CN103797111A - 用于正丙醇产生的微生物 - Google Patents

用于正丙醇产生的微生物 Download PDF

Info

Publication number
CN103797111A
CN103797111A CN201280037553.3A CN201280037553A CN103797111A CN 103797111 A CN103797111 A CN 103797111A CN 201280037553 A CN201280037553 A CN 201280037553A CN 103797111 A CN103797111 A CN 103797111A
Authority
CN
China
Prior art keywords
host cell
seq
sequence
polynucleotide
coding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280037553.3A
Other languages
English (en)
Inventor
P.奥尔森
L.克里斯坦森
S.乔尔根森
T.雷圭拉
B.克里斯坦森
B.柯布曼
T.格罗特克耶尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Publication of CN103797111A publication Critical patent/CN103797111A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes

Abstract

本文中描述了宿主细胞，其包含乳酸脱氢酶活性，乳醛脱氢酶活性，乳醛还原酶活性，丙二醇脱水酶活性，和/或正丙醇脱氢酶活性，其中宿主细胞能够产生正丙醇。本文中亦描述了产生正丙醇的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇的条件下在培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞具有乳酸脱氢酶活性，乳醛脱氢酶活性，乳醛还原酶活性，丙二醇脱水酶活性，和/或正丙醇脱氢酶活性；和(b)回收正丙醇。亦提供了从重组的正丙醇产生聚丙烯的方法。

Description

用于正丙醇产生的微生物
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年5月27日提交的美国临时申请号61/490,989和2011年5月27日提交的美国临时申请号61/490,995的优先权权益。这些申请的全部内容通过提述并入本文。
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
发明背景
对于未来石油供应的忧虑促进了在可再生能源以及其它原材料的可再生来源的领域的研究。生物燃料，如乙醇和生物塑料(例如特别是聚乳酸)为可使用微生物直接从农业来源制备的产品的实例。然后，其它所需产品可使用非酶法化学转化来得到，例如将乙醇脱水为乙烯。
乙烯的聚合提供聚乙烯，其为具有广泛范围的有用用途的塑料类型。乙烯传统上通过精炼的非可再生性化石燃料来产生，但是将生物来源的乙醇脱水为乙烯提供了从可再生的碳源得到乙烯的替代途径，即来自可发酵糖的发酵的乙醇。该工艺已应用于产生“绿色聚乙烯(Green Polyethylene)”，其除了在碳同位素分布方面的微小差异之外，与从石油产生的聚乙烯完全相同。
类似地，可将异丙醇和正丙醇脱水为丙烯，其又可聚合为聚丙烯。如同聚乙烯，使用生物来源的起始材料(即异丙醇或正丙醇)会得到“绿色聚丙烯(GreenPolypropylene)”。然而，不像聚乙烯，从可再生来源的聚乙烯起始材料的产生已证明具挑战性。提出的对于丙烯产生的努力已报道于WO2009/049274，WO2009/103026，WO2009/131286，WO2010/071697，WO2011/031897，WO2011/029166，和WO2011/022651。显而易见，生物产生丙醇的工艺的成功开发需要仔细选择代谢途径中的酶，以及有效的总体代谢工程策略。
本领域中有利的是改进正丙醇产生，作为使用重组DNA技术进行遗传工程改造的结果。
发明内容
在本文中描述了重组宿主细胞，其包含乳酸脱氢酶活性，乳醛脱氢酶活性，乳醛还原酶活性，丙二醇脱水酶活性，和/或正丙醇脱氢酶活性，其中宿主细胞产生(或能够产生)增加量的正丙醇。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)异源多核苷酸，其编码乳酸脱氢酶，乳醛脱氢酶，乳醛还原酶，丙二醇脱水酶，和/或正丙醇脱氢酶，其中当在相同条件下培养时，宿主细胞与不含所述异源多核苷酸的宿主细胞相比，产生(或能够产生)和/或分泌(和/或能够分泌)更多量的正丙醇。所述宿主细胞可进一步包含一种或多种异源多核苷酸，其编码硫解酶；CoA转移酶(例如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶)；乙酰乙酸脱羧酶；和/或异丙醇脱氢酶，其中所述宿主细胞产生(或能够产生)正丙醇和异丙醇两者。在一些方面，所述宿主细胞是乳杆菌属(Lactobacillus)宿主细胞。
亦描述了使用重组宿主细胞以供产生正丙醇的方法。在一个方面，产生正丙醇的方法包括：(a)在适于产生正丙醇的条件下在培养基中培养重组宿主细胞(例如乳杆菌属宿主细胞)，所述重组宿主细胞具有乳酸脱氢酶活性，乳醛脱氢酶活性，乳醛还原酶活性，丙二醇脱水酶活性，和/或正丙醇脱氢酶活性；和(b)回收正丙醇。在一些方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)异源多核苷酸，其编码乳酸脱氢酶，乳醛脱氢酶，乳醛还原酶，丙二醇脱水酶，和/或正丙醇脱氢酶。在另一个方面，产生正丙醇的方法包括：(a)将一种或多种本文中所述的编码乳酸脱氢酶，乳醛脱氢酶，乳醛还原酶，丙二醇脱水酶，和/或正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸转化入宿主细胞(例如，乳杆菌属宿主细胞)；(b)在适于产生正丙醇的条件下在培养基中培养经转化的生物；和(c)回收正丙醇。在所述方法的一些方面，所述宿主细胞进一步包含一种或多种异源多核苷酸，其编码硫解酶；CoA转移酶(例如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶)；乙酰乙酸脱羧酶；和/或异丙醇脱氢酶，并产生正丙醇和异丙醇两者。在所述方法的一些方面，所述宿主细胞是乳杆菌属宿主细胞。
附图说明
图1显示从葡萄糖至正丙醇的代谢途径。
图2显示从葡萄糖至正丙醇和异丙醇的代谢途径。
图3显示路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)乳酸脱氢酶基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:1和2)。
图4显示植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)乳酸脱氢酶基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:3和4)。
图5显示短乳杆菌(Lactobacillus brevis)乳醛脱氢酶基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:5和6)。
图6显示大肠杆菌(Escherichia coli)乳醛脱氢酶基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:7和8)。
图7显示大肠杆菌(Escherichia coli)乳醛还原酶基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:9和10)。
图8显示克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)乳醛还原酶基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:11和12)。
图9显示产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)丙二醇脱水酶β亚基基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:13和14)。
图10显示产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)丙二醇脱水酶γ亚基基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:15和16)。
图11显示路氏乳杆菌丙二醇脱水酶中亚基(medium subunit)基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:17和18)。
图12显示路氏乳杆菌丙二醇脱水酶小亚基基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:19和20)。
图13显示布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)乳醛脱氢酶基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:25和26)。
图14显示布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)乳醛还原酶基因的DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:27和28)。
图15显示pTRGU88的限制性图谱。
图16显示pTRGU130的限制性图谱。
图17显示pTRGU152的限制性图谱。
图18显示pJP042的限制性图谱。
图19显示pBKQ332的限制性图谱。
图20显示pBKQ405的限制性图谱。
图21显示pBKQ175的限制性图谱。
图22显示pBKQ178的限制性图谱。
图23显示pBKQ186的限制性图谱。
图24显示pBKQ156的限制性图谱。
定义
乳酸脱氢酶：术语“乳酸脱氢酶”在本文中定义为催化丙酮酸至乳酸的可逆转化的酶(例如EC1.1.1.27或EC1.1.1.28)。所述乳酸脱氢酶可为L-乳酸脱氢酶或D-乳酸脱氢酶。所述乳酸脱氢酶可为单体，或为在细胞条件下包含两个或更多个亚基(例如两个杂聚亚基)的蛋白复合物的形式。乳酸脱氢酶活性可如本领域中所述，例如如Q.Jin等,2009,J Biotechnol144(2):160-164所述自不含细胞的提取物确定。例如，乳酸脱氢酶活性可在含有15mM NAD+和100mM的L-乙酸的锂盐(Sigma–Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)的100mMTris–HCl(pH8.0)溶液中通过监控342nm处的光密度来确定。
乳醛脱氢酶：术语“乳醛脱氢酶”在本文中定义为催化L-乳酸至L-乳醛的可逆转化的酶(例如EC1.2.1.22)。所述乳醛脱氢酶可为单体，或为在细胞条件下包含两个或更多个亚基(例如两个杂聚亚基)的蛋白复合物的形式。乳醛脱氢酶活性可如本领域中所述，例如如J.Rodriguiz-Zavala等,2009,Protein Science15(6):1387-1396所述自不含细胞的提取物确定。例如，乳醛脱氢酶活性可在含有100mM H2NaPO4(pH7.5)，100mM NaCl，20mM2-巯基乙醇，和2mMNAD+的缓冲液中通过添加L-乳醛并追踪由于NADH形成所致的荧光增加(对于激发为340nm和在460nm记录发射)来确定。
乳醛还原酶：术语“乳醛还原酶”在本文中定义为催化L-乳醛至L-1,2-丙二醇的可逆转化的酶(例如EC1.1.1.55或EC1.1.1.77)。所述乳醛还原酶可为单体，或为在细胞条件下包含两个或更多个亚基(例如两个杂聚亚基)的蛋白复合物的形式。乳醛还原酶活性可如本领域中所述，例如如A.Boronat和J.Aguilar,1979,J.Bacteriol.140,320-326所述自不含细胞的提取物确定。例如，乳醛还原酶活性可在25℃在含有2.5mM L-乳醛和0.125mM NADH的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中通过在340nm测量NADH降低来确定。
丙二醇脱水酶：术语“丙二醇脱水酶”在本文中定义为催化L-1,2-丙二醇至丙醛的可逆转化的酶(例如4.2.1.28)。所述丙二醇脱水酶可为单体，或为在细胞条件下包含两个或更多个亚基(例如两个杂聚亚基)的蛋白复合物的形式。丙二醇脱水酶活性可如本领域中所述，例如如D.Sriramulul等,2008,J.Bacteriol.190:4559-4567所述自不含细胞的提取物确定。例如，丙二醇脱水酶活性可使用“3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone)方法”(T.Toraya等,1977,J.Biol.Chem.252:963-970)来确定，其中测定混合物含有丙二醇脱水酶，0.2M1,2-丙二醇，0.05M KCl，0.035M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，和15μM腺苷钴胺素，总体积为1.0mL。在37℃温育10分钟之后，通过添加1mL的0.1M柠檬酸钾缓冲液(pH3.6)和0.5mL的0.1%盐酸MBTH来终止酶反应。在37℃进行15分钟之后，添加1mL的水，并根据305nm处的吸光度确定丙醛的量。
正丙醇脱氢酶：术语“正丙醇脱氢酶”在本文中定义为催化丙醛至正丙醇的还原的任何醇脱氢酶(例如，EC1.1.1.1)。所述正丙醇脱氢酶可为单体，或为在细胞条件下包含两个或更多个亚基(例如两个杂聚亚基)的蛋白复合物的形式。正丙醇脱氢酶活性可如本领域中所述，例如如C.Drewke和M.Ciriacy,1988,Biochemica et Biophysica Acta,950:54-60所述自不含细胞的提取物确定。例如，正丙醇脱氢酶活性可遵循在pH8.3的NADH氧化的NAD+还原的动力学来以分光光度法测量。
硫解酶：术语“硫解酶”在本文中定义催化两个分子的乙酰CoA至乙酰乙酰CoA和CoA的化学反应的酰基转移酶(例如，EC2.3.1.9)。所述硫解酶可为单体，或为在细胞条件下包含两个或更多个亚基(例如两个杂聚亚基)的蛋白复合物的形式。硫解酶活性可如本领域中所述，例如如D.P.Wiesenborn等,1988,Appl.Environ.Microbiol.54:2717-2722所述自不含细胞的提取物确定。例如，硫解酶活性可通过监控与使用100mM Tris盐酸(pH7.4)，1.0mM乙酰CoA，0.2mM NADH，1mM二硫苏糖醇，和2U的3-羟酰基-CoA脱氢酶中的3-羟酰基-CoA脱氢酶的NADH氧化偶联的缩合反应来以分光光度法测量。在将小杯中的内含物在30℃平衡2分钟之后，通过添加10μL中的约125ng硫解酶来起始反应。测量在340nm由于NADH的氧化所致的吸光度减少，并使用6.22mM-1cm-1的消光系数。
CoA转移酶：如用于本文中，术语“CoA转移酶”定义为催化从乙酰乙酰CoA去除辅酶A以生成乙酰乙酸的任何酶。在一些方面，所述CoA转移酶是EC2.8.3.9的乙酰乙酰CoA:乙酸/丁酸CoA转移酶。在一些方面，所述CoA转移酶是EC3.1.2.11的乙酰乙酰CoA水解酶。在一些方面，所述CoA转移酶是将乙酰乙酰CoA和乙酸转化为乙酰乙酸和乙酰CoA的乙酰乙酰CoA转移酶。
在一些方面，所述CoA转移酶是琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶。如用于本文中“琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶”是催化乙酰乙酰CoA和琥珀酸至乙酰乙酸和琥珀酰CoA的化学反应的乙酰转移酶(EC2.8.3.5)。所述琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶可为包含两个或更多个如本文中所述的亚基(例如两个杂聚亚基)的蛋白复合物形式。琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性可如本领域中所述，例如如L.Stols等,1989,Protein Expression and Purification53:396-403所述自不含细胞的提取物确定。例如，琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性可通过监控乙酰乙酰CoA的烯醇型阴离子的形成来以分光光度法测量，其中吸光度在50mM Tris，pH9.1中的67mM乙酰乙酸锂，300μM琥珀酰CoA，和15mMMgCl2的测定缓冲液中在310nm/30℃测量4分钟。
乙酰乙酸脱羧酶：术语“乙酰乙酸脱羧酶”在本文中定义为催化乙酰乙酸至二氧化碳和丙酮的化学反应(例如，EC4.1.1.4)的酶。所述乙酰乙酸脱羧酶可为单体，或为在细胞条件下包含两个或更多个亚基(例如两个杂聚亚基)的蛋白复合物的形式。乙酰乙酸脱羧酶活性可如本领域中所述，例如如D.J.Petersen,等,1990,Appl.Environ.Microbiol.56,3491-3498所述自不含细胞的提取物确定。例如，乙酰乙酸脱羧酶活性可通过监控在26℃在5nM乙酰乙酸，0.1M KPO4，pH5.9中乙酰乙酸的损耗(depletion)以分光光度法来测量。
异丙醇脱氢酶：术语“异丙醇脱氢酶”在本文中定义为催化丙酮至异丙醇的还原的任何合适的氧还酶(例如任何合适的EC1.1.1.1或EC1.1.1.80的酶)。所述异丙醇脱氢酶可为单体，或为在细胞条件下包含两个或更多个亚基(例如两个杂聚亚基)的蛋白复合物的形式。乙酰乙酸脱羧酶活性可如本领域中所述自不含细胞的提取物以分光光度法确定，例如，在25℃在包含25mM磷酸钾,pH7.2中的200μM NADPH和10mM丙酮的测定法中通过340nm处的吸光度的减少来确定。
丙酮酸脱羧酶：术语“丙酮酸脱羧酶“在本文中定义为催化丙酮酸脱羧为乙醛的酶(例如，EC4.1.1.1)。丙酮酸脱羧酶活性可如本领域中所述，例如J.Wang等,2001,Biochemistry,40:1755-1763所述自不含细胞的提取物确定。例如，丙酮酸脱羧酶活性可通过在25℃，pH6.0监控NADH的醛脱氢酶偶联的消耗来以分光光度法测量。
丙醛脱氢酶：术语“丙醛脱氢酶”在本文中定义为催化丙醛至丙酰CoA的转化的酶。丙醛脱氢酶活性可如本领域中所述，例如如N.Hosoi等,1979,J.Ferment.Technol.,57:418-427所述自不含细胞的提取物确定。例如，丙醛脱氢酶活性可通过在30℃使用含有100μmol丙醛，3μmol NAD+，0.3μmol CoA，30μmol GSH，100μg牛血清白蛋白，120μmol佛罗那(veronal)-HCl缓冲液(pH8.6)的3mL溶液藉由340nm处的吸光度增加而监控NAD+的减少来以分光光度法测量。
异源多核苷酸：术语“异源多核苷酸”在本文中定义为对于宿主细胞并非天然的多核苷酸；其中已对编码区进行一种或多种(例如几种)结构修饰的天然多核苷酸；作为通过重组DNA技术(例如，连接于所述多核苷酸的不同的(外来)启动子)操纵DNA的结果其表达定量改变的天然多核苷酸；或其表达通过将一个或多个(几个)额外拷贝的多核苷酸导入宿主细胞而定量改变的天然多核苷酸。
分离的/纯化的：术语“分离的”和“纯化的”意指从至少一种与其天然结合(associated)的成分分离的多肽或多核苷酸。举例而言，如通过SDS-PAGE确定的，该多肽可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，至少93%纯，至少95%纯，至少97%纯，至少98%纯，或至少99%纯；且如通过琼脂糖电泳确定的，该多核苷酸可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，至少93%纯，至少95%纯，至少97%纯，至少98%纯，或至少99%纯。
编码序列：术语“编码序列”的意思是指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码序列的边界一般由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成多核苷酸和/或重组多核苷酸的序列。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指提及的多肽序列在任何翻译后修饰(如N-末端加工和/或C-末端截短)之后的部分。成熟独特序列可例如基于SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6)或InterProScan程序(The EuropeanBioinformatics Institute)来预测。在一些情况下，所述成熟多肽序列可与整个提及的多肽序列相同。在本领域中已知，宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽序列(即具有不同的C端和/或N端)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指提及的多核苷酸序列编码成熟多肽序列的部分。成熟多肽编码序列可例如基于SignalP程序(见上文)或InterProScan程序(见上文)来预测。在一些情况下，所述成熟多肽编码序列可与整个提及的多核苷酸序列相同。
片段：术语“片段”意指从提及的多肽序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽。在一个方面，所述片段具有乳酸脱氢酶，乳醛脱氢酶，乳醛还原酶，丙二醇脱水酶，或正丙醇脱氢酶活性。在另一个方面，片段中的氨基酸残基的数量为SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、或24中的氨基酸残基的数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%或95%。
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从提及的核苷酸序列的5'和/或3'端缺失了一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸。在一个方面，所述亚序列编码具有乳酸脱氢酶，乳醛脱氢酶，乳醛还原酶，丙二醇脱水酶，或正丙醇脱氢酶活性的片段。在另一个方面，亚序列中的核苷酸残基的数量为SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、或19中的核苷酸残基的数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%或95%。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
序列同一性：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数“序列同一性”所描述。
就本文中所述而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套组(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)，Rice等，2000，Trends Genet.16:276-277)的Needle程序(优选为3.0.0版或之后的版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定的。所用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)
就本文中所述而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套组(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)，Rice等，2000，见上)的Needle程序(优选为3.0.0版或之后的版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)确定的。所用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为”最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：
(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口总数)
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达可通过本领域中已知的技术测量(例如，以检测增加的表达)，如通过测量mRNA和/或翻译的多肽的水平来测量。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指包含一个或多个(例如几个)调控序列的多核苷酸。所述多核苷酸可为单链或双链，且可分离自天然存在的基因，或经修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或为合成的。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对于多肽表达所必需的核酸序列。调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外来的，且对于彼此可以是天然的或外来的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列和转录终止子序列。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸的编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并与调控序列可操作地连接，其中所述调控序列提供编码所述多肽的多核苷酸的表达。最低限度，所述表达载体包含启动子序列，和转录和翻译终止信号序列。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于用核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)，所述核酸构建体或表达载体包含一种或多种(例如两种，几种)本文中所述的多核苷酸(例如一种或多种编码乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶、或正丙醇脱氢酶的多核苷酸)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，其由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。
破坏：术语“破坏”意指在宿主细胞内编码具有酶活性的多肽的多核苷酸的启动子、编码区和/或终止子部分地或完全地受修饰(如通过一个或多个核苷酸的修饰、缺失、插入和/或取代)，导致宿主细胞的所述酶活性的缺失或减少。酶活性的缺失或降低可通过本领域中已知的技术直接测量(如本文中提及的不含细胞的提取物测量)；或若存在，通过相应的mRNA的缺失或减少(例如至少50%减少，至少60%减少，至少70%减少，至少80%减少，或至少90%减少)；相应的具有酶活性的多肽的量的缺失或减少(例如至少50%减少，至少60%减少，至少70%减少，至少80%减少，或至少90%减少)；或相应的具有酶活性的多肽的比活性的缺失或减少(例如至少50%减少，至少60%减少，至少70%减少，至少80%减少，或至少90%减少)来测量。特定感兴趣的基因的破坏可根据本领域中已知的方法来生成，例如通过定向的同源重组(参见Methods in Yeast Genetics(1997版),Adams,Gottschling,Kaiser和Stems,ColdSpring Harbor Press(1998))；或通过RNAi或反义技术来生成。
体积生产力：术语“体积生产力”指每单位时间每体积(例如，培养基及其中内含物的总体积)使用的系统所产生的提及的产物的量(例如，产生的正丙醇的量)。
发酵培养基：术语“发酵培养基”指包含一种或多种(例如几种)糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖的培养基，其中所述培养基能够部分地通过宿主细胞转化(发酵)为所需产物，如正丙醇。在一些情况下，所述发酵培养基源自天然来源，如甘蔗，淀粉，或纤维素，并可为通过酶水解(糖化)而预处理所述来源的结果。
在本文中，提及“约”某值或参数包括了涉及该值或参数本身的方面。举例而言，提及“约X”的描述包括了“X”的方面。当与测量值组合使用时，“约”包含涵盖至少与测量特定值的方法相关的不确定性的范围，并可包含在所提出的值左右加减两个标准偏差的范围。
如用于本文中和所附权利要求中，除非上下文明确地表示相反，单数形式“一(个/种…)(a)”和/或“所述/该(the)”包括了对复数的提及。应理解本文中所述的各方面包括了“由…组成(consisting)”和/或“基本上由…组成(consistingessentially of)”的方面。
除非另行定义或上下文明确指出，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域一般技术人员通常理解的相同的含意。
发明详述
本文中至少部分描述了在重组宿主细胞中增加特定基因的表达以增强正丙醇的产生。所述宿主细胞可包含乳酸脱氢酶活性，乳醛脱氢酶活性，乳醛还原酶活性，丙二醇脱水酶活性，和/或正丙醇脱氢酶活性以产生正丙醇，例如，如图1所描绘的。所述宿主细胞可进一步包含硫解酶活性，CoA-转移酶活性(例如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性)，乙酰乙酸脱羧酶活性，和/或异丙醇脱氢酶活性，以产生正丙醇和异丙醇两者，例如如图2所描绘的。
图1和2中所示的乳酸脱氢酶，乳醛脱氢酶，乳醛还原酶，丙二醇脱水酶，和/或正丙醇脱氢酶转化，和图2中所示的硫解酶，CoA-转移酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶转化可得自编码每种多肽的异源多核苷酸的活性，或得自补充一种或多种本文中所述异源多核苷酸的活性的内源基因表达的活性组合。可在培养条件下过表达任何合适的乳酸脱氢酶，乳醛脱氢酶，乳醛还原酶，丙二醇脱水酶，正丙醇脱氢酶，硫解酶，CoA-转移酶，乙酰乙酸脱羧酶，和/或异丙醇脱氢酶以增加正丙醇(或任选地，异丙醇)的效价。
乳酸脱氢酶和编码乳酸脱氢酶的多核苷酸
在本文中所述的重组宿主细胞和方法的一些方面，所述宿主细胞具有乳酸脱氢酶活性。所述乳酸脱氢酶可为任何适用于本文中所述的宿主细胞及其使用方法的任何乳酸脱氢酶，如天然存在的乳酸脱氢酶或其保留乳酸脱氢酶活性的变体。在一个方面，所述乳酸脱氢酶存在于宿主细胞的胞质溶胶中。在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸。
在一些方面，当在相同条件下培养时，包含一种或多种(例如两种，几种)编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码乳酸脱氢酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有增加水平的乳酸脱氢酶活性。在一些方面，当在相同条件下培养时，所述包含一种或多种编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码具有乳酸脱氢酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的乳酸脱氢酶活性。
在一些方面，所述宿主细胞包含编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸选自下组：(a)编码乳酸脱氢酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:2，4，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与SEQ ID NO:1，3，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链杂交；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1，3，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性。如本领域技术人员可知晓，所述编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸可符合上述指出的选择(a)、(b)和(c)的多于一条。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码乳酸脱氢酶，所述乳酸脱氢酶与SEQID NO:2，4，或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，乳酸脱氢酶序列与SEQ ID NO:2，4，或其成熟多肽序列相差不超过10个氨基酸，例如相差不超过5个氨基酸，不超过4个氨基酸，不超过3个氨基酸，不超过2个氨基酸，或相差1个氨基酸。
在一个方面，所述乳酸脱氢酶包含或组成为(consist of)：SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列，SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列，其等位变体，或前述的具有乳酸脱氢酶活性的片段。在另一个方面，所述乳酸脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列。在另一个方面，所述乳酸脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列。在另一个方面，所述乳酸脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至326或SEQ ID NO:4的氨基酸1至309。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码乳酸脱氢酶，所述乳酸脱氢酶在SEQID NO:2，4，或其成熟多肽序列的一个或多个(例如两个，几个)位置具有氨基酸取代、缺失和/或插入。氨基酸取代意指对应于提及的序列的某位置的氨基酸是不同的；氨基酸缺失意指对应于提及的序列的某位置的氨基酸不存在；而氨基酸插入意指存在在提及的序列的对应位置不存在的氨基酸。在这些方面中的一些，SEQ ID NO:2，4或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1。
一般地，氨基酸改变的性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
或者，氨基酸改变具有这样的性质：使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改善乳酸脱氢酶的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。
能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定乳酸脱氢酶中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的乳酸脱氢酶活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。乳酸脱氢酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见，例如de Vos等,1992,Science255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与其它乳酸脱氢酶的同一性分析来推断，所述乳酸脱氢酶与提及的乳酸脱氢酶相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法接着进行有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene46:145；Ner等,1988,DNA7:127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性乳酸脱氢酶的诱变的DNA分子，并且使用本领域中的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
在一个方面，所述编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1，3，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链(参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。
在一个方面，所述编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸与SEQ ID NO:1，3，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个方面，所述编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:1，3，或其成熟多肽编码序列的序列。在一个方面，所述编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:1或3的序列。在一个方面，所述编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列。在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸1至981或SEQ ID NO:3的核苷酸1至930。在一个方面，所述编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:1，3，或其成熟多肽编码序列的亚序列，其中所述亚序列编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽。在一个方面，所述亚序列中的核苷酸残基数为SEQ ID NO:1或3中的核苷酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码SEQ ID NO:2，4，或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有乳酸脱氢酶活性。在一个方面，片段中的氨基酸残基数是SEQ ID NO:2或4中的氨基酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
所述乳酸脱氢酶可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽融合于乳酸脱氢酶的N端或C端。可通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于编码乳酸脱氢酶的多核苷酸来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的调控下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science266:776-779)。
融合多肽还可以包含在两个多肽之间的切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World4:35-48中的位点。
用于分离或克隆编码多核苷酸，如编码乳酸脱氢酶的多核苷酸，以及任何其它多核苷酸的技术是本领域内已知的，且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共享的结构特征的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods andApplication,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从曲霉属(Aspergillus)菌株，或其他或相关生物体克隆所述多核苷酸，并且因此可为例如核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体。
SEQ ID NO:1，3的多核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ ID NO:2，4的氨基酸序列；或其片段，可用于设计核酸探针以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码乳酸脱氢酶的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，例如至少14个核苷酸，至少25个核苷酸，至少35个核苷酸，和至少70个核苷酸的长度。所述核酸探针可更长，例如至少100个核苷酸，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸的长度。可使用甚至更长的探针，如至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以供检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。
可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1，3，或其亚序列同源的克隆或DNA，所述载体材料可用于Sounthern印迹。
就如上所述的探针而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO:1或3，SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列，或其全长互补链；或前述序列的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1或3。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2，4的多肽或其片段的多核苷酸。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45℃(非常低严格性)，在50℃(低严格性)，在55℃(中严格性)，在60℃(中-高严格性)，在65℃(高严格性)，和在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)计算的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5%NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。
本文中所述的编码乳酸脱氢酶的多核苷酸可以获得自任何属的微生物。如用于本文中，与给定的来源有关的术语“获得自”意思应为由多核苷酸编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。
所述乳酸脱氢酶可以是细菌乳酸脱氢酶。例如，所述乳酸脱氢酶可以是革兰氏阳性细菌乳酸脱氢酶例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)乳酸脱氢酶；或革兰氏阴性细菌乳酸脱氢酶，如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)乳酸脱氢酶。
在一个方面，所述乳酸脱氢酶是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)乳酸脱氢酶。
在另一个方面，所述乳酸脱氢酶是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)乳酸脱氢酶。在另一个方面，所述乳酸脱氢酶是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)乳酸脱氢酶。
在一个方面，所述乳酸脱氢酶是乳杆菌属乳酸脱氢酶，如SEQ ID NO:2的路氏乳杆菌乳酸脱氢酶或SEQ ID NO:4的植物乳杆菌乳酸脱氢酶。
所述乳酸脱氢酶可为真菌乳酸脱氢酶。在一个方面，所述真菌乳酸脱氢酶为酵母乳酸脱氢酶，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)乳酸脱氢酶。
在另一个方面，所述乳酸脱氢酶是丝状真菌乳酸脱氢酶，如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)乳酸脱氢酶。
在另一个方面，所述乳酸脱氢酶是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)乳酸脱氢酶。
在另一个方面，所述乳酸脱氢酶是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黄曲霉、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Asperigullus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)乳酸脱氢酶。
可理解的是对于前述的种，涵盖了完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。
其它可用于本文中所述的宿主细胞和使用方法的乳酸脱氢酶候选者包括但不限于获得自瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、米根霉(Rhizopus oryzae)或牛类来源如牛(Bos taurus)的L-乳酸脱氢酶基因，和获得自瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、Lactobacillus bulgaricus、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和乳酸片球菌的D-乳酸脱氢酶基因。例如，所述乳酸脱氢酶可为SEQ ID NO:34的瑞士乳杆菌乳酸脱氢酶(由SEQ ID NO:33的多核苷酸序列编码)或SEQ ID NO:36的巨大芽孢杆菌乳酸脱氢酶(由SEQ ID NO:35的多核苷酸序列编码)。任何本文中所述的涉及其序列同一性、杂交、氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亚序列的方面也适用于上述乳酸脱氢酶。
在一些方面，在相同条件下，所述乳酸脱氢酶具有SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列的乳酸脱氢酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%。
亦可使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)获得的DNA样品鉴定和获得所述乳酸脱氢酶。用于从天然生境(habitat)直接分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。然后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码乳酸脱氢酶的多核苷酸。一旦用如本文中所述的合适探针检测到编码乳酸脱氢酶的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员已知的技术将所述序列分离或克隆(参见，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。
乳醛脱氢酶和编码乳醛脱氢酶的多核苷酸
在重组宿主细胞和及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞具有乳醛脱氢酶活性。所述乳醛脱氢酶可为任何适用于本文中所述的宿主细胞及其使用方法的任何乳醛脱氢酶，如天然存在的乳醛脱氢酶或其保留乳醛脱氢酶活性的变体。在一个方面，所述乳醛脱氢酶存在于宿主细胞的胞质溶胶中。在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸。
在一些方面，当在相同条件下培养时，包含一种或多种(例如两种，几种)编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码乳醛脱氢酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有增加水平的乳醛脱氢酶活性。在一些方面，当在相同条件下培养时，所述包含一种或多种编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码具有乳醛脱氢酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的乳醛脱氢酶活性。
在一些方面，所述宿主细胞包含编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸选自下组：(a)编码乳醛脱氢酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:6，8，26或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与SEQ ID NO:5，7，25，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链杂交；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:5，7，25，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性。如本领域技术人员可知晓，在一些情况下，所述编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸可符合上述指出的选择(a)、(b)和(c)的多于一条。
在一个方面，所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，所述乳醛脱氢酶与SEQ IDNO:6，8，26或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，乳醛脱氢酶序列与SEQ ID NO:6，8，26或其成熟多肽序列相差不超过10个氨基酸，例如相差不超过5个氨基酸，不超过4个氨基酸，不超过3个氨基酸，不超过2个氨基酸，或相差1个氨基酸。
在一个方面，所述乳醛脱氢酶包含或组成为(consist of)SEQ ID NO:6或8的氨基酸序列，SEQ ID NO:6或8的成熟多肽序列，其等位变体，或前述的具有乳醛脱氢酶活性的片段。在另一个方面，所述乳醛脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:6，8或26的氨基酸序列。在另一个方面，所述乳醛脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:6，8或26的成熟多肽序列。在另一个方面，所述乳醛脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:6的氨基酸1至516，SEQ ID NO:8的氨基酸1至479，或SEQ ID NO:26的氨基酸1至516。
例如，在一个方面，所述异源多核苷酸编码乳醛脱氢酶，所述乳醛脱氢酶具有SEQ ID NO:6，8，26或其成熟多肽序列的一个或多个(例如两个，几个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入，如上文所述。在一些方面，SEQ IDNO:6，8，26或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1。
在一个方面，所述编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:5，7，25，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链(参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上文)。
在一个方面，所述编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸与SEQ ID NO:5，7，25，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个方面，所述编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:5，7，25，或其成熟多肽编码序列的序列。在一个方面，所述编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:5，7，25的序列。在一个方面，所述编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:5，7，25的成熟多肽编码序列，在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸1至1551，SEQID NO:7的核苷酸1至1440或SEQ ID NO:25的核苷酸1至1551。在一个方面，所述异源多核苷酸包含SEQ ID NO:5，7，25，或其成熟多肽编码序列的亚序列，其中所述亚序列编码具有乳醛脱氢酶活性的多肽。在一个方面，所述亚序列中的核苷酸残基数为SEQ ID NO:5，7，25中的核苷酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码SEQ ID NO:6，8，26，或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有乳醛脱氢酶活性。在一个方面，片段中的氨基酸残基数是SEQ ID NO:6，8，26中的氨基酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
所述乳醛脱氢酶亦可为乳醛脱氢酶的等位变体或人工变体。
所述乳醛脱氢酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。
用于分离或克隆编码乳醛脱氢酶的多核苷酸的技术如上文所述。
SEQ ID NO:5，7，25的多核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ ID NO:6，8，26的氨基酸序列；或其片段，可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码乳醛脱氢酶的DNA，如上文所述。可对从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与如上所述的探针杂交并编码乳醛脱氢酶的DNA，如上文所述。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:5，7或25。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:5，7或25的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:6，8，26，其成熟多肽序列，或前述的片段的多核苷酸序列。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格和洗涤条件如上文所述定义。对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格和洗涤条件如上文所述定义。
编码乳醛脱氢酶的多核苷酸可以获得自任何属的微生物。在一个方面，所述乳醛脱氢酶可为获得自本文中所述的微生物的细菌、酵母或丝状真菌乳醛脱氢酶。在另一个方面，所述乳醛脱氢酶是乳杆菌属乳醛脱氢酶，如SEQ IDNO:6的短乳杆菌乳醛脱氢酶或SEQ ID NO:26的布氏乳杆菌乳醛脱氢酶。在另一个方面，所述乳醛脱氢酶是埃希氏菌属(Escherichia)乳醛脱氢酶，如SEQID NO:8的大肠杆菌乳醛脱氢酶。
其它可用于本文中所述的宿主细胞和使用方法的乳醛脱氢酶候选者包括但不限于SEQ ID NO:30的干酪乳杆菌乳醛脱氢酶(由SEQ ID NO:29的多核苷酸序列编码；UNIPROT:D8GC01)，和SEQ ID NO:32的希氏乳杆菌乳醛脱氢酶(由SEQ ID NO:31的多核苷酸序列编码；UNIPROT:C0XL11)。任何本文中所述的涉及其序列同一性、杂交、氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亚序列的方面也适用于上述乳醛脱氢酶。
在一些方面，在相同条件下，所述乳醛脱氢酶具有SEQ ID NO:6，8或26的成熟多肽序列的乳醛脱氢酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%。
亦可如上文所述从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)获得的DNA样品鉴定和获得所述乳醛脱氢酶。
乳醛还原酶和编码乳醛还原酶的多核苷酸
在重组宿主细胞和及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞具有乳醛还原酶活性。所述乳醛还原酶可为任何适用于本文中所述的宿主细胞及其使用方法的任何乳醛还原酶，如天然存在的乳醛还原酶或其保留乳醛还原酶活性的变体。在一个方面，所述乳醛还原酶存在于宿主细胞的胞质溶胶中。在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码乳醛还原酶的异源多核苷酸。
在一些方面，当在相同条件下培养时，包含一种或多种(例如两种，几种)编码乳醛还原酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码乳醛还原酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有增加水平的乳醛还原酶活性。在一些方面，当在相同条件下培养时，所述包含一种或多种编码乳醛还原酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码具有乳醛还原酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的乳醛还原酶活性。
在一些方面，所述宿主细胞包含编码乳醛还原酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述编码乳醛还原酶的异源多核苷酸选自下组：(a)编码乳醛还原酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:10，12，28，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与SEQ ID NO:9，11，27，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链杂交；和(c)多核苷酸，其与SEQ IDNO:9，11，27，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性。如本领域技术人员可知晓，在一些情况下，所述编码乳醛还原酶的异源多核苷酸可符合上述指出的选择(a)、(b)和(c)的多于一条。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码乳醛还原酶，所述乳醛还原酶与SEQID NO:10，12，28，或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，乳醛还原酶序列与SEQ ID NO:10，12，28或其成熟多肽序列相差不超过10个氨基酸，例如相差不超过5个氨基酸，不超过4个氨基酸，不超过3个氨基酸，不超过2个氨基酸，或相差1个氨基酸。
在一个方面，所述乳醛还原酶包含或组成为(consist of)SEQ ID NO:10，12，或28的氨基酸序列，SEQ ID NO:10，12，或28的成熟多肽序列，其等位变体，或前述的具有乳醛还原酶活性的片段。在另一个方面，所述乳醛还原酶包含或组成为SEQ ID NO:10，12，或28的氨基酸序列。在另一个方面，所述乳醛还原酶包含或组成为SEQ ID NO:10，12，或28的成熟多肽序列。在另一个方面，所述乳醛还原酶包含或组成为SEQ ID NO:10的氨基酸1至383，SEQ ID NO:12的氨基酸1至382，或SEQ ID NO:28的氨基酸1至389。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码乳醛还原酶，所述乳醛还原酶具有SEQ ID NO:10，12，28，或其成熟多肽序列的一个或多个(例如两个，几个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入，如上文所述。在一些方面，SEQ ID NO:10，12，28，或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1。
在一个方面，所述编码乳醛还原酶的异源多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:9，11，27，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链(参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上文)。
在一个方面，所述编码乳醛还原酶的异源多核苷酸与SEQ ID NO:9，11，27，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个方面，所述编码乳醛还原酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:9，11，27，或其成熟多肽编码序列。在一个方面，所述编码乳醛还原酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:9，11，或27的序列。在一个方面，所述编码乳醛还原酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:9，11，或27的成熟多肽编码序列，在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:9的核苷酸1至1152，SEQID NO:11的核苷酸1至1149或SEQ ID NO:27的核苷酸1至1170。在一个方面，所述异源多核苷酸包含SEQ ID NO:9，11，27，或其成熟多肽编码序列的亚序列，其中所述亚序列编码具有乳醛还原酶活性的多肽。在一个方面，所述亚序列中的核苷酸残基数为SEQ ID NO:9，11，27中的核苷酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码SEQ ID NO:10，12，28，或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有乳醛还原酶活性。在一个方面，片段中的氨基酸残基数是SEQ ID NO:10，12，28中的氨基酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
所述乳醛还原酶亦可为乳醛还原酶的等位变体或人工变体。
所述乳醛还原酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。
用于分离或克隆编码乳醛还原酶的多核苷酸的技术如上文所述。
SEQ ID NO:9，11，27的多核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ ID NO:10，12，28的氨基酸序列；或其片段，可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码乳醛还原酶的DNA，如上文所述。可对从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与如上所述的探针杂交并编码乳醛还原酶的DNA，如上文所述。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:9，11或27。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:9，11或27的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:10，12，28，其成熟多肽序列，或前述的片段的多核苷酸序列。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格和洗涤条件如上文所述定义。对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格和洗涤条件如上文所述定义。
编码乳醛还原酶的多核苷酸可以获得自任何属的微生物。在一个方面，所述乳醛还原酶可为获得自本文中所述的微生物的细菌、酵母或丝状真菌乳醛还原酶。在另一个方面，所述乳醛还原酶是乳杆菌属乳醛还原酶。在另一个方面，所述乳醛还原酶是埃希氏菌属乳醛还原酶，如SEQ ID NO:10的大肠杆菌乳醛还原酶。在另一个方面，所述乳醛还原酶是柠檬酸杆菌属(Citrobacter)乳醛还原酶，如SEQ ID NO:12的Citrobacter koseri乳醛还原酶。
其它可用于本文中所述的宿主细胞和使用方法的乳醛还原酶候选者包括但不限于SEQ ID NO:54的肠沙门氏菌(Salmonella enterica)乳醛还原酶(由SEQ ID NO:53的多核苷酸序列编码；UNIPROT:E7XFN0)，和SEQ ID NO:56的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)乳醛还原酶(由SEQ ID NO:55的多核苷酸序列编码；UNIPROT:C4ILU0)。任何本文中所述的涉及其序列同一性、杂交、氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亚序列的方面也适用于上述乳醛还原酶。
在一些方面，在相同条件下，所述乳醛还原酶具有SEQ ID NO:10，12，或28的成熟多肽序列的乳醛还原酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%。
亦可如上文所述从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)获得的DNA样品鉴定和获得所述乳醛还原酶。
丙二醇脱水酶和编码丙二醇脱水酶的多核苷酸
在重组宿主细胞和及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞具有丙二醇脱水酶活性。所述丙二醇脱水酶可为任何适用于本文中所述的宿主细胞及其使用方法的任何丙二醇脱水酶，如天然存在的丙二醇脱水酶或其保留丙二醇脱水酶活性的变体。在一个方面，所述丙二醇脱水酶存在于宿主细胞的胞质溶胶中。在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码丙二醇脱水酶的异源多核苷酸。在一些方面，所述丙二醇脱水酶是蛋白复合物，其包含第一丙二醇脱水酶亚基和第二丙二醇脱水酶亚基，其中所述亚基包含不同的氨基酸序列。
在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码丙二醇脱水酶的异源多核苷酸。在一些方面，当在相同条件下培养时，包含一种或多种编码丙二醇脱水酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码丙二醇脱水酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有增加水平的丙二醇脱水酶活性。在一些方面，当在相同条件下培养时，所述包含一种或多种编码丙二醇脱水酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码具有丙二醇脱水酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的丙二醇脱水酶活性。
在一个方面，宿主细胞包含编码第一丙二醇脱水酶亚基的第一异源多核苷酸，和编码第二丙二醇脱水酶亚基的第二异源多核苷酸，其中所述第一丙二醇脱水酶亚基和第二丙二醇脱水酶亚基形成具有丙二醇脱水酶活性的蛋白复合物。
在一个方面，所述编码第一丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸和编码第二丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸包含于单个异源多核苷酸中。在另一个方面，所述编码第一丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸和编码第二丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸各自包含于不同的、无关联的异源多核苷酸中。对与丙二醇脱水酶和其它多肽相关的核酸构建体和表达载体的扩展讨论描述于本文。
在一个方面，所述编码第一丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸选自下组：(a)编码丙二醇脱水酶亚基的多核苷酸，其与SEQ ID NO:14，18或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与SEQ ID NO:13，17，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链杂交；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:13，17，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性。
所述编码第二丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸选自下组：(a)编码丙二醇脱水酶亚基的多核苷酸，其与SEQ ID NO:16，20或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与SEQ ID NO:15，19，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链杂交；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:15，19，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性。
在一个方面，所述第一丙二醇脱水酶亚基与SEQ ID NO:14，18或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；而所述第二丙二醇脱水酶亚基与SEQ ID NO:16，20或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，第一丙二醇脱水酶亚基序列与SEQ ID NO:14，18或其成熟多肽序列相差不超过10个氨基酸，例如相差不超过5个氨基酸，不超过4个氨基酸，不超过3个氨基酸，不超过2个氨基酸，或相差1个氨基酸；而第二丙二醇脱水酶亚基序列与SEQ ID NO:16，20或其成熟多肽序列相差不超过10个氨基酸，例如相差不超过5个氨基酸，不超过4个氨基酸，不超过3个氨基酸，不超过2个氨基酸，或相差1个氨基酸。
在一个方面，所述第一丙二醇脱水酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:14，18的氨基酸序列，SEQ ID NO:14，18的成熟多肽序列，其等位变体，或前述的片段，而所述第二丙二醇脱水酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:16，20的氨基酸序列，SEQ ID NO:16，20的成熟多肽序列，其等位变体，或前述的片段。在另一个方面，所述第一丙二醇脱水酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:14或18的氨基酸序列，而所述第二丙二醇脱水酶亚基包含或组成为SEQ IDNO:16或20的氨基酸序列。在另一个方面，所述第一丙二醇脱水酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:14或18的成熟多肽序列，而所述第二丙二醇脱水酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:16或20的成熟多肽序列。在另一个方面，所述第一丙二醇脱水酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:14的氨基酸1至224，或SEQ ID NO:18的氨基酸1至236，而所述第二丙二醇脱水酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:16的氨基酸1至173，或SEQ ID NO:20的氨基酸1至171。
在一个方面，所述第一丙二醇脱水酶亚基包含SEQ ID NO:14，18或其成熟多肽序列的一个或多个(例如两个，几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，或所述第二丙二醇脱水酶亚基具有SEQ ID NO:16，20或其成熟多肽序列的一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入，如上文所述。在一些方面，SEQ IDNO:14，18或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1。在一些方面，SEQ ID NO:16，20或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1。
在一个方面，所述编码第一丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:13，17，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；而所述编码第二丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:15，19，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链(参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上文)。
在一个方面，所述编码第一丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸与SEQ IDNO:13，17，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，而所述编码第二丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸与SEQ ID NO:15，19，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个方面，所述编码第一丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸包含SEQID NO:13，17，或其成熟多肽编码序列的序列；而所述编码第二丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:15，19，或其成熟多肽编码序列的序列。在一个方面，所述编码第一丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸包含SEQID NO:13，17；而所述编码第二丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸包含SEQID NO:15，19。在一个方面，所述编码第一丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:13，17的成熟多肽编码序列；而所述编码第二丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:15，19的成熟多肽编码序列。在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:13的核苷酸1至675，SEQID NO:17的核苷酸1至711，SEQ ID NO:15的核苷酸1至522或SEQ ID NO:19的核苷酸1至516。
在一个方面，所述编码第一丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸包含SEQID NO:13，17，或其成熟多肽编码序列的亚序列，和/或所述编码第二丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸由亚序列编码，所述亚序列是SEQ ID NO:15，19，或其成熟多肽编码序列的亚序列，其中所述第一丙二醇脱水酶亚基与第二丙二醇脱水酶亚基一同形成具有丙二醇脱水酶活性的蛋白复合物。在一个方面，所述亚序列中的核苷酸残基数为SEQ ID NO:13，15，17或19中的核苷酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
在一个方面，所述编码第一丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸编码SEQID NO:14，18，或其成熟多肽序列的片段，和/或所述编码第二丙二醇脱水酶亚基的异源多核苷酸编码SEQ ID NO:16，20，或其成熟多肽序列的片段，其中所述第一和第二丙二醇脱水酶亚基一同形成具有丙二醇脱水酶活性的蛋白复合物。在一个方面，片段中的氨基酸残基数是SEQ ID NO:14，16，18或20中的氨基酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
所述丙二醇脱水酶(或其亚基)亦可为丙二醇脱水酶的等位变体或人工变体。
所述丙二醇脱水酶(或其亚基)亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。
用于分离或克隆编码丙二醇脱水酶(或其亚基)的多核苷酸的技术如上文所述。
SEQ ID NO:13，15，17或19的多核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ IDNO:14，16，18或20的氨基酸序列；或其片段，可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码丙二醇脱水酶的DNA，如上文所述。可对从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与如上所述的探针杂交并编码丙二醇脱水酶的DNA，如上文所述。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:13，15，17或19。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:13，15，17或19的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:14，16，18或20，其成熟多肽序列，或前述的片段的多核苷酸序列。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格和洗涤条件如上文所述定义。对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格和洗涤条件如上文所述定义。
编码丙二醇脱水酶或其亚基的多核苷酸可以获得自任何属的微生物。在一个方面，所述丙二醇脱水酶可为获得自本文中所述的微生物的细菌、酵母或丝状真菌丙二醇脱水酶。在另一个方面，所述丙二醇脱水酶是克雷伯氏菌属丙二醇脱水酶，如产酸克雷伯氏菌丙二醇脱水酶，其包含SEQ ID NO:14的成熟多肽序列和SEQ ID NO:16的成熟多肽序列。在另一个方面，所述丙二醇脱水酶是乳杆菌属丙二醇脱水酶，如路氏乳杆菌丙二醇脱水酶，其包含SEQ ID NO:18的成熟多肽序列和SEQ ID NO:20的成熟多肽序列。
其它可用于本文中所述的宿主细胞和使用方法的丙二醇脱水酶候选者包括但不限于Lactobacillus dioliverans丙二醇脱水酶复合物，其包含SEQ ID NO:58的亚基(由SEQ ID NO:57的多核苷酸序列编码；InterPro:IPR003208)，和SEQ IDNO:60的亚基(由SEQ ID NO:59的多核苷酸序列编码；InterPro:IPR003207)。任何本文中所述的涉及其序列同一性、杂交、氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亚序列的方面也适用于上述丙二醇脱水酶。
在一些方面，在相同条件下，所述丙二醇脱水酶具有蛋白复合物的丙二醇脱水酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%，所述蛋白复合物包含具有SEQ ID NO:14的成熟多肽序列的第一亚基和具有SEQ ID NO:16的成熟多肽序列的第二亚基，或所述蛋白复合物包含具有SEQID NO:18的成熟多肽序列的第一亚基和具有SEQ ID NO:20的成熟多肽序列的第二亚基。
亦可如上文所述从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)获得的DNA样品鉴定和获得所述丙二醇脱水酶。
正丙醇脱氢酶和编码正丙醇脱氢酶的多核苷酸
在重组宿主细胞和及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞具有正丙醇脱氢酶活性。所述正丙醇脱氢酶可为任何适用于本文中所述的宿主细胞及其使用方法的任何正丙醇脱氢酶，如天然存在的正丙醇脱氢酶或其保留正丙醇脱氢酶活性的变体。在一个方面，所述正丙醇脱氢酶存在于宿主细胞的胞质溶胶中。在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。
在一些方面，当在相同条件下培养时，包含一种或多种(例如两种，几种)编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码正丙醇脱氢酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有增加水平的正丙醇脱氢酶活性。在一些方面，当在相同条件下培养时，所述包含一种或多种编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码具有正丙醇脱氢酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的正丙醇脱氢酶活性。
在一些方面，所述宿主细胞包含编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸选自下组：(a)编码正丙醇脱氢酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:22，24或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与SEQ ID NO:21，23，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链杂交；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:21，23，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性。如本领域技术人员可知晓，在一些情况下，所述编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸可符合上述指出的选择(a)、(b)和(c)的多于一条。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码正丙醇脱氢酶，所述正丙醇脱氢酶与SEQ ID NO:22，24或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，正丙醇脱氢酶序列与SEQ ID NO:22，24或其成熟多肽序列相差不超过10个氨基酸，例如相差不超过5个氨基酸，不超过4个氨基酸，不超过3个氨基酸，不超过2个氨基酸，或相差1个氨基酸。
在一个方面，所述正丙醇脱氢酶包含或组成为(consist of)SEQ ID NO:22或24的氨基酸序列，SEQ ID NO:22或24的成熟多肽序列，其等位变体，或前述的具有正丙醇脱氢酶活性的片段。在另一个方面，所述正丙醇脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:22或24的氨基酸序列。在另一个方面，所述正丙醇脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:22或24的成熟多肽序列。在另一个方面，所述正丙醇脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:22的氨基酸1至336，或SEQ IDNO:24的氨基酸1至376。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码正丙醇脱氢酶，所述正丙醇脱氢酶具有SEQ ID NO:22，24或其成熟多肽序列的一个或多个(例如两个，几个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入，如上文所述。在一些方面，SEQ ID NO:22，24或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1。
在一个方面，所述编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:21，23，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链(参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上文)。
在一个方面，所述编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸与SEQ ID NO:21，23，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个方面，所述编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:21，23，或其成熟多肽编码序列。在一个方面，所述编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:21，23。在一个方面，所述编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:21，23的成熟多肽编码序列，在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:21的核苷酸1至1011，或SEQ ID NO:23的核苷酸1至1131。在一个方面，所述异源多核苷酸包含SEQ ID NO:21或23的亚序列，其中所述亚序列编码具有正丙醇脱氢酶活性的多肽。在一个方面，所述亚序列中的核苷酸残基数为SEQ ID NO:21或23中的核苷酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码SEQ ID NO:22，24，或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有正丙醇脱氢酶活性。在一个方面，片段中的氨基酸残基数是SEQ ID NO:22，24中的氨基酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
所述正丙醇脱氢酶亦可为正丙醇脱氢酶的等位变体或人工变体。
所述正丙醇脱氢酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。
用于分离或克隆编码正丙醇脱氢酶的多核苷酸的技术如上文所述。
SEQ ID NO:21或23的多核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ ID NO:22或24的氨基酸序列；或其片段，可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码正丙醇脱氢酶的DNA，如上文所述。可对从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与如上所述的探针杂交并编码正丙醇脱氢酶的DNA，如上文所述。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:21或23。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:21或23的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:22或24，其成熟多肽序列，或前述的片段的多核苷酸序列。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格和洗涤条件如上文所述定义。对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格和洗涤条件如上文所述定义。
编码正丙醇脱氢酶的多核苷酸可以获得自任何属的微生物。在一个方面，所述正丙醇脱氢酶可为获得自本文中所述的微生物的细菌、酵母或丝状真菌正丙醇脱氢酶。在另一个方面，所述正丙醇脱氢酶是乳杆菌属正丙醇脱氢酶。在另一个方面，所述正丙醇脱氢酶是埃希氏菌属正丙醇脱氢酶，如SEQ ID NO:22的大肠杆菌正丙醇脱氢酶。在另一个方面，所述正丙醇脱氢酶是丙酸杆菌属(Propionibacterium)正丙醇脱氢酶，如SEQ ID NO:24的费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)正丙醇脱氢酶。
其它可用于本文中所述的宿主细胞和使用方法的正丙醇脱氢酶候选者包括但不限于SEQ ID NO:62的路氏乳杆菌正丙醇脱氢酶(由SEQ ID NO:61的多核苷酸序列编码；InterPro:IPR001670)。任何本文中所述的涉及其序列同一性、杂交、氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亚序列的方面也适用于上述正丙醇脱氢酶。
在一些方面，在相同条件下，所述正丙醇脱氢酶具有SEQ ID NO:22或24的成熟多肽序列的正丙醇脱氢酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%。
亦可如上文所述从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)获得的DNA样品鉴定和获得所述正丙醇脱氢酶。
硫解酶和编码硫解酶的多核苷酸
在重组宿主细胞和及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞具有硫解酶活性。所述硫解酶可为任何适用于本文中所述的宿主细胞及其使用方法的任何硫解酶，如天然存在的硫解酶或其保留硫解酶活性的变体。在一个方面，所述硫解酶存在于宿主细胞的胞质溶胶中。在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码硫解酶的异源多核苷酸。
在一些方面，当在相同条件下培养时，包含一种或多种(例如两种，几种)编码硫解酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码硫解酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有增加水平的硫解酶活性。在一些方面，当在相同条件下培养时，所述包含一种或多种编码硫解酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码具有硫解酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的硫解酶活性。
在一些方面，所述宿主细胞包含编码硫解酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述编码硫解酶的异源多核苷酸选自下组：(a)编码硫解酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:38或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与SEQ ID NO:37，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链杂交；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:37，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性。如本领域技术人员可知晓，在一些情况下，所述编码硫解酶的异源多核苷酸可符合上述指出的选择(a)、(b)和(c)的多于一条。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码硫解酶，所述硫解酶与SEQ ID NO:38或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，硫解酶序列与SEQ ID NO:38或其成熟多肽序列相差不超过10个氨基酸，例如相差不超过5个氨基酸，不超过4个氨基酸，不超过3个氨基酸，不超过2个氨基酸，或相差1个氨基酸。
在一个方面，所述硫解酶包含或组成为(consist of)SEQ ID NO:38的氨基酸序列，SEQ ID NO:38的成熟多肽序列，其等位变体，或前述的具有硫解酶活性的片段。在另一个方面，所述硫解酶包含或组成为SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在另一个方面，所述硫解酶包含或组成为SEQ ID NO:38的成熟多肽序列。在另一个方面，所述硫解酶包含或组成为SEQ ID NO:38的氨基酸1至392。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码硫解酶，所述硫解酶具有SEQ ID NO:38或其成熟多肽序列的一个或多个(例如两个，几个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入，如上文所述。在一些方面，SEQ ID NO:38或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1。
在一个方面，所述编码硫解酶的异源多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:37，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链(参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上文)。
在一个方面，所述编码硫解酶的异源多核苷酸与SEQ ID NO:37，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个方面，所述编码硫解酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:37，或其成熟多肽编码序列。在一个方面，所述编码硫解酶的异源多核苷酸包含SEQID NO:37。在一个方面，所述编码硫解酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列，在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:37的核苷酸1至1179。在一个方面，所述异源多核苷酸包含SEQ ID NO:37，或其成熟多肽编码序列的亚序列，其中所述亚序列编码具有硫解酶活性的多肽。在一个方面，所述亚序列中的核苷酸残基数为SEQ ID NO:37中的核苷酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码SEQ ID NO:38，或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有硫解酶活性。在一个方面，片段中的氨基酸残基数是SEQ ID NO:38中的氨基酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
所述硫解酶亦可为硫解酶的等位变体或人工变体。
所述硫解酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。
用于分离或克隆编码硫解酶的多核苷酸的技术如上文所述。
SEQ ID NO:37的多核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ ID NO:38的氨基酸序列；或其片段，可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码硫解酶的DNA，如上文所述。可对从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与如上所述的探针杂交并编码硫解酶的DNA，如上文所述。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:37。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ IDNO:38，其成熟多肽序列，或前述的片段的多核苷酸序列。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格和洗涤条件如上文所述定义。对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格和洗涤条件如上文所述定义。
编码硫解酶的多核苷酸可以获得自任何属的微生物。在一个方面，所述硫解酶可为获得自本文中所述的微生物的细菌、酵母或丝状真菌硫解酶。在另一个方面，所述硫解酶是乳杆菌属硫解酶。在另一个方面，所述硫解酶是梭菌属(Clostridium)硫解酶，如SEQ ID NO:38的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)硫解酶。
其它可用于本文中所述的宿主细胞和使用方法的硫解酶候选者包括但不限于大肠杆菌(E.coli)硫解酶(NP_416728,Martin等,Nat.Biotechnology21:796-802(2003))和酿酒酵母(S.cerevisiae)硫解酶(NP_015297,Hiser等,J.BioI.Chem.269:31383-31389(1994))，巴氏梭菌(C.pasteurianum)硫解酶(例如蛋白IDABAI8857.l)，拜氏梭菌(C.beijerinckii)硫解酶(例如蛋白ID EAP59904.1或EAP59331.1)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)硫解酶(例如蛋白IDABG86544.l，ABG83108.l)，艰难梭菌(Clostridium diflicile)硫解酶(例如蛋白IDCAJ67900.1或ZP_01231975.1)，热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)硫解酶(例如蛋白ID CAB07500.1)，腾冲热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)硫解酶(例如A.L\.M23825.1)，生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)硫解酶(例如蛋白ID ABB13995.l)，还原脱硫肠菌(Desulfotomaculum reducens)MI-l硫解酶(例如蛋白ID EAR45123.1)，或热带假丝酵母(Candida tropicalis)硫解酶(例如蛋白ID BAA02716.1或BAA02715.1)。任何本文中所述的涉及其序列同一性、杂交、氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亚序列的方面也适用于上述硫解酶。
在一些方面，在相同条件下，所述硫解酶具有SEQ ID NO:38的成熟多肽序列的硫解酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%。
亦可如上文所述从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)获得的DNA样品鉴定和获得所述硫解酶。
CoA转移酶和编码CoA转移酶的多核苷酸
在重组宿主细胞和及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞具有CoA转移酶活性。所述CoA转移酶可为任何适用于本文中所述的宿主细胞及其使用方法的任何CoA转移酶，如天然存在的CoA转移酶或其保留CoA转移酶活性的片段。在一些方面，所述CoA转移酶是乙酰乙酰CoA:乙酸/丁酸CoA转移酶。在一些方面，所述CoA转移酶是乙酰乙酰CoA水解酶。在一些方面，所述CoA转移酶是乙酰乙酰CoA转移酶，其将乙酰乙酰CoA和乙酸转化为乙酰乙酸和乙酰CoA。在一些方面，所述CoA转移酶是琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶。在一个方面，所述CoA转移酶存在于宿主细胞的胞质溶胶中。在一些方面，所述CoA转移酶是蛋白复合物，其包含第一CoA转移酶亚基和第二CoA转移酶亚基，其中所述亚基包含不同的氨基酸序列。
在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码CoA转移酶的异源多核苷酸。在一些方面，当在相同条件下培养时，包含一种或多种编码CoA转移酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码CoA转移酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有增加水平的CoA转移酶活性。在一些方面，当在相同条件下培养时，所述包含一种或多种编码CoA转移酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码具有CoA转移酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的CoA转移酶活性。
在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的异源多核苷酸。在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种编码琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的异源多核苷酸。在一个方面，宿主细胞包含编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的第一异源多核苷酸，和编码第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的第二异源多核苷酸，其中所述第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基和第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基形成具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物。
在一个方面，所述编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸和编码第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸包含于单个异源多核苷酸中。在另一个方面，所述编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸和编码第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸各自包含于不同的、无关联的异源多核苷酸中。对与琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶和其它多肽相关的核酸构建体和表达载体的扩展讨论描述于本文。
在一个方面，所述编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸选自下组：(a)编码琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的多核苷酸，其与SEQ ID NO:40，44，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与SEQ ID NO:39，43，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链杂交；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:39，43，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性。
所述编码第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸选自下组：(a)编码琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的多核苷酸，其与SEQ ID NO:42，46，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与SEQ ID NO:41，45，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链杂交；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:41，45，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性。如本领域技术人员可知晓，在一些情况下，所述编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基或编码第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸可符合上述指出的选择(a)、(b)和(c)的多于一条。
在一个方面，所述第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基与SEQ ID NO:40，44，或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；而所述第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基与SEQ ID NO:42，46，或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基序列与SEQ ID NO:40，44，或其成熟多肽序列相差不超过10个氨基酸，例如相差不超过5个氨基酸，不超过4个氨基酸，不超过3个氨基酸，不超过2个氨基酸，或相差1个氨基酸；而第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基序列与SEQ ID NO:42，46，或其成熟多肽序列相差不超过10个氨基酸，例如相差不超过5个氨基酸，不超过4个氨基酸，不超过3个氨基酸，不超过2个氨基酸，或相差1个氨基酸。
在一个方面，所述第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:40或44的氨基酸序列，SEQ ID NO:40或44的成熟多肽序列，其等位变体，或前述的片段，而所述第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:42或46的氨基酸序列，SEQ ID NO:42或46的成熟多肽序列，其等位变体，或前述的片段。在另一个方面，所述第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:40或44的氨基酸序列，而所述第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:42或46的氨基酸序列。在另一个方面，所述第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:40或44的成熟多肽序列，而所述第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:42或46的成熟多肽序列。在另一个方面，所述第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基包含或组成为SEQ IDNO:40的氨基酸1至233，或SEQ ID NO:44的氨基酸1至237，而所述第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基包含或组成为SEQ ID NO:42的氨基酸1至216，或SEQ ID NO:46的氨基酸1至218。
在一个方面，所述第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基具有SEQ ID NO:40，44或其成熟多肽序列的一个或多个(例如两个，几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，或所述第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基具有SEQ ID NO:42，46或其成熟多肽序列的一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入，如上文所述。在一些方面，SEQ ID NO:40，44或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1。在一些方面，SEQ ID NO:42，46或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1。
在一个方面，所述编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:39，43，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；而所述编码第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:41，45，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链(参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上文)。
在一个方面，所述编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸与SEQ ID NO:39，43，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，而所述编码第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸与SEQ ID NO:41，45，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个方面，所述编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:39，43，或其成熟多肽编码序列的序列；而所述编码第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:41，45，或其成熟多肽编码序列的序列。在一个方面，所述编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:39，43；而所述编码第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:41，45。在一个方面，所述编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:39，43的成熟多肽编码序列；而所述编码第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:41，45的成熟多肽编码序列。在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:39的核苷酸1至702，或SEQ ID NO:43的核苷酸1至714。
在一个方面，所述编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:39或43的亚序列，和/或所述编码第二多肽亚基的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:41或45的亚序列，其中所述第一和第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基一同形成具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物。在一个方面，所述亚序列中的核苷酸残基数为SEQ ID NO:39，41，43或45中的核苷酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
在一个方面，所述编码第一琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸编码SEQ ID NO:40，44，或其成熟多肽序列的片段，和/或所述编码第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基的异源多核苷酸编码SEQ ID NO:42，46，或其成熟多肽序列的片段，其中所述第一和第二琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基一同形成具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物。在一个方面，片段中的氨基酸残基数是SEQ ID NO:40，42，44或46中的氨基酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
所述CoA转移酶(或其亚基)亦可为CoA转移酶的等位变体或人工变体。
所述CoA转移酶(或其亚基)亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。
用于分离或克隆编码CoA转移酶(或其亚基)的多核苷酸的技术如上文所述。
SEQ ID NO:39，43，41或45的多核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ IDNO:40，44，42或46的氨基酸序列；或其片段，可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的DNA，如上文所述。可对从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与如上所述的探针杂交并编码琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的DNA，如上文所述。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:39，43，41或45。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:39，43，41或45的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:40，44，42或46，其成熟多肽序列，或前述的片段的多核苷酸序列。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格和洗涤条件如上文所述定义。对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格和洗涤条件如上文所述定义。
编码CoA转移酶和其亚基的多核苷酸可以获得自任何属的微生物。在一个方面，所述CoA转移酶可为获得自本文中所述的微生物的细菌、酵母或丝状真菌CoA转移酶。在另一个方面，所述CoA转移酶是乳杆菌属CoA转移酶。在另一个方面，所述CoA转移酶是芽孢杆菌属CoA转移酶，如芽孢杆菌属琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶复合物，其包含SEQ ID NO:40的成熟多肽序列和SEQ ID NO:42的成熟多肽序列，或摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶复合物，其包含SEQ ID NO:44的成熟多肽序列和SEQ ID NO:46的成熟多肽序列。
其它可用于本文中所述的宿主细胞和使用方法的琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶候选者包括但不限于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶(YP_627417，YP_627418，Corthesy-Theulaz等，J Biol Chem272:25659-25667(1997))，和人(Homo sapiens)琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶(NP_000427，NP071403，Fukao，T.等，Genomics68:144-151(2000)；Tanaka，H.等，Mol Hum Reprod8:16-23(2002))。任何本文中所述的涉及其序列同一性、杂交、氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亚序列的方面也适用于上述琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶候选者。
其它可用于本文中所述的宿主细胞和使用方法的乙酰乙酰CoA:乙酸/丁酸CoA转移酶候选者包括但不限于大肠杆菌乙酰乙酰CoA:乙酸CoA转移酶(NP416726.1，NP_416725.1；Hanai等,Appl Environ Microbiol73:7814-7818(2007))，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA:乙酸CoA转移酶(NP_149326.1，NP_149327.1；Jojima等,Appl Microbiol Biotechnol77:1219-1224(2008))，和糖多丁醇乙酸梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)乙酰乙酰CoA:乙酸CoA转移酶(AAP42564.1，AAP42565.1；Kosaka等,Biosci.BiotechnolBiochem.71:58-68(2007))。任何本文中所述的涉及其序列同一性、杂交、氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亚序列的方面也适用于上述乙酰乙酰CoA:乙酸/丁酸CoA转移酶候选者。
其它可用于本文中所述的宿主细胞和使用方法的乙酰乙酰CoA水解酶候选者包括但不限于酰基CoA水解酶，3-羟基异丁酰CoA水解酶，乙酰CoA水解酶和二羧酸硫酯酶，如褐鼠(Rattus norvegicus)3-羟基异丁酰CoA水解酶(Q5XIE6.2；Shimomura等,J Biol.Chem.269:14248-14253(1994))，人3-羟基异丁酰CoA水解酶(Q6NVY1.2；Shimomura等,见上文)，褐鼠乙酰CoA水解酶(NP570103.1；Robinson等,Res.Commun.71:959-965(1976))，酿酒酵母乙酰CoA水解酶(NP_009538；Buu等,J.Biol.Chem.278:17203-17209(2003))，人二羧酸硫解酶(CAA15502；Westin等,J Biol.Chem.280:38125-38132(2005))，和大肠杆菌二羧酸硫解酶(Naggert等,J Biol.Chem.266:11044-11050(1991))。任何本文中所述的涉及其序列同一性、杂交、氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亚序列的方面也适用于上述乙酰乙酰CoA水解酶候选者。
在一些方面，在相同条件下，所述CoA转移酶具有蛋白复合物的CoA转移酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%，所述蛋白复合物包含具有SEQ ID NO:40的成熟多肽序列的第一亚基和具有SEQ ID NO:42的成熟多肽序列的第二亚基，或所述蛋白复合物包含具有SEQ ID NO:44的成熟多肽序列的第一亚基和具有SEQ ID NO:46的成熟多肽序列的第二亚基。
亦可如上文所述从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)获得的DNA样品鉴定和获得所述CoA转移酶。
乙酰乙酸脱羧酶和编码乙酰乙酸脱羧酶的多核苷酸
在重组宿主细胞和及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞具有乙酰乙酸脱羧酶活性。所述乙酰乙酸脱羧酶可为任何适用于本文中所述的宿主细胞及其使用方法的任何乙酰乙酸脱羧酶，如天然存在的乙酰乙酸脱羧酶或其保留乙酰乙酸脱羧酶活性的变体。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶存在于宿主细胞的胞质溶胶中。在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸。
在一些方面，当在相同条件下培养时，包含一种或多种(例如两种，几种)编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码乙酰乙酸脱羧酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有增加水平的乙酰乙酸脱羧酶活性。在一些方面，当在相同条件下培养时，所述包含一种或多种编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码具有乙酰乙酸脱羧酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的乙酰乙酸脱羧酶活性。
在一些方面，所述宿主细胞包含编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸选自下组：(a)编码乙酰乙酸脱羧酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:48或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与SEQ ID NO:47，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链杂交；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:47，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性。如本领域技术人员可知晓，在一些情况下，所述编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸可符合上述指出的选择(a)、(b)和(c)的多于一条。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码乙酰乙酸脱羧酶，所述乙酰乙酸脱羧酶与SEQ ID NO:48或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，乙酰乙酸脱羧酶序列与SEQ ID NO:48或其成熟多肽序列相差不超过10个氨基酸，例如相差不超过5个氨基酸，不超过4个氨基酸，不超过3个氨基酸，不超过2个氨基酸，或相差1个氨基酸。
在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含或组成为(consist of)SEQ ID NO:48的氨基酸序列，SEQ ID NO:48的成熟多肽序列，其等位变体，或前述的具有乙酰乙酸脱羧酶活性的片段。在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含或组成为SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含或组成为SEQ ID NO:48的成熟多肽序列。在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含或组成为SEQ ID NO:48的氨基酸1至246。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码乙酰乙酸脱羧酶，所述乙酰乙酸脱羧酶具有SEQ ID NO:48或其成熟多肽序列的一个或多个(例如两个，几个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入，如上文所述。在一些方面，SEQ ID NO:48或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1。
在一个方面，所述编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:47，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链(参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上文)。
在一个方面，所述编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸与SEQ ID NO:47，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个方面，所述编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:47，或其成熟多肽编码序列。在一个方面，所述编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:47的序列。在一个方面，所述编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:47的成熟多肽编码序列，在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:47的核苷酸1至741。在一个方面，所述异源多核苷酸包含SEQ ID NO:47，或其成熟多肽编码序列的亚序列，其中所述亚序列编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的多肽。在一个方面，所述亚序列中的核苷酸残基数为SEQ ID NO:47中的核苷酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码SEQ ID NO:48，或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有乙酰乙酸脱羧酶活性。在一个方面，片段中的氨基酸残基数是SEQ ID NO:48中的氨基酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
所述乙酰乙酸脱羧酶亦可为乙酰乙酸脱羧酶的等位变体或人工变体。
所述乙酰乙酸脱羧酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。
用于分离或克隆编码乙酰乙酸脱羧酶的多核苷酸的技术如上文所述。
SEQ ID NO:47的多核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或其片段，可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码乙酰乙酸脱羧酶的DNA，如上文所述。可对从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与如上所述的探针杂交并编码乙酰乙酸脱羧酶的DNA，如上文所述。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:47。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:47的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ IDNO:48，其成熟多肽序列，或前述的片段的多核苷酸序列。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格和洗涤条件如上文所述定义。对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格和洗涤条件如上文所述定义。
编码乙酰乙酸脱羧酶的多核苷酸可以获得自任何属的微生物。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶可为获得自本文中所述的微生物的细菌、酵母或丝状真菌乙酰乙酸脱羧酶。在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶是乳杆菌属乙酰乙酸脱羧酶。在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶是梭菌属乙酰乙酸脱羧酶，如SEQ ID NO:48的拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶。
其它可用于本文中所述的宿主细胞和使用方法的乙酰乙酸脱羧酶候选包括但不限于丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶(NP_149328.1，Petersen和Bennett,Appl.Environ.Microbiol56:3491-3498(1990))和糖多丁醇乙酸梭菌乙酰乙酸脱羧酶(AAP42566.1，Kosaka等,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))任何本文中所述的涉及其序列同一性、杂交、氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亚序列的方面也适用于上述乙酰乙酸脱羧酶。
在一些方面，在相同条件下，所述乙酰乙酸脱羧酶具有SEQ ID NO:48的成熟多肽序列的乙酰乙酸脱羧酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%。
亦可如上文所述从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)获得的DNA样品鉴定和获得所述乙酰乙酸脱羧酶。
异丙醇脱氢酶和编码异丙醇脱氢酶的多核苷酸
在重组宿主细胞和及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞具有异丙醇脱氢酶活性。所述异丙醇脱氢酶可为任何适用于本文中所述的宿主细胞及其使用方法的任何异丙醇脱氢酶，如天然存在的异丙醇脱氢酶或其保留异丙醇脱氢酶活性的变体。在一个方面，所述异丙醇脱氢酶存在于宿主细胞的胞质溶胶中。在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。
在一些方面，当在相同条件下培养时，包含一种或多种(例如两种，几种)编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码异丙醇脱氢酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有增加水平的异丙醇脱氢酶活性。在一些方面，当在相同条件下培养时，所述包含一种或多种编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞与不含所述一种或多种编码具有异丙醇脱氢酶的多核苷酸的宿主细胞相比较，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的异丙醇脱氢酶活性。
在一些方面，所述宿主细胞包含编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸选自下组：(a)编码异丙醇脱氢酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:50，52，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与SEQ ID NO:49，51，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链杂交；和(c)多核苷酸，其与SEQ IDNO:49，51，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性。如本领域技术人员可知晓，在一些情况下，所述编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸可符合上述指出的选择(a)、(b)和(c)的多于一条。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码异丙醇脱氢酶，所述异丙醇脱氢酶与SEQ ID NO:50，52，或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，异丙醇脱氢酶序列与SEQ ID NO:50，52，或其成熟多肽序列相差不超过10个氨基酸，例如相差不超过5个氨基酸，不超过4个氨基酸，不超过3个氨基酸，不超过2个氨基酸，或相差1个氨基酸。
在一个方面，所述异丙醇脱氢酶包含或组成为(consist of)SEQ ID NO:50或52的氨基酸序列，SEQ ID NO:50或52的成熟多肽序列，其等位变体，或前述的具有异丙醇脱氢酶活性的片段。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:50或52的氨基酸序列。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:50或52的成熟多肽序列。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:50的氨基酸1至351，或SEQ IDNO:52的氨基酸1至352。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码异丙醇脱氢酶，所述异丙醇脱氢酶具有SEQ ID NO:50，52，或其成熟多肽序列的一个或多个(例如两个，几个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入，如上文所述。在一些方面，SEQ ID NO:50，52或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1。
在一个方面，所述编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:49，51，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链(参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上文)。
在一个方面，所述编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸与SEQ ID NO:49，51，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个方面，所述编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:49，51，或其成熟多肽编码序列。在一个方面，所述编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:49，51的序列。在一个方面，所述编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸包含SEQ ID NO:49，51的成熟多肽编码序列，在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:49的核苷酸1至1056或SEQ ID NO:51的核苷酸1至1059。在一个方面，所述异源多核苷酸包含SEQ ID NO:49，51，或其成熟多肽编码序列的亚序列，其中所述亚序列编码具有异丙醇脱氢酶活性的多肽。在一个方面，所述亚序列中的核苷酸残基数为SEQ ID NO:49，51中的核苷酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
在一个方面，所述异源多核苷酸编码SEQ ID NO:50，52，或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有异丙醇脱氢酶活性。在一个方面，片段中的氨基酸残基数是SEQ ID NO:50，52中的氨基酸残基数的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。
所述异丙醇脱氢酶亦可为异丙醇脱氢酶的等位变体或人工变体。
所述异丙醇脱氢酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。
用于分离或克隆编码异丙醇脱氢酶的多核苷酸的技术如上文所述。
SEQ ID NO:49，51的多核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ ID NO:50，52的氨基酸序列；或其片段，可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码异丙醇脱氢酶的DNA，如上文所述。可对从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与如上所述的探针杂交并编码异丙醇脱氢酶的DNA，如上文所述。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:49或51。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:49，51的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:50，52，其成熟多肽序列，或前述的片段的多核苷酸序列。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格和洗涤条件如上文所述定义。对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格和洗涤条件如上文所述定义。
编码异丙醇脱氢酶的多核苷酸可以获得自任何属的微生物。在一个方面，所述异丙醇脱氢酶可为获得自本文中所述的微生物的细菌、酵母或丝状真菌异丙醇脱氢酶。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶是乳杆菌属异丙醇脱氢酶。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶是梭菌属异丙醇脱氢酶，如SEQ ID NO:50的拜氏梭菌异丙醇脱氢酶。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶是热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)异丙醇脱氢酶，例如SEQ ID NO:52的产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)异丙醇脱氢酶。
其它可用于本文中所述的宿主细胞和使用方法的异丙醇脱氢酶候选者包括但不限于布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)异丙醇脱氢酶(P14941.1，Hanai等，Appl.Environ.Microbiol.73:7814-7818(2007)；Peretz等，Anaerobe3:259-270(1997))，真养雷尔氏菌(Ralstonia eutropha)(之前称为真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus))正丙醇脱氢酶(YP_299391.1，Steinbuchel和Schlegel等，Eur.J.Biochem.141:555-564(1984))，伯克霍尔德氏菌属菌种(Burkholderia sp.)AIU652异丙醇脱氢酶，和植物单胞菌属(Phytomonas)菌种异丙醇脱氢酶(AAP39869.1，Uttaro和Opperdoes等，Mol.Biochem.Parasitol.85:213-219(1997))。任何本文中所述的涉及其序列同一性、杂交、氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亚序列的方面也适用于上述异丙醇脱氢酶。
在一些方面，在相同条件下，所述异丙醇脱氢酶具有SEQ ID NO:50或52的成熟多肽序列的异丙醇脱氢酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%。
亦可如上文所述从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮饲料等)获得的DNA样品鉴定和获得所述异丙醇脱氢酶。
表达载体和核酸构建体
所述重组宿主细胞和方法利用表达载体，所述表达载体包含一种或多种(例如两种，几种)异源多核苷酸连接于调控序列，所述异源多核苷酸编码乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶、和/或正丙醇脱氢酶，所述调控序列指导在与所述调控序列相容的条件下在合适宿主细胞中的表达。此类重组表达载体可用于任何本文中所述的宿主细胞和方法。可以以多种方式操纵本文中所述的多核苷酸以提供所需多肽的表达。取决于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对所述多核苷酸进行操作可能是合意的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术在本领域是公知的。
多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(例如两个，几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
在一个方面，本文中所述的每个编码乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶、和/或正丙醇脱氢酶的多核苷酸包含于独立的载体中。在一个方面，至少两个所述多核苷酸包含于单个载体上。在一个方面，至少三个所述多核苷酸包含于单个载体上。在一个方面，至少四个所述多核苷酸包含于单个载体上。在一个方面，所有编码乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶、和/或正丙醇脱氢酶的多核苷酸都包含于单个载体上。编码蛋白复合物(例如丙二醇脱水酶)的杂聚亚基的多核苷酸可包含于单个载体上的单个异源多核苷酸中，或包含于不同载体上的不同异源多核苷酸中。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
所述表达载体可含有任何合适的启动子序列，其由宿主细胞识别以供表达编码任何本文中所述的多肽(例如乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶、或正丙醇脱氢酶)的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
每个本文中所述的多核苷酸可以可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外来的启动子。例如，在一个方面，所述编码乳酸脱氢酶或其亚基的异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外来的启动子。在另一个方面，所述编码乳醛脱氢酶或其亚基的异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外来的启动子。在另一个方面，所述编码乳醛还原酶或其亚基的异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外来的启动子。在另一个方面，所述编码丙二醇脱水酶或其亚基的异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外来的启动子。在另一个方面，所述编码正丙醇脱氢酶或其亚基的异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外来的启动子。
如上文所述，编码蛋白复合物的杂聚亚基的多核苷酸可包含于单个异源多核苷酸(例如单个质粒)中，或者包含于不同的异源多核苷酸中(例如在不同质粒上)。例如，在一个方面，所述编码第一亚基的异源多核苷酸，和编码第二亚基的异源多核苷酸包含于单个异源多核苷酸中，所述异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述编码第一亚基的异源多核苷酸和编码第二亚基的异源多核苷酸均是外来的启动子。在一个方面，所述编码第一亚基的异源多核苷酸和编码第二亚基的异源多核苷酸各自包含于不同的、无关联的异源多核苷酸中，其中所述编码第一亚基的异源多核苷酸可操纵地连接于外来的启动子，且所述编码第二亚基的异源多核苷酸可操纵地连接于外来的启动子。所述的启动子可为相同或不同的。
用于指导核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列已由曲霉属(Aspergilli)中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列已由构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。
用于指导核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等，1988，Gene69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of所述National Academy of Sciences USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins from recombinant bacteria"于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何终止子。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，当被转录时其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导多肽进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外来的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
载体可含有一个或多个(例如两个，几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。
载体可含有一个或多个(例如两个，几个)元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
可以将多于一个拷贝的本文中所述的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本文中所述的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
重组宿主细胞(例如酵母宿主细胞或细菌宿主细胞)可包含一种或多种(例如两种，几种)本文中所述的多核苷酸，其可可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导一种或多种所述多肽的表达以供重组产生正丙醇。宿主细胞可包含所述的多种多核苷酸的任何一种或组合。例如，在一个方面，所述重组宿主细胞包含编码本文中所述的乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶、或正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸；其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含所述异源多核苷酸的宿主细胞相比，产生(或能够产生)更多量的正丙醇。
在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。
在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。
在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。
在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。
在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乳醛还原酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的丙二醇脱水酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。
在一些这些方面，所述重组宿主细胞缺乏内源的乳酸脱氢酶，缺乏内源的乳醛脱氢酶，缺乏内源的乳醛还原酶，缺乏内源的丙二醇脱水酶，和/或缺乏内源的正丙醇脱氢酶。
例如，在一个方面，重组宿主细胞(例如乳杆菌属宿主细胞)包含一种或多种(例如两种，几种)选自下组的异源多核苷酸：
(1)异源多核苷酸，其编码乳酸脱氢酶，其中所述多核苷酸选自：(a)多核苷酸，其编码乳酸脱氢酶，其与SEQ ID NO:2，4，34，36，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:1，3，33，35，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1，3，33，35，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性；
(2)异源多核苷酸，其编码乳醛脱氢酶，其中所述多核苷酸选自：(a)多核苷酸，其编码乳醛脱氢酶，其与SEQ ID NO:6，8，26，30，32，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:5，7，25，29，31，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:5，7，25，29，31，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性；
(3)异源多核苷酸，其编码乳醛还原酶，其中所述多核苷酸选自：(a)多核苷酸，其编码乳醛还原酶，其与SEQ ID NO:10，12，28，54，56，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:9，11，27，53，55，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:9，11，27，53，55，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性；
(4)异源多核苷酸，其编码第一丙二醇脱水酶亚基，和异源多核苷酸，其编码第二丙二醇脱水酶亚基，其中编码第一亚基的多核苷酸选自：(a)多核苷酸，其编码丙二醇脱水酶亚基，其与SEQ ID NO:14，18，58，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:13，17，57，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:13，17，57，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性；和其中编码第二亚基的多核苷酸选自：(a)多核苷酸，其编码丙二醇脱水酶亚基，其与SEQ ID NO:16，20，60，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与以下杂交：SEQ IDNO:15，19，59，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:15，19，59，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性；和
(5)异源多核苷酸，其编码正丙醇脱氢酶，其中所述多核苷酸选自：(a)多核苷酸，其编码正丙醇脱氢酶，其与SEQ ID NO:22，24，62，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:21，23，61，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:21，23，61，或其成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性；
其中在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含所述一种或多种多核苷酸的宿主细胞相比，产生(或能够产生)更多量的正丙醇。
如本领域技术人员可知晓，在一些情况下，所述编码上述指出的多肽的异源多核苷酸可符合相应选择(a)、(b)和(c)的多于一条。
任何上述宿主细胞可进一步包含一种或多种(例如两种，几种)编码如图2中描绘的异丙醇途径的多肽的异源多核苷酸以供同时产生正丙醇和异丙醇。例如，在一个方面，所述重组宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的硫解酶、CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶、或异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸；其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含所述异源多核苷酸的宿主细胞相比，产生(或能够产生)更多量异丙醇。
在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的硫解酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种编码本文中所述的CoA转移酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种编码本文中所述的乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种编码本文中所述的异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。
在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的硫解酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的CoA转移酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种编码本文中所述的硫解酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种编码本文中所述的硫解酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。
在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的硫解酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的CoA转移酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种编码本文中所述的硫解酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的CoA转移酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种编码本文中所述的硫解酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种编码本文中所述的CoA转移酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。
在一个方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的硫解酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的CoA转移酶的异源多核苷酸，一种或多种编码本文中所述的乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸，和一种或多种编码本文中所述的异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。
将包含一个或多个(例如两个，几个)多核苷酸的构建体或载体(或多个构建体或载体)导入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而与亲本细胞不同。在一些情况下，宿主细胞的选择会很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。下文中所述的方面适用于宿主细胞本身，以及使用宿主细胞的方法。
所述宿主细胞可为任何能够重组产生本文中所述的多肽的真核细胞，和/或任何能够重组产生正丙醇的细胞。所述宿主细胞还可以是任何合适的真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
所述宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上)。
所述真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本文中所述而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
所述酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、西洋蓍霉属、或伊萨酵母属(Issatchenkia)细胞，如Candida sonorensis、Candida methanosorbosa、Candida ethanolica、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、Pichiagaleiformis、膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens)、Pichia deserticola、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、Saccharomyces bulderi、解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)、或东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)细胞。
在一些方面，所述酵母宿主细胞来源于经遗传修饰以产生高乳酸效价，呈现对酸性pH增加的耐受性，和/或展现增加的发酵戊糖能力的细胞。示例性遗传修饰的酵母细胞描述于WO00/71738，WO03/049525，WO03/102201，03/102152，WO02/42471，WO2007/032792，WO2007/106524，WO2007/117282，其针对所述细胞的内容通过提述并入本文。涵盖了前述申请中所述的任何酵母细胞，其通过引入一种或多种(例如两种，几种)本文中所述的多核苷酸进一步修饰以产生正丙醇(例如，一种或多种编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，一种或多种编码乳醛还原酶的异源多核苷酸，一种或多种编码丙二醇脱水酶的异源多核苷酸，和/或一种或多种编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸)。
在一些方面，所述酵母是Crabtree阳性表型或Crabtree阴性表型。Crabtree阴性生物表征为受诱导进入增加的发酵状态的能力。天然存在的生物和遗传修饰的生物均可表征为Crabtree阴性。Crabtree作用定义为当微生物在高浓度的葡萄糖(例如>5mM葡萄糖)存在下在有氧条件下培养时，微生物中氧消耗的抑制。在葡萄糖存在下，Crabtree阳性生物无论是否能获得氧仍继续发酵(而不是呼吸)，而Crabtree阴性生物不呈现氧消耗的葡萄糖介导的抑制。该特征对于有机产物合成是有用的，因为这允许细胞在高底物浓度生长，但仍保持氧化磷酸化的有益能量作用。在一个方面，所述酵母具有Crabtree阴性表型。
在一些方面，所述酵母宿主细胞与野生型菌株相比，具有减少的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性以将糖代谢从乙醇产生转向乳酸产生，如下文在基因破坏段落中所述。在一些方面，所述酵母宿主细胞经遗传修饰以破坏编码丙酮酸脱羧酶(PDC)的内源多核苷酸。pdc基因的破坏可以以多种方式实现，其包括，例如与WO99/114335，WO02/42471，WO03/049525，WO03/102152和WO03/102201中所述的那些类似的方法。其它破坏PDC活性的方法描述于Porro,"Development of metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae cells for theproduction oflactic acid",Biotechnol.Prog.1995May-Jun；11(3):294-8；Porro等,"Replacement of a metabolic pathway for large-scale production of lactic acid fromengineered yeasts",App.Environ.Microbiol.1999Sep:65(9):4211-5；Bianchi等,"Efficient homolactic fermentation by Kluyveromyces lactis strains defective inpyruvate utilization and transformed with the heterologous LDH gene",App.Environ.Microbiol.2001Dec；67(12)5621-5；和WO99/14335。在一些方面，所述丙酮酸脱羧酶(PDC)基因在PDC基因的基因座通过插入一种或多种编码上文所述的乳酸脱氢酶的异源多核苷酸来破坏，如WO03/102201所述。
在一些方面，所述酵母宿主细胞与野生型菌株相比具有减少的L-或D-乳酸:高铁细胞色素(ferricytochrome)c氧还酶活性以减少将乳酸重新转化回丙酮酸。在一些方面，所述酵母宿主细胞经遗传修饰以破坏编码L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶的内源多核苷酸。L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶基因的破坏可以以多种方式实现，包括，例如与WO2007/117282中所述的那些类似的方法。在一些方面，酵母宿主细胞经遗传修饰以破坏编码L-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶基因的内源多核苷酸。在一些方面，所述破坏的L-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶基因包括WO2007/117282的SEQ ID NO:1(野生型马克斯克鲁维酵母菌株的L-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶基因CYB2)，WO2007/117282的SEQ ID NO:79(野生型东方伊萨酵母菌株的CYB2A基因)，或WO2007/117282的SEQ ID NO:81(野生型东方伊萨酵母菌株的CYB2B基因)；和/或编码具有鉴定为WO2007/117282的SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:80，或SEQ ID NO:82的氨基酸序列的酶。在一些方面，所述酵母宿主细胞经遗传修饰以破坏编码D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶基因的内源多核苷酸。在一些方面，所述破坏的D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶基因包括WO2007/117282的SEQ ID NO:83(野生型马克斯克鲁维酵母菌株的D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶(DLD1)基因)，WO2007/117282中所述的酿酒酵母的DLD1基因，或WO2007/117282中所述的东方伊萨酵母的DLDl1基因；和/或编码具有鉴定为WO2007/117282的SEQ ID NO:84的氨基酸序列的酶，具有由WO2007/117282的酿酒酵母DLD1基因编码的蛋白的氨基酸序列的酶，或具有由WO2007/117282中所述的东方伊萨酵母DLD1基因编码的蛋白的氨基酸序列的酶。在一些方面，在相同条件下，所述酵母宿主细胞的L-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶活性，所述酵母宿主细胞的D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶活性，或所述酵母宿主细胞的总乳酸:高铁细胞色素c氧还酶活性与未经破坏的酵母宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。
在一些方面，所述酵母宿主细胞经遗传修饰以破坏供产生甘油的天然代谢途径。在一些方面，所述酵母宿主细胞具有减少的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)活性和/或减少的甘油-3-磷酸酶(GPP)活性。在一些方面，所述酵母宿主细胞经遗传修饰以破坏编码甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)的内源多核苷酸和/或破坏编码甘油-3-磷酸酶(GPP)的内源多核苷酸。在一些方面，在相同条件下，所述酵母宿主细胞的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)活性与未经破坏的酵母宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，在相同条件下，所述酵母宿主细胞的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)活性与未经破坏的酵母宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，在相同条件下，由酵母宿主细胞产生的甘油的量与未经甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因和/或甘油-3-磷酸酶(GPP)基因的破坏的酵母宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因和甘油-3-磷酸酶(GPP)基因的破坏可以以多种方式完成，包括，例如与WO2007/106524中的那些类似的方法。
在一些方面，其中所述酵母宿主细胞具有经由二羟基丙酮产生甘油的替代途径(例如，粟酒裂殖酵母(S.pombe))，所述细胞经遗传修饰通过减少二羟基丙酮磷酸磷酸酶活性和/或减少甘油脱氢酶活性以减少甘油产生。在一些方面，所述酵母宿主细胞经遗传修饰以破坏或缺失天然的二羟基丙酮磷酸磷酸酶基因和/或破坏编码甘油脱氢酶的内源多核苷酸。在一些方面，在相同条件下，所述酵母宿主细胞的二羟基丙酮磷酸磷酸酶活性与未经破坏的酵母宿主细胞相比减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，在相同条件下，所述酵母宿主细胞的甘油脱氢酶活性与未经破坏的酵母宿主细胞相比减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，在相同条件下，由酵母宿主细胞产生的甘油的量与未经二羟基丙酮磷酸磷酸酶和/或甘油脱氢酶破坏的宿主细胞相比减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。二羟基丙酮磷酸磷酸酶基因和甘油脱氢酶基因的破坏可以以多种方式实现，包括，例如与WO2007/106524中所述的那些类似的方法。
在一些方面，所述酵母宿主细胞包含(1)一种或多种编码木糖异构酶基因的异源多核苷酸，(2)产生催化木糖至木糖醇的转化的酶的天然基因的破坏，(3)功能性木糖醇脱氢酶基因的破坏和/或(4)导致细胞过表达功能性木酮糖激酶的修饰。用于将此类修饰引入酵母细胞的方法描述于例如WO04/099381，其针对其方法和宿主细胞的内容通过提述并入本文。在一些方面，所述酵母宿主细胞可代谢除了葡萄糖或其它单糖己糖之外的糖，特别是戊糖，包括非限定性实例：木糖和L-阿拉伯糖。
所述宿主细胞可为真菌宿主细胞，如丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
所述丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
所述丝状真菌宿主细胞可为棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。
所述宿主细胞可为能够重组产生本文中所述的多肽的任何原核细胞和/或能够重组产生正丙醇的任何细胞。所述原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何乳杆菌属细胞，包括但不限于，耐酸乳杆菌(L.acetotolerans)，L.acidifarinae，L.acidipiscis，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)，敏捷乳杆菌(L.agilis)，L.algidus，消化乳杆菌(L.alimentarius)，L.amylolyticus，嗜淀粉乳杆菌(L.amylophilus)，L.amylotrophicus，噬淀粉乳杆菌(L.amylovorus)，动物乳杆菌(L.animalis)，L.antri，L.apodemi，L.aquaticus，L.arizonensis，鸟乳杆菌(L.aviarius)，巴伐利亚乳杆菌(L.bavaricus)，双发酵乳杆菌(L.bifermentans)，L.bobalius，短乳杆菌(L.brevis)，布氏乳杆菌(L.buchneri)，L.bulgaricus，L.cacaonum，L.camelliae，L.capillatus，L.carni，干酪乳杆菌(L.casei)，链状乳杆菌(L.catenaformis)，纤维二糖乳杆菌(L.cellobiosus)，L.ceti，L.coleohominis，丘状菌落乳杆菌(L.collinoides)，L.composti，L.concavus，L.confusus，棒状乳杆菌(L.coryniformis)，卷曲乳杆菌(L.crispatus)，L.crustorum，弯曲乳杆菌(L.curvatus)，L.cypricasei，德氏乳杆菌(L.delbrueckii)，L.dextrinicus，L.diolivorans，L.divergens，L.durianis，L.equi，L.equicursoris，L.equigenerosi，L.fabifermentans，香肠乳杆菌(L.farciminis)，L.farraginis，L.ferintoshensis，发酵乳杆菌(L.fermentum)，L.fornicalis，食果糖乳杆菌(L.fructivorans)，果糖乳杆菌(L.fructosus)，L.frumenti，L.fuchuensis)，鸡乳杆菌(L.gallinarum)，加氏乳杆菌(L.gasseri)，L.gastricus，L.ghanensis，草乳杆菌(L.graminis)，L.halotolerans，L.hammesii，哈氏乳杆菌(L.hamsteri)，L.harbinensis，L.hayakitensis，瑞士乳杆菌(L.helveticus)，异型腐酒乳杆菌(L.heterohiochii)，希氏乳杆菌(L.hilgardii)，同型腐酒乳杆菌(L.homohiochii)，L.hordei，L.iners，L.ingluviei，肠乳杆菌(L.intestinalis)，詹氏乳杆菌(L.jensenii)，约氏乳杆菌(L.johnsonii)，L.kalixensis，L.kandleri，马乳酒样乳杆菌(L.kefiranofaciens)，马乳酒样乳杆(L.kefiranofaciens)，高加索酸奶粒乳杆菌(L.kefirgranum)，L.kefiri，L.kimchii，L.kisonensis，L.kitasatonis，L.kunkeei，L.lactis，L.leichmannii，林氏乳杆菌(L.lindneri)，坏发酵乳杆菌(L.malefermentans)，马里乳杆菌(L.mali)，麦芽香乳杆菌(L.maltaromicus)，L.manihotivorans，L.mindensis，L.minor，L.minutus，L.mucosae，鼠乳杆菌(L.murinus)，L.nagelii，L.namurensis，L.nantensis，L.nodensis，L.oeni，L.oligofermentans，东方乳杆菌(L.oris)，L.otakiensis，面包乳杆菌(L.panis)，L.pantheris，L.parabrevis，类布氏乳杆菌(L.parabuchneri)，类干酪乳杆菌(L.paracasei)，L.paracollinoides，L.parafarraginis，类高加索酸奶乳杆菌(L.parakefiri)，L.paralimentarius，L.paraplantarum，戊糖乳杆菌(L.pentosus)，L.perolens，L.piscicola，植物乳杆菌(L.plantarum)，L.pobuzihii，桥乳杆菌(L.pontis)，L.psittaci，L.rapi，L.rennini，路氏乳杆菌(L.reuteri)，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，L.rimae，路氏乳杆菌(L.rogosae)，L.rossiae，瘤胃乳杆菌(L.ruminis)，L.saerimneri，清酒乳杆菌(L.sakei)，唾液乳杆菌(L.salivarius)，旧金山乳杆菌(L.sanfranciscensis)，L.satsumensis，L.secaliphilus，L.senmaizukei，沙氏乳杆菌(L.sharpeae)，L.siliginis，L.similis，L.sobrius，L.spicheri，L.sucicola，猪双臼乳杆菌(L.suebicus)，L.sunkii，L.suntoryeus，L.taiwanensis，L.thailandensis，L.thermotolerans，发状乳杆菌(L.trichodes)，L.tucceti，齿龈乳杆菌(L.uli)，L.ultunensis，L.uvarum，牛痘乳杆菌(L.vaccinostercus)，阴道乳杆菌(L.vaginalis)，L.versmoldensis，L.viridescens，犊乳杆菌(L.vitulinus)，L.xylosus，果汁乳杆菌(L.yamanashiensis)，玉米乳杆菌(L.zeae)，和L.zymae。在一个方面，所述细菌宿主细胞是植物乳杆菌，食果糖乳杆菌或路氏乳杆菌。
在一个方面，所述宿主细胞选自埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(Escherichia coli))，乳杆菌属(例如植物乳杆菌，食果糖乳杆菌，或路氏乳杆菌)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)(例如费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii))。在一个方面，所述宿主细胞是植物乳杆菌。在一个方面，所述宿主细胞是路氏乳杆菌。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic AcidsRes.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)本文中所述的正丙醇途径的多核苷酸，其中在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含有所述一种或多种多核苷酸的宿主细胞相比分泌(和/或能够分泌)增加水平的正丙醇。在一些方面，在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含有所述一种或多种多核苷酸的宿主细胞相比，分泌和/或能够分泌增加至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或500%水平的正丙醇。合适的培养条件的实例在下文中描述，且对于本领域技术人员而言基于本文中的教导会容易地是明显的。
在一些方面，所述宿主细胞进一步包含一种或多种(例如两种，几种)本文中所述的异丙醇途径的多核苷酸，其中在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含有所述一种或多种多核苷酸的宿主细胞相比分泌(和/或能够分泌)增加水平的异丙醇。在一些方面，在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含有所述一种或多种多核苷酸的宿主细胞相比，分泌和/或能够分泌增加至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或500%水平的正丙醇。
在任何这些方面，所述宿主细胞以理论值至少10%，例如至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%或至少90%的产率产生(和/或能够产生)正丙醇和/或异丙醇。
在任何这些方面，所述重组宿主具有大于约0.1g/L每小时，例如，大于约0.2g/L每小时，0.5g/L每小时，0.6g/L每小时，0.7g/L每小时，0.8g/L每小时，0.9g/L每小时，1.0g/L每小时，1.1g/L每小时，1.2g/L每小时，1.3g/L每小时，1.5g/L每小时，1.75g/L每小时，2.0g/L每小时，2.25g/L每小时，2.5g/L每小时，或3.0g/L每小时；或约0.1g/L每小时至约2.0g/L每小时，例如约0.3g/L每小时至约1.7g/L每小时，约0.5g/L每小时至约1.5g/L每小时，约0.7g/L每小时至约1.3g/L每小时，约0.8g/L每小时至约1.2g/L每小时，或约0.9g/L每小时至约1.1g/L每小时的正丙醇和/或异丙醇体积生产力(volumetric productivity)。
可将所述重组宿主细胞在适于产生乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶、或正丙醇脱氢酶的营养培养基中使用本领域中公知的方法进行培养。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所需多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)，或可从商业上可获得的成分制备。
乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶、或正丙醇脱氢酶及其活性，可使用本领域中公知的方法检测。这些检测方法可包括使用特异性抗体，酶产物的形成，或酶底物的消失。参见，例如Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)；及Hanai等,Appl.Environ.Microbiol.73:7814-7818(2007))。
基因破坏
宿主细胞可包含一种或多种(例如两种，几种)基因破坏，例如，以将糖代谢从不合意的产物转向正丙醇。特定的感兴趣基因如丙酮酸脱羧酶的破坏，可通过本领域中已知的方法产生，如通过直接同源重组(参见Methods in YeastGenetics(1997版),Adams,Gottschling,Kaiser,和Stems,Cold Spring HarborPress(1998))；或通过RNAi或反义技术。
在一些方面，所述宿主细胞具有丙酮酸脱羧酶(PDC)活性的缺失或减少。在一些方面，所述宿主细胞包含对编码丙酮酸脱羧酶(PDC)的内源多核苷酸的破坏。在一些方面，所述编码丙酮酸脱羧酶(PDC)的多核苷酸在丙酮酸脱羧酶基因的基因座处通过插入一种或多种编码本文中所述的多肽的异源多核苷酸(例如编码见上文的乳酸脱氢酶的多核苷酸)来破坏。在一些方面，所述宿主细胞不具有丙酮酸脱羧酶活性。在一些方面，在洗脱条件下，所述宿主细胞的丙酮酸脱羧酶活性与未经编码丙酮酸脱羧酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，所述宿主细胞不具有由受破坏的多核苷酸编码的丙酮酸脱羧酶。在一些方面，在相同条件下，由受破坏的多核苷酸编码的丙酮酸脱羧酶与未经破坏的宿主细胞相比减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，所述宿主细胞不具有来自受破坏的多核苷酸的对应的mRNA。在一些方面，在相同条件下，来自受破坏的多核苷酸的对应的mRNA与未经破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，在相同条件下，由宿主细胞产生的乙醇的量与未经编码丙酮酸脱羧酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，在相同条件下，产生的正丙醇的量与未经编码丙酮酸脱羧酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比多至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少50%，或至少100%。
在一些方面，所述宿主细胞具有丙醛脱氢酶活性的缺失或减少。减少丙醛脱氢酶活性可避免下游代谢物丙醛代谢为丙酰CoA。宿主细胞可缺乏编码丙醛脱氢酶的内源多核苷酸，或包含对编码丙醛脱氢酶的内源多核苷酸的破坏。在一些方面，所述宿主细胞包含对pduP基因(SEQ ID NO:67)的编码序列的破坏，所述基因编码SEQ ID NO:68的丙醛脱氢酶。在一些方面，所述宿主细胞包含对编码丙醛脱氢酶的内源基因的破坏，所述丙醛脱氢酶与SEQ IDNO:68，或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一些方面，所述宿主细胞包含对内源丙醛脱氢酶基因的破坏，其中所述基因的编码序列与SEQ ID NO:67，或其成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一些方面，所述内源基因的编码序列包含或组成为SEQ ID NO:67。
在一些方面，所述宿主细胞具有醇脱氢酶活性的缺失或减少。减少醇脱氢酶活性可改善氧化还原电势以供将乳酸转化为乳醛。所述宿主细胞可缺乏编码醇脱氢酶的内源多核苷酸，或包含对编码醛脱氢酶的内源多核苷酸的破坏。在一些方面，所述宿主细胞包含对具有SEQ ID NO:65的编码序列的内源adhE基因的破坏，所述基因编码SEQ ID NO:66的双功能性醇脱氢酶。在一些方面，所述宿主细胞包含对编码乙酸激酶的内源基因的破坏，所述乙酸激酶与SEQID NO:66，或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一些方面，所述宿主细胞包含对内源醇脱氢酶基因的破坏，其中所述基因的编码序列与SEQ ID NO:65，或其成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一些方面，所述内源基因的编码序列包含或组成为SEQ ID NO:65。
在一些方面，编码丙醛脱氢酶或醇脱氢酶的多核苷酸在所述醛脱氢酶或醇脱氢酶基因的基因座处通过插入一种或多种编码本文中所述的多肽的异源多核苷酸(例如编码见上文的乳酸脱氢酶的多核苷酸)来破坏。在一些方面，所述宿主细胞不具有丙醛脱氢酶或醇脱氢酶活性。在一些方面，在相同条件下，所述宿主细胞的丙醛脱氢酶或醇脱氢酶活性与未经编码丙醛脱氢酶或醇脱氢酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，所述宿主细胞不具有由受破坏的多核苷酸编码的丙醛脱氢酶或醇脱氢酶。在一些方面，在相同条件下，由受破坏的多核苷酸编码的丙醛脱氢酶或醇脱氢酶与未经破坏的宿主细胞相比减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，所述宿主细胞不具有来自受破坏的多核苷酸的对应的mRNA。在一些方面，在相同条件下，来自受破坏的多核苷酸的对应的mRNA与未经破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，在相同条件下，由宿主细胞产生的丙酰CoA或丙酸的量与未经编码丙醛脱氢酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。在一些方面，在相同条件下，产生的正丙醇的量与未经编码丙醛脱氢酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比多至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少50%，或至少100%。
方法
本文中所述的重组宿主细胞可用于产生正丙醇，或同时产生正丙醇和异丙醇。在一个方面，是产生正丙醇的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇的条件下，将任何一个本文中所述的重组宿主细胞(例如任何具有乳酸脱氢酶活性、乳醛脱氢酶活性、乳醛还原酶活性、丙二醇脱水酶活性、和正丙醇脱氢酶活性的宿主细胞)在培养基中培养；和(b)回收所述正丙醇。在一个方面，是产生正丙醇的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇的条件下，在培养基中培养任何一种本文中所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的乳酸脱氢酶、本文中所述的乳醛脱氢酶、本文中所述的乳醛还原酶、本文中所述的丙二醇脱水酶和/或本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸；和(b)回收所述正丙醇。
在一个方面，是同时产生正丙醇和异丙醇的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇和异丙醇的条件下在培养基中培养本文中所述的任何一个重组宿主细胞(例如，任何具有乳酸脱氢酶活性、乳醛脱氢酶活性、乳醛还原酶活性、丙二醇脱水酶活性、正丙醇脱氢酶活性、硫解酶活性、CoA转移酶活性、乙酰乙酸脱羧酶活性和异丙醇脱氢酶活性的真核或细菌宿主细胞)；和(b)回收所述正丙醇和异丙醇。在一方面，是共同产生正丙醇和异丙醇的方法，其包括：(a)在培养基中培养任何一种本文中所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(1)一种或多种(例如两种，几种)编码本文中所述的乳酸脱氢酶、本文中所述的乳醛脱氢酶、本文中所述的乳醛还原酶、本文中所述的丙二醇脱水酶和/或本文中所述的正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸和(ii)一种或几种编码本文中所述的硫解酶、本文中所述的CoA转移酶、本文中所述的乙酰乙酸脱羧酶、和本文中所述的异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸；和(b)回收所述正丙醇和异丙醇。
用于产生丙醇的方法可在可发酵的培养基中进行，所述培养基包含一种或多种(例如两种，几种)糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖。在一些情况下，所述发酵培养基来源于自然来源如甘蔗、淀粉或纤维素，且可为通过酶水解(糖化)预处理所述来源的结果。
除了来自一种或多种(例如两种，几种)糖的合适碳源，所述发酵培养基可含有其它本领域技术人员已知的营养物或刺激剂，如常量营养物(例如氮源)和微量营养物(例如维生素、矿物质盐和金属辅因子)。在一些方面，所述碳源可优选地与至少一种氮源如酵母提取物、N2或蛋白胨(例如BactoTM Peptone)一同供应。维生素的非限定性实例包括多种维生素、生物质、泛酸、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、和维生素A、B、C、D和E。矿物质盐和金属辅因子的实例包括但不限于Na，P，K，Mg，S，Ca，Fe，Zn，Mn，和Cu。
用于丙醇产生方法的合适条件可由本领域技术人员根据本文中的教导来确定。在所述方法的一些方面，将宿主细胞培养约12小时至约216个小时，如约24小时至约144个小时，约36小时至约96个小时，温度通常为约26℃至约60℃，例如约34℃至约50℃，和pH为约3.0至约8.0，如约3.0至约7.0，约3.0至约6.0，约3.0至约5.0，约3.5至约4.5，约4.0至约8.0，约4.0至约7.0，约4.0至约6.0，约4.0至约5.0，约5.0至约8.0，约5.0至约7.0，或约5.0至约6.0或小于约6.0，小于约5.5，小于约5.0，小于约4.5，小于约4.0，小于约3.5，小于约3.0，或小于约2.5。所述方法的一些方面，宿主细胞所得的胞内pH为约2.0至约8.0，如约2.0至约7.0，约2.0至约6.0，约2.0至约5.0，约1.5至约4.5，约3.0至约8.0，如约3.0至约7.0，约3.0至约6.0，约3.0至约5.0，约3.5至约4.5，约4.0至约8.0，约4.0至约7.0，约4.0至约6.0，约4.0至约5.0，约5.0至约8.0，约5.0至约7.0，或约5.0至约6.0，或小于约6.0，小于约5.5，小于约5.0，小于约4.5，小于约4.0，小于约3.5，小于约3.0，或小于约2.5。视需要，培养可在厌氧、微氧或有氧条件下进行。在一些方面，培养在厌氧条件下进行。
视需要，培养可在厌氧、基本上厌氧(微氧)或需氧条件下进行。简言之，厌氧指排除氧的环境，基本上厌氧(微氧)指其中氧浓度低于空气的环境，而需氧指其中氧浓度大约等于或大于空气的环境。基本上厌氧条件包括例如这样的培养、分批发酵或连续发酵，所述培养基中溶解的氧浓度维持低于10%饱和。基本上厌氧条件亦包括在维持低于1%氧的空气的密封容器内部的液体培养基中或在固体琼脂上生长或静息的细胞。氧的百分比可通过例如用N2/CO2混合物或其它合适的一种或多种非氧气体在所述培养物中鼓泡来维持。在一些实施方案中，培养在厌氧条件或基本上厌氧条件下进行。
本文中所述的方法可采用任何合适的发酵操作模式。例如，可对于封闭系统使用分批模式的发酵，其中在发酵开始时设定的培养基和宿主微生物除了(例如用于pH控制，泡沫控制，或其它工艺维持所需的)某些试剂之外不具有其它输入。在本文中所述的工艺亦可在补料分批或连续模式中使用。
本文中所述的方法亦可在如搅拌釜、鼓泡塔、气升式反应器和其它本领域技术人员已知的数种生物反应器构造中实践。
所述方法视需要可在游离细胞培养或在固定化细胞培养中进行。可使用任何对于固定化细胞培养的支持材料，如海藻酸，纤维床(fibrous bed)或Argyle(多色菱形纹)材料如贵橄榄石(chrysolite)、蒙脱石KSF和蒙脱石K-10。
在所述方法的一个方面，正丙醇、异丙醇或合并的正丙醇和异丙醇，以大于约10g/L的效价，例如大于约25g/L，50g/L，75g/L，100g/L，125g/L，150g/L，160g/L，170g/L，180g/L，190g/L，200g/L，210g/L，225g/L，250g/L，275g/L，300g/L，325g/L，350g/L，400g/L，或500g/L的效价；或约10g/L至约500g/L，例如约50g/L至约350g/L，约100g/L至约300g/L，约150g/L至约250g/L，约175g/L至约225g/L，或约190g/L至约210g/L的效价产生。在所述方法的一个方面，正丙醇以大于约0.01克每克糖，例如大于约0.02，0.05，0.75，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，或1.0克每克糖的效价产生。
在所述方法的一个方面，在相同条件下培养时，产生的正丙醇、异丙醇或合并的正丙醇的量与不含一种或多种编码乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶和/或正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，多至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少50%，或至少100%。
重组产物(例如正丙醇或异丙醇)可任选地从发酵培养基使用任何本领域已知方法回收，所述方法包括但不限于层析(例如大小排阻层析，吸附层析，离子交换层析)，电泳方法，差示溶解度，渗透，蒸馏，提取(例如液-液萃取)，渗透蒸发，提取性过滤，膜过滤，膜分离，反向过滤或超滤。在一个方面，将正丙醇和异丙醇通过常规的蒸馏方法而从其它发酵的材料分离并纯化。相应地，在一个方面，所述方法进一步包括通过蒸馏纯化回收的正丙醇，或合并的正丙醇和异丙醇。
重组的正丙醇和异丙醇亦可通过将杂质(污染物)化学转化为更易通过上述方法(例如层析，电泳方法，差示溶解度，蒸馏，或萃取)从丙醇去除的产物和/或通过将一种或多种(例如两种，几种)所述杂质直接化学转化为正丙醇或异丙醇来纯化。例如，在一个方面，本方法进一步包括通过将丙醛污染物转化为正丙醇或将丙酮污染物转化为异丙醇来纯化回收的正丙醇。将将丙醛转化为正丙醇或丙酮转化为异丙醇可使用任何本领域中已知的合适还原剂(例如氢化锂铝(LiAlH4)，钠物种(如钠汞齐或硼氢化钠(NaBH4))，锡物种(如氯化锡(II)，肼，锌汞齐(Zn(Hg))，二异丁基铝氢化物(diisobutylaluminum hydride，DIBAH)，草酸(C2H2O4)，甲酸(HCOOH)，抗坏血酸，铁物种(如硫酸铁(II)等等)来完成。
在所述方法的一些方面，在经任选地纯化之前和/或之后的重组丙醇制备物是基本上纯的。对于产生正丙醇和同时产生正丙醇与异丙醇的方法，“基本上纯的”意指回收的制备物，其含有不超过15%杂质，其中杂质意指除了丙醇以外的化合物，但不包括任何丙醇异构体。基本上纯的制备物可含有正丙醇和异丙醇二者的混合物。在一个变化形式中，提供了基本上纯的制备物，其中所述制备物含有不多于25%杂质，或不多于20%杂质，或不多于10%杂质，或不多于5%杂质，或不多于3%杂质，或不多于1%杂质，或不多于0.5%杂质。
由本文中所述的任何方法产生的正丙醇和异丙醇可转化为丙烯。丙烯可通过使用本领域中已知的酸性催化剂将正丙醇和/或异丙醇化学脱水来产生，所述催化剂如酸性氧化铝、沸石和其它金属氧化物，酸性有机磺酸树脂，无机酸如磷酸和硫酸，和路易斯酸如三氟化硼和铝化合物(March，Jerry.Advanced Organic Chemistry.New York:John Wiley和Sons，1992)。对于将正丙醇和/或异丙醇脱氢为丙烯的合适温度通常范围为约180℃至约600℃，例如300℃至约500℃，或350℃至约450℃。
正丙醇和/或异丙醇的脱氢反应通常在绝热或恒温反应器中进行，所述反应器亦可为固定或流化床反应器，并可使用范围为约0.1至约60秒，例如约1至约30秒的停留时间来优化。可将未转化的醇再循环至脱氢反应器。
在一个方面，是产生丙烯的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇的条件下在培养基中培养本文中所述的重组宿主细胞；(b)回收所述正丙醇；(c)在适于产生丙烯的条件下将所述正丙醇脱水；和(d)回收所述丙烯。在另一个方面，是产生丙烯的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇和异丙醇的条件下在培养基中培养本文中所述的重组宿主细胞；(b)回收所述正丙醇和异丙醇；(c)在适于产生丙烯的条件下将所述正丙醇和异丙醇脱水；和(d)回收所述丙烯。
在一个产生丙烯的一些方面，所述培养基是可发酵的培养基。在另一个方面，所述培养基是包含甘蔗汁(例如未经灭菌的甘蔗汁)的可发酵的培养基。在一个方面，在对所述正丙醇进行脱水之前产生的正丙醇的量为大于约0.01g/L，例如大于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价。在脱水之前回收的正丙醇和异丙醇可以是或可以不是基本上纯的，如上文中所述。在一个方面，在适于产生丙烯的条件下对正丙醇和异丙醇进行脱水包括将正丙醇和异丙醇与酸性催化剂相接触或用酸性催化剂处理，如本领域中已知。
在脱水过程中可产生的污染物可通过使用本领域中已知的技术进行纯化来去除。例如，丙烯可用水或苛性碱溶液(caustic solution)洗涤以去除酸性化合物如二氧化碳，和/或给料至床以吸收极性化合物如水或去除例如一氧化碳。或者，可使用蒸馏塔来分离高级烃类如丙烷，丁烷，丁烯和更高级的化合物。从污染物(如乙烯)分离丙烯可通过本领域中已知的方法如低温蒸馏(cryogenic distillation)进行。
对于本文中所述的产生方法和宿主细胞，测试正丙醇，异丙醇和丙烯的合适测定法可使用本领域中已知的方法进行。例如，最终正丙醇和异丙醇产物，和中间物(例如丙醛和丙酮)以及其它有机化合物可通过方法如HPLC(高效液相色谱)，GC-MS(气相色谱-质谱)和LC-MS(液相色谱-质谱)或其它合适的分析方法使用本领域中公知的常规方法来进行分析。在发酵液中正丙醇和异丙醇的释放亦可用发酵上清测试。在发酵培养基中的副产物和剩余糖(例如葡萄糖)可通过HPLC使用例如针对葡萄糖和醇的折射率检测器，和针对有机酸的UV检测器(Lin等，Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))，或使用其它本领域中公知的合适测定法和检测方法来进行定量。
从正丙醇和异丙醇产生的丙烯可通过本领域中已知的聚合工艺进一步转化为聚丙烯或聚丙烯共聚物。合适的温度通常范围对于本体聚合(bulkpolymerization)为约105℃至300℃，或对于悬液中聚合为约50℃至约100℃。或者，聚丙烯可在聚合催化剂如Ziegler-Natta或金属茂(metalocene)催化剂存在下在气相反应器中在约60℃至约80℃的范围的温度来产生。
下述实施例以说明的方式提供，且其并不旨在限制本发明。
实施例
用作缓冲剂和底物的化学品是至少试剂级别的商品。
宿主菌株
路氏乳杆菌SJ10655(O4ZXV)
描述为路氏乳杆菌DSM20016的菌株从公共菌株收藏获得。将该菌株在MRS培养基中传代培养，并将一份等分试样作为SJ10468冻结。将SJ10468接种入MRS培养基，在37℃在不振荡下繁殖一日，并铺板于MRS琼脂平板上以获得单菌落。在37℃生长两日之后，将单个菌落在MRS琼脂平板上重新分离，将平板在37℃温育三日，然后将在平板上的细胞生长物刮去，并作为SJ10655储藏于菌株收集物中(另用名：O4ZXV)。
将同样的细胞生长物用于接种10mL MRS培养物，将该培养物在37℃在不振荡下温育3日，在此之后将细胞通过离心收获，并使用QIAamp DNABlood Kit(Qiagen,Hilden,Germany)制备基因组DNA并送去基因组测序。
基因组序列揭示了分离株SJ10655(O4ZXV)具有与JCM1112，而非与紧密相关的菌株DSM20016基本上相同的基因组。JCM1112和DSM20016来源于相同的原始分离株，路氏乳杆菌F275(Morita等DNA research,2008,15,151-161.)。
路氏乳杆菌SJ11294
路氏乳杆菌菌株SJ11294是SJ10655具有改善的转化能力的突变体(当可获得时提供EcFc，USSN:61/648,958，2012年5月18日提交)。
路氏乳杆菌SJ11360
路氏乳杆菌菌株SJ11360是使用如下所述的转化步骤用pSJ10600(参见WO2012/058603)转化的路氏乳杆菌菌株SJ11294。
路氏乳杆菌TRGU1014
路氏乳杆菌菌株TRGU1014是使用如下所述的转化步骤用pSJ10600(参见WO2012/058603)转化的路氏乳杆菌菌株TRGU1013(参见实施例22)。
大肠杆菌TG1
TG1是常用的克隆菌株，并从商业供应商获得；其具有下述基因型：F’[traD36lacIqΔ(lacZ)M15proA+B+]glnV(supE)thi-1Δ(mcrB-hsdSM)5(rK-mK-McrB-)thiΔ(lac-proAB)。
培养基
LB平板由37g LB琼脂(Sigma目录号L3027)和双蒸水至1L构成。
LBPGS平板由37g LB琼脂(Sigma目录号L3027)，0.5%淀粉(Merck目录号101252)，0.01M K2PO4，0.4%葡萄糖，和双蒸水至1L构成。
TY肉汤培养基由20g胰蛋白胨(Difco目录号211699)，5g酵母提取物(Difco目录号212750)，7*10-3g氯化铁(ferrochloride)，1*10-3g氯化锰(II)，1.5*10-3g硫酸镁，和双蒸水至1L构成。
基本培养基(MM)由20g葡萄糖，1.1g KH2PO4，8.9g K2HPO4；1.0g(NH4)2SO4；0.5g柠檬酸钠(Na-citrate)；5.0g MgSO4·7H2O；4.8mgMnSO4·H2O；2mg硫胺素；0.4mg/L生物素；0.135g FeCl3·6H2O；10mgZnCl2·4H2O；10mg CaCl2·6H2O；10mg Na2MoO4·2H2O；9.5mg CuSO4·5H2O；2.5mg H3BO3；和双蒸水至1L构成，pH用HCl调整至7。
MRS培养基从DifcoTM获得，作为DifcoTM乳杆菌MRS琼脂(DifcoTMLactobacilli MRS Agar)或DifcoTM乳杆菌MRS培养液(DifcoTM LactobacilliMRS Broth)，其具有下述组成—DifcoTM乳杆菌MRS琼脂：月示蛋白胨(ProteosePeptone)No.3(10.0g)，牛肉提取物(Beef Extract)(10.0g)，酵母提取物(YeastExtract)(5.0g)，右旋糖(Dextrose)(20.0g)，聚山梨醇酯(Polysorbate)80(1.0g)，柠檬酸铵(Ammonium Citrate)(2.0g)，乙酸钠(Sodium Acetate)(5.0g)，硫酸镁(Magnesium Sulfate)(0.1g)，硫酸锰(Manganese Sulfate)(0.05g)，磷酸氢二钾(Dipotassium Phosphate)(2.0g)，琼脂(Agar)(15.0g)和水至1L。DifcoTM乳杆菌MRS培养液：由相同成分组成，但不含琼脂。
LC(乳杆菌属携带)培养基由胰蛋白酶解酪蛋白(Trypticase)(10g)，胰蛋白月示(Tryptose)(3g)，酵母提取物(5g)，KH2PO4(3g)，Tween80(1ml)，乙酸钠(1g)，柠檬酸铵(1.5g)，盐酸半胱氨酸(Cystein-HCl)(0.2g)，MgSO4.7H2O(12mg)，FeSO4.7H2O(0.68mg)，MnSO4.2H2O(25mg)，和双蒸水至1L构成，pH调整至7.0。在蒸汽灭菌至1%(5ml的20%葡萄糖储液/100ml培养基)之后添加灭菌的葡萄糖。
用于路氏乳杆菌的转化方案
除非另行指明，质粒DNA通过电穿孔引入路氏乳杆菌。如下所述将路氏乳杆菌菌株准备用于电穿孔：将菌株从冻结的储备培养物接种入LCM培养基，并在37℃在无振荡下温育过夜。将5ml等分试样转移至500ml LCM并在37℃无振荡下温育直至OD600达到大约0.8。细胞如上所述通过离心来收获，在室温在50ml的经离子交换的灭菌水中重悬并洗涤两次，并通过离心收获。将细胞最后轻柔地重悬于2.5ml的30%PEG1500，并将50微升等分试样迅速冻结于醇/干冰浴，并储藏于-80℃直至使用。
对于路氏乳杆菌的电穿孔，将冻结的细胞在冰上熔融，并添加2微升TE缓冲液中的DNA悬液。将40微升的混合物转移至冰冷的2mm电穿孔小杯，在冰上放置1至3分钟，而电穿孔在BioRad Gene PulserTM中进行，设定如下：1.5kV；25微法拉第；400欧姆。添加500微升LCM，并将混合物在37℃无振荡下温育2小时，然后铺板。将细胞铺板于MRS琼脂平板，所述平板补充以所需的抗生素，并在厌氧室中温育(Oxoid，配备有Anaerogen小袋(Anaerogen))。
实施例1：丙酮丁醇梭菌硫解酶基因的克隆和载体pTRGU51的构建
将在丙酮丁醇梭菌中鉴定的硫解酶基因的1176bp编码序列(CDS)优化以供在大肠杆菌中表达，并合成地构建入pTRGU51。将含有密码子优化的CDS的DNA片段设计为在紧接着起始密码子之前具有核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)。然后将所得的序列提交至Geneart AG(Regenburg,Germany)并由其合成，并递送入含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体。当合成时，CDS和RBS片段侧翼为限制性位点以便于后续克隆步骤。克隆入pMA载体的整个合成片段为EcoRI–RBS–CDS–STOP–BamHI–XbaI，得到pTRGU51。
丙酮丁醇梭菌硫解酶基因的野生型核苷酸序列(WT)和推导的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:37和38。编码序列为1179bp，包括终止密码子，而编码的预测的蛋白为392个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering10:1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有392个氨基酸，具有41.4kDa的预测的分子量，和7.08的等电点pH。
实施例2：枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的克隆和载体pTRGU58和pTRGU59的构建
将枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的scoA亚基的699bp编码序列(CDS)和枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的scoB亚基的648bp编码序列优化以供在大肠杆菌中表达，并分别合成地构建入pTRGU58和pTRGU59。将每个含有密码子优化的CDS的DNA片段设计为具有核糖体结合位点并由Geneart AG(Regenburg,Germany)合成，如实施例1中所述，且具有以下所示的修饰的限制性位点。克隆入pMA载体的含有scoA的整个合成片段为EcoRI–BamHI–RBS–scoA–STOP–NotI–XbaI，得到pTRGU58。克隆入pMA载体的含有scoB的整个合成片段为EcoRI–NotI–RBS–scoB–STOP–HindIII–XbaI，得到的载体命名为pTRGU59。
所述琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的枯草芽孢杆菌scoA亚基的野生型核苷酸序列(WT)和推导的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:39和40。编码序列为702bp，包括终止密码子，而编码的预测的蛋白为233个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有233个氨基酸，具有25.1kDa的预测的分子量，和6.50的等电点pH。
所述琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的枯草芽孢杆菌scoB亚基的野生型核苷酸序列(WT)和推导的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:41和42。编码序列为651bp，包括终止密码子，而编码的预测的蛋白为216个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有216个氨基酸，具有23.4kDa的预测的分子量，和5.07的等电点pH。
实施例2：摩加夫芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的克隆和载体pTRGU60和pTRGU61的构建
摩加夫芽孢杆菌的基因组序列通过用Genome Analyzer II(Illumina,SanDiego,CA,USA)使用本领域中已知的标准技术进行测序获得。将72个碱基配对的8,327,624读取用Velvet版本0.7.31汇编入73个重叠群和3,913,09个碱基对。使用Glimmer3进行基因查找(gene finding)，得到4,092个推定的基因。摩加夫芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的scoA和scoB亚基的编码序列(CDS)通过与来自枯草芽孢杆菌的已知的scoA和scoB基因的同源性而发现。
将摩加夫芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的scoA亚基的711bp编码序列(CDS)和摩加夫芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的scoB亚基的654bp编码序列优化以供在大肠杆菌中表达，并分别合成地构建入pTRGU60和pTRGU61。将每个含有密码子优化的CDS的DNA片段设计为具有核糖体结合位点并由Geneart AG合成，如实施例1中所述，且具有以下所示的修饰的限制性位点。克隆入pMA载体的含有scoA的整个合成片段为EcoRI–BamHI–RBS–scoA–STOP–NotI–XbaI，得到pTRGU60。克隆入pMA载体的含有scoB的整个合成片段为EcoRI–NotI–RBS–scoB–STOP–HindIII–XbaI，得到的载体命名为pTRGU61。
所述琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的摩加夫芽孢杆菌scoA亚基的野生型核苷酸序列(WT)和推导的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:43和44。编码序列为714bp，包括终止密码子，而编码的预测的蛋白为237个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有237个氨基酸，具有25.5kDa的预测的分子量，和5.82的等电点pH。
所述琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的摩加夫芽孢杆菌scoB亚基的野生型核苷酸序列(WT)和推导的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:45和46。编码序列为657bp，包括终止密码子，而编码的预测的蛋白为218个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有218个氨基酸，具有23.7kDa的预测的分子量，和5.40的等电点pH。
实施例4：拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因的克隆和载体pTRGU62的构建
将拜氏梭菌的乙酰乙酸脱羧酶基因的738bp编码序列(CDS)优化以供在大肠杆菌中表达，并合成地构建入pTRGU62。将含有密码子优化的CDS的DNA片段设计为具有核糖体结合位点并由Geneart AG合成，如实施例1中所述，且具有以下所示的修饰的限制性位点。克隆入pMA载体的整个合成片段为EcoRI–HindIII-RBS–CDS–STOP–AscI-XbaI，得到pTRGU62。
拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶的野生型核苷酸序列(WT)和推导的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:47和48。编码序列为741bp，包括终止密码子，而编码的预测的蛋白为246个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有246个氨基酸，具有27.5kDa的预测的分子量，和6.18的等电点pH。
实施例5：拜氏梭菌异丙醇脱氢酶基因的克隆和载体pTRGU53的构建
将拜氏梭菌的异丙醇脱氢酶基因的1053bp编码序列(CDS)优化以供在大肠杆菌中表达，并合成地构建入pTRGU53。将含有密码子优化的CDS的DNA片段设计为具有核糖体结合位点并由Geneart AG合成，如实施例1中所述，且具有以下所示的修饰的限制性位点。克隆入pMA载体的整个合成片段为EcoRI–AscI-RBS–CDS–STOP-XbaI，得到pTRGU53。
拜氏梭菌异丙醇脱氢酶的野生型核苷酸序列(WT)和推导的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:49和50。编码序列为1056bp，包括终止密码子，而编码的预测的蛋白为351个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有351个氨基酸，具有37.8kDa的预测的分子量，和6.64的等电点pH。
实施例6：产乙醇热厌氧杆菌异丙醇脱氢酶基因的克隆和载体pTRGU54的构建
将产乙醇热厌氧杆菌的异丙醇脱氢酶基因的1056bp编码序列(CDS)优化以供在大肠杆菌中表达，并合成地构建入pTRGU54。将含有密码子优化的CDS的DNA片段设计为具有核糖体结合位点并由Geneart AG合成，如实施例1中所述，且具有以下所示的修饰的限制性位点。克隆入pMA载体的整个合成片段为EcoRI–AscI–RBS–CDS–STOP–XbaI，得到pTRGU54。
产乙醇热厌氧杆菌异丙醇脱氢酶的野生型核苷酸序列(WT)和推导的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:51和52。编码序列为1059bp，包括终止密码子，而编码的预测的蛋白为352个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有352个氨基酸，具有37.7kDa的预测的分子量，和6.23的等电点pH。
实施例7：空表达载体pTRGU88的构建和转化
将含有LacIq阻抑物、trc启动子和多克隆位点(MCS)的2349bp片段从pTrc99A(E.Amann和J.Brosius,1985,Gene40(2-3),183-190)使用下示的引物pTrcBglIItop和pTrcScaIbot进行扩增。
引物pTrcBglIItop：
5’-GAAGATCTATGGTGCAAAACCTTTCGCGG-3’(SEQ ID NO:63)
引物pTrcScaIbot：
5’-AAAAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAG-3’(SEQ ID NO:64)
PCR反应含有12.5pmol引物pTrcBglIItop，12.5pmol引物pTrcScaIbot和0.625单位的Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen,UK)。扩增反应程序如下：25个循环，每个在95℃进行2分钟；95℃进行30秒，42℃进行30秒，和72℃进行2分钟；然后一个循环，在72℃进行3分钟。将所得的PCR产物用PCR Purification Kit(Qiagen,Hilden,Germany)根据生产商的指示纯化，并在37℃用各5单位的BglII(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)和ScaI(New England Biolabs)(限制性位点在上述引物中用下划线标出)消化过夜。然后将消化的片段用PCR Purification Kit(Qiagen)根据生产商的指示进行纯化。
将含有p15A复制起点的质粒pACYC177(Y.K.Mok,等,1988,NucleicAcids Res.16(1),356)在37℃用5单位ScaI(New England Biolabs)和10单位BamHI(New England Biolabs)消化两小时。将10单位的小牛肠磷酸酯酶(CIP)(New England Biolabs)添加至消化物，且温育再继续进行一个小时，得到3256bp片段和685bp片段。将消化混合物在1%琼脂糖凝胶上运行，并将3256bp片段从凝胶切出，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)根据生产商的指示进行纯化。
将纯化的2349bp PCR/限制性片段使用Rapid Ligation Kit(F.Hoffmann-La Roche Ltd,Basel Switzerland)根据生产商的指示连接入3256bp限制性片段，得到pMlBa2。将质粒pMlBa2用PstI如New England Biolabs提示使用标准缓冲液3和BSA进行消化，得到1078bp PstI片段，其含有blaTEM-1的最初547bp(包括blaTEM-1启动子和RBS)，和4524bp片段，其含有p15A复制起点，LacIq阻抑物，trc启动子，多克隆位点(MCS)，和氨基糖苷3’磷酸转移酶基因。
将4524bp片段在16℃使用含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液(F.Hoffmann-La Roche Ltd)中的T4DNA连接酶连接过夜。将连接混合物的1μL等分试样使用电穿孔转化入大肠杆菌SJ2细胞。将转化体铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LBPGS平板上，并在37℃温育过夜。然后将选定的菌落在含200μg/mL氨苄青霉素的LB平板和含20μg/mL卡那霉素的LB平板上划线。分离了八个氨苄青霉素敏感和卡那霉素抗性的转化体，并在含20μg/mL卡那霉素的LB平板上划线纯化。将八个菌落的每一个均接种于液体TY肉汤培养基，并在37℃温育过夜。将来自每个菌落的质粒使用
Figure BDA0000462967770000861
SpinMiniprep Kit(Qiagen)分离，然后用EcoRI和MluI双重消化。当使用来自Lonza(Basel,Switzerland)的电泳系统
Figure BDA0000462967770000862
System”进行分析时，每个质粒产生1041bp和3483bp的正确限制性样式。将一个命名为大肠杆菌TRGU88转化体的液体过夜培养物在-80℃储藏于30%甘油。将对应的质粒pTRGU88(图14)用
Figure BDA0000462967770000863
Spin Miniprep Kit(Qiagen)使用生产商的指示从大肠杆菌TRGU88分离，并储藏于-20℃。
实施例8：表达丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因，和拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因的pTRGU170的构建和转化
将质粒pTRGU88和pTRGU51各自用EcoRI和XbaI消化，并使用如本文中概述的标准方法用CIP去磷酸化。将所得的pTRGU51的1205bp片段和pTRGU88的4497bp片段各自使用凝胶电泳纯化，然后如本文中概述连接。将连接混合物的1μl等分试样使用电穿孔转化入大肠杆菌TOP10细胞(InVitrogen,UK)。将10μl的转化混合物铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上。将四个所得菌落均接种于TY肉汤培养基，并在37℃培养过夜。将来自每个菌落的质粒分离，用EcoRI和XbaI消化，并将所得的片段如本文中所述在1%琼脂糖凝胶上按尺寸分离。插入序列具有正确的大小，并通过测序验证。将一个命名为大肠杆菌TRGU130的转化体在-80℃储藏于30%甘油中。将对应的质粒pTRGU130(图15)如本文中所述从大肠杆菌TRGU130分离，并储藏于-20℃。将质粒pTRGU130用BamHI和XbaI限制性消化，并使用如本文中概述的标准方法用CIP去磷酸化。将所得的5696bp DNA片段如本文中所述在1%琼脂糖凝胶上纯化。
将质粒pTRGU58，pTRGU59，和pTRGU88分别用EcoRI/NotI，NotI/XbaI，和EcoRI/XbaI单独消化，并使用如本文中概述的标准方法用CIP去磷酸化。将所得的pTRGU58的scoA片段，pTRGU59的scoB片段，和pTRGU88的4497bp片段各自如本文中所概述使用凝胶电泳纯化。所得片段的三片段连接使用标准方法用T4DNA连接酶和含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液(F.Hoffmann-La Roche Ltd)进行，然后如本文中概述进行转化、分离和储藏，得到pTRGU136，其中合并的scoA和scoB序列(scoAB)的侧翼为限制性位点BamHI和XbaI。然后将scoAB片段用BamHI和XbaI从pTRGU136切出，纯化，并使用本文中所述的标准方法与上述pTRGU130的纯化的BamHI–XbaI5696bp DNA片段连接。将所得的连接产物如本文中概述转化、分离和储藏，得到pTRGU152(图17)，其含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因和枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因。
将质粒pTRGU88和pTRGU62各自用EcoRI和XbaI消化，并如本文中概述使用标准方法用CIP去磷酸化。将所得的含有拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因的pTRGU62的片段和pTRGU88的4497bp片段如本文中所概述各自使用凝胶电泳纯化、连接、转化和储藏，得到pTRGU140。然后将质粒pTRGU140用HindIII和XbaI消化，且所得的769bp片段如本文中概述使用凝胶电泳纯化。
将质粒pTRGU152分别(in parallel)用下述消化：1)EcoRI和XbaI，得到XbaI-EcoRI片段(4497bp)和2)EcoRI和HindIII，得到XbaI-HindIII片段(4497bp)。将每个片段各自如本文中所述在1%琼脂糖凝胶上纯化，并在3片段连接中与769bp上述HindIII-XbaI片段使用T4DNA连接酶在生产商(F.Hoffmann-La Roche Ltd)推荐的标准条件下连接在一起。将连接混合物的1μl等分试样如本文中所述转化入大肠杆菌TOP10细胞，并铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上。将菌落TRGU170在含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上划线纯化之后，在-80℃储藏于30%甘油。将相应的质粒pTRGU170从TRGU170分离，并如上所述验证所需的基因插入。
实施例9：表达丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，摩加夫芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因，和拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因的pTRGU178的构建和转化。
质粒pTRGU178如对于实施例8中的pTRGU170所述的类似的方式构建，只是分别从pTRGU60和pTRGU61分离摩加夫芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶亚基基因scoA和scoB。将scoA和scoB基因克隆入pTRGU88，如实施例8中详细概述进行转化、分离和储藏，构建载体pTRGU138。然后将含有scoAB基因的片段从pTRGU138用BamHI和XbaI切出，纯化，与pTRGU130的纯化的BamHI–XbaI片段连接，如本文中概述转化、分离和储藏，得到载体pTRGU156(图24)，其含有硫解酶基因和scoAB。
将来自pTRGU140的拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶769bp片段通过三片段连接与XbaI-EcoRI pTRGU156片段和XbaI-HindIII pTRGU156片段以与实施例8中所述类似的方式进行连接，接着进行转化。选择了一个转化体，大肠杆菌TRGU178，并在含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上划线纯化，并在-80℃储藏于30%甘油。将相应的质粒pTRGU178从大肠杆菌TRGU178分离，
并如上所述验证了所需的基因插入。
实施例10：表达丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌异丙醇脱氢酶基因的pTRGU196的构建和转化
将质粒pTRGU170和pTRGU53遵循生产商的指示用AscI和XbaI在标准缓冲液4(NEB)中消化。将pTRGU170的7853bp片段和pTRGU53的1077bp片段如本文中所述在1%琼脂糖凝胶上纯化。将两个片段在16℃使用T4DNA连接酶在含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液(F.Hoffmann-La Roche Ltd)中连接在一起过夜。将连接混合物的1μl等分试样转化入大肠杆菌TOP10细胞，并如本文中所述铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上。将菌落TRGU196如本文中所述在-80℃储藏于30%甘油。将相应的质粒pTRGU196从TRGU196分离，并如上所述验证了所需的基因插入。
实施例11：表达丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和产乙醇热厌氧杆菌异丙醇脱氢酶基因的pTRGU198的构建和转化
将质粒pTRGU170和pTRGU54遵循生产商的指示用AscI和XbaI在标准缓冲液4(NEB)中消化。将pTRGU170的7853bp片段和pTRGU54的1080bp片段如本文中所述在1%琼脂糖凝胶上纯化。将两个片段在16℃使用T4DNA连接酶在含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液(F.Hoffmann-La Roche Ltd)中连接在一起过夜。将连接混合物的1μl等分试样转化入大肠杆菌TOP10细胞，并如本文中所述铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上。将菌落TRGU198如本文中所述在-80℃储藏于30%甘油。将相应的质粒pTRGU198从TRGU198分离，并如上所述验证了所需的基因插入。
实施例12：表达丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，摩加夫芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌异丙醇脱氢酶基因的pTRGU200的构建和转化
将质粒pTRGU178和pTRGU53遵循生产商的指示用AscI和XbaI在标准缓冲液4(NEB)中消化。将pTRGU178的7871bp片段和pTRGU53的1077bp片段如本文中所述在1%琼脂糖凝胶上纯化。将两个片段在16℃使用T4DNA连接酶在含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液(F.Hoffmann-La Roche Ltd)中连接在一起过夜。将连接混合物的1μl等分试样转化入大肠杆菌TOP10细胞，并如本文中所述铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上。将一个菌落TRGU200如本文中所述在-80℃储藏于30%甘油。将相应的质粒pTRGU200从TRGU200分离，并如上所述验证了所需的基因插入。
实施例13：表达丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，摩加夫芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和产乙醇热厌氧杆菌异丙醇脱氢酶基因的pTRGU202的构建和转化
将质粒pTRGU178和pTRGU54遵循生产商的指示用AscI和XbaI在标准缓冲液4(NEB)中消化。将pTRGU178的7871bp片段和pTRGU54的1080bp片段如本文中所述在1%琼脂糖凝胶上纯化。将两个片段在16℃使用T4DNA连接酶在含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液(F.Hoffmann-La Roche Ltd)中连接在一起过夜。将连接混合物的1μl等分试样转化入大肠杆菌TOP10细胞，并如本文中所述铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上。将一个菌落TRGU202如本文中所述在-80℃储藏于30%甘油。将相应的质粒pTRGU202从TRGU202分离，并如上所述验证了所需的基因插入。
实施例14：在摇瓶培养中丙酮和异丙醇的产生
将七个大肠杆菌菌株(TRGU170，TRGU178，TRGU196，TRGU198，TRGU200，TRGU202，和作为阳性对照的TRGU88)各自在37℃在含有10μg/mL卡那霉素和1mM异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷的10mL LB培养基中在振荡下(250rpm)生长过夜。在24小时之后，从每个培养基移去2mL样品。将每个样品使用桌上离心机在15000x g离心，并使用气相色谱分析上清。发酵液中的丙酮、正丙醇和异丙醇可通过GC-FID检测。将样品用0.05%甲醇中的四氢呋喃1+1稀释，并进行分析。GC参数列于表1。
所述分析显示了在来自大肠杆菌TRGU170和大肠杆菌TRGU178(均缺乏异源异丙醇脱氢酶基因)的上清中检测出的主要丙酮峰，其停留时间为2.012分钟(与在2.012min的标样中的丙酮停留时间相比较)。如表2中所示，大肠杆菌TRGU170和大肠杆菌TRGU178的上清中的丙酮估计为是大肠杆菌TRGU88的至少7至8倍。异丙醇在TRGU196，TRGU198，TRGU200，和TRGU202(每个均含有异源硫解酶基因，异源琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因，异源乙酰乙酸脱羧酶基因，和异源异丙醇脱氢酶基因)中检测出来，其停留时间为3.253至3.258(与在3.240min的标样中的异丙醇停留时间相比较)。大肠杆菌TRGU196，TRGU198，TRGU200，和TRGU202中的丙酮水平与在阴性对照TRGU88中观察到的水平类似。
表1
Figure BDA0000462967770000901
表2
培养基/菌株 通过气相色谱检测出的代谢物 产生的量[mg/L]
LB培养基 痕量丙酮 无法定量
TRGU88 痕量丙酮 无法定量
TRGU170 丙酮 10
TRGU178 丙酮 10
TRGU196 异丙醇 80
TRGU198 痕量异丙醇 无法定量
TRGU200 异丙醇 70
TRGU202 异丙醇 70
实施例15：用植物乳杆菌产生异丙醇(先验性)
构建了质粒使其含有针对硫解酶基因、琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因、乙酰乙酸脱羧酶基因和异丙醇脱氢酶基因的表达载体，其经密码子优化以供如本文中所述在植物乳杆菌中表达。然后将质粒转化入植物乳杆菌细胞，并如本文中所述铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上。将选定的转化体在37℃在10mL LB培养基中在振荡下生长过夜，并如上所述分离相应的质粒并验证所需的基因插入。将含有所需的质粒的转化体在-80℃储藏于30%甘油中。
将几个转化体和阴性对照各自在37℃在含有10μg/mL卡那霉素和1mM异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷的10mL LB培养基中在振荡下生长过夜。在24小时之后，从每个培养基移去2mL样品。将每个样品使用桌上离心机在15000x g离心，并如本文中所述使用气相色谱分析上清。发酵液中的丙酮、正丙醇和异丙醇可通过GC-FID检测。将样品用0.05%甲醇中的四氢呋喃1+1稀释，并如上所述就异丙醇产生进行分析。
实施例16：在路氏乳杆菌中的正丙醇耐受
在下文中所述条件下，路氏乳杆菌显示对正丙醇具有抗性。
为了制备用于罐发酵的接种物，如上所述进行路氏乳杆菌的菌株的预培养。使用50mL的该培养物接种含有1950mL如下所述制备的培养基的发酵罐：
培养基组成：用自来水调整至最终BRIX为5的浓缩的甘蔗汁(BRIX53)用作基础组分。向此稀释的甘蔗汁，以10g/L的量添加了酵母提取物(Bacto)和以1mL/L的量添加了抑泡剂(Pluronic/Dowfax63N)。将该混合物转移至实验室规模的发酵器(3升容器)，并在121至123℃蒸汽灭菌30分钟。在蒸汽灭菌之后，将温度调整至37℃，并将80mL(对应40ml/L)的正丙醇通过灭菌过滤添加至罐。
在接种之后，将温度维持在约37℃，并将pH维持在pH6.5或pH3.8(例如，通过添加10%(w/w)NH4OH)。少量的N2流入(0.1升每分钟)确保培养物在400rpm搅拌过程中为厌氧的。在整个发酵过程中进行OD650测量以监测细胞生长。
路氏乳杆菌在pH6.5和pH3.8均能够在4%正丙醇中生长。在pH3.8，生长速率有些延缓，但在约40小时的发酵之后获得同样的最大OD。对在122小时的发酵后取得的发酵样品的基于气相色谱-质谱(GCMS)的分析显示对于正丙醇的起始量，pH6.5和pH3.8分别含有79.8%和93.1%。确定了用于实验的正丙醇最初除了96%正丙醇之外还含有大约4%异丙醇。
实施例17：在野生型(wt)路氏乳杆菌中产生的正丙醇
显示野生型路氏乳杆菌在下文中所述的条件下产生正丙醇。
将用于罐发酵的野生型路氏乳杆菌的预培养物在37℃在MRS培养基中在无通气或振荡下生长2日。将该培养物的50mL样品用于接种含有1950mL下述培养基的发酵罐：
培养基组成：将用自来水调整至最终BRIX为5的浓缩的甘蔗汁(BRIX53)用作基础组分。向此稀释的甘蔗汁，以10g/L的量添加了酵母提取物(Bacto)和以1mL/L的量添加了抑泡剂(Pluronic/Dowfax63N)。将该混合物转移至实验室规模的发酵器(3升容器)，并在121至123℃蒸汽灭菌30分钟。
在接种之后，将pH通过添加10%(w/w)NH4OH维持恒定在6.5，并将温度保持在37℃。将培养物通过少量的泵入N2流(0.1升每分钟)来保持厌氧，且搅拌速率为400rpm。
对在48小时的发酵后取得的发酵样品的基于气相色谱-质谱(GCMS)的分析显示培养物含有大约40μL/L正丙醇。
在用如上所述的相同菌株和在相同条件下进行，但pH维持恒定在pH3.8而不是pH6.5的另一个实验中，在48小时的发酵之后取得的样品显示培养物含有大约40μL/L正丙醇。
实施例18：在野生型路氏乳杆菌中从1,2-丙二醇产生正丙醇
在野生型路氏乳杆菌中说明1,2-丙二醇至正丙醇的转化。
将用于罐发酵的野生型路氏乳杆菌的预培养物在37℃在MRS培养基中在无通气或振荡下生长2日。使用该培养物的50mL样品以接种含有1950mL含1,2-丙二醇的下述培养基的发酵罐：
1,2-丙二醇培养基：用自来水调整至最终BRIX为5的浓缩的甘蔗汁(BRIX53)用作基础组分。向此稀释的甘蔗汁，以10g/L的量添加了酵母提取物(Bacto)和以1mL/L的量添加了抑泡剂(Pluronic/Dowfax63N)。将该混合物转移至实验室规模的发酵器(3升容器)，并在121至123℃蒸汽灭菌30分钟。在蒸汽灭菌之后，将温度调整至37℃，并将20g(对应10g/L)的1,2-丙二醇通过灭菌过滤添加至罐。
在接种之后，将温度维持在约37℃，并将pH通过添加10%(w/w)NH4OH维持在约pH6.5。少量的N2流入(0.1升每分钟)确保培养物在400rpm搅拌过程中为厌氧的。
取得发酵样品并基于下述步骤通过气相色谱-质谱(GCMS)对其进行分析：
样品制备：将发酵样品离心，并使用上清进行挥发组分分析。将等体积的样品上清和由0.25M HCl(水性)中的5mL/L2-甲基-1-丙醇组成的内标混合，产生施于GCMS的溶液。
GC设定：将0.1μL的上述溶液以200:1的分离比(split ratio)注射入GCMS(Agilent7890A,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)。输入温度为200℃，而所述柱为从Agilent Technologies购买的DB200柱(长度为30m/内径为250μm/薄膜厚度为0.5μm)。载气为氦，而起始流速为0.489mL/min(维持恒定1分钟)上升至0.90mL/min(上升速率：0.2907mL/min/min)，并进一步提高至1.0mL/min的最终流速(上升速率：0.6mL/min/min)，并维持1分钟。GCMS的温度程序如下所述：起始温度为50℃(维持恒定2.3分钟)，上升至175℃(上升：120℃/min)，维持2分钟。在一些情况下，由于陡的温度梯度和GCMS的能力，温度与上述温度程序不同。
MS设定：MS分析基于选定的离子监视(SIM)模式进行。用于定量的离子(m/z)如下所述(停留时间在括号中给出)：2-甲基-1-丙醇(内标)，43(2.89分钟)；异丙醇，43(2.43分钟)；正丙醇，31(2.62分钟)；丙醛，58(2.66分钟)；丙酸，74(3.27分钟)。尽管停留时间偶尔重叠，但选择这些离子使得最小化或完全消除了实际定量中共同洗脱的化合物的干扰。
在112小时的发酵之后取得的发酵样品的基于GCMS的分析显示至正丙醇和丙酸几乎定量的转化(7.30mL/L正丙醇，1.55mL/L丙酸和60μL/L丙醛)。在接种之前取得的样品，未显示丙酸和丙醛的迹象，并显示50μL/L的正丙醇浓度。
在相同但未添加1,2-丙二醇的条件下进行的对照实验中，GCMS分析显示在112小时之后取得的样品中不存在丙酸和丙醛，且正丙醇浓度为20μL/L。在培养23小时之后取得的样品中，GCMS分析显示在培养物中有40μL/L正丙醇，且没有丙酸或丙醛。在接种之前取得的样品对于正丙醇、丙醛和丙酸都是阴性的。
实施例19：正丙醇产生细菌的制备和在细菌宿主中正丙醇的产生(先验性)
将每个选定的编码所述的乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶或正丙醇脱氢酶的正丙醇途径基因(例如SEQ ID NO:1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，53，55，57，59，或61)各自密码子优化以供在大肠杆菌宿主或乳杆菌属宿主(例如路氏乳杆菌)中表达，并以类似于实施例1-6中所述的技术的方式进行克隆。然后消化所得的载体的所需的组合，并以pTRGU88克隆入操纵子，接着以类似于实施例8-13中所述的技术的方式转化入大肠杆菌或乳杆菌属菌种和进行菌落选择。然后如上所述将菌落温育，通过离心收获，和将质粒分离、消化和验证。
对于发酵，将所得的转化的宿主和Trc99A(阴性对照)各自遵循类似于实施例14-18中的那些的技术在振荡下生长过夜(例如，在含有100μg/mL氨苄青霉素和1mM异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG))的10mL LB培养基中，250rpm)。在其它实验中，如实施例16中所述将培养基的pH调整至不同的酸度，如6.5或3.8(例如通过添加10%(w/w)NH4OH)。
将每次发酵运行的样品在不同的温育时间(例如72小时，100小时)之后取样，稀释，并使用GC-FID使用实施例14中所述的参数，或如实施例18中所述的气相色谱-质谱(GCMS)分析正丙醇、异丙醇、丙醛、丙酸的存在。
在发酵过程中正丙醇途径基因的表达使用本领域中公知的用于确定表达的方法，包括例如Northern印迹，mRNA的PCR扩增，免疫印迹等证实(corroborate)。表达的多核苷酸的酶活性如本文中所述使用对于各种多肽具特异性的测定法确认。具有功能性正丙醇途径，但具有任何异源多核苷酸限速表达的菌株进一步通过途径的优化来加强，例如通过引入额外的基因拷贝和/或通过本领域中已知的其它启动子。
说明在野生型路氏乳杆菌中从1,2-丙二醇产生正丙醇的试验结果(实施例18)表明，在一些情况下，可能不需要图1的正丙醇途径中所示的每个基因的异源表达以进行正丙醇产生。例如，可能不需要在布氏乳杆菌中异源表达一些内源基因，例如将乳酸经由乳醛转化为1,2-丙二醇的基因。相应地，设计了含有更少异源基因(例如，对于路氏乳杆菌，仅编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，编码乳醛还原酶的异源多核苷酸，或其组合)的最小化的途径，并如上所述进行转化、发酵和分析正丙醇产生。
实施例20：正丙醇/异丙醇共同产生细菌的制备和在细菌宿主中正丙醇/异丙醇的共同产生(先验性)
将实施例19中所述含有正丙醇途径基因的表达载体和含有上述异丙醇途径基因的表达载体(例如，如实施例1-14中所述)通过电穿孔同时转化入大肠杆菌宿主或乳杆菌属宿主(例如路氏乳杆菌)，接着如上所述进行菌落选择。然后将菌落温育，通过离心收获，并如上所述对质粒进行分离、消化和验证。
为了发酵，将所得的转化的宿主和阴性对照遵循类似于实施例14-18中的那些的技术，各自在振荡下生长过夜(例如，在含有100μg/mL氨苄青霉素和1mM异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG))的10mL LB培养基中，250rpm)。在其它实验中，如实施例16中所述将培养基的pH调整至不同的酸度，如6.5或3.8(例如通过添加10%(w/w)NH4OH)。
将每次发酵运行的样品在不同的温育时间(例如72小时，100小时)之后取样，稀释，并使用GC-FID使用实施例14中所述的参数，或如实施例18中所述的气相色谱-质谱(GCMS)分析正丙醇、异丙醇、丙醛、丙酸的存在。
在发酵过程中正丙醇途径基因和异丙醇途径基因的表达使用本领域中公知的用于确定表达的方法，例如Northern印迹，mRNA的PCR扩增，免疫印迹等证实(corroborate)。表达的多核苷酸的酶活性如本文中所述使用对于各种多肽具特异性的测定法确认。具有功能性正丙醇和异丙醇途径，但具有任何异源多核苷酸限速表达的菌株进一步通过途径的优化来加强，例如通过引入额外的基因拷贝和/或通过本领域中已知的其它启动子。
实施例21：正丙醇产生酵母的制备和在酵母宿主中正丙醇的产生(先验性)
将含有每个编码所述的乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶或正丙醇脱氢酶的正丙醇途径基因(例如SEQ ID NO:1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，53，55，57，59，或61)的表达载体使用标准的分子生物学实验方案(参见，例如Methods inEnzymology,Volume194,Guide to Yeast Genetics and Molecular and CellBiology(Part A,2004,Christin Guthrie和Gerald R.Fink(编),Elsevier AcademicPress,San Diego,CA))合成。将每个选定的非天然基因各自密码子优化以供在选定的酵母宿主细胞中改善的表达，并如本文中所述将其设计为含有一种或多种上游启动子、终止子和/或选择标志物序列。选定的对于酵母宿主细胞天然的基因序列(例如天然乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶或正丙醇脱氢酶)可设计为供改善的表达，即如本领域中已知的，将一种或多种其它调控序列(例如本文中所述的合适的启动子)引入含有所需天然基因的表达载体。
然后将上述的表达载体的合意的组合(例如，一个、两个或几个本文中所述的不同途径基因)使用标准的分子生物学转化实验方案(参见，例如Methodsin Yeast Genetics(1997版),Adams,Gottschling,Kaiser,和Stems,Cold SpringHarbor Press(1998))插入酵母宿主细胞基因组序列的靶插入位点。靶插入位点可为任何合适的位点，如对丙醇产生具有最小限或无不利作用的位点，或在意欲进行可改善丙醇产生的基因破坏的位点(如编码丙酮酸脱羧酶(PDC)，甘油脱氢酶，二羟基丙酮磷酸磷酸酶，甘油-3-磷酸酶(GPP)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶的内源多核苷酸，或编码催化木糖至木糖醇的转化的多肽的内源多核苷酸的基因座)。
然后将转化体铺板于适于选定宿主和使用的选择标志物的培养基上。然后如本领域中已知的将单菌落重新铺板，并分离基因组DNA。然后各个基因的整合使用合适的引物序列通过PCR确认。
然后基于本领域中已知的技术和本文中所述的参数，将转化体和阴性对照在含有本文中所述的合适的培养基(例如，含有氮源、维生素、矿物盐、和/或金属辅因子，补充葡萄糖)的不同的带挡板的摇瓶中在适于选定的酵母宿主细胞的pH、温度和振荡水平下培养。
将每次发酵运行的样品在不同的温育时间(例如72小时，100小时)之后取样，稀释，并使用GC-FID使用如基于实施例18中所述的参数的气相色谱-质谱(GCMS)分析正丙醇、异丙醇、丙醛、乙醇、和丙酸的存在。
在发酵过程中正丙醇途径基因的表达使用本领域中公知的用于确定表达的方法，例如Northern印迹，mRNA的PCR扩增，免疫印迹等证实(corroborate)。表达的多核苷酸的酶活性如本文中所述使用对于各种多肽具特异性的测定法确认。具有功能性正丙醇途径，但具有任何异源多核苷酸限速表达的菌株进一步通过途径的优化来加强，例如通过引入额外的基因拷贝和/或通过本领域中已知的其它启动子。
如本领域技术人员会知晓，在一些情况下(例如，取决于宿主的选择)，可能不需要图1的正丙醇途径中所示的每个基因的异源表达以进行正丙醇产生，因为宿主细胞可具有来自一种或多种途径基因的内源酶活性。相应地，如上所述构建含有更少异源基因(例如，编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，编码乳醛还原酶的异源多核苷酸，或其组合)的最小化的途径以测试正丙醇产生。
实施例22：正丙醇/异丙醇共同产生酵母的制备和在酵母宿主中正丙醇/异丙醇的共同产生(先验性)
对于正丙醇途径，将含有编码乳酸脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、丙二醇脱水酶或正丙醇脱氢酶的多核苷酸(例如SEQ ID NO:1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，53，55，57，59，或61)的表达载体设计为具有合适的调控序列，进行密码子优化(如适于非天然序列)，并如上文实施例21中所述合成。将表达载体的合意的组合(例如，一个、两个或几个本文中所述的不同正丙醇途径基因)如上所述使用标准的分子生物学转化实验方案插入酵母宿主细胞基因组序列的选定的靶插入位点(见上文)。
对于异丙醇途径，将含有编码硫解酶、CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶或异丙醇脱氢酶的多核苷酸(例如SEQ ID NO:37，39，41，43，45，47，49，或51)的表达载体设计为具有合适的调控序列，进行密码子优化(如适于非天然序列)，并如上所述合成。将表达载体的合意的组合(例如，一个、两个或几个本文中所述的不同异丙醇途径基因)如上所述使用标准的分子生物学转化实验方案插入酵母宿主细胞基因组序列的靶插入位点。
然后将转化体铺板于适于选定的宿主和对两种途径均使用选择性标志物的培养基上。然后将单个菌落重新铺板，并分离基因组DNA。然后每个基因的整合使用合适的引物序列通过PCR确认。
然后基于本领域中已知的技术和本文中所述的参数，将转化体和阴性对照在含有本文中所述的合适的培养基(例如，含有氮源、维生素、矿物盐、和/或金属辅因子，补充葡萄糖)的不同的带挡板的摇瓶中在适于选定的酵母宿主细胞的pH、温度和振荡水平下培养。
将每次发酵运行的样品在不同的温育时间(例如72小时，100小时)之后取样，稀释，并使用GC-FID使用如基于实施例18中所述的参数的气相色谱-质谱(GCMS)分析正丙醇、异丙醇、丙醛、乙醇、和丙酸的存在。
在发酵过程中正丙醇途径基因和异丙醇途径基因的表达使用本领域中公知的用于确定表达的方法证实(corroborate)，且表达的多核苷酸的酶活性如本文中所述使用对于各种多肽具特异性的测定法确认。具有功能性正丙醇途径和异丙醇途径，但具有任何异源多核苷酸限速表达的菌株进一步通过途径的优化来加强，例如通过引入额外的基因拷贝和/或通过本领域中已知的其它启动子。
实施例23：在路氏乳杆菌中从乳醛产生正丙醇
在路氏乳杆菌菌株SJ11294中说明了乳醛至正丙醇的转化。
将菌株SJ11294接种于10ml MRS培养基，并在37℃厌氧下温育过夜。然后在2ml Eppendorf管中收获两个0.95ml的培养物，并用以DL-乳酸pH调整至4.0的MRS培养基洗涤。在洗涤和去除上清之后，添加2x0.95ml的用乳酸pH调整至4.0的新鲜MRS培养基。将培养物在37℃温育2小时，其中将0.05ml的2.442%(w/v)乳醛溶液添加至一个培养物，而未对另一个进行添加。将培养物在37℃温育过夜，接着进行离心，并针对正丙醇含量进行上清分析(表3)。
在将乳醛添加至生长培养基之后，发现乳醛转化为正丙醇。将对于乳醛至1-丙醇的转化的C-回收(C-recovery)针对正丙醇的背景产生进行校正，并估计其大约为70%。
表3
菌株 培养基 1-丙醇(g/L) C-回收(1-丙醇/乳醛)
路氏乳杆菌SJ11294 - 0.03
路氏乳杆菌SJ11294 1.221g/L的乳醛 0.72 0.70
空白 - nd
空白 1.221g/L的乳醛 nd
实施例24：具有对adhE和pduP的破坏的路氏乳杆菌菌株的构建
为了改善乳酸至乳醛的转化的氧化还原电势，对adhE基因的编码序列(SEQ ID NO:65)进行了破坏，所述基因编码SEQ ID NO:66的双功能性醇脱氢酶。该醇脱氢酶在路氏乳杆菌中心能量代谢中通过将乙酰CoA转化为乙醇消耗所需的NADH。此外，为了避免下游代谢物丙醛至丙酰CoA的代谢，对pduP基因的编码序列(SEQ ID NO:67)进行了破坏，所述基因编码SEQ ID NO:68的丙醛脱氢酶。
如下所述构建了路氏乳杆菌JCM1112的突变体，其中adhE和pduP两者均被破坏，得到菌株路氏乳杆菌TRGU1013。
将pJP042引入宿主菌株路氏乳杆菌JCM1112(O4ZXV)和菌株TRGU768 的分离
将含有5μg/ml红霉素的MRS培养基用携带pJP042的路氏乳杆菌MM4菌株(Pijkeren和Britton Nuc.Acids Res.2012,1–13；图18)接种，并在37℃温育过夜。将菌株在含有5μg/ml红霉素的10ml MRS中传代培养至OD600=0.1。将培养物在37℃温育大约4小时至OD600=0.8并在8000x g离心5分钟。弃去上清，并将细胞重悬于10ml SET缓冲液(0.1M NaCl,1mM EDTA,10mMTris-Cl)。将悬液在8000x g离心5分钟并弃去上清。然后将细胞重悬于1ml裂解缓冲液(6.7%蔗糖(saccharose)，50mM Tris-Cl pH8，0.1mM EDTA)。将溶菌酶添加至10mg/ml，并将混合物在37℃温育1小时。然后将裂解物在8000x g离心5分钟。将质粒pJP042DNA使用PureYieldTM MiniPrep试剂盒(Promega,USA)遵循生产商的指示从上清分离。
JCM1112细胞通过在含有5μg/ml红霉素的40ml MRS中传代培养至OD=0.1并在OD=0.8收获来从5μg/ml红霉素的40ml MRS的过夜培养物制成感受态。将细胞保持在冰上，并用40ml冰冷的洗涤缓冲液(Wash Buffer)(0.5M蔗糖，10%(V/V)甘油)小心洗涤两次，并重悬于400μl洗涤缓冲液。
将5μl的分离的pJP042(见上文)添加至100μl新鲜制备的感受态细胞(见上文)，并在BioRad Gene PulserTM中电穿孔，设定如下：2.5kV，25微法拉第和400欧姆。向其添加1ml MRS培养基，并将细胞在37℃温育3小时。将经电穿孔的细胞在37℃在含有5μg/ml红霉素的MRS琼脂平板(含有15g/lBacto琼脂的MRS培养基)上厌氧地温育过夜以供选择pJP042转化体。用使用recT1侧翼的引物的菌落PCR，就pJP042的存在检查红霉素抗性菌落。在11个转化体中，分离了2个并确认其携带pJP042。将这些菌株中的一个作为TRGU768在-80℃储藏于10%甘油。
通过同源重组破坏adhE和分离菌株TRGU980
为了通过重组工程(recombineering)破坏adhE基因，使用PyRec3.1(从Robert Britton,Microbial Genomics Laboratory,Michigan State University,MI,USA获得)设计了下述四个寡核苷酸。
o524：5’-CAAGAAACAA GTTGAAAAGA AAGAATTAAC TGCTGAAGAA AAGCTTTAAAACGCCCAAAA GCTAGTTGAC GATTTAATGA CTAAGAGTCA-3’(SEQ ID NO:69)
o525：5’-AGGGTGTTGGAGTAATGCGGT-3’(SEQ ID NO:70)
o526：5’-AGAAAGAATTAACTGCTGAAGAAAAGCTTT-3’(SEQ ID NO:71)
o527：5’-TGAATGATAGTGATTATGACGTTAAAGATC-3’(SEQ ID NO:72)
设计了这四个寡核苷酸以构建和筛选具有框内的终止密码子和HindIII限制性位点的突变体。序列o524用于核苷酸GCTTT的重组工程和引入，其在互补方向在读框中造成了终止密码子，因此导致基因翻译的破坏。序列o525、o526和o527用于PCR筛选所有筛选的菌落。578bp的扩增子表明已组入突变，而单个1031bp扩增子表明o526序列由于寡聚物和野生型序列之间的错配而并未退火。
将TRGU768的过夜培养物在含有5μg/ml红霉素的40ml MRS培养基中传代培养至OD6000.1。在37℃温育大约2小时之后，OD600达到大约0.55，而recT1表达通过添加诱导肽(8μl；50μg/ml)MAGNSSNFIHKIKQIFTHR(SEQ IDNO:73)来诱导。在37℃的温育延长20分钟。然后感受态细胞通过将细胞离心并在40ml冰冷的洗涤缓冲液(0.5M蔗糖，10%(v/v)甘油)中洗涤两次来制备。最终将细胞重悬于800ul洗涤缓冲液。将100μl重悬的细胞用于每次转化。然后将细胞通过如上文步骤中所述用5μl o524(20μg/μl)电穿孔来转化。在37℃在1ml MRS培养基中温育两小时之后，将细胞在MRS琼脂平板上厌氧地温育过夜。
将288个菌落使用o525，o526，和o527用PCR进行筛选。所有PCR反应导致单个1031bp的扩增子，表明细胞并未突变。在MRS琼脂平板与菌落的另外1日厌氧温育之后，出现了另外7个菌落。对这些菌落用PCR测试，并得到了一个正确的adhE突变体，TRGU956，如578bp扩增子的存在所示。
因为在重组工程事件中，诱变性寡聚物o524组入染色体双螺旋的一个DNA链，鉴定出的菌落可为混合的基因型，其由突变体和野生型路氏乳杆菌细胞组成。因此，将25μl的TRGU956的过夜培养物划线于MRS琼脂平板上以获得单菌落。在过夜温育之后，通过PCR用o525，o526，和o527测试了16个菌落，且所有均得到1031bp条带但未观察到578bp条带。因此推定该过夜培养物似乎主要由野生型菌株组成，因为该菌株比adhE突变体生长更快。将分离了正确突变体的平板上的菌落在MRS琼脂平板上划线出来，以获得单个菌落。然后用菌落PCR使用o525，o526和o527测试了96个菌落。这96个菌落中的16个得到了578bp和1031bp的两个扩增子，如根据琼脂糖凝胶电泳所估测的。
对上述16个adhE突变体测试pJP042的存在，即从不含红霉素的过夜培养物传代培养至含有10μg/ml红霉素的MRS。这些菌落中的一个生长过夜，表明ermR基因和因此质粒pJP042的存在。将该菌株命名为TRGU980并在-80℃储藏于10%甘油。DNA测序显示o524并未按预期组入，但造成adhE内部中的短缺失。该内部基因缺失破坏了读框，并因此构建了adhE敲除突变体。
通过同源重组破坏pduP和菌株TRGU1013的分离
为了通过重组工程(recombineering)破坏pduP基因，使用PyRec3.1(从Robert Britton,Microbial Genomics Laboratory,Michigan State University,MI,USA获得)设计了下述四个寡核苷酸。
o532：5’-GTAGTAGCTG CAACGTTTGC ACTTGAAGAG CTGGCATTAT CCTAAGCTTCGGCAAGAATT TTGCGTACAG CACTTTCAAT ATCATTAATC-3’(SEQ ID NO:74)
o533：5’-ACAACTAAATTATGAAGGCCTGTTGC-3’(SEQ ID NO:75)
o534：5’-CGCAAAATTCTTGCCGAAGCTTAG-3’(SEQ ID NO:76)
o535：5’-ATAATGCTTCTAAAAATCTATTTGATCGGC-3’(SEQ ID NO:77)
设计了这四个寡核苷酸以构建和筛选具有框内的终止密码子和HindIII限制性位点的突变体。序列o532用于核苷酸CTAAG的重组工程和引入，其在互补方向在读框中造成了终止密码子，因此导致基因翻译的破坏。序列o533、o534和o535用于PCR筛选所有筛选的菌落。566bp的扩增子表明已组入突变，而单个1026bp扩增子表明o534序列由于寡聚物和野生型序列之间的错配而并未退火。
将TRGU980的过夜培养物(见上文)在含有5μg/ml红霉素的40ml MRS培养基中传代培养至OD6000.1。在37℃温育大约2小时之后，OD600达到大约0.55，而recT1表达通过添加诱导肽(8μl；50μg/ml)MAGNSSNFIHKIKQIFTHR(SEQ ID NO:73)来诱导。在37℃的温育延长20分钟。然后感受态细胞通过将细胞离心并在40ml冰冷的洗涤缓冲液(0.5M蔗糖，10%(v/v)甘油)中洗涤两次来制备。最终将细胞重悬于800ul洗涤缓冲液。将100μl重悬的细胞用于每次转化。然后将细胞通过如上文步骤中所述用5μl o5324(20μg/μl)电穿孔来转化。在37℃在1ml MRS培养基中温育两小时之后，将细胞在MRS琼脂平板上厌氧地温育过夜。
将96个菌落使用o533，o534，和o535用PCR进行筛选。四个菌落产生两个通过琼脂糖凝胶电泳估测均为正确大小的条带。将过夜培养物在MRS琼脂平板上划线至单菌落，并在37℃厌氧地温育过夜。将来自每个的32个菌落用菌落PCR使用o533和o535进行分析，其均导致正确的1026bp扩增产物。
将扩增产物用HindIII消化，并在琼脂糖凝胶电泳上分析。分析显示五个扩增产物受HindIII完全消化，表明这些菌落为具有纯基因型的pduP破坏突变体。将这些突变体中的两个平行接种于MRS培养基和含有5μg/ml红霉素的MRS培养基。在过夜温育之后，在含有红霉素的MRS培养基中对任一突变体菌株未检测出生长，表明突变体丧失了质粒pJP042。将这些突变体中的一个，命名为TRGU1013，在-80℃储藏于10%甘油。PCR扩增产物使用o533和o535的DNA测序表明正确的突变组入了pduP，由此验证了TRGU1013是adhE pduP双突变体。
实施例25：短乳杆菌乳醛脱氢酶基因的克隆和载体pBKQ175的构建。
将在短乳杆菌中鉴定的乳醛脱氢酶基因aldA的1548bp编码序列(CDS)合成地构建入pBKQ175。将含有CDS的DNA片段设计为在紧接着起始密码子之前具有核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)。然后将所得的序列提交至Geneart AG(Regenburg,Germany)并合成，并递送入含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体。当合成时，CDS和RBS片段侧翼为限制性位点以便于后续克隆步骤。克隆入pMA载体的整个合成片段为NcoI-EcoRI-BamHI-RBS-BspHI-CDS-STOP-XhoI-EcoRI-KpnI，得到pBKQ175(图21)。
短乳杆菌乳醛脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)和推导的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:5和6。编码序列为1551bp，包括终止密码子，而编码的预测的蛋白为516个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering10:1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有516个氨基酸，具有56.4kDa的预测的分子量，和5.11的等电点pH。
实施例26：大肠杆菌乳醛还原酶基因的克隆和载体pBKQ186的构建。
将在大肠杆菌中鉴定的乳醛还原酶基因fucO的1149bp编码序列(CDS)合成地构建入pBKQ186。将含有CDS的DNA片段设计为在紧接着起始密码子之前具有核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)。然后将所得的序列提交至Geneart AG(Regenburg,Germany)并合成，并递送入含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体。当合成时，CDS和RBS片段侧翼为限制性位点以便于后续克隆步骤。克隆入pMA载体的整个合成片段为NcoI-EcoRI-HindIII-XhoI-RBS-BspHI-CDS-STOP-AscI-EcoRI-KpnI，得到pBKQ186(图23)。
短乳杆菌乳醛脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)和推导的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:9和10。编码序列为1152bp，包括终止密码子，而编码的预测的蛋白为383个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering10:1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有383个氨基酸，具有40.6kDa的预测的分子量，和4.91的等电点pH。
实施例27：从合成启动子表达短乳杆菌乳醛脱氢酶基因和大肠杆菌乳醛还原酶基因的pBKQ405的构建和转化
将质粒pSJ10603(参见WO2012/058603)用NcoI和KpnI消化，并将5117bp的片段从1%琼脂糖凝胶电泳纯化。将质粒pBKQ175(见上文)用BspHI和KpnI消化，并使用凝胶电泳将来自基因aldA的编码短乳杆菌乳醛脱氢酶的1569bp片段从1%琼脂糖凝胶纯化。将纯化的片段混合、连接，并使用连接混合物转化大肠杆菌TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。含有编码短乳杆菌乳醛脱氢酶、由P27驱动的合成基因的转化体通过限制性分析和测序确认。将转化体作为大肠杆菌BKQ178储藏，且质粒命名为pBKQ178(图22)。
启动子P27：5’-CGGGGTTTAGTTGTTGACAGGGAGGCTTCGTTGTGATAAGATGGTAG-3’(SEQ ID NO:80；亦描述于Rud等Microbiology2006,152,1011-1019)。
将质粒pBKQ186(见上文)用XhoI和KpnI消化，且编码来自基因fucO的大肠杆菌乳醛还原酶的1198bp片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pBKQ178用XhoI和KpnI消化，且编码pSH71复制起点，红霉素抗性基因，氯霉素抗性基因，和短乳杆菌乳醛脱氢酶，由P27启动子驱动的6670bp片段使用凝胶电泳纯化。将纯化的片段混合、连接，且将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。含有编码短乳杆菌乳醛脱氢酶的合成基因和编码大肠杆菌乳醛还原酶的合成基因两者的转化体通过限制性分析和测序确认。将转化体作为大肠杆菌BKQ332储藏，且将质粒命名为pBKQ332(图19)。
用编码fucO上游的P11启动子的型式替代在pBKQ332中的fucO如下所述进行：质粒pBKQ332用XhoI和KpnI消化，得到6670bp片段，其使用凝胶电泳从1%琼脂糖凝胶纯化。fucO的PCR片段(1.3kb)通过使用质粒pBKQ186作为模板进行的引物pr037和引物pr034的扩增来获得，由此在fucO上游引入P11启动子。
P11启动子：5’-AGCGCTATAGTTGTTGACAGAATGGACATACTATGATATATTGTTGC-3’(SEQ ID NO:81；描述于Rud等Microbiology2006,152,1011-1019)
引物pr037：
5’-GTGCGAAGCT TGTCGACTCG AGAGCGCTAT AGTTGTTGAC AGAATGGACA TACTATGATATATTGTTGCT ATAGCGCGAG ACTATTACAA GGAGATTTTA G-3’(SEQ ID NO:78)
引物pr034：
5-GTGCGAAGCT TCCGACTGGA AAGCGGGCAG TG-3’(SEQ ID NO:79)
将PCR产物用XhoI和KpnI消化，得到1256bp片段，然后将其使用凝胶电泳从1%琼脂糖凝胶纯化。将经消化的pBKQ332和经消化的PCR产物的纯化的片段混合，连接，并使用连接混合物以转化大肠杆菌TG1化学感受态细胞，对所述细胞在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。含有编码短乳杆菌乳醛脱氢酶的合成基因和编码大肠杆菌乳醛还原酶的合成基因两者的转化体通过限制性分析和测序确认。将转化体作为大肠杆菌BKQ405储藏，且将质粒命名为pBKQ405(图20)。
将质粒pBKQ405(见上文)使用上述的电穿孔步骤引入路氏乳杆菌adhEpduP双突变体菌株TRGU1013(见上文)，得到菌株BKQ498。
实施例28：在含有乳醛脱氢酶基因的路氏乳杆菌中产生正丙醇
将路氏乳杆菌菌株SJ11360，TRGU1014和BKQ498每个均接种于10mlMRS培养基(补充10μg/ml红霉素)，接着在37℃过夜厌氧温育。将2x1ml的细胞培养基通过离心收获，然后在MRS培养基中洗涤(pH用DL-乳酸调整至4.0)。将洗涤的细胞接种入10ml的以下之一：1)补充10μg/ml的MRS培养基，或2)补充10μg/ml红霉素的MRS培养基，且pH用DL-乳酸调整至4.0。然后将培养物在37℃温育三日，接着进行正丙醇分析。结果示于表4。
表4
Figure BDA0000462967770001051
由aldA(SEQ ID NO:5)编码来自短乳杆菌的乳醛脱氢酶和由fucO(SEQID NO:9)编码来自大肠杆菌的乳醛还原酶在路氏乳杆菌BKQ498中的存在导致与仅含有空质粒载体的路氏乳杆菌SJ11360和TRGU1014(20-30mg/L)相比导致增加水平的正丙醇产生(90mg/L)。因为路氏乳杆菌SJ11360具有无需进一步遗传修饰而将乳醛转化为正丙醇的能力(参见实施例21)，在目前实验中测量的正丙醇产生的观察到的增加可与通过由aldA编码的乳醛脱氢酶乳酸至乳醛的转化相关。之前的实验已显示，尽管低pH，野生型菌株路氏乳杆菌SJ11294中aldA的存在不足以导致增加的1-丙醇产生(数据未显示)。观察到的作用见于在用乳酸pH调整的培养基(pH4.0)中生长的adhE破坏突变体路氏乳杆菌TRGU1013。因此，在表达乳醛脱氢酶(aldA)的路氏乳杆菌中乳酸至乳醛的有效转化可包括异源乳醛脱氢酶基因，改善的氧化还原电势(例如通过adhE的敲除)，和降低的pH。
本发明可通过下述编号段落进一步描述：
[1]一种重组宿主细胞，其包含乳酸脱氢酶活性，乳醛脱氢酶活性，乳醛还原酶活性，丙二醇脱水酶活性，和/或正丙醇脱氢酶活性，其中所述宿主细胞能够产生正丙醇。
[2]段[1]的重组宿主细胞，其包含：
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳酸脱氢酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳醛脱氢酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳醛还原酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码丙二醇脱水酶，或
一种或多种异源多核苷酸，其编码正丙醇脱氢酶；
其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含所述异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够产生更多量的正丙醇。
[3]一种重组宿主细胞，其包含：
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳酸脱氢酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳醛脱氢酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳醛还原酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码丙二醇脱水酶，或
一种或多种异源多核苷酸，其编码正丙醇脱氢酶；
其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含所述异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够产生更多量的正丙醇。
[4]段[1]-[3]任一项的重组宿主细胞，其包含：
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳酸脱氢酶；
其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含所述一种或多种编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够产生更多量的正丙醇。
[5]段[1]-[4]任一项的重组宿主细胞，其包含：
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳醛脱氢酶；
其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含所述一种或多种编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够产生更多量的正丙醇。
[6]段[1]-[5]任一项的重组宿主细胞，其包含：
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳醛还原酶；
其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含所述一种或多种编码乳醛还原酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够产生更多量的正丙醇。
[7]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞，其包含：
一种或多种异源多核苷酸，其编码丙二醇脱水酶；
其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含所述一种或多种编码丙二醇脱水酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够产生更多量的正丙醇。
[8]段[1]-[3]任一项的重组宿主细胞，其包含：
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳酸脱氢酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳醛脱氢酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码乳醛还原酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码丙二醇脱水酶，和
一种或多种异源多核苷酸，其编码正丙醇脱氢酶；
其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含所述编码乳酸脱氢酶活性，乳醛脱氢酶活性，乳醛还原酶活性，丙二醇脱水酶活性，和正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够产生更多量的正丙醇。
[9]段[2]-[8]任一项的重组宿主细胞，其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含一种或多种编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够多产生至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少50%，或至少100%的正丙醇。
[10]段[2]-[9]任一项的重组宿主细胞，其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含一种或多种编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够多产生至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少50%，或至少100%的正丙醇。
[11]段[2]-[10]任一项的重组宿主细胞，其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含一种或多种编码乳醛还原酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够多产生至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少50%，或至少100%的正丙醇。
[12]段[2]-[11]任一项的重组宿主细胞，其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含一种或多种编码丙二醇脱水酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够多产生至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少50%，或至少100%的正丙醇。
[13]段[2]-[12]任一项的重组宿主细胞，其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含一种或多种编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，能够多产生至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少50%，或至少100%的正丙醇。
[14]段[1]-[13]任一项的重组宿主细胞，其包含编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
(a)编码乳酸脱氢酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:2，4，34，36，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；
(b)多核苷酸，其在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:1，3，33，35，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和
(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1，3，33，35，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[15]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:2或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[16]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:4或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[17]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:34或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[18]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:36或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[19]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:1，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[20]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:3，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[21]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:33，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[22]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:35，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[23]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:1，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[24]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:3，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[25]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:33，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[26]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:35，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[27]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2的乳酸脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[28]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:2或其成熟多肽序列。
[29]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:2。
[30]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:4的乳酸脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[31]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:4或其成熟多肽序列。
[32]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:4。
[33]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:34的乳酸脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[34]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:34或其成熟多肽序列。
[35]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:34。
[36]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:36的乳酸脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[37]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:36或其成熟多肽序列。
[38]段[14]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳酸脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:36。
[39]段[2]-[38]任一项的重组宿主细胞，其中所述编码乳酸脱氢酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外来的启动子。
[40]段[1]-[13]任一项的重组宿主细胞，其包含编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
(a)编码乳醛脱氢酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:6，8，26，30，32，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；
(b)多核苷酸，其在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:5，7，25，29，31，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和
(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:5，7，25，29，31，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[41]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[42]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[43]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:26或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[44]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:30或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[45]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:32或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[46]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:5，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[47]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:7，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[48]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:25，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[49]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:29，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[50]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:31，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[51]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:5，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[52]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:7，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[53]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:25，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[54]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:29，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[55]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:31，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[56]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:6的乳醛脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[57]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列。
[58]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6。
[59]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:8的乳醛脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[60]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列。
[61]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:8。
[62]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:26的乳醛脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[63]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:26或其成熟多肽序列。
[64]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:26。
[65]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:30的乳醛脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[66]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:30或其成熟多肽序列。
[67]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:30。
[68]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:32的乳醛脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[69]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:32或其成熟多肽序列。
[70]段[40]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:32。
[71]段[2]-[70]任一项的重组宿主细胞，其中所述编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外来的启动子。
[72]段[1]-[13]任一项的重组宿主细胞，其包含编码乳醛还原酶的异源多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
(a)编码乳醛还原酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:10，12，28，54，56，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；
(b)多核苷酸，其在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:9，11，27，53，55，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和
(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:9，11，27，53，55，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[73]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，所述酶与SEQ ID NO:10或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[74]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，所述酶与SEQ ID NO:12或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[75]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，所述酶与SEQ ID NO:28或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[76]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，所述酶与SEQ ID NO:54或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[77]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，所述酶与SEQ ID NO:56或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[78]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:9，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[79]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:11，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[80]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:27，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[81]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:53，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[82]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQID NO:55，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[83]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:9，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[84]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:11，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[85]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:27，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[86]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:53，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[87]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:55，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[88]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:10的乳醛还原酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[89]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，其包含或组成为SEQ ID NO:10或其成熟多肽序列。
[90]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，其包含或组成为SEQ ID NO:10。
[91]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:12的乳醛还原酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[92]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，其包含或组成为SEQ ID NO:12或其成熟多肽序列。
[93]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，其包含或组成为SEQ ID NO:12。
[94]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:28的乳醛还原酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[95]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，其包含或组成为SEQ ID NO:28或其成熟多肽序列。
[96]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，其包含或组成为SEQ ID NO:28。
[97]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:54的乳醛还原酶变体或其成熟多肽序列，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[98]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，其包含或组成为SEQ ID NO:54或其成熟多肽序列。
[99]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，其包含或组成为SEQ ID NO:54。
[100]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:56的乳醛还原酶变体或其成熟多肽序列，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[101]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，其包含或组成为SEQ ID NO:56或其成熟多肽序列。
[102]段[72]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码乳醛还原酶，其包含或组成为SEQ ID NO:56。
[103]段[2]-[102]任一项的重组宿主细胞，其中所述编码乳醛还原酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外来的启动子。
[104]段[1]-[13]任一项的重组宿主细胞，其包含编码第一丙二醇脱水酶亚基的第一异源多核苷酸，和编码第二丙二醇脱水酶亚基的第二异源多核苷酸，其中所述第一丙二醇脱水酶亚基和第二丙二醇脱水酶亚基形成具有丙二醇脱水酶活性的蛋白复合物。
[105]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸选自：
(a)编码第一脱水酶亚基的多核苷酸，其与SEQ ID NO:14，18，58，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；
(b)多核苷酸，其在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:13，17，57，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和
(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:13，17，57，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和
其中所述第二异源多核苷酸选自：
(a)编码第二脱水酶亚基的多核苷酸，其与SEQ ID NO:16，20，60，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；
(b)多核苷酸，其在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:15，19，59，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和
(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:15，19，59，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[106]段[104]的重组宿主细胞，其中编码第一脱水酶亚基的第一异源多核苷酸与SEQ ID NO:14，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和
其中编码第二脱水酶亚基的第二异源多核苷酸与SEQ ID NO:16，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[107]段[104]的重组宿主细胞，其中编码第一脱水酶亚基的第一异源多核苷酸与SEQ ID NO:18，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和
其中编码第二脱水酶亚基的第二异源多核苷酸与SEQ ID NO:20，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[108]段[104]的重组宿主细胞，其中编码第一脱水酶亚基的第一异源多核苷酸与SEQ ID NO:58，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和
其中编码第二脱水酶亚基的第二异源多核苷酸与SEQ ID NO:60，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[109]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:13，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和
其中所述第二异源多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:15，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[110]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:17，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和
其中所述第二异源多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:19，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[111]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:57，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和
其中所述第二异源多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:59，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[112]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸与SEQ IDNO:13，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和
其中所述第二异源多核苷酸与SEQ ID NO:15，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[113]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸与SEQ IDNO:17，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和
其中所述第二异源多核苷酸与SEQ ID NO:19，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[114]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸与SEQ IDNO:57，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和
其中所述第二异源多核苷酸与SEQ ID NO:59，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[115]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸编码SEQ ID NO:14或其成熟多肽序列的第一脱水酶亚基变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入；和
其中所述第二异源多核苷酸编码SEQ ID NO:16或其成熟多肽序列的第二脱水酶亚基变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[116]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸编码第一脱水酶亚基，其包含或组成为SEQ ID NO:14或其成熟多肽序列；和
其中所述第二异源多核苷酸编码第二脱水酶亚基，其包含或组成为SEQID NO:16或其成熟多肽序列。
[117]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸编码第一脱水酶亚基，其包含或组成为SEQ ID NO:14；和
其中所述第二异源多核苷酸编码第二脱水酶亚基，其包含或组成为SEQID NO:16。
[118]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸编码SEQ ID NO:18或其成熟多肽序列的第一脱水酶亚基变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入；和
其中所述第二异源多核苷酸编码SEQ ID NO:20或其成熟多肽序列的第二脱水酶亚基变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[119]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸编码第一脱水酶亚基，其包含或组成为SEQ ID NO:18或其成熟多肽序列；和
其中所述第二异源多核苷酸编码第二脱水酶亚基，其包含或组成为SEQID NO:20或其成熟多肽序列。
[120]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸编码第一脱水酶亚基，其包含或组成为SEQ ID NO:18；和
其中所述第二异源多核苷酸编码第二脱水酶亚基，其包含或组成为SEQID NO:20。
[121]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸编码SEQ ID NO:58或其成熟多肽序列的第一脱水酶亚基变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入；和
其中所述第二异源多核苷酸编码SEQ ID NO:60或其成熟多肽序列的第二脱水酶亚基变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[122]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸编码第一脱水酶亚基，其包含或组成为SEQ ID NO:58或其成熟多肽序列；和
其中所述第二异源多核苷酸编码第二脱水酶亚基，其包含或组成为SEQID NO:60或其成熟多肽序列。
[123]段[104]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸编码第一脱水酶亚基，其包含或组成为SEQ ID NO:58；和
其中所述第二异源多核苷酸编码第二脱水酶亚基，其包含或组成为SEQID NO:60。
[124]段[104]-[123]任一项的重组宿主细胞，其中所述编码第一脱水酶亚基的第一异源多核苷酸和编码第二脱水酶亚基的第二异源多核苷酸包含于单个异源多核苷酸中。
[125]段[124]的重组宿主细胞，其中所述单个异源多核苷酸可操作地连接于对所述编码第一脱水酶亚基的第一异源多核苷酸和编码第二脱水酶亚基的第二异源多核苷酸两者均为外来的启动子。
[126]段[104]-[123]任一项的重组宿主细胞，其中所述编码第一脱水酶亚基的第一异源多核苷酸和编码第二脱水酶亚基的第二异源多核苷酸各自包含于不同的异源多核苷酸。
[127]段[126]的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸可操作地连接于外来的启动子，且所述第二异源多核苷酸可操作地连接于外来的启动子。
[128]段[1]-[13]任一项的重组宿主细胞，其包含异源多核苷酸，其编码正丙醇脱氢酶，其中所述多核苷酸选自：
(a)编码正丙醇脱氢酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:22，24，62，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；
(b)多核苷酸，其在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:21，23，61，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和
(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:21，23，61，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[129]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码正丙醇脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:22或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[130]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码正丙醇脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:24或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[131]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码正丙醇脱氢酶，所述酶与SEQ ID NO:62或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[132]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:21，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[133]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:23，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[134]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:61，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
[135]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:21，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[136]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:23，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[137]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:61，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[138]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:22的正丙醇脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[139]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码正丙醇脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:22或其成熟多肽序列。
[140]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码正丙醇脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:22。
[141]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:24的正丙醇脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[142]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码正丙醇脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:24或其成熟多肽序列。
[143]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码正丙醇脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:24。
[144]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:62的正丙醇脱氢酶或其成熟多肽序列的变体，其在不超过10个位置，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1个位置包含取代、缺失和/或插入。
[145]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码正丙醇脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:62或其成熟多肽序列。
[146]段[128]的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸编码正丙醇脱氢酶，其包含或组成为SEQ ID NO:62。
[147]段[2]-[146]任一项的重组宿主细胞，其中所述编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外来的启动子。
[148]段[1]-[147]任一项的重组宿主细胞，其进一步包含硫解酶活性、CoA转移酶活性、乙酰乙酸脱羧酶活性、和异丙醇脱氢酶活性，其中所述细胞能够产生异丙醇。
[149]段[1]-[148]任一项的重组宿主细胞，其包含：
一种或多种异源多核苷酸，其编码硫解酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码CoA转移酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码乙酰乙酸脱羧酶，或
一种或多种异源多核苷酸，其编码异丙醇脱氢酶；
其中当在相同条件下培养时，所述宿主细胞与不含异源多核苷酸的宿主细胞相比，产生更多量的异丙醇。
[150]段[149]的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶。
[151]段[1]-[150]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞能够具有大于约0.1g/L每小时，例如大于约0.2g/L每小时，0.5g/L每小时，0.6g/L每小时，0.7g/L每小时，0.8g/L每小时，0.9g/L每小时，1.0g/L每小时，1.1g/L每小时，1.2g/L每小时，1.3g/L每小时，1.5g/L每小时，1.75g/L每小时，2.0g/L每小时，2.25g/L每小时，2.5g/L每小时，或3.0g/L每小时；或约0.1g/L每小时至约2.0g/L每小时，例如约0.3g/L每小时至约1.7g/L每小时，约0.5g/L每小时至约1.5g/L每小时，约0.7g/L每小时至约1.3g/L每小时，约0.8g/L每小时至约1.2g/L每小时，或约0.9g/L每小时至约1.1g/L每小时的正丙醇体积生产力。
[152]段[1]-[151]任一项的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述细胞与野生型菌株相比具有减少的丙醛脱氢酶活性。
[153]段[1]-[151]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有丙醛脱氢酶活性的缺失。
[154]段[1]-[155]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码丙醛脱氢酶的内源多核苷酸的破坏。
[155]段[154]的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码丙醛脱氢酶的内源多核苷酸的破坏，所述酶与SEQ ID NO:68具有至少60%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[156]段[154]或[155]的重组宿主细胞，所述破坏使丙醛脱氢酶基因失活。
[157]段[154]-[156]任一项的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述宿主细胞的丙醛脱氢酶活性与未经编码丙醛脱氢酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。
[158]段[1]-[157]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码醇脱氢酶的内源多核苷酸的破坏。
[159]段[158]的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码醇脱氢酶的内源多核苷酸的破坏，所述酶与SEQ ID NO:66具有至少60%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
[160]段[158]或[159]的重组宿主细胞，其中所述破坏使醇脱氢酶基因失活。
[161]段[158]-[160]任一项的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述宿主细胞的醇脱氢酶活性与未经编码醇脱氢酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。
[162]段[1]-[161]任一项的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌宿主细胞。
[163]段[162]的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下组的属的成员：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。
[164]段[162]的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下组的属的成员：埃希氏菌属(例如大肠杆菌)，乳杆菌属(例如植物乳杆菌，食果糖乳杆菌，或路氏乳杆菌)，和丙酸杆菌属(例如费氏丙酸杆菌)。
[165]段[1]-[161]任一项的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
[166]段[165]的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。
[167]段[165]的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、根霉属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属宿主细胞。
[168]段[165]的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞。
[169]段[165]的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是米曲霉宿主细胞。
[170]段[165]的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母宿主细胞。
[171]段[170]的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、西洋蓍霉属、或伊萨酵母属宿主细胞。
[172]段[170]的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是东方伊萨酵母、Pichia galeiformis、毕赤酵母属菌种YB-4149(NRRL命名)、C.ethanolica、P.deserticola、膜醭毕赤酵母、或发酵毕赤酵母、或酿酒酵母宿主细胞。
[173]段[170]的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是东方伊萨酵母或膜醭毕赤酵母宿主细胞。
[174]段[1]-[173]任一项的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞经遗传修饰以在相同条件下与野生型菌株相比产生较少的乙醇。
[175]段[1]-[174]任一项的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞无法产生多于约20g/L，例如约15g/L，约10g/L，约5g/L，约2.5g/L，约1g/L，约0.5g/L，或约0.1g/L乙醇。
[176]段[1]-[174]任一项的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞无法产生可检测的量的乙醇。
[177]段[1]-[176]任一项的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述细胞与野生型菌株相比具有减少的丙酮酸脱羧酶活性。
[178]段[1]-[176]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有丙酮酸脱羧酶活性的缺失。
[179]段[1]-[178]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码丙酮酸脱羧酶的内源多核苷酸的破坏。
[180]段[179]的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述宿主细胞的丙酮酸脱羧酶活性与未经编码丙酮酸脱羧酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。
[181]段[1]-[180]任一项的重组宿主细胞，其包含：
一种或多种异源多核苷酸，其编码木糖异构酶基因，
编码催化木糖至木糖醇的转化的多肽的内源多核苷酸的破坏，
编码木糖醇脱氢酶的内源多核苷酸的破坏；和/或
一种或多种异源多核苷酸，其编码木酮糖激酶。
[182]段[1]-[181]任一项的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述细胞与野生型菌株相比具有减少的L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶活性。
[183]段[1]-[181]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶活性的缺失。
[184]段[1]-[183]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶的内源多核苷酸的破坏。
[185]段[184]的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述宿主细胞的L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶活性与未经编码L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧还酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。
[186]段[1]-[185]任一项的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞经遗传修饰以在相同条件下与野生型菌株相比产生较少的甘油。
[187]段[1]-[186]任一项的重组宿主细胞，所述宿主细胞无法产生多于约20g/L，例如约15g/L，约10g/L，约5g/L，约2.5g/L，约1g/L，约0.5g/L，或约0.1g/L甘油。
[188]段[1]-[186]任一项的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞无法产生可检测的量的甘油。
[189]段[1]-[188]任一项的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述细胞与野生型菌株相比具有减少的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)活性。
[190]段[1]-[188]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)活性的缺失。
[191]段[1]-[190]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)的内源多核苷酸的破坏。
[192]段[191]的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述宿主细胞的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)活性与未经编码甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。
[193]段[1]-[192]任一项的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述细胞与野生型菌株相比具有减少的甘油-3-磷酸酶(GPP)活性。
[194]段[1]-[192]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有甘油-3-磷酸酶(GPP)活性的缺失。
[195]段[1]-[194]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码甘油-3-磷酸酶(GPP)的内源多核苷酸的破坏。
[196]段[195]的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述宿主细胞的甘油-3-磷酸酶(GPP)活性与未经编码甘油-3-磷酸酶(GPP)的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。
[197]段[1]-[196]任一项的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述细胞与野生型菌株相比具有减少的二羟基丙酮磷酸磷酸酶活性。
[198]段[1]-[196]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有二羟基丙酮磷酸磷酸酶活性的缺失。
[199]段[1]-[198]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码二羟基丙酮磷酸磷酸酶的内源多核苷酸的破坏。
[200]段[199]的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述宿主细胞的二羟基丙酮磷酸磷酸酶活性与未经编码二羟基丙酮磷酸磷酸酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。
[201]段[1]-[200]任一项的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述细胞与野生型菌株相比具有减少的甘油脱氢酶活性。
[202]段[1]-[200]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有甘油脱氢酶活性的缺失。
[203]段[1]-[202]任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码甘油脱氢酶的内源多核苷酸的破坏。
[204]段[203]的重组宿主细胞，其中在相同条件下，所述宿主细胞的甘油脱氢酶活性与未经编码甘油脱氢酶的多核苷酸的破坏的宿主细胞相比，减少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%。
[205]一种组合物，其包含段[1]-[204]任一项的重组宿主细胞。
[206]段[205]的组合物，其中所述培养基是可发酵的培养基。
[207]段[205]或[206]的组合物，其进一步包含正丙醇。
[208]段[207]的组合物，其中所述正丙醇为大于约10g/L的效价，例如大于约25g/L，50g/L，75g/L，100g/L，125g/L，150g/L，160g/L，170g/L，180g/L，190g/L，200g/L，210g/L，225g/L，250g/L，275g/L，300g/L，325g/L，350g/L，400g/L，或500g/L的效价；或约10g/L至约500g/L，例如约50g/L至约350g/L，约100g/L至约300g/L，约150g/L至约250g/L，约175g/L至约225g/L，或约190g/L至约210g/L的效价。
[209]段[205]-[208]任一项的组合物，其进一步包含异丙醇。
[210]段[209]的组合物，其中所述异丙醇为大于约10g/L的效价，例如大于约25g/L，50g/L，75g/L，100g/L，125g/L，150g/L，160g/L，170g/L，180g/L，190g/L，200g/L，210g/L，225g/L，250g/L，275g/L，300g/L，325g/L，350g/L，400g/L，或500g/L的效价；或约10g/L至约500g/L，例如约50g/L至约350g/L，约100g/L至约300g/L，约150g/L至约250g/L，约175g/L至约225g/L，或约190g/L至约210g/L的效价。
[211]一种产生正丙醇的方法，其包括：
(a)在适于产生正丙醇的条件下在培养基中培养段[1]-[204]任一项的重组宿主细胞；和
(b)回收所述正丙醇。
[212]段[211]的方法，其中所述培养基是可发酵的培养基。
[213]段[211]的方法，其中所述可发酵的培养基包含甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。
[214]段[211]-[213]任一项的方法，其中产生的正丙醇为大于约10g/L的效价，例如大于约25g/L，50g/L，75g/L，100g/L，125g/L，150g/L，160g/L，170g/L，180g/L，190g/L，200g/L，210g/L，225g/L，250g/L，275g/L，300g/L，325g/L，350g/L，400g/L，或500g/L的效价；或约10g/L至约500g/L，例如约50g/L至约350g/L，约100g/L至约300g/L，约150g/L至约250g/L，约175g/L至约225g/L，或约190g/L至约210g/L的效价。
[215]段[211]-[214]任一项的方法，其进一步包括通过蒸馏纯化回收的正丙醇。
[216]段[211]-[214]任一项的方法，其进一步包括通过在还原剂存在下将丙醛污染物转化为正丙醇来纯化回收的正丙醇。
[217]段[211]-[216]任一项的方法，其中所述重组宿主细胞在约1.5至约7.0，例如约1.5至约5.0，约2.0至约4.0，或约2.0至约4.5的pH培养。
[218]一种产生丙烯的方法，其包括：
(a)在适于产生正丙醇的条件下在培养基中培养段[1]-[204]任一项所述的重组宿主细胞；
(b)回收所述正丙醇；
(c)在适于产生丙烯的条件下将所述正丙醇脱水；和
(d)回收所述丙烯。
[219]段[218]的方法，其中所述培养基是可发酵的培养基。
[220]段[219]的方法，其中所述可发酵的培养基包含甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。
[221]段[218]-[220]任一项的方法，其中产生的正丙醇为大于约10g/L的效价，例如大于约25g/L，50g/L，75g/L，100g/L，125g/L，150g/L，160g/L，170g/L，180g/L，190g/L，200g/L，210g/L，225g/L，250g/L，275g/L，300g/L，325g/L，350g/L，400g/L，或500g/L的效价；或约10g/L至约500g/L，例如约50g/L至约350g/L，约100g/L至约300g/L，约150g/L至约250g/L，约175g/L至约225g/L，或约190g/L至约210g/L的效价。
[222]段[218]-[221]任一项的方法，其中正丙醇的脱水包括用酸性催化剂处理正丙醇。
[223]一种用于共同产生正丙醇和异丙醇的方法，其包括：
(a)在适于产生正丙醇和异丙醇的条件下在培养基中培养段[148]-[204]任一项的重组宿主细胞；和
(b)回收所述正丙醇和异丙醇。
[224]段的方法[223]，其中所述培养基是可发酵的培养基。
[225]段[224]的方法，其中所述可发酵的培养基包含甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。
[226]段[223]-[225]任一项的方法，其中产生的正丙醇和/或异丙醇为大于约10g/L的效价，例如大于约25g/L，50g/L，75g/L，100g/L，125g/L，150g/L，160g/L，170g/L，180g/L，190g/L，200g/L，210g/L，225g/L，250g/L，275g/L，300g/L，325g/L，350g/L，400g/L，或500g/L的效价；或约10g/L至约500g/L，例如约50g/L至约350g/L，约100g/L至约300g/L，约150g/L至约250g/L，约175g/L至约225g/L，或约190g/L至约210g/L的效价。
[227]段[223]-[226]任一项的方法，其进一步包括通过蒸馏纯化回收的正丙醇和异丙醇。
[228]段[223]-[226]任一项的方法，其进一步包括通过在还原剂存在下将丙醛污染物转化为正丙醇和/或将丙酮污染物转化为异丙醇来纯化回收的正丙醇。
[229]段[223]-[228]任一项的方法，其中所述重组宿主细胞在约1.5至约7.0，例如约1.5至约5.0，约2.0至约4.0，或约2.0至约4.5的pH培养。
尽管为了理解清楚的目的，前述通过说明和实例进行了一定程度详细的描述，对于本领域技术人员显而易见可实施任何等同的方面或修饰。因此，所述描述和实例不应视为限制本发明的范围。
Figure IDA0000462967810000011
Figure IDA0000462967810000031
Figure IDA0000462967810000041
Figure IDA0000462967810000061
Figure IDA0000462967810000071
Figure IDA0000462967810000081
Figure IDA0000462967810000091
Figure IDA0000462967810000101
Figure IDA0000462967810000121
Figure IDA0000462967810000131
Figure IDA0000462967810000141
Figure IDA0000462967810000151
Figure IDA0000462967810000161
Figure IDA0000462967810000171
Figure IDA0000462967810000181
Figure IDA0000462967810000191
Figure IDA0000462967810000211
Figure IDA0000462967810000221
Figure IDA0000462967810000241
Figure IDA0000462967810000251
Figure IDA0000462967810000261
Figure IDA0000462967810000271
Figure IDA0000462967810000291
Figure IDA0000462967810000301
Figure IDA0000462967810000311
Figure IDA0000462967810000321
Figure IDA0000462967810000331
Figure IDA0000462967810000341
Figure IDA0000462967810000351
Figure IDA0000462967810000371
Figure IDA0000462967810000381
Figure IDA0000462967810000401
Figure IDA0000462967810000411
Figure IDA0000462967810000421
Figure IDA0000462967810000431
Figure IDA0000462967810000451
Figure IDA0000462967810000461
Figure IDA0000462967810000471
Figure IDA0000462967810000481
Figure IDA0000462967810000491
Figure IDA0000462967810000501
Figure IDA0000462967810000521
Figure IDA0000462967810000531
Figure IDA0000462967810000541
Figure IDA0000462967810000571

Claims (27)

1.一种重组宿主细胞，其包含编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸，其中所述宿主细胞能够产生正丙醇。
2.权利要求1的重组宿主细胞，其进一步包括编码乳醛还原酶的异源多核苷酸。
3.权利要求1或2的重组宿主细胞，其进一步包括：
异源多核苷酸，其编码硫解酶，
一种或多种异源多核苷酸，其编码CoA转移酶，
异源多核苷酸，其编码乙酰乙酸脱羧酶，或
异源多核苷酸，其编码异丙醇脱氢酶；
其中所述宿主细胞能够产生异丙醇。
4.权利要求1-3任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码丙醛脱氢酶的内源多核苷酸的破坏。
5.权利要求4的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码丙醛脱氢酶的内源多核苷酸的破坏，其中所述酶与SEQ ID NO:68具有至少60%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
6.权利要求4或5的重组宿主细胞，其中所述破坏使得所述丙醛脱氢酶基因失活。
7.权利要求1-6任一项的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码醇脱氢酶的内源多核苷酸的破坏。
8.权利要求7的重组宿主细胞，其中所述细胞具有对编码醇脱氢酶的内源多核苷酸的破坏，其中所述酶与SEQ ID NO:66具有至少60%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
9.权利要求7或8的重组宿主细胞，其中所述破坏使得所述醇脱氢酶基因失活。
10.权利要求1-9任一项的重组宿主细胞，其中所述编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸选自：
(a)编码乳醛脱氢酶的多核苷酸，所述酶与SEQ ID NO:6，8，26，30，32，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；
(b)多核苷酸，其在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:5，7，25，29，31，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和
(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:5，7，25，29，31，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
11.权利要求1-9任一项的重组宿主细胞，其中所述乳醛脱氢酶与SEQ IDNO:6，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
12.权利要求1-9任一项的重组宿主细胞，其中所述编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:5，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
13.权利要求1-9任一项的重组宿主细胞，其中所述编码乳醛脱氢酶的异源多核苷酸与SEQ ID NO:5，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
14.权利要求1-9任一项的重组宿主细胞，其中所述乳醛脱氢酶具有SEQID NO:6的氨基酸序列。
15.权利要求2-14任一项的重组宿主细胞，其中所述编码乳醛还原酶的异源多核苷酸选自：
(a)编码乳醛还原酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:10，12，28，54，56，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；
(b)多核苷酸，其在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:9，11，27，53，55，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链；和
(c)多核苷酸，其与SEQ ID NO:9，11，27，53，55，或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
16.权利要求2-14任一项的重组宿主细胞，其中所述乳醛还原酶与SEQ IDNO:10，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
17.权利要求2-14任一项的重组宿主细胞，其中所述编码乳醛还原酶的异源多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:9，其成熟多肽编码序列，或前述的全长互补链。
18.权利要求2-14任一项的重组宿主细胞，其中所述编码乳醛还原酶的异源多核苷酸与SEQ ID NO:9或其成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
19.权利要求2-14任一项的重组宿主细胞，其中所述乳醛还原酶具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
20.权利要求1-19任一项的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌宿主细胞。
21.权利要求20的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下组的属的成员：埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(Escherichia coli))，乳杆菌属(Lactobacillus)(例如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)，或路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri))，和丙酸杆菌属(Propionibacterium)(例如费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii))。
22.权利要求20的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是路氏乳杆菌。
23.一种组合物，其包含权利要求1-22任一项的重组宿主细胞和正丙醇。
24.一种产生正丙醇的方法，其包括：
(a)在适于产生正丙醇的条件下在培养基中培养权利要求1-22任一项的重组宿主细胞；和
(b)回收所述正丙醇。
25.一种产生丙烯的方法，其包括：
(a)在适于产生正丙醇的条件下在培养基中培养权利要求1-22任一项所述的重组宿主细胞；
(b)回收所述正丙醇；
(c)在适于产生丙烯的条件下将所述正丙醇脱水；和
(d)回收所述丙烯。
26.权利要求24或25的方法，其中所述培养基包含甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。
27.权利要求24-26任一项的方法，其中所述重组宿主细胞在约1.5至约7.0，例如约1.5至约5.0，约2.0至约4.0，或约2.0至约4.5的pH培养。
CN201280037553.3A 2011-05-27 2012-05-25 用于正丙醇产生的微生物 Pending CN103797111A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161490995P 2011-05-27 2011-05-27
US201161490989P 2011-05-27 2011-05-27
US61/490,989 2011-05-27
US61/490,995 2011-05-27
PCT/EP2012/059909 WO2012163857A1 (en) 2011-05-27 2012-05-25 MICROORGANISMS FOR n-PROPANOL PRODUCTION

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103797111A true CN103797111A (zh) 2014-05-14

Family

ID=46149499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280037553.3A Pending CN103797111A (zh) 2011-05-27 2012-05-25 用于正丙醇产生的微生物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20140134691A1 (zh)
EP (1) EP2714889A1 (zh)
CN (1) CN103797111A (zh)
BR (1) BR112013030382A2 (zh)
WO (1) WO2012163857A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108192899A (zh) * 2018-01-15 2018-06-22 清华大学 一种兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体及其应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013173711A1 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 Novozymes A/S Bacterial mutants with improved transformation efficiency
US20140134690A1 (en) * 2012-11-06 2014-05-15 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Microbes and methods for producing 1-propanol
WO2014102180A1 (en) * 2012-12-27 2014-07-03 Novozymes A/S Propanol production by lactobacillus bacterial hosts
CN107937289B (zh) * 2017-12-15 2021-06-25 北京工商大学 一株盔状毕赤酵母by27菌株在水果采后病害防治中的应用
CN107988088B (zh) * 2017-12-15 2021-06-25 北京工商大学 一株沙漠毕赤酵母在水果采后病害防治中的应用
CN113247946B (zh) * 2021-04-22 2022-07-05 哈尔滨工业大学 一种自组装纳米生物催化剂及其制备方法和在丁醇生产中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007129465A1 (ja) * 2006-05-09 2007-11-15 Mitsui Chemicals, Inc. 補酵素合成強化によるヒドロキシカルボン酸類の生産方法
AU2009291825B2 (en) * 2008-09-10 2016-05-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABDEL I. QATIBI ET AL: "Anaerobic Degradation of Glycerol by Desulfovibrio fructosovorans and D. carbinolìcus and Evidence for Glycerol-Dependent Utilization of 1,2-PropanedioI", 《CURRENT MICROBIOLOGY》 *
JOSE´ SALUD RODRI´GUEZ-ZAVALA ET AL: "Characterization of E. coli tetrameric aldehyde dehydrogenases with atypical properties compared to other aldehyde dehydrogenases", 《PROTEIN SCIENCE》 *
STEFANIE J. W. H. OUDE ELFERINK ET AL: "Anaerobic Conversion of Lactic Acid to Acetic Acid and 1,2-Propanediol by Lactobacillus buchneri", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
TORU JOJIMA ET AL: "Production of isopropanol by metabolically engineered Escherichia coli", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108192899A (zh) * 2018-01-15 2018-06-22 清华大学 一种兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体及其应用
CN108192899B (zh) * 2018-01-15 2020-12-25 清华大学 一种兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20140134691A1 (en) 2014-05-15
EP2714889A1 (en) 2014-04-09
BR112013030382A2 (pt) 2016-12-13
WO2012163857A1 (en) 2012-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2011320329B2 (en) Recombinant n-propanol and isopropanol production
CN103797111A (zh) 用于正丙醇产生的微生物
US10358664B2 (en) Mutant host cells for the production of 3-hydroxypropionic acid
US8663956B2 (en) Recombinant microorganisms for production C4-dicarboxylic acids
US9404091B2 (en) Dehydrogenase variants and polynucleotides encoding same
US20180273915A1 (en) Recombinant Host Cells For The Production Of 3-Hydroxypropionic Acid
US8617859B2 (en) C4 dicarboxylic acid production in filamentous fungi
US20170362613A1 (en) Recombinant Host Cells For The Production Of 3-Hydroxypropionic Acid
WO2014076232A2 (en) Isopropanol production by recombinant hosts using an hmg-coa intermediate
US8728804B2 (en) Polypeptides having succinyl-CoA: acetoacetate transferase activity and polynucleotides encoding same
WO2013178699A1 (en) Isopropanol production by bacterial hosts
US20180265902A1 (en) Beta-Alanine Aminotransferases For The Production of 3-Hydroxypropionic Acid
WO2014068010A1 (en) Isopropanol production by bacterial hosts

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140514