CN110563823A - 一种凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法 - Google Patents
一种凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110563823A CN110563823A CN201910973360.2A CN201910973360A CN110563823A CN 110563823 A CN110563823 A CN 110563823A CN 201910973360 A CN201910973360 A CN 201910973360A CN 110563823 A CN110563823 A CN 110563823A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lectin
- boletus
- agglutinin
- chromatography
- leaching
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 title claims abstract description 56
- 239000002523 lectin Substances 0.000 title claims abstract description 56
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 241000222620 Suillus luteus Species 0.000 title description 2
- 241000222455 Boletus Species 0.000 claims abstract description 27
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims abstract description 21
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 21
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 21
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 16
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 15
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 11
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 7
- 238000005360 mashing Methods 0.000 claims description 7
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000021022 fresh fruits Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000013076 target substance Substances 0.000 claims description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 2
- DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N Clorprenaline hydrochloride Chemical compound O.Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=CC=C1Cl DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- RGEMJCLUPGZKTQ-WAUHAFJUSA-N (3s,8r,9s,10r,13s,14s)-3-[2-(dimethylamino)ethoxy]-10,13-dimethyl-1,2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-one Chemical compound C([C@@H]12)C[C@]3(C)C(=O)CC[C@H]3[C@@H]1CC=C1[C@]2(C)CC[C@H](OCCN(C)C)C1 RGEMJCLUPGZKTQ-WAUHAFJUSA-N 0.000 abstract 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222485 Agaricales Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 241000222453 Boletaceae Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N L-Fucose Natural products C[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 241001201267 Sutorius Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000023852 carbohydrate binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000013325 dietary fiber Nutrition 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 1
- NKHAVTQWNUWKEO-UHFFFAOYSA-N fumaric acid monomethyl ester Natural products COC(=O)C=CC(O)=O NKHAVTQWNUWKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- NKHAVTQWNUWKEO-NSCUHMNNSA-N monomethyl fumarate Chemical compound COC(=O)\C=C\C(O)=O NKHAVTQWNUWKEO-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- 229940005650 monomethyl fumarate Drugs 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 235000000053 special nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/375—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Basidiomycetes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法。将新鲜的茶褐牛肝菌子实体粉碎后经浸提、沉淀、离心、透析除盐、冷冻干燥等步骤后得到凝集素粗品。之后经DAEA离子交换柱层析、sephadex G‑100分子凝胶过滤层析等步骤得到茶褐牛肝菌的凝集素。本发明通过对新鲜茶褐牛肝菌进行浸提、沉淀、透析除盐、离子交换、凝胶层析等过程获得了凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素，有助于茶褐牛肝菌活性成分多方位的开发利用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法。
背景技术
茶褐牛肝菌（Sutorius brunneissimus），又名羊肝菌、黑羊肝、黑牛肝等，属于担子菌门、伞菌纲、牛肝菌目、牛肝菌科、异色牛肝菌属，是一种广泛分布于云南、贵州、四川等中国西南地区的药食兼用真菌。研究表明，茶褐牛肝菌具有抗肿瘤、降血糖、保肝利胆、提高人体免疫力、调节内分泌等功能。由于营养方式的特殊，该菌目前尚未人工栽培，对其开发利用正成为国内外学者们的研究热点。
凝集素是一种非免疫来源、不具酶活性、至少具有一个非催化结构域、能可逆地结合特异性单糖或低聚糖的糖蛋白或糖结合蛋白。分子量从几万Da到几十万Da，一般由2或4个亚基构成。根据来源不同可分为植物凝集素、动物凝集素和真菌凝集素等；其中来源于植物、微生物的凝集素属于外源性凝集素，来源于动物的凝集素属于内源性凝集素；根据其在细胞中结合的部位不同可分为可溶性凝集素和膜结合凝集素；还可以根据与糖结合的专一性分为D-甘露糖或D-葡萄糖凝集素、D-半乳糖凝集素、N-乙酰氨基葡萄糖凝集素、N-乙酰氨基半乳糖凝集素、L-岩藻糖凝集素和唾液酸或N-乙酰神经氨酸凝集素等。研究表明，凝集素依靠结合的糖分子与外源细胞相互识别，具有凝集细胞、免疫调节、促有丝分裂、抗癌、抗菌、抗病毒等多种生物学功能。在医学肿瘤治疗研究方面，利用凝集素的糖特异结合性及细胞毒性，凝集素不仅可用于构成免疫毒素，还能用作免疫佐剂和靶向运载工具。目前，人们已经分离纯化了1000多种凝集素，但大多是植物凝集素，仅豆科植物凝集素就达600余种，对大型真菌尤其是牛肝菌类凝集素的研究相对较少。
茶褐牛肝菌含有丰富的蛋白质、氨基酸、膳食纤维、微量元素等营养成分，同时研究还发现其富含麦角甾醇、富马酸单甲酯、烟酰胺等生理活性成分，而目前国内外对茶褐牛肝菌凝集素却尚无报道。本发明通过对新鲜茶褐牛肝菌进行浸提、沉淀、透析除盐、离子交换、凝胶层析等过程获得了凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素，有助于茶褐牛肝菌活性成分多方位的开发利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法。
本发明的目的是这样实现的，包括前处理、浸提、第一次离心、静置沉淀、第二次离心和后处理步骤，具体包括：
A、前处理：选取茶褐牛肝菌新鲜子实体，剪碎，加入Tris-HCl缓冲液于组织捣碎机中捣碎得到物料a；
B、浸提：物料a中加入物料a体积10~15倍的Tris-HCl缓冲液浸提得到浸提液b；
C、第一次离心：将浸提液b经离心处理后弃掉沉淀，收集上清液得到物料c；
D、静置沉淀：将物料c中加入固体硫酸铵至30~40%饱和度，静置沉淀得到物料d；
E、第二次离心：将物料d经离心处理后收集沉淀得到沉淀e；
F、后处理：
1）沉淀e中加入磷酸盐缓冲液透析除盐、冷冻干燥得到凝集素粗品f；
2）将凝集素粗品f经层析后得到目标物茶褐牛肝菌凝集素。
本发明通过对新鲜茶褐牛肝菌进行浸提、沉淀、透析除盐、离子交换、凝胶层析等过程获得了凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素，有助于茶褐牛肝菌活性成分多方位的开发利用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法，包括前处理、浸提、第一次离心、静置沉淀、第二次离心和后处理步骤，具体包括：
A、前处理：选取茶褐牛肝菌新鲜子实体，剪碎，加入Tris-HCl缓冲液于组织捣碎机中捣碎得到物料a；
B、浸提：物料a中加入物料a体积10~15倍的Tris-HCl缓冲液浸提得到浸提液b；
C、第一次离心：将浸提液b经离心处理后弃掉沉淀，收集上清液得到物料c；
D、静置沉淀：将物料c中加入固体硫酸铵至30~40%饱和度，静置沉淀得到物料d；
E、第二次离心：将物料d经离心处理后收集沉淀得到沉淀e；
F、后处理：
1）沉淀e中加入磷酸盐缓冲液透析除盐、冷冻干燥得到凝集素粗品f；
2）将凝集素粗品f经层析后得到目标物茶褐牛肝菌凝集素。
所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01mol/L。
所述的Tris-HCl缓冲液的pH值为7.4。
B步骤中浸提的温度控制在3~5℃。
C、E步骤中离心处理是将浸提液b在转速8000~12000rmp/min的条件下离心10~20min。
C、E步骤中离心处理的温度控制在3~5℃。
D步骤中所述的静置沉淀的温度控制在3~5℃，静置沉淀的时间为12~24h。
F步骤中所述的层析包括DAEA-Cellulose离子交换柱层析和sephadex G-100分子凝胶过滤层析。
所述的层析包括DAEA-Cellulose离子交换柱层析是取凝集素粗品f，用磷酸盐缓冲液溶解，上样于预先用磷酸盐缓冲液平衡过3个柱体积的DAEA-Cellulose离子交换柱上，然后以20ml/h的速度用磷酸盐缓冲液洗脱，收集所需洗脱峰组分，充分透析除盐，冷冻干燥；所述的洗脱峰为第3个洗脱峰。
所述的sephadex G-100分子凝胶过滤层析是取DAEA-Cellulose离子交换柱层析后的凝集素样品，用磷酸盐缓冲液溶解，上样于预先用蒸馏水平衡过的sephadex G-100分子凝胶过滤层析交换柱上，然后以30ml/h的速度用磷酸盐缓冲液洗脱，收集所需洗脱峰组分，充分透析除盐，冷冻干燥得到茶褐牛肝菌凝集素；所述的洗脱峰为第2个洗脱峰。
所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH值为7.4。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
（1）凝集素粗品的提取：茶褐牛肝菌新鲜子实体称重、剪碎，加入少量Tris-Hcl缓冲液（0.01mol/L，pH7.4），组织捣碎机捣碎，然后按照料液比1:10加入Tris-Hcl缓冲液，于4℃条件下浸提24-48h，滤液经过滤后于4℃，12000rmp/min条件下离心15min，弃掉沉淀，收集上清液。加入固体硫酸铵至35%饱和度，4℃条件下透析12h，于4℃，12000rmp/min条件下离心15min，收集沉淀。加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液，0.01mol/L，pH7.4），充分透析除盐，检测凝集活性，冷冻干燥后得到凝集素粗品。
（2）DAEA-Cellulose离子交换柱层析：取步骤（1）凝集素粗品，用磷酸盐缓冲液溶解，上样于预先用磷酸盐缓冲液平衡过3个柱体积的DAEA-Cellulose离子交换柱上，然后以20ml/h的速度用磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰组分，充分透析除盐，冷冻干燥。
（3）sephadex G-100分子凝胶过滤层析：取步骤（2）凝集素样品，用磷酸盐缓冲液溶解，上样于预先用蒸馏水平衡过的sephadex G-100分子凝胶过滤层析交换柱上，然后以30ml/h的速度用磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰组分，充分透析除盐，冷冻干燥得到茶褐牛肝菌凝集素。
实施例2
（1）凝集素粗品的提取：茶褐牛肝菌新鲜子实体称重、剪碎，加入少量Tris-Hcl缓冲液（0.01mol/L，pH7.4），组织捣碎机捣碎，然后按照料液比1:12加入Tris-Hcl缓冲液，于4℃条件下浸提36h，滤液经过滤后于4℃，10000rmp/min条件下离心15min，弃掉沉淀，收集上清液。加入固体硫酸铵至40%饱和度，4℃条件下透析12h，于4℃，10000rmp/min条件下离心15min，收集沉淀。加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液，0.01mol/L，pH7.4），充分透析除盐，检测凝集活性，冷冻干燥后得到凝集素粗品。
（2）DAEA-Cellulose离子交换柱层析：取步骤（1）凝集素粗品，用磷酸盐缓冲液溶解，上样于预先用磷酸盐缓冲液平衡过3个柱体积的DAEA-Cellulose离子交换柱上，然后以20ml/h的速度用磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰组分，充分透析除盐，冷冻干燥。
（3）sephadex G-100分子凝胶过滤层析：取步骤（2）凝集素样品，用磷酸盐缓冲液溶解，上样于预先用蒸馏水平衡过的sephadex G-100分子凝胶过滤层析交换柱上，然后以30ml/h的速度用磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰组分，充分透析除盐，冷冻干燥得到茶褐牛肝菌凝集素。
Claims (10)
1.一种凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法，其特征在于包括前处理、浸提、第一次离心、静置沉淀、第二次离心和后处理步骤，具体包括：
A、前处理：选取茶褐牛肝菌新鲜子实体，剪碎，加入Tris-HCl缓冲液于组织捣碎机中捣碎得到物料a；
B、浸提：物料a中加入物料a体积10~15倍的Tris-HCl缓冲液浸提得到浸提液b；
C、第一次离心：将浸提液b经离心处理后弃掉沉淀，收集上清液得到物料c；
D、静置沉淀：将物料c中加入固体硫酸铵至30~40%饱和度，静置沉淀得到物料d；
E、第二次离心：将物料d经离心处理后收集沉淀得到沉淀e；
F、后处理：
1）沉淀e中加入磷酸盐缓冲液透析除盐、冷冻干燥得到凝集素粗品f；
2）将凝集素粗品f经层析后得到目标物茶褐牛肝菌凝集素。
2.根据权利要求1所述的凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法，其特征在于所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01mol/L。
3.根据权利要求1所述的凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法，其特征在于所述的Tris-HCl缓冲液的pH值为7.4。
4.根据权利要求1所述的凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法，其特征在于B步骤中浸提的温度控制在3~5℃。
5.根据权利要求1所述的凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法，其特征在于C、E步骤中离心处理是将浸提液b在转速8000~12000rmp/min的条件下离心10~20min。
6.根据权利要求1所述的凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法，其特征在于C、E步骤中离心处理的温度控制在3~5℃。
7.根据权利要求1所述的凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法，其特征在于D步骤中所述的静置沉淀的温度控制在3~5℃，静置沉淀的时间为12~24h。
8.根据权利要求1所述的凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法，其特征在于F步骤中所述的层析包括DAEA-Cellulose离子交换柱层析和sephadex G-100分子凝胶过滤层析。
9.根据权利要求8所述的凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法，其特征在于所述的层析包括DAEA-Cellulose离子交换柱层析是取凝集素粗品f，用磷酸盐缓冲液溶解，上样于预先用磷酸盐缓冲液平衡过3个柱体积的DAEA-Cellulose离子交换柱上，然后以20ml/h的速度用磷酸盐缓冲液洗脱，收集第三个洗脱峰组分，充分透析除盐，冷冻干燥。
10.根据权利要求8所述的凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法，其特征在于所述的sephadex G-100分子凝胶过滤层析是取DAEA-Cellulose离子交换柱层析后的凝集素样品，用磷酸盐缓冲液溶解，上样于预先用蒸馏水平衡过的sephadex G-100分子凝胶过滤层析交换柱上，然后以30ml/h的速度用磷酸盐缓冲液洗脱，收集第二个洗脱峰组分，充分透析除盐，冷冻干燥得到茶褐牛肝菌凝集素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910973360.2A CN110563823A (zh) | 2019-10-14 | 2019-10-14 | 一种凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910973360.2A CN110563823A (zh) | 2019-10-14 | 2019-10-14 | 一种凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110563823A true CN110563823A (zh) | 2019-12-13 |
Family
ID=68784914
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910973360.2A Pending CN110563823A (zh) | 2019-10-14 | 2019-10-14 | 一种凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110563823A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003246799A (ja) * | 2002-02-25 | 2003-09-02 | Shizuoka Prefecture | クロカワ由来のレクチンおよびその分離精製法 |
| CN101341888A (zh) * | 2008-08-19 | 2009-01-14 | 北京市农林科学院 | 一种牛肝菌提取物及其制备方法和应用 |
| WO2015058944A1 (en) * | 2013-10-23 | 2015-04-30 | National Institute of Biology | Composition and method for plant protection |
-
2019
- 2019-10-14 CN CN201910973360.2A patent/CN110563823A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003246799A (ja) * | 2002-02-25 | 2003-09-02 | Shizuoka Prefecture | クロカワ由来のレクチンおよびその分離精製法 |
| CN101341888A (zh) * | 2008-08-19 | 2009-01-14 | 北京市农林科学院 | 一种牛肝菌提取物及其制备方法和应用 |
| WO2015058944A1 (en) * | 2013-10-23 | 2015-04-30 | National Institute of Biology | Composition and method for plant protection |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| YU-CHENG DAI等: "Species Diversity and Utilization of Medicinal Mushrooms and Fungi in China", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MEDICINAL MUSHROOMS》 * |
| YU-CHENG DAI等: "Species Diversity and Utilization of Medicinal Mushrooms and Fungi in China", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MEDICINAL MUSHROOMS》, vol. 11, no. 3, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 287 - 302 * |
| 叶选怡等: "二次正交旋转组合设计优化牛肝菌蛋白提取工艺", 《核农学报》 * |
| 叶选怡等: "二次正交旋转组合设计优化牛肝菌蛋白提取工艺", 《核农学报》, vol. 31, no. 04, 21 January 2017 (2017-01-21), pages 728 - 735 * |
| 吴刚等: "摘除"洋帽"，秉承先辈，为中国牛肝菌"正名"", 中国菌物学会第七届全国会员代表大会暨2017年学术年会摘要集, vol. 1, pages 22 - 69 * |
| 张月娇: "牛肝菌、红菇等真菌凝集素初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 * |
| 张月娇: "牛肝菌、红菇等真菌凝集素初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》, 15 July 2019 (2019-07-15), pages 006 - 467 * |
| 李玉等, 中原农民出版社 * |
| 鲍小敏等: "黄牛肝菌凝集素的分离纯化及部分性质", 《四川大学学报(自然科学版)》 * |
| 鲍小敏等: "黄牛肝菌凝集素的分离纯化及部分性质", 《四川大学学报(自然科学版)》, vol. 52, no. 02, 28 March 2015 (2015-03-28), pages 409 - 415 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Meng et al. | Structural characterization and immunomodulating activities of polysaccharides from a newly collected wild Morchella sextelata | |
| JP4420470B2 (ja) | あわび多糖類抽出方法 | |
| Jordan et al. | Structure and properties of polysaccharides from Viscum album (L.) | |
| CN107857806B (zh) | 一种鲟鱼精蛋白及鲟鱼精蛋白多肽的制备方法 | |
| US10835552B2 (en) | Method for preparing linseed polysaccharide having antiviral activity and immunological activity, and use of the linseed polysaccharide | |
| US20210155720A1 (en) | Method for Preparing Hyaluronan Odd-numbered Oligosaccharides by Double Enzyme Hydrolysis | |
| CN108265092B (zh) | 一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖及制备方法 | |
| CN107541533B (zh) | 一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法 | |
| CN115260334B (zh) | 一种桑叶多糖的复合提取工艺 | |
| CN110916198A (zh) | 一种利用黄秋葵发酵酒酒渣同时制备果胶多糖和黏性糖蛋白的方法 | |
| CN114288308A (zh) | 一种以四糖为主的透明质酸寡糖组合物及其制备方法和应用 | |
| CN107602719B (zh) | 一种具有显著辅助抗肿瘤活性的灵芝子实体精制多糖及其制备方法和应用 | |
| CN107216405A (zh) | 一种青稞β‑葡聚糖的制备工艺及其结构序列 | |
| CN113603799B (zh) | 一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物及其制备方法 | |
| CN105420325A (zh) | 一种胎盘多肽的制备方法 | |
| CN116715724B (zh) | 来源于草菇子实体的抗氧化肽及其应用 | |
| CN110563823A (zh) | 一种凝集活性较高的茶褐牛肝菌凝集素的制备方法 | |
| CN110922499B (zh) | 一种富硒化绣球菌多糖及其制备方法和应用 | |
| CN116589604A (zh) | 一种高纯度人参多糖的制备方法 | |
| CN109400748B (zh) | 一种裙带菜硫酸多糖的提取方法及其在调节肠道菌群中的应用 | |
| CN114560959B (zh) | 一种菌菇类提取物的制备方法 | |
| CN116731108A (zh) | 草菇抗氧化肽及其应用 | |
| CN116240256A (zh) | 一种人参糖肽及其制备工艺 | |
| Thuy et al. | Deproteinization in purification of exopolysaccharide from Ophiocordyceps sinensis olive oil-stimulated culture. | |
| CN113307893A (zh) | 一种高纯度灰树花多糖提取物的制备与纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191213 |