma, y a una cepa Lactobacillus plantarum PM41 1 , mutantes de la misma. Otros aspectos se refieren al uso de cada una de estas cepas como plaguicidas en plantas, particularmente en el control del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae. Otros aspectos se refieren a composiciones plaguicidas que comprenden al menos una de estas cepas junto con compuestos aceptables a nivel agrícola y el uso de estas composiciones en el control del fuego bacteriano. La invención también se refiere a un procedimiento de obtención de células de Lactobacillus plantarum TC54 y/o Lactobacillus plantarum PM41 1 análogo al descrito para Lactobacillus plantarum TC92. La invención también contempla mutantes derivados de las cepas TC54 y PM41 1 . Dichos mutantes deben poseer las propiedades arriba mencionadas para los mutantes de la cepa TC92. Las cepas Lactobacillus plantarum TC54 y Lactobacillus plantarum PM41 1 , aisladas de plantas de tomate y de peral, respectivamente, procedentes de la región de Girona (Cataluña), fueron depositadas por el solicitante (Universitat de Girona) de acuerdo con el Tratado de Budapest el 13.03.2013 en la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), situada en el Pare Cientific Universitat de Valencia, Edificio 3 CUE. Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia), España. La cepa de Lactobacillus plantarum TC54 recibió el número de acceso CECT 8298. La cepa de Lactobacillus plantarum PM41 1 recibió el número de acceso CECT 8299. La Autoridad Internacional de Depósito declaró como viables dichas cepas.
La invención en otro aspecto se refiere a un extracto de la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o de un muíante de la misma obtenible mediante el
procedimiento que comprende: (i) inocular la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o un muíante de la misma en un medio de cultivo apropiado, (¡i) someíer el medio de culíivo inoculado con la eíapa (i) a condiciones propicias para el crecimienfo de la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o un muíante de la misma hasta alcanzar una conceníración celular superior a 1 χ10*9 UFC/ml, (iii) separar las células del medio de culíivo de la eíapa (¡i), (iv) recoger exíracío libre de células, y (v) someíer el exíracío de la eíapa (iv) a un proceso de conceníración.
Medios de culíivo, condiciones de inoculación y condiciones de crecimienfo adecuados para la cepa de la invención para la obíención del exíracío son los mismos que los descriíos más arriba para el procedimienfo de obíención de células de esía bacíeria. Prefereníemeníe, el crecimienfo de las células se frenará en fase esíacionaria, más prefereníemeníe después de 18-30 horas. En cuanío a la eíapa (v), ejemplos no limifanfes de procesos de conceníración adecuados son deshidraíación (liofilización, afomización), filíración,
u If raf i If ración, precipiíación, cenírifugación, y cromaíog rafia.
Los exíracíos de Lactobacillus plantarum TC92 o de una cepa muíaníe de la misma, obíenidos según el procedimienfo proporcionado por la preseníe invención presenían una elevada acíividad aníagonisía freníe a E. amylovora. Adicionalmenfe, con el fin de incremenfar su acíividad, el exíracío de la invención se puede someter a un proceso de fraccionamiento para separar las fracciones más activas. Preferentemente, el fraccionamiento comprende un tratamiento con ácido tncloro acético y/o cromatografía de intercambio catiónico en fase reversa.
Los extractos de la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o un muíante de la misma pueden usarse directamente en el control biológico del fuego bacteriano aunque, preferentemente, formarán parte de una composición plaguicida junto con otros compuestos aceptables a nivel agrícola. Por lo tanto, aspectos adicionales de la invención proporcionan una composición plaguicida que comprende el extracto de la invención y compuestos aceptables a nivel agrícola, así como el uso de dichas composiciones para el control del fuego bacteriano.
Los extractos de Lactobacillus plantarum TC54 y/o sus m ufantes, de
Lactobacillus plantarum PM41 1 y/o sus mutantes, o de composiciones que los comprenden también son útiles para el control del fuego bacteriano. Dichos extractos se obtienen de manera análoga a la descrita para la obtención del extracto de la cepa TC92.
Por último la invención se refiere a un método de control biológico del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae que comprende el tratamiento de las plantas con la cepa de la invención o una composición que comprende dicha cepa y/o el extracto de la cepa de la invención definido más arriba o una composición que comprende dicho extracto.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus vanantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso
"consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Los signos numéricos relativos a los dibujos y colocados entre paréntesis en una reivindicación, son solamente para intentar aumentar la comprensión de la reivindicación, y no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la protección de la reivindicación. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1 . Dendrograma correspondiente al coeficiente de disimilaridad de 62 cepas de L.plantarum positivas para los genes plnEF, según su perfil de antagonismo in vitro en agar LBP y MRS, frente a Erwinia amylovora (Ea), Escherichia coli (Ec), Pseudomonas syringae (Ps), Staphylococcus aureus (Sa) y Bacillus subtilis (Bs). Los símbolos de actividad inhibitoria para cada bacteria indicadora significan: ++, halos de inhibición superiores a 10 mm en ambos medios de cultivo; +, halos de inhibición inferiores a 10 mm en ambos medios de cultivo; d, halos de inhibición sólo en un medio de cultivo; -, no se observan halos de inhibición. Se indican las tres agrupaciones principales al nivel de disimilaridad de 0,70 (G1 , G2, G3), así como la posición de las cepas TC92, TC54 y PM41 1 en el dendrograma (flechas).
FIG. 2. Dendrograma correspondiente al coeficiente de disimilaridad de 41 cepas de L. plantarum que presentan actividad inhibitoria frente a Erwinia amylovora, clasificadas según el nivel de inhibición del sobrenandante del cultivo (S) y según la capacidad de protección frente a infecciones de fuego bacteriano en flores (Fl), frutos (Fr) y hojas (H) de peral. En este último caso se realizaron dos experimentos. Los símbolos indican en el caso de la actividad inhibitoria de los sobrenadantes de cultivos (S): +++, intensa, ++, moderada, +, ligera. Los símbolos indican en el caso de la protección frente a infecciones: ++, en ambos experimentos efectos significativos; +, efectos significativos en un experimento; -, sin efecto en ninguno de los experimentos. La flecha indica la posición de las cepas TC54, TC92 y PM41 1 .
FIG. 3. Cinética de crecimiento (círculos sólidos) de Lactobacillus plantarum TC92 y PM41 1 en caldo MRS a 25 °C y evolución del pH (círculos vacíos) y de la actividad antimicrobiana de sobrenadantes frente a Erwinia amylovora (triángulos). X, tiempo (horas). Y, concentración de viables (Log10 UFC/ml). Z, actividad inhibitoria (unidades arbitrarias). FIG. 4. Multiplicación y supervivencia de las cepas de Lactobacillus plantarum TC54 (círculos sólidos), TC92 (círculos vacíos) y PM41 1 (triángulos) en flores de peral y manzano, bajo condiciones de humedad relativa (HR) elevada (90%) y baja (50%). A, peral, HR alta; B, manzano, HR alta; C, peral, HR baja; D, manzano, HR baja. X, días tras la inoculación. Y, nivel poblacional (Log10 UFC/flor). Los valores son las medias de tres réplicas y las barras de error representan el 95% del intervalo de confianza de la media.
FIG. 5. Efecto de los tratamientos con las cepas de Lactobacillus plantarum TC54, TC92 y PM41 1 en la susceptibilidad a infecciones por Erwinia amylovora en flores (A) frutos inmaduros (B) y hojas (C) de peral Passe Crassane. La intensidad de las infecciones se compara con un control no tratado (NT) y con un control tratado con el antibiótico de referencia estreptomicina (Str). Los valores son las medias de tres réplicas y las barras de error representan el 95% del intervalo de confianza de la media. Letras ¡guales sobre las barras indican que los tratamientos no difieren significativamente según la prueba de Tukey (P<0,05). Y, intensidad de las infecciones (%).
FIG. 6. Efecto de los tratamientos con las cepas de Lactobacillus plantarum TC54, TC92 y PM41 1 en la intensidad de las infecciones de fuego bacteriano en plantas de peral Conference. La intensidad de las infecciones se determinó a la semana de la inoculación de Erwinia amylovora. Se realizaron dos experimentos independientes (A, B). Los resultados se comparan con un control no tratado (NT) y con un control tratado con el antibiótico estreptomicina (Str). Los valores son las medias de tres réplicas y las barras de error representan el 95% del intervalo de confianza de la media. Letras ¡guales sobre las barras indican que los tratamientos no difieren significativamente según la prueba de Tukey (P<0,05). Y, intensidad de las infecciones (%).
FIGURA 7. Efecto de los tratamientos con células de Lactobacillus plantarum TC92C y PM41 1 C y con extractos de cultivos diluidos 1/10 (TC92S y
PM41 1 S), en la susceptibilidad a infecciones por Erwinia amylovora en hojas de peral Conference. La intensidad de las infecciones se compara con un control no tratado. Los valores son las medias de tres réplicas de 3 hojas y las barras de error representan el 95% del intervalo de confianza de la media. Letras ¡guales sobre las barras correspondientes a cada uno de los días evaluados indican que los tratamientos no difieren significativamente según la prueba de Waller (P<0,05). Y, intensidad de las infecciones (%). Barras grises corresponden a los niveles de infección a los 6 días, y barras negras a los 9 días.
FIGURA 8. Patrón de amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD) para diferentes cebadores: P3, P4, P7, M13, Inv-A, 512Fb y XD9. M, escalera 1 Kb Plus (Invitrogen); 1 , L. plantarum TC54; 2, L. plantarum TC92; 3, L. plantarum PM41 1 ; 4, L. plantarum CECT 223; 5, L. plantarum ATCC 8014; 6, L. plantarum CECT 4528; 7, L. plantarum CECT 5785; 8, L. plantarum LNG921 1 (WCSF1 ).
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Aislamiento y caracterización de las cepas Lactobacillus plantarum TC92, Lactobacillus plantarum TC54 y Lactobacillus plantarum PM41 1
Para obtener los aislados se tomaron muestras de hojas, flores y frutos obtenidos a partir de plantaciones comerciales de frutales de pepita y hueso, así como de productos hortícolas obtenidos en mercados y de productos de cuarta gama (ensaladas, germinados, etc.), todos ellos procedentes de campos de cultivo y entornos naturales de clima mediterráneo. Las muestras se procesaron según métodos microbiológicos convencionales (Mora et al, "Antimicrobial peptide genes in Bacillus strains from plant environments",
International Microbiology, 201 1 , vol. 14, pp. 213-223), y se aislaron bacterias del ácido láctico (BALs) en medio MRS a 23 °C durante 48 h, constituyendo una colección de 600 aislados. Dichos aislados se sometieron a un estudio para determinar la presencia del gen plnEF responsable de la producción de un tipo de plantaricinas (Sáenz Y et al, "Genetic diversity of the pin locus among oenological Lactobacillus plantarum strains", Int. J. Food Microbiol. 2009, vol. 134, pp. 176-183). El DNA de los aislados y de las cepas de referencia L. plantarum LMG 921 1 (control positivo) y Leuconostoc mesenteroides CM160 (control negativo) se utilizó para detectar dicho gen mediante PCR. El DNA se obtuvo a partir de cultivos en fase exponencial mediante extracción en tampón Tris-salino-EDTA-SDS antioxidante y precipitación con isopropanol, ajusfando la concentración a 10 ng/ L. Las reacciones de amplificación se realizaron en condiciones estándar utilizando los cebadores definidos por las secuencias SEC ID NO: 25 (plnEF i) y SEC ID NO: 26 (plnEF r). Las condiciones fueron de 4 min a 95°C, 35 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 53 °C, y 1 min a 72 °C, con una etapa de extensión final de 10 min at 72 °C seguida de una parada a 4 °C. Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 .5 % en 1 X Tris-acetato EDTA (TAE) durante 45 min a 90 V y visualizados con Sybr Safe (SYBR®Safe Invitrogen Life Technologies, CA). Entre los aislados sólo el 10.5% de las cepas (63 de 600 aislados) presentan el marcador génico plnEF (FIG. 1 ), lo que demuestra una presencia de dichos genes baja en la población de BALs aisladas de plantas.
Para determinar la especie de BAL a la que pertenecían los 63 aislados que poseían los genes pin EF, se procedió a secuenciar parcialmente el gen 16S rDNA (regiones V1 a V3). Para ello se procedió a realizar una PCR sobre el DNA extraído de los cultivos con los cebadores 27f (SEC ID NO: 1 ) y 1492r (SEC ID NO: 2) en condiciones estándar (Lañe, D.J., "Nucleic acid techniques in bacterial systematics", Stackebrandt, E., and Goodfellow, M., eds., John Wiley and Sons, New York, NY, 1991 , pp. 1 15-175). Los productos de PCR fueron purificados, concentrados convenientemente y secuenciados mediante un secuenciador 3730XL (Macrogen, Seoul, Korea). Las secuencias obtenidas fueron analizadas y alineadas mediante BioEdit Sequencing Editor, y la homología determinada mediante el programa BLAST en la base de datos NCBI datábase. Las secuencias de las cepas más representativas se
depositaron en el GenBank (cepa Lactobacillus plantarum TC92, No JX440375 16S; cepa Lactobacillus plantarum TC54, No. EU074830.1 ; y cepa
Lactobacillus plantarum PM41 1 , No. JX440377 16S).
Los 62 aislados de L plantarum que poseían los genes plnEF fueron sometidos a pruebas de actividad antimicrobiana in vitro contra seis bacterias indicadoras (E. amylovora PMV6076, P. syringae EPS94, L. mesenteroides CM160, E coli ATCC5954, S. aureus ATCC9144 y B. subtilis EPS2017), utilizando la técnica del repicado de colonias en sobrecapa de agar lactosa-púrpura de bromocresol (LBP) y MRS modificado (MRS0.2). Los halos de inhibición del crecimiento en los indicadores se determinaron al cabo de 48 h a 23 °C. Los resultados de diámetro de inhibición se normalizaron y se utilizaron para realizar un análisis jerárquico de agregación utilizando el coeficiente de Jaccard de disimilaridad con el algoritmo UPGMA (NTSYS, Exeter, USA). Se observan 3 agregados diferentes en función del patrón de actividad antibacteriana a un nivel de similaridad de 0,7, siendo el grupo G2 el más activo (FIG. 1 ). Los restantes otros dos grupos presentaron una actividad baja o sólo frente a una o dos bacterias indicadoras. Aunque se podría esperar que todas las cepas de L. plantarum plnEF+ (que poseen el gen de síntesis de plantaricina EF) presentaran actividad antagonista frente a E. amylovora o contra las otras bacterias fitopatogenas, esto no es así ya que 19 cepas no son activas o sólo lo son ligeramente. Sólo en el grupo 2 la mayoría de cepas muestran amplio espectro de antagonismo, en especial las cepas TC54, PM41 1 y TC92. Esto puede deberse a que dicho gen no se exprese en algunas cepas o que las cepas activas presenten mecanismos adicionales que influyen en su capacidad antagonista frente a bacterias. Es bien conocido que las bacterias del ácido láctico productoras de bacteriocinas son muy efectivas contra bacterias de la misma especie y contra otras Gram positivas (como ellas mismas), pero escasamente contra bacterias Gram negativas. Sin embargo, algunas cepas plnEF+ de la invención, contrariamente a lo esperado, presentan un mayor antagonismo contra E. amylovora y P. syringae (Gram negativas) que contra Gram positivas (B. subtilis, S. aureus, L. monocytogenes). Sorprendentemente, ninguna de las cepas mostró actividad contra L. mesenteroides CM160.
Además, se realizó un estudio de los 41 aislados que mostraron actividad antagonista in vitro frente a E. amylovora, determinando su capacidad para inhibir infecciones de dicho patógeno en flores, frutos inmaduros y hojas que permitió diferenciar aún más entre los aislados plnEF+. Se realizaron varios experimentos en flores, hojas y frutos de peral de la variedad Passe Crassane. Para ello se obtuvo el material vegetal a partir de una finca comercial en Girona. Para los ensayos con flores una vez en el laboratorio se dispusieron individualmente sumergiendo el pedúnculo en tubos conteniendo una solución de sacarosa 10%. Los frutos inmaduros y hojas se desinfectaron con una solución de hipoclorito diluida, se lavaron y se eliminó el exceso de agua. Los frutos se lesionaron con un sacabocados (3 heridas por fruto) mientras que a las hojas se les practicó una incisión transversal en el nervio central. Todo el material vegetal fue inoculado con los aislados que mostraron actividad antagonista in vitro frente a E amylovora, incluyendo las cepas TC54, TC92 o PM41 1 a 10*8 CFU/mL (0.4-1 mL por flor, hoja o fruto) utilizando un
micropulverizador. El material se incubó en contenedores de plástico transparente que se dispusieron en cámaras de ambiente controlado a 25 °C, humedad relativa (HR) elevada y 16 h luz-8 h oscuridad. Al cabo de 24 h se inocularon los hipantios de las flores y las heridas de los frutos u hojas con una suspensión de E. amylovora EPS101 a 10*7 CFU/mL. El material tratado se incubó en las condiciones anteriores durante 5 días y se determinó la incidencia y severidad de la enfermedad (infecciones). El análisis del dendrograma resultante según su capacidad antagonista y de inhibición de infecciones revela que existe una diversidad muy notable entre aislados (FIG. 2). Se confirma de forma sorprendente la naturaleza única de las cepas TC54, TC92 y PM41 1 que se agrupan en agregados en la parte inferior del dendrograma porque muestran una eficacia superior a las demás.
Con el fin de caracterizar con más detalle una de las cepas TC92, TC54 y PM41 1 se procedió a determinar la presencia de genes relacionados con la síntesis de plantaricinas, concretamente del operón regulador p/nABCD (pin A, pin B, pin C, pin D) y de producción de diversas plantaricinas (pin K, pin M, pin N, pin O, pin P, pin EF, pin I), y se comparó con otras cepas de la colección y con cepas de referencia descritas por otros autores y depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Dicho estudio se realizó mediante cultivo de las cepas en medio MRS en las condiciones descritas anteriormente, extracción del DNA, y realización de una PCR mediante los cebadores específicos de los genes reguladores, de transporte y de síntesis de plantaricinas. A continuación se describen las secuencias de los cebadores y referencias bibliográficas para cada uno de ellos.
En el caso del gen plnA se utilizaron las condiciones y la pareja de cebadores definidos por la SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4 descritos por Macwana et al ("A 'bacteriocin PCR array' for identification of bacteriocin-related structural genes in lactic acid bacteria", Journal of Microbiological Methods 2012, vol. 88, pp. 197-204). El resto de genes reguladores y de síntesis se determinó mediante las parejas de cebadores descritos por Sáenz et al., ("Genetic diversity of the pin locus among oenological Lactobacillus plantarum Strains", International Journal of Food Microbiology 2009, vol. 134, pp. 176-183) para los genes plnB (SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6), plnC (SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8), plnD (SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10), plnJ (SEC ID NO: 1 1 y SEC ID NO: 12), p/n (SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 14), pin M (SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 16), plnN (SEC ID NO: 17 y SEC ID NO: 18) , plnO (SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 20), plnP (SEC ID NO: 21 y SEC ID NO: 22), y plnl (SEC ID NO: 23 y SEC ID NO: 24) . Para el gen de síntesis de plantaricina plnEF se utilizaron los cebadores (SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 26) descritos por Rojo-Bezares et al. ("Characterization of a new organization of the plantaricin locus in the inducible bacteriocin-producing Lactobacillus plantarum J23 of grape must origin", Arch Microbiol 2008, vol. 189, pp. 491-499).
Como se puede apreciar en la siguiente tabla, las cepas TC92, TC54 y PM41 1 pueden diferenciarse por PCR de otras cepas mediante el tipado de dichos genes de síntesis de plantaricinas, dando un patrón específico positivo para todos ellos. Además dicho estudio confirma que las cepas de la invención poseen el potencial de producción de otros tipos distintos de bacteriocinas, además de la codificada por el gen plnEF, como por ejemplo las codificadas por los genes plnJ, plnK, plnM, plnN, plnO, plnP, y pin I.
Tabla 1 A y 1 B. Características de las cepas de Lactobacillus plantarum TC92, PM41 1 y TC54 en cuanto a la presencia de genes que intervienen en la síntesis de plantaricinas, en comparación con otras cepas de diversos orígenes y cepas de referencia depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). +, presencia; -, ausencia; s, amplificación por PCR de menor intensidad que el control positivo; nd, no determinado.
Tabla 1A
Cepa Origen Operón regulador
plnA plnB plnC plnD
TC92 tomate + + + +
TC54 tomate + + + +
PM41 1 pera + + + +
CECT223 desconocido s - s -
ATCC8014 maíz ensilado s - - +
CECT4528 leche s - s -
CECT5785 queso + + + +
EC65 maíz fermentado + + - -
J51 vino + + + +
NC8 ensilado - - - + Tabla 1 B
Operones de síntesis de plantaricinas
Cepa Origen p/nJKLR p/nMNOP p/nEFI
pin pin pin pin pin pin plnE pin
J K M N 0 P F 1
TC92 tomate + + + + + + + +
TC54 tomate + + + + + + + +
PM41 1 pera + + + + + + + + desconocid _ _ _ _ _ _ _ _
CECT223
o
ATCC801 maíz - - - - - - + +
4 ensilado
CECT452 leche - - - - - + s +
8
CECT578 queso - - - - - - + +
5
EC65 maíz - + nd + nd nd + +
J51 vino - - - - - - + +
NC8 ensilado + + - - - + + +
Con el fin de diferenciar las cepas TC92, TC54 y PM41 1 de otras cepas de L. plantarum depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) se procedió a la amplificación aleatoria de ADN polimórfico, técnica conocida por el acrónimo inglés RAPDs (Random Amplification of Polymorphic DNA), que utiliza cebadores cortos arbitrarios (8-12 nucleotidos) que generan tras la PCR con un solo cebador, amplificaciones que permiten realizar tipado de cepas (Williams J G et al, "DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers". Nucleic Acids Res. , 1 190, vol. 18, pp. 6531 -6535). Dicho estudio se realizó mediante cultivo de las cepas en medio MRS en las condiciones descritas anteriormente, extracción del DNA, y realización de PCRs mediante cebadores específicos conocidos en el estado de la técnica. Los siguientes cebadores fueron utilizados: SEC ID NO: 27 (P3, Tailliez P, et al, "Molecular diversity and relationships with Lactococcus lactis as revelead by rendomly amplified polimorphic DNA (RAPD)". System. Appl. Microbiol., 1998, vol. 21 , pp. 530-538), SEC ID NO: 28 (P4), SEC ID NO: 29 (P7) y SEC ID NO: 30 (M13)(D¡ Cagnio R, et al. "Selection and use of autochtonous mixed starter for lactic acid fermentation of carrots, french beans or marrows.", Int. J. Food Microbiol, 2008, vol. 127, pp. 220-228), SEC ID NO: 31 (Inv-A, Rahn K, et al. "Amplification of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polimerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella", Mol. Cell. Probes, 1992, 6: 271 -279), SEC ID NO: 32 (512Fb, Holt S M y Cote G L. "Differentiation of dextran-producing Leuconostoc strains by a modified randomly amplified polymorphic DNA protocol", Appl. Environ. Microbiol., 1998, vol. 64, pp. 3096-3098), y SEC ID NO: 33 (XD9, Moschetti G J, et al. "Random amplified polymorphic DNA and amplified ribosomal DNA spacer polymorphism: powerful methods to differentiate Streptococcus thermophilus strains", Appl. Microbiol., 1998, vol. 85, pp. 25-36). El mix de PCR consistió en un volumen total de 50 μΙ conteniendo 1x de tampón, 200 μΜ de dNTPs, 1 ,5 mM de MgCI2 , 0,5 μΜ de cebador y 3,75 U de taq polymerasa (Invitrogen) y 4 μΙ de DNA (25 ng/μΙ). Las condiciones para la amplificación fueron para el cebador SEC ID NO: 30 M13 de (i) desnaturalización a 94°C durante 3 min, (¡i) 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 1 min, 40°C durante 20 s, con una rampa hasta 72°C a 0.6 °C/s i (i¡¡) una extensión final a 72°C durante 2 min. Para los cebadores SEC ID NO: 27 P3 y SEC ID NO: 28 P4 las condiciones fueron de (i) desnaturalización a 94°C durante 3 min, (¡i) 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 1 min, 36°C durante 2 min y una extensión a 72°C durante 2 min. Para los cebadores SEC ID NO: 29 (P7), SEC ID NO: 31 (Inv-A), SEC ID NO: 32 (512Fb) y SEC ID NO: 33 (XD9), las condiciones fueron (i) desnaturalización a 94°C durante 4 min, (¡i) 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 1 min, 35°C durante 1 min, extensión a 72°C durante 2 min (i¡¡) una extensión final a 72°C durante 5 min. En la FIG 8 se puede apreciar que las cepas TC92, TC54 y PM41 1 se pueden diferenciar de otras cepas de L. plantarum depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) como CECT223, ATCC8014, CECT4528, CECT5785 y LMG921 1 , ya que su patrón de bandas RAPDs es diferente con los cebadores P3, P4, P7, M13, Inv-A, 512Fb y XD9. Dichos patrones son reproducibles en las mismas condiciones experimentales para todas las cepas.
Las cepas TC92 y TC54, si bien no son diferenciabas en función de su patrón de RAPDs, sí pueden diferenciarse en función de su actividad antagonista frente a diferentes patógenos (ver FIG 1 ) y, en concreto, por su actividad inhibitoria frente a Erwinia amylovora (FIG 2). Como se puede apreciar en los ejemplos que siguen, dichas cepas también mostraron diferencias en cuanto a su capacidad para colonizar y sobrevivir en flores de manzano y peral (ver FIG 4) y su capacidad para inhibir infecciones por fuego bacteriano (ver FIG 5). Ejemplo 2. Estudio de la actividad antagonista de los extractos de L. plantarum
TC92, L. plantarum TC54 y L. plantarum PM41 1
La singularidad de las cepas TC54, TC92 y PM41 1 , pone de manifiesto el interés en determinar la naturaleza de su actividad antagonista e inhibitoria contra E. amyiovora.
En primer lugar, se verificó que existía actividad antimicrobiana en el extracto resultante del crecimiento en "batch" de dichas cepas en caldo MRS (a 30 °C, pH 6,0, pÜ2 20%), y que esta actividad vanaba a lo largo del proceso. Para ello, alícuotas de los cultivos tomadas a distintos tiempos, filtrados para eliminar las células, fueron liofilizados y el material resultante resuspendido en tampón citrato. El extracto 15 veces concentrado fue ensayado mediante la técnica de la sobrecapa de agar, aplicando alícuotas de 10 μΙ contra E. amyiovora inoculada en agar Mueller-Hinton. La actividad antimicrobiana se determinó en unidades arbitrarias (UA) como el inverso de la mayor dilución que mostraba actividad inhibitoria. Durante la realización de las curvas de crecimiento en cultivo en "batch", se determinó además de la concentración de células viables, el pH y la actividad antibacteriana del extracto tal y como se ha indicado. Se observa que los cultivos crecen exponencialmente hasta 20h después de la inoculación en medio fresco, entrando posteriormente en fase estacionaria, llegando a concentraciones celulares muy elevadas de 5 x 10*9 CFU/mL. La actividad inhibitoria de los extractos se inicia con la fase estacionaria y aumenta con la disminución del pH. Sin embargo, una vez éste se estabiliza en valores ácidos (pH de 3,6-4,0) hacia las 20 h, la actividad antibacteriana contra E.
amyiovora continúa aumentando hasta 60-80 h desde el inicio del cultivo. Estos resultados son indicativos de que además de compuestos de carácter ácido que pueden inhibir E. amyiovora, las cepas producen otras sustancias antimicrobianas (FIG. 3).
La naturaleza de la actividad antibacteriana de los extractos de los cultivos también se determinó estudiando el efecto de: (1 ) neutralizar los extractos para ver si se trataba de ácidos inhibidores, (2) mediante tratamiento por calor para desnaturalizar posibles proteínas activas, y (3) con tratamiento por proteasas para confirmar su naturaleza peptídica. Para verificar el efecto del pH los extractos se ajustaron a valores de 2, 3, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 7 y 8. Para la inactivación térmica los filtrados concentrados se sometieron a 50, 70, 90 o 121 °C durante 30 min. Para la susceptibilidad a proteasas se realizó una digestión con proteinasa K. El ensayo de actividad inhibitoria se realizó con el sistema de micropocillos ELISA añadiendo los extractos crudos tratados a cultivos de E. amyiovora en caldo LBP y mediante monitorización del crecimiento, tras incubación de las microplacas a 25 °C durante 72 en agitación. La actividad inhibitoria se determinó mediante el área bajo las curvas de crecimiento y se calculó como proporción de inhibición respecto a los controles no tratados. Los extractos retuvieron completamente la actividad tras el tratamiento térmico a 120 °C durante 10 min y la actividad se mantuvo estable a pH entre 3-4, pero disminuyó progresivamente hasta pH 7.0, restaurándose de nuevo al ajusfar a valores ácidos. La actividad inhibitoria se perdió completamente tras el tratamiento con proteinasa K y disminuyó drásticamente con quimotripsina. Estos resultados confirman que las cepas TC54, TC92 y PM41 1 producen dos tipos de sustancias inhibidoras de E.
amyiovora: compuestos de naturaleza ácida y compuestos de naturaleza peptídica termoestables.
Se procedió también a una caracterización adicional de los extractos de los cultivos de las cepas TC54, TC92 y PM41 1 mediante fraccionamiento. Los extractos concentrados por liofilización fueron tratados con TCA-acetona-DTT (15% TCA, 20 mM DTT acetona fría) para precipitar péptidos y proteínas. El material resuspendido se aplicó a columnas de intercambio catiónico de fase reversa, recogiendo fracciones no retenidas, y eluyendo el material adsorbido mediante metanol, ácido acético 50% y ácido acético al 100%. Las fracciones obtenidas se liofilizaron para concentrar y eliminar los ácidos orgánicos utilizados como eluyentes, y el sedimento resultante se disolvió en agua. Se ensayó la actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas mediante el método de difusión en agar, contra E. amyiovora 6076 y E coli ATCC1 1775. Se concluyó que una parte importante de la actividad contra ambas bacterias se debe a productos de naturaleza peptídica, un grupo de éstos no son retenidos en la columna cromatográfica, mientras que otro queda retenido y es eluído con metanol. Ejemplo 3. Colonización de órganos de las plantas por las cepas de L.
plantarum para su protección contra el fuego bacteriano.
Se estudió la capacidad de las cepas TC92, TC54 y PM41 1 para colonizar y sobrevivir en flores de manzano y peral. Esta propiedad es muy importante para proteger las principales vías de entrada de infecciones por E. amylovora en las plantas.
Las cepas TC92, TC54 y PM41 1 fueron cultivadas en "baten" en caldo MRS a 30 °C, pH 6,0, p02 20% hasta alcanzar una concentración de 5 x 10*9 CFU/mL (aproximadamente durante 20 h). Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en solución Ringer 1/4, hasta conseguir una
concentración de 1 x 10*8 CFU/mL. Con el fin de disponer de un sistema para el análisis específico de las cepas durante el experimento de colonización y evitar la interferencia de microbiota autóctona que pudiera quedar tras la desinfección, se obtuvieron mutantes espontáneos resistentes a rifampicina (cepas TC92R y TC54R) y ácido nalidíxico (PM41 1 N), de modo que esta propiedad se utilizó como herramienta de contraselección en el recuento de viables en placa añadiendo los correspondientes antibióticos al agar. Se tomaron corimbos florales de árboles en una finca comercial de Girona y una vez en el laboratorio se pulverizaron hasta punto de goteo con suspensiones de las cepas a 10*8 CFU/mL. Las flores se dispusieron individualmente
sumergiendo el pedúnculo en tubos conteniendo una solución de sacarosa 10%. EL material se dispuso en cámaras de ambiente controlado bajo humedad relativa elevada (90% RH) o baja (50% RH) a 25 °C. Para cada HR se emplearon 3 replicados de 30 flores. Un experimento se realizó con flores de peral Passe Crassane y otro con flores de manzano Golden. A continuación se tomaron muestras de 5 flores a diferentes tiempos (0, 24, 48, 120, 168, y 216 h). Las flores se homogeneizaron en tampón fosfato peptonado neutro mediante un agitador de palas. Los extractos se diluyeron adecuadamente y las diluciones se sembraron utilizando un sistema automático de siembra en espiral sobre placas de agar MRS suplementadas con los correspondientes antibióticos. Las placas se incubaron a 25°C durnate 48 h y se contaron las colonias mediante un sistema de recuento automático. La dinámica poblacional de las tres cepas fue similar tanto en manzano como en peral. Se observaron diferencias significativas en los niveles poblacionales entre condiciones de humedad. Bajo HR elevada los niveles poblacionales aumentaron en las tres cepas 10 veces dos días tras su inoculación, manteniéndose niveles
poblacionales cercanos a 10*8 UFC/flor durante 7 días (FIG. 4). En
condiciones de HR baja, que son más adversas para el crecimiento bacteriano, los niveles poblacionales decrecieron progresivamente tan sólo 10 veces en 9 días. Estos resultados confirman la capacidad de las cepas para colonizar o sobrevivir en órganos de las plantas a proteger contra el fuego bacteriano, y en especial en las flores que son los órganos más susceptibles al fuego
bacteriano.
Ejemplo 4. Capacidad inhibitoria de infecciones por fuego bacteriano en órganos de las plantas.
Para poner de manifiesto las capacidades de protección de las cepas TC92, TC54 y PM41 1 se realizó un ensayo de inhibición de infecciones en flores, frutos inmaduros y hojas de peral Passe Crassane.
Suspensiones de las cepas a 1 x 10*8 CFU/mL se obtuvieron de igual modo que en el Ejemplo 3. El material vegetal se obtuvo de una plantación comercial cerca de Girona, en donde no se había detectado fuego bacteriano en el pasado. Para los ensayos con flores, cada flor individual se dispuso con el pedúnculo sumergido en una solución de sacarosa al 10% en viales de plástico. Los frutos inmaduros de 6 semanas y las hojas jóvenes fueron desinfectados por inmersión en una solución diluida de hipocrlorito sódico y posteriormente lavados para eliminar restos. En cada fruto se practicaros tres heridas con un sacabocados (1 mm). En las hojas se practicó una incisión transversal en el nervio principal. Las flores y frutos inmaduros fueron pulverizados con suspensiones de las cepas TC92, TC54 y PM41 1 a 10*8 UFC /mL (0.4-1 mi por flor o fruto) mediante micropulverizador, mientras que las hojas se inocularon por inmersión en la suspensión. Tanto los viales
conteniendo la flores como los frutos y hojas se incubaron en una cámara de ambiente controlado a 25 °C y control de la humedad relativa, con 16 h de luz fluorescente y 8 h de oscuridad. Al cabo de 24 h, se inocularon los hipantios de las flores, y las heridas de los frutos y hojas con 10 μΙ de una suspensión de E. amylovora EPS101 a 10*7 UFC /mL. El material inoculado se dispuso en cajas de plástico transparente y se incubaron durante 5 días en las condiciones descritas anteriormente. El diseño experimental consistió en 3 replicas por tratamiento con 3 frutos, 10 flores o 3 hojas por replica. Se incluyeron controles no tratados con L. plantarum o tratados con un antibiótico de referencia
(estreptomicina) a 100 mg/L y se realizaron dos experimentos independientes. Los niveles de infección en el caso de las flores se determinaron para cada flor de acuerdo con una escala de 0 a 3 en función de los síntomas observados: 0, no síntomas; 1 , necrosis parcial del hipantio; 2, necrosis total del hipantio; 3, progresión de la necrosis a través del pedúnculo. Para los frutos cada herida se valoró según: 0, sin síntomas; 1 , presencia de exudados en la herida; 2, presencia de exudados y necrosis alrededor de la herida; 3, necrosis que se extiende por la superficie del fruto. En las hojas la intensidad de las infecciones se determinó según: 0, sin síntomas; 1 , presencia de exudado en la herida; 2, presencia de exudado y necrosis alrededor de la herida; y 3, progresión de la necrosis a través de la superficie foliar. La severidad se normalizó para el máximo valor obtenido en el experimento y se expresó en porcentaje relativo (0-100).
El efecto inhibitorio del fuego bacteriano en las 3 cepas (TC92, TC54 y PM41 1 ) fue significativo en comparación con los controles no tratados, y en general, no difirieron significativamente del antibiótico de referencia (FIG. 5). Las cepas TC92 y TC54 difirieron significativamente del control no tratado en todos los órganos estudiados, mientras que PM41 1 sólo fue efectiva en hojas y flores. Las eficacias medias se situaron entre 67 y 78% en hojas, y 45-75% en flores. En frutos inmaduros las cepas TC92 y TC54 redujeron infecciones en
comparación con los controles no tratados con una eficacia media del 50%. Por lo tanto este experimento demostró la efectividad del tratamiento del fuego bacteriano con dichas cepas, en unas condiciones en que las infecciones por el patógeno están muy favorecidas.
Ejemplo 5. Tratamiento preventivo del fuego bacteriano en plantas de frutales mediante las cepas de L. plantarum TC92, TC54 y PM41 1 .
Para demostrar la eficacia de las cepas de L. plantarum de la invención en el control del fuego bacteriano se realizaron ensayos con plantas de peral del cultivar Conference. Las plantas fueron cultivadas en macetas de 20 cm de diámetro. Durante el invierno se sometieron a vernalización y durante primavera se podaron para dejar 3 a 4 brotes por planta y forzadas a brotación en el invernadero. Durante el desarrollo vegetativo las plantas fueron fertilizadas con una solución de 200 ppm N/P/K (20: 10:20) y fueron utilizadas cuando los brotes tenían 3-4 cm de longitud con 5-6 hojas jóvenes por brote. Para su uso en los ensayos, se practicó una incisión doble en el nervio principal de las tres hojas expandidas en cada uno de los tres brotes. Posteriormente las plantas fueron pulverizadas con la correspondiente suspensión de la cepa de L. plantarum a 10*8 CFU/mL (obtenida de igual modo que en el Ejemplo 3) hasta el punto de goteo (10 ml_ por planta). El material tratado fue cubierto con bolsas de plástico y mantenido a 25 °C durante 24 h con un fotoperiodo de 16h luz-8 h oscuridad.
Posteriormente, se procedió a inocular las heridas practicadas en las hojas con una suspensión de E amylovora EPS101 a 10*6 UFC/ml y el material introducido de nuevo en bolsas de plástico y mantenido a 25 °C en fotoperiodo. El diseño experimental consistió en tres repeticiones de dos plantas por tratamiento de cepa de L. plantarum. Se realizaron también controles no tratados y un control tratado con estreptomicina a 100 mg/L. Se realizaron dos experimentos independientes. La intensidad de las infecciones se determinó según la misma escala descrita en el apartado anterior para hojas. Las tres cepas de L. plantarum inhibieron significativamente las infecciones por fuego bacteriano en los dos ensayos realizados, en comparación con los controles no tratados. Los niveles de enfermedad fueron significativamente menores que en los controles no tratados para las cepas PM41 1 y TC92 en los dos
experimentos (FIG. 6), aunque sólo en uno de ellos para la cepa TC54. Los niveles de eficacia fueron 50-68% para TC92, 35-65% para PM41 1 , y 28-58% para TC54.
Ejemplo 6. Efecto de los extractos de L. plantarum TC92 y L. plantarum PM41 1 en la inhibición de infecciones por fuego bacteriano en hojas.
Para poner de manifiesto las capacidades de protección de los extractos de las cepas TC92, y PM41 1 se realizó un ensayo de inhibición de infecciones en hojas de peral Conference. Para cada cepa se preparó un cultivo en "baten" como en el ejemplo 3. Las suspensiones de las células se obtuvieron a partir de una muestra tomada a las 20 h de cultivo y la concentración se ajustó a 1 x 10*8 CFU/mL como en el ejemplo 3. Los extractos de los cultivos se prepararon como se indica en el Ejemplo 2 a partir de una muestra del cultivo tomada a las 70 h en la que la actividad antibacteriana era máxima. El material vegetal se obtuvo de una plantación comercial cerca de Girona, en donde no se había detectado fuego bacteriano en el pasado. Las hojas jóvenes fueron desinfectadas con hipoclorito sódico, posteriormente se les practicó una incisión transversal en el nervio principal, y fueron inoculadas con suspensiones celulares de las cepas TC92 y PM41 1 a 10*8 UFC /mi por inmersión en la suspensión o con los extractos de las mismas cepas diluidos a 1/10. Las hojas se incubaron en una cámara de ambiente controlado a 25 °C y control de la humedad relativa, con 16 h de luz fluorescente y 8 h de oscuridad, y al cabo de 24 h, se inocularon con 10 μΙ de una suspensión de E. amylovora EPS101 a 10*7 UFC /mL. El material inoculado se incubó en las condiciones descritas anteriormente y se determinó la intensidad de las infecciones a los 6 y 9 días. El diseño
experimental consistió en 3 replicas por tratamiento con 3 hojas por replica. La intensidad de las infecciones se determinó según: 0, sin síntomas; 1 , presencia de exudado en la herida; 2, presencia de exudado y necrosis alrededor de la herida; y 3, progresión de la necrosis a través de la superficie foliar. La severidad se normalizó para el máximo valor obtenido en el experimento y se expresó en porcentaje relativo (0-100). Se observó que a los 6 días de la inoculación del patógeno tanto las células como los extractos de las dos cepas presentaron niveles de infección menores que el control no tratado, y no difirieron significativamente entre ellos (Figura 7). Al cabo de 9 días las células de TC92 mantuvieron su efectividad mientras que los extractos demostraron una menor efectividad. La pérdida de actividad de los extractos a lo largo del tiempo podría minimizarse mediante una adecuada formulación del extracto, por ejemplo, añadiendo compuestos adecuados para uso agrícola que favorezcan la conservación de las sustancias antimicrobianas o incrementando la concentración del extracto. Ejemplo 7. Producción a escala industrial y preparación de formulados para alargar la vida útil de L. plantarum TC92.
Para la producción a escala industrial de las cepas de la invención se pueden utilizar las condiciones óptimas de fermentación que se detallan a continuación mediante bioreactor de tipo CSTR en medio líquido, aunque también se pueden utilizar técnicas basadas en fermentación en medio sólido, todos ellos métodos estándar utilizados en la industria microbiológica.
Para determinar las condiciones óptimas se utilizó un fermentador Braun Biostat de 5 litros en medio MRS a 30 °C, pH 6,0, p02 20% con rampa, y agitación a 100 rpm. Se inoculó un cultivo exponencial de la cepa L. plantarum TC92 al 1 % y se monitorizaron los parámetros operacionales del bioreactor, finalizando el crecimiento en fase estacionaria a las 12 h, consiguiendo concentraciones celulares de entre 5-8 x 10*9 UFC/ml. A continuación se centrifugó el cultivo en continuo a 8000 rpm y 10 l/h y se recogieron las células asépticamente mediante una centrífuga SA-1 Westfalia- Separator. Al final de esta etapa la biomasa se concentró unas 10-12 veces, resuspendiéndose en tampón fosfato, obteniéndose alrededor de 0,5 litros de concentrado 4-8 x 10*10 UFC/ml. Posteriormente al concentrado se le añadió un ingrediente osmoprotector inerte (lactosa 15%) y se deshidrató en un Liofilizador Virtis en condiciones estándar durante 36 h, obteniéndose unos 40-50 g de peso seco (15% materia activa), con una actividad de 2-4x10*1 1 UFC/g p.s. En dichas condiciones se obtiene un producto con una viabilidad de las células cercana al 100 %, estable y fácil de almacenar y manejar, que a las dosis operativas de 108 UFC/ml permite preparar unos 100 litros de producto listo para ser aplicado en las plantas de cultivo a proteger. Posteriormente se envasó el material en bolsas herméticas al vacío, que conservadas a 4 °C mantienen durante más de un año su vida útil.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Cepa de Lactobacillus plantarum TC92 depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8297, o un muíante de la misma, donde dicho muíante se obtiene uíilizando la cepa Lactobacillus plantarum TC92 como producío de partida y además íiene las siguieníes propiedades del Lactobacillus plantarum TC92:
(i) acíividad aníagonisía freníe a Erwinia amylovora,
(¡i) presencia de los genes pin A, pin B, pin C, pin D, pin J, pin K, pin
M, plnN, pin O, pin P, pin EF y pin I relacionados con la síníesis de planíaricinas,
(iii) capacidad de colonizar o sobrevivir en la flor, hojas y fruíos de las plañías períenecieníes a la familia Rosaceae, y
(iv) capacidad de inhibir infecciones por E. amylovora en flores, fruíos y hojas de plañías de la familia Rosaceae.
2. Uso de la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o de un muíaníe de la misma según se definen en la reivindicación 1 , como plaguicida en plañías.
3. Uso según la reivindicación 2, para el conírol del fuego bacíeriano en plañías de la familia Rosaceae.
4. Uso según la reivindicación 3 donde las plañías de la familia Rosaceae se seleccionan del grupo que consisíe en plañías fruíales y plañías ornameníales.
5. Uso según la reivindicación 4 donde las plañías se seleccionan del grupo que consisíe en peral, manzano, membrillero, níspero, espino de fuego, serbal, mosíajo, acerolo, guillomo, espino albar y durillo.
6. Procedimienfo de obíención de células de una cepa Lactobacillus plantarum TC92 o de un muíaníe de la misma, según se definen en la reivindicación 1 , que comprende:
(i) inocular la cepa Lactobacillus plantarum TC92, o un muíaníe de la misma, en un medio de culíivo seleccionado del grupo que consisíe en medios siníéíicos, medios de origen vegeíal, medios de origen animal, y combinaciones de los mismos (¡i) someter el medio de cultivo inoculado de la etapa (i) a una temperatura entre 25 y 35 °C, un pH entre 5 y 7, y una concentración de oxígeno entre 15 y 30%, hasta alcanzar una concentración celular superior a 1 χ10*9 UFC/ml,
(iii) separar las células de Lactobacillus plantarum TC92 o del muíante de la misma del medio de cultivo, y
(iv) recoger las células de Lactobacillus plantarum TC92 derivadas de la etapa (iii).
7. Procedimiento según la reivindicación 6, que comprende llevar a cabo una etapa (v), después de la etapa (iv), en la que las células se someten a un proceso de deshidratación.
8. Composición que comprende la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o un muíante de la misma según se define en la reivindicación 1 .
9. Composición plaguicida que comprende la cepa Lactobacillus plantarum TC92 según se define en la reivindicación 1 y compuesíos acepíables a nivel agrícola.
10. Composición según la reivindicación 9, donde los compuesíos acepíables a nivel agrícola se seleccionan del grupo que consisíe en fiíoforíificaníes, nuírieníes, humecíaníes, compuesíos que mejoran la adherencia, compuesíos íamponadores, esíabilizaníes, aníioxidaníes, osmoproíecíores y proíecíores solares.
1 1 . Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 que comprende al menos un plaguicida adicional.
12. Composición según la reivindicación 1 1 donde el plaguicida adicional se selecciona del grupo que consisíe en la cepa Lactobacillus plantarum TC54 (deposiíada en la CECT con el número de acceso CECT 8298), la cepa Lactobacillus plantarum PM41 1 (deposiíada en la CECT con el número de acceso CECT 8299), un aníibióíico y un compuesío derivado del cobre.
13. Composición según la reivindicación 12 que comprende Lactobacillus plantarum TC54 y Lactobacillus plantarum PM41 1 .
14. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-13 en el control del fuego bacteriano en plantas de la familia Rosaceae.
15. Extracto de una cepa de Lactobacillus plantarum TC92 o de un muíante de la misma, según se definen en la reivindicación 1 , dicho extracto siendo obtenible mediante el procedimiento que comprende:
(i) inocular la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o un muíante de la misma según se definen en la reivindicación 1 , en un medio de culíivo apropiado,
(¡i) someíer el medio de culíivo inoculado con la eíapa (i) a una íemperaíura eníre 25 y 35 °C, un pH eníre 5 y 7, y una conceníración de oxígeno eníre 15 y 30%, hasía alcanzar una conceníración celular superior a 1 χ10*9 UFC/ml,
(iii) separar las células del medio de culíivo de la eíapa (¡i),
(iv) recoger exíracío libre de células, y
(v) someíer el exíracío de la eíapa (iv) a un proceso de conceníración.
16. Exíracío de Lactobacillus plantarum TC92 o de un muíaníe de la misma, según la reivindicación 15, donde el proceso de conceníración de la eíapa (v) se lleva a cabo medianfe deshidraíación, filíración, u If raf i If ración, cenírifugación, precipiíación o cromaíografía.
17. Composición que comprende el exíracío de Lactobacillus plantarum TC92 o de un muíaníe de la misma, según las reivindicaciones 15-16.
18. Composición plaguicida que comprende el exíracío de Lactobacillus plantarum TC92 o de un muíaníe de la misma, según las reivindicaciones 15-16, y compuesíos acepíables a nivel agrícola.
19. Uso de una composición plaguicida según se define en la reivindicación 18 en el conírol del fuego bacíeriano en plañías de la familia Rosaceae.
20. Méíodo de conírol biológico del fuego bacíeriano en plañías de la familia Rosaceae que comprende el frafamienfo de las plañías con la cepa Lactobacillus plantarum TC92 o un muíaníe de la misma según la reivindicación 1 , el extracto según las reivindicaciones 15-16, la composición según las reivindicaciones 9-13 y/o la composición según la reivindicación 18.
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