KR20170120269A - 항염 활성을 가진 톳 발효물의 제조방법 - Google Patents
항염 활성을 가진 톳 발효물의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 김치로부터 분리된 웨이셀라 속 균주로, 상기 균주를 톳에 접종하고 발효를 수행하는 경우, 톳의 발효물의 항염 활성을 개선하는 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)와 이의 용도, 구체적으로 상기 균주를 톳에 접종시키고 발효시키는 단계를 포함하는 항염 활성을 갖는 톳 발효물의 추출물에 관한 것이다.
상기 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)를 이용하여 발효시키는 경우, 기존 톳에 비하여, 항염 활성이 개선될 뿐만 아니라, 발효 효율의 경우에도, 다른 유산균에 비하여 가장 우수하며, 상기 유산균은 GRAS 미생물로 인정되는 유산균에 해당하여 안전성도 확보되므로, 톳의 다양한 용도의 개발 및 산업화에 활용될 수 있다.
상기 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)를 이용하여 발효시키는 경우, 기존 톳에 비하여, 항염 활성이 개선될 뿐만 아니라, 발효 효율의 경우에도, 다른 유산균에 비하여 가장 우수하며, 상기 유산균은 GRAS 미생물로 인정되는 유산균에 해당하여 안전성도 확보되므로, 톳의 다양한 용도의 개발 및 산업화에 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 톳을 발효시킨 톳의 발효물의 생리활성, 구체적으로 항염 활성을 현저하게 개선시킬 수 있는 유산균, 구체적으로 웨이셀라 속 균주로 발효시키는 단계를 포함하는 항염 활성을 가진 톳 발효물의 추출물 제조방법에 관한 것이다.
염증은 외부에서 들어온 해로운 물질이나 유기체 등과 같은 여러 요인에 의하여 세포나 조직이 손상을 입거나 파괴되었을 때 그 손상을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키기 위하여 국소적으로 일어나는 면역반응으로서, 생체를 보호하고 조직 손상으로 생성된 산물들을 제거하는데 유용한 방어 메카니즘이다. 상기 방어 메카니즘에 의해, 결과적으로 통증, 부종, 발적 또는 발열 등이 일어나 기능장애가 유발되기도 한다. 상기 염증을 유발하는 여러 요인에는 외상, 화상, 동상, 방사능 등에 의한 물리적 요인, 산(acid)과 같은 화학물질에 의한 화학적 요인 및 항체반응에 의한 면역학적 요인들이 있으며, 그 외에 혈관이나 호르몬 불균형에 의해 발생되기도 한다.
상기 염증은 정상적인 경우에는 생체 내에서 염증반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키는 작용을 하지만, 염증의 정도가 일정 수준 이상이 되거나 만성화되어 만성염증과 같은 질병 상태로 진행되는 경우 문제가 된다. 임상질환 가운데 거의 모든 질환에서 염증 반응을 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 암발생과정(carcinogenesis)에서도 염증 반응과 관련된 효소들이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 염증은 다양한 세포와 사이토카인(cytokine)들이 관여한다. 초기 염증반응은 인체 내 선천적 면역반응을 담당하는 면역세포인 대식세포가 염증매개물질을 분비하여 유도한다. 또한, 지속된 염증반응의 경우, 염증반응을 촉진하는 cyclooxygenase-2(COX-2), inducible nitric oxide synthase(iNOS), interleukin-6(IL-6), tumor necrosis factor-α(TNF-α), IL-1β와 같은 사이토카인(cytokine)들이 관여한다. 상기 지속된 염증반응의 경우, 만성화되면 여러 질환의 원인이 되기도 한다.
최근 밝혀진 바에 의하면, 체내에서의 염증반응의 진행은 특히 강력한 염증 매개물인 나이트릭 옥사이드(Nitric oxide, NO)와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 상기 나이트릭 옥사이드는 NO 합성효소(NOS)에 의해 L-알지닌으로부터 생성되며, UV와 같은 외부 스트레스나 엔도톡신 또는 사이토카인과 같은 물질에 의해 많은 종류의 세포에서 생성된다. 상기와 같은 염증 자극들은 세포 내의 유도성 NOS(iNOS)의 발현을 증가시키고, 이를 통하여 세포내에서 NO 생성을 유도하여, 대식 세포를 활성화시킴으로써 염증 반응을 일으킬 수 있다.
따라서, 최근 효과적인 염증 완화를 위하여, NO의 생성을 억제할 수 있는 물질에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나, 이러한 연구에 의해 개발된 항염물질의 경우 몇 가지 부작용이 문제되고 있다. 일 예로, 급성 또는 류마티스성 관절염과 같은 만성 염증 질환의 치료에 사용되는 비스테로이드성 소염 약물들은 COX-2 효소를 억제할 뿐만 아니라 COX-1 효소도 억제함으로써 위장관 장애와 같은 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
한편, 일상생활에 사용되는 화장품은 피부를 보호하고 미화 청결을 위해 사용되는 제품이지만 화장품 조성물을 살펴보면 피부 보호 목적과는 상이한 성분들이 제품 형성에 필수 불가결한 존재로서 사용된다. 예를 들어, 계면활성제, 방부제, 향료, 자외선 차단제, 색소 및 기타 효능이나 효과를 부여하기 위해 쓰이는 여러 가지 성분들을 들 수 있다. 상기 화장품 제조에 필수적으로 사용되는 성분은 일반적으로 피부에 염증이나, 뾰루지 또는 부종 등과 여러 가지 부작용을 발생하는 것으로 알려져 있다.
또한, 체내로부터 배출되는 피지 성분, 땀 성분 및 화장품 성분 중의 지방산, 고급 알코올, 단백질 등이 피부 상에 존재하는 피부 상재 균들에 의해 독성이 강한 물질로 분해되면, 이들에 의해 피부 염증이 유발될 수도 있으며, 태양으로부터 나오는 자외선에 의해서도 피부 염증이 유발된다는 것은 잘 알려진 사실이다.
이렇듯 화장품에 있어서 피부 부작용 유발요인은 항상 잠재되어 있으며 이를 해결 하고자 여러 가지 연구가 진행되어 왔다. 현재까지 홍반이나 부종 같은 자극완화 및 염증 완화 목적으로 이용되고 있는 물질로는 비스테로이드계로 플루페나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin)등이 있고, 스테로이드계로는 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone) 등이 있으며, 알란토인, 아즈렌, ε-아미노키프론산, 하이드로코티존, 감초산 및 그 유도체(β-글리칠레친산, 글리칠레친산 유도체) 등이 항염증에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
그러나, 일반적으로 항염제로 쓰이는 상기 인도메타신은 화장료에는 사용할 수 없는 물질이고, 상기 하이드로코티존은 사용량이 제한되어 있으며, 감초산 및 그 유도체는 안정화시키기 어렵거나 용해도가 좋지 않아 실제 적용 시 농도의 제한으로 인하여 실질적인 효과를 거두기가 어려운 점이 있는 등 지금까지 알려진 항염제는 피부안전성 면이나 화장료 배합시의 안정성 면에서 대부분 문제점을 가지고 있어서 그 사용이 제한되고 있다.
그러므로, 천연물질 유래 물질로 이러한 부작용이나 세포독성에 대한 위험이 없거나 적으면서, 효과적으로 NO의 생성을 억제할 수 있어 항염효과가 우수하여, 부작용 없이 염증을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 그 함량의 제한 없이 화장품에 사용될 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.
특히, 최근에는 소비자들의 욕구에 부응하기 위하여 천연 원료를 이용한 화장료에 대한 연구개발이 활발히 진행되고 있는 실정이다.
또한, 발효란 효소 작용에 의해 복잡한 유기물이 간단한 화합물로 변화해 자유 에너지를 내놓는 현상으로, 일반적으로 미생물이 유기물을 분해해서 대사산물을 축적하는 현상을 말한다. 또 다른 측면에서, 발효는 고분자량의 유기 화학물로부터 보다 간단한 물질을 얻기 위해 대사과정을 수행하는 생화학반응을 의미한다.
발효는 필수 아미노산을 생합성하거나 단백질 함량과 섬유질의 소화가능성을 개선함으로써, 식품의 영양학적 가치를 증가시킨다. 또한, 발효는 칼슘이나 인 또는 다양한 비타민과 같은 미량영양소(micronutrient)의 생물학적 이용가능성(bioavailability )도 개선시킨다.
이러한 발효과정에 사용되는 대표적인 미생물로, 유산균, 효모, 아세트산균 등이 있으며, 이 중 오랜 시간 동안 발효식품의 제조에 관여하여 안전성이 확보된 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)이 주로 관심을 받고 있다.
상기 유산균은 당류를 발효해서 50% 이상 젖산을 생성하는 세균으로, 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물로 젖산균이라고도 불리운다. 음식물뿐만 아니라 포유동물의 구강과 소화관, 토양 등 자연계에 널리 분포하고 있으며, 식품의 보존과 관능적 특성과 관련된 중요한 역할 등을 수행하는 인간생활에 유익한 미생물이다. 상기 유산균은 형태학적으로 포자를 형성하지 않고(non-spore forming), 그람 양성(gram-positive )이며, 간균(rods)과 구균(cocci)으로 구분된다.
전 세계적으로 오랜 기간에 걸쳐 유산균 함유 발효 식품 등 널리 식품으로 사용된 유산균은 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물로 안정성을 인정받고 있다. 따라서, 상대적으로 안전성에 대한 문제가 발생할 가능성을 최소화 할 수 있을 것으로 기대되는 천연물을 이용한 방법들에 대한 연구가 진행되고 있으며, 최근에는 각국의 연구진에 의하여, 식이요법과 함께 사용될 각종 기능성 식품이나 식이보충제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 상황이다.
이러한 유산균의 안정성 및 유산균이 건강에 좋다는 인식을 기초로 하여 유산균 함유 식품을 통하여 건강을 유지하고, 질병을 예방하려는 노력이 증대되었으며, 최근 유산균을 기능성 식품에 사용하기 위하여 잠재력을 평가하기 위한 프로바이오틱 유산균에 대한 연구가 전 세계적으로 광범위하게 진행되고 있다.
또한, 우리나라는 3면이 바다와 접해 있는 지형을 가지고 있으며, 약 750여 종의 해조류가 분포되어 있다. 또한, 육상생물자원의 고갈 및 전염병 등에 의한 오염과 새로운 자원의 보고로서 해양에 대한 관심이 증가되며, 최근에는 해양생물자원 유래의 기능성 천연 생리활성물질에 대한 관심이 지속적으로 높아지고 있다. 특히, 해조류 유래의 생리활성물질이 영양적인 측면은 물론 각종 질병의 치료 및 건강 유지 등에 도움이 된다는 많은 연구결과가 지속적으로 보고되고 있는 실정이다. 이러한 관심에도 불구하고, 우리나라의 경우, 우리나라의 해안에 서식하고 있는 다양한 해조류 중 극히 일부분인 30 여종을 식용으로 소비하거나, 식품첨가물이나 공업용 다당류의 원료 또는 비료 및 사료의 원료 등으로 이용하고 있는 것으로 보고되고 있다.
다양한 생리활성물질을 가지고 있는 해조류의 경우, 주로 해조류 내의 유용성분을 열수로 직접 추출하거나, 알칼리, 산 또는 효소 등을 처리하여 추출한 후 가공하는 방법으로 이용하고 있다. 그러나, 이러한 추출공정만으로는 해조류에 포함된 성분들을 효과적으로 추출해내지 못하는 단점을 가지고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여, 최근에는 미생물을 이용하여 해조류를 발효하려는 시도들이 행해지고 있지만, 해조류 발효 추출물에 대한 체계적인 생리활성검증에 대한 보고는 미흡하며, 개별 해조류 별 생리활성을 개선시킬 수 있는 적합한 미생물에 대한 연구가 제한된 실정이다. 따라서, 해조류의 발효물에 대해 기능성을 부여하는 등 해조류의 품질 향상을 위한 제조방법 또는 이를 위한 미생물에 대한 연구의 필요성이 점차 증가하고 있다.
상기와 같은 필요성에 따라, 본 발명은 톳 발효물의 추출물의 생리활성을 개선할 수 있는 신규한 미생물을 이용한 톳 발효물의 추출물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 필요성에 따라, 김치로부터 분리되고, 톳의 발효물에 생리활성을 개선할 수 있는 생촉매(biocatalyst)를 이용한 톳 발효물의 추출물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 톳을 발효시킨 톳의 발효물의 생리활성, 구체적으로 항염 활성을 현저하게 개선시킬 수 있는 유산균, 구체적으로 웨이셀라 속 균주로 발효시키는 단계를 포함하는 항염 활성을 가진 톳 발효물의 추출물 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 김치로부터 분리된 웨이셀라 속 균주로, 상기 균주를 톳에 접종하고 발효를 수행하는 경우, 톳의 발효물의 항염 활성을 개선하는 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 톳에 접종하고 발효시켜 톳 발효물을 제조하는 톳 발효물 제조단계; 및 상기 제조된 톳 발효물에 에탄올을 첨가하고 추출하여 톳 발효물 에탄올 추출물을 제조하는 톳 발효물 추출물 제조단계를 포함하는 항염 활성을 갖는 톳 발효물의 추출물 제조방법에 관한 것일 수 있다.
상기 톳 발효물 제조단계는 톳(Hizikia fusiformis) 분말을 포함하는 용액에 상기 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 접종하고 발효시켜 톳 발효액을 제조하는 톳 발효액 제조과정 및 상기 톳 발효액을 건조시켜 톳 발효물을 제조하는 과정을 포함하는 것일 수 있다.
상기 톳 발효액 제조과정은 물에 톳(Hizikia fusiformis) 건조 분쇄물 5%(w/v), 포도당(glucose) 1%(w/v) 및 젖산(lactate) 0.5%(w/v)을 첨가하고 혼합시킨 톳 용액에 상기 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 접종하고 발효시켜 톳 발효액을 제조하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
상기 톳 발효액 제조과정은 상기 톳 용액에 상기 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 접종하고 30℃에서 30일 동안 발효시켜 톳 발효액을 제조하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
상기 톳 발효물 추출물 제조단계는 상기 제조된 톳 발효물에 톳 발효물 100 중량부를 기준으로 900 내지 1,000 중량부의 에탄올을 첨가하고 80℃에서 추출하여 톳 발효물 에탄올 추출물을 제조하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물에 관한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 김치로부터 분리된 웨이셀라 속 균주로, 상기 균주를 톳에 접종하고 발효를 수행하는 경우, 톳의 발효물의 항염 활성을 개선하는 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P) 균주에 관한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 배양물의 농축액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 항염 활성을 가진 톳의 발효물 제조용 생촉매(biocatalyst)에 관한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 톳의 발효물 제조용 생촉매를 톳에 첨가하고 발효시키는 단계를 포함하는 항염 활성이 개선된 톳의 발효물의 제조방법에 관한 것일 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 웨이셀라 속 SH-1 균주를 이용하여 발효시키는 경우, 톳 발효물의 추출물의 항염 효과를 현저하게 개선시킬 뿐만 아니라, 해당 유산균은 GRAS 미생물로서, 해당 유산균을 이용하여 식용인 톳을 발효시켜 제조된 발효액을 안전한 에탄올 용매를 이용하여 추출하는 것으로서 안전성도 확보되므로, 톳 발효물의 추출물의 다양한 산업적 용도, 특히 화장품 소재 등으로의 활용 및 관련 제품의 품질 향상에 이바지할 수 있다는 점에서 관련 산업에 다양하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 SH-1 균주의 16S rDNA의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 SH-1 균주의 16S rDNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통발생론적 관계(Phylogenetic tree)를 나타내는 표이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 톳 발효물의 세포독성을 확인하기 위해, 톳 에탄올 추출물과 SH-1 균주로 발효시킨 톳 발효물 에탄올 추출물을 처리한 경우, RAW264.7 대식세포주를 이용한 MTT Assay를 수행한 것으로, 가로축은 LPS 처리 여부 및 시료 투여량을 나타내고, 세로축은 세포생존도(Cell viability)를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 톳 발효물의 항염 활성을 확인하기 위해, 톳 에탄올 추출물과 SH-1 균주로 발효시킨 톳 발효물 에탄올 추출물을 처리한 경우, NO 생성 억제량을 확인한 것으로, 가로축은 LPS 처리 여부 및 시료 투여량을 나타내고, 세로축은 NO 생성량을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 발효 유산균 종류에 따른 톳 발효물의 항염 활성을 확인하기 위해, SH-1 균주 및 Leuconostoc sp.으로 각각 발효시킨 톳 발효물 에탄올 추출물을 처리한 경우, NO 생성 억제량을 확인한 것으로, 가로축은 LPS 처리 여부 및 시료 투여량을 나타내고, 세로축은 NO 생성량을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 발효 미생물 종류에 따른 톳 발효물의 항염 활성을 확인하기 위해, SH-1 균주 및 B. longum 또는 S. thermophillus으로 각각 발효시킨 톳 발효물 에탄올 추출물을 처리한 경우, NO 생성 억제량을 확인한 것으로, 가로축은 LPS 처리 여부 및 시료 투여량을 나타내고, 세로축은 NO 생성량을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 SH-1 균주의 16S rDNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통발생론적 관계(Phylogenetic tree)를 나타내는 표이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 톳 발효물의 세포독성을 확인하기 위해, 톳 에탄올 추출물과 SH-1 균주로 발효시킨 톳 발효물 에탄올 추출물을 처리한 경우, RAW264.7 대식세포주를 이용한 MTT Assay를 수행한 것으로, 가로축은 LPS 처리 여부 및 시료 투여량을 나타내고, 세로축은 세포생존도(Cell viability)를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 톳 발효물의 항염 활성을 확인하기 위해, 톳 에탄올 추출물과 SH-1 균주로 발효시킨 톳 발효물 에탄올 추출물을 처리한 경우, NO 생성 억제량을 확인한 것으로, 가로축은 LPS 처리 여부 및 시료 투여량을 나타내고, 세로축은 NO 생성량을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 발효 유산균 종류에 따른 톳 발효물의 항염 활성을 확인하기 위해, SH-1 균주 및 Leuconostoc sp.으로 각각 발효시킨 톳 발효물 에탄올 추출물을 처리한 경우, NO 생성 억제량을 확인한 것으로, 가로축은 LPS 처리 여부 및 시료 투여량을 나타내고, 세로축은 NO 생성량을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 발효 미생물 종류에 따른 톳 발효물의 항염 활성을 확인하기 위해, SH-1 균주 및 B. longum 또는 S. thermophillus으로 각각 발효시킨 톳 발효물 에탄올 추출물을 처리한 경우, NO 생성 억제량을 확인한 것으로, 가로축은 LPS 처리 여부 및 시료 투여량을 나타내고, 세로축은 NO 생성량을 나타낸다.
본 발명은 톳을 발효시킨 톳의 발효물의 생리활성, 구체적으로 항염 활성을 현저하게 개선시킬 수 있는 유산균, 구체적으로 웨이셀라 속 균주로 발효시키는 단계를 포함하는 항염 활성을 가진 톳 발효물의 추출물 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물의 산업적 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 상기 웨이셀라 속 균주를 이용하여 톳 발효물 제조단계; 및 상기 제조된 톳 발효물을 용매로 추출하여 추출물을 제조하는 톳 발효물 추출물 제조단계를 포함하는 항염 활성을 갖는 톳 발효물의 추출물 제조방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명자들은 대한민국 부산지역에서 수집된 김치로부터 분리한 신규 웨이셀라 속 균주(Weissella sp.)인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1) 균주로 톳을 발효하는 경우, 다른 유산균 및 미생물에 비해 항염 활성을 우수하게 개선시킨다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 있어서, 톳(Hizikia fusiformis)은 갈조식물 모자반과에 속하는 해조류로, 우리나라에서 식용으로 널리 이용되고 있는 바닷말의 일종이다. 우리나라의 서해안, 남해안 및 제주지역뿐만 아니라 일본과 중국 등지에 널리 분포하고 있다. 상기 톳은 칼슘과 철 등의 무기질과 비타민뿐만 아니라 아미노산과 식이섬유가 풍부하게 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근 연구에서는 항균, 항산화, 항고지혈증, 항콜레스테롤 효과 등 다양한 기능성이 있는 것으로 알려져 있다. 현재까지 톳의 기능성을 이용하기 위한 연구는 주로 톳의 열수 또는 주정을 이용한 추출물이나 알칼리 및 산 처리 또는 효소 처리한 처리물과 관련된 것이나, 이들 방법에 의한 추출물 또는 처리물은 해조류에 다량 포함된 비소화성 복합다당류 등의 유용성분을 효과적으로 추출하기 어렵다는 단점을 가지고 있으며, 해조류 특유의 이취와 관련된 문제를 해결하지 못한다는 단점이 있다.
본 발명에 있어서, 생촉매(biocatalyst)란 여러 가지 화학반응 또는 생화학반응에서 촉매의 역할을 하는 미생물 또는 미생물이 분비하는 물질을 포함하는 것일 수 있고, 일 예로 화학반응 또는 생화학반응을 촉매하는 미생물, 미생물 배양액 및 이들의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 배지(culture medium)란 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 포함하거나, 특수한 목적을 위하여 상기 주성분 외에 추가적인 물질을 더욱 포함하는 것을 의미하며, 배양배지, 배양기 또는 배양액이라고도 한다. 상기 배지는 천연배지, 합성배지 또는 선택배지가 있고, 성상에 따라 고체배지 또는 액체배지가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 상기 웨이셀라 속 균주를 이용하여 톳 발효물 제조단계; 및 상기 제조된 톳 발효물을 용매로 추출하여 추출물을 제조하는 톳 발효물 추출물 제조단계를 포함하는 항염 활성을 갖는 톳 발효물의 추출물 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 일 측면에서, 톳 발효물의 항염 활성을 개선하는 웨이셀라 속(Weissella sp.) 균주에 관한 것일 수 있다.
상기 웨이셀라 속(Weissella sp.) 균주는 김치로부터 분리된 웨이셀라 속 균주로, 상기 균주를 톳에 접종하고 발효를 수행하는 경우, 톳의 발효물의 항염 활성을 개선하는 균주일 수 있으며, 구체적으로 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P) 균주일 수 있다.
상기 웨이셀라 속 균주, 구체적으로 상기 웨이셀라 속 SH-1는 김치로부터 분리된 균주로, 상기 균주를 톳에 접종하고 발효를 수행하는 경우, 발효된 톳의 발효물, 구체적으로 톳 발효물의 추출물의 항염활성을 강화할 수 있는 균주이다.
본 발명의 일 예에서, 본 발명의 김치나 물김치 등의 한국 전통 발효식품으로부터 분리된 유산균 균주를 탐색한 과정은 톳에 해당 미생물을 접종시켜 발효하는 경우, 다른 균주에 비해 발효물의 기능성, 구체적으로 항염활성의 개선 또는 강화 효과가 우수한 균주를 선별하는 방법으로 수행하였다.
상기의 탐색과정을 통하여, 톳의 발효물 제조를 위해 톳에 첨가된 미생물 중에서 기능성 개선 효과가 가장 우수한 것으로 선별된 SH-1 균주는 동정 결과 상기 도 1에 나타낸 바와 같이 웨이셀라 속(Weissella sp.)인 것으로 확인되었다. 상기 선별된 SH-1 균주는 웨이셀라 속(Weissella sp.)에 속하는 것으로 동정되어, 상기 균주는 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1)으로 명명하였다.
상기 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1)는 대한민국 서울시 서대문구에 위치한 한국미생물보존센터에 2016년 2월 12일자로 기탁되어 기탁번호 KCCM 11813P를 부여 받았다.
상기 기탁번호 KCCM 11813P를 부여받은 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)는 통상의 배지에서 배양할 수 있다. 또한, 상기 웨이셀라 속 SH-1는 탐색과정에서 확인된 바와 같이, 당원으로 갈조류, 구체적으로 톳을 분해하여 이용할 수 있으므로, 톳, 톳의 건조물, 톳의 건조물의 분말 및/또는 톳이나 톳의 건조물을 이용하여 제조된 발효대상물 또는 발효대상 원액을 발효시켜 제조된 톳의 발효물의 기능성을 개선할 수 있다.
또한, 상기 웨이셀라 속 SH-1의 최적 배양 기간은 기능성 개선의 측면 및 경제적 측면에서 20일 내지 40일 또는 25일 내지 35일, 바람직하게는 28일 내지 32일, 더욱 바람직하게는 29일 내지 31일, 더더욱 바람직하게는 30일 동안 수행할 수 있으며, 최적 배양 온도조건은 20℃ 내지 37℃ 또는 25℃ 내지 35℃ 또는 28℃ 내지 32℃일 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 측면에서 톳의 발효물 제조용 생촉매(biocatalyst)에 관한 것이다.
상기 톳의 발효물 제조용 생촉매(biocatalyst)는 상기 웨이셀라 속 SH-1 균주(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P), 상기 균주의 배양물 및 상기 배양물의 농축액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 균주의 배양물이란 웨이셀라 속 SH-1를 배양하여 얻어진 배양배지를 의미하며, 상기 균주가 포함되어 있는 배양배지일 수 있다. 상기 균주의 배양물이란 액상의 배양배지에 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 배양한 후, 얻어진 배양배지일 수 있으나, 상기 배양물의 성상이 액체 또는 고체로 한정되는 것은 아니다.
상기 배양배지는 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위한 통상의 배지일 수 있으며, 영양원으로는 포도당(glucose), 젖산(lactate), 효모 엑기스(yeast extract), 감자 전분(potato starch), 덱스트로스(dextrose) 및 이들의 혼합물로 이루어진 것 중에서 선택된 어느 하나가 첨가된 것일 수 있다.
상기 배양물의 농축물이란 상기 균주의 배양물을 통상적인 방법으로 농축한 것을 의미한다. 상기 배양물의 농축물은 상기 웨이셀라 속 균주를 배양한 액상의 배양배지를 통상의 방법으로 농축한 농축액일 수 있으나, 상기 배양물의 성상이 액체로 한정되는 것은 아니다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 톳의 발효물 제조방법에 관한 것이다.
상기 톳의 발효물 제조방법은 상기 톳의 발효물 제조용 생촉매를 톳에 첨가하고 발효시키는 단계를 포함하는 항염 활성이 개선된 톳의 발효물의 제조방법에 관한 것일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항염 활성을 갖는 톳 발효물의 추출물 제조방법에 관한 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 상기 웨이셀라 속 균주를 이용하여 톳 발효물 제조단계; 및 상기 제조된 톳 발효물을 용매로 추출하여 추출물을 제조하는 톳 발효물 추출물 제조단계를 포함하는 항염 활성을 갖는 톳 발효물의 추출물 제조방법에 관한 것일 수 있다.
상기 톳 발효물 제조단계는 김치로부터 분리된 웨이셀라 속 균주로, 상기 균주를 톳에 접종하고 발효를 수행하는 경우, 톳의 발효물의 항염 활성을 개선하는 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 톳에 접종하고 발효시켜 톳 발효물을 제조하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 톳 발효물 제조단계는 톳(Hizikia fusiformis) 분말을 포함하는 용액에 상기 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 접종하고 발효시켜 톳 발효액을 제조하는 톳 발효액 제조과정 및 상기 톳 발효액을 건조시켜 톳 발효물을 제조하는 과정을 포함하는 것일 수 있다.
상기 톳 발효액 제조과정은 물에 톳(Hizikia fusiformis) 건조 분쇄물, 포도당(glucose) 및 젖산(lactate), 구체적으로 톳 건조 분쇄물 5%(w/v), 포도당 1%(w/v) 및 젖산 0.5%(w/v)을 첨가하고 혼합시킨 톳 용액에 상기 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 접종하고 발효시켜 톳 발효액을 제조하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
상기 톳 발효액 제조과정은 상기 톳 용액에 상기 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 접종하고 20℃ 내지 37℃ 또는 25℃ 내지 35℃ 또는 28℃ 내지 32℃에서 발효시켜 톳 발효액을 제조하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
상기 발효액을 제조하는 방법은 기능성 개선의 측면 및 경제적 측면에서 20℃ 내지 37℃ 또는 25℃ 내지 35℃ 또는 28℃ 내지 32℃에서 20일 내지 40일 또는 25일 내지 35일, 바람직하게는 28일 내지 32일, 더욱 바람직하게는 29일 내지 31일, 더더욱 바람직하게는 30일 동안 수행할 수 있다.
상기 톳 발효물 추출물 제조단계는 상기 제조된 톳 발효물에 물 또는 유기용매, 구체적으로 탄소수 1 내지 5의 알코올, 바람직하게는 에탄올 또는 에탄올 수용액을 첨가하고 추출하는 방법으로 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 톳 발효물 추출물 제조단계는 톳 발효물 100 중량부를 기준으로 900 내지 1,000 중량부의 에탄올을 첨가하고 50℃ 내지 90℃ 또는 70℃ 내지 85℃ 또는 80℃에서 추출하여 톳 발효물 에탄올 추출물을 제조하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물에 관한 것일 수 있다.
상기 톳 발효물의 추출물은 상기 톳 발효물의 추출물을 시료로 하여 실험을 수행한 결과, 톳 자체 또는 다른 미생물을 이용하여 제조된 발효물의 추출물에 비하여, 항염활성 개선 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
이러한 측면에서, 본 발명은 톳 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물에 관한 것이다.
상기 유효성분은 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳의 발효물의 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 톳 분말(Hizikia fusiformis powder), 포도당(glucose) 및 젖당(lactate)를 첨가하고 혼합시킨 톳 용액에 상기 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)를 접종시키고 30℃에서 30일 동안 발효시켜 톳 발효액을 건조시킨 톳 발효물에 에탄올을 첨가하고 80℃에서 추출하는 방법으로 제조된 톳 발효물의 추출물일 수 있다.
일 예로, 본 발명은 또한 상기 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물 또는 상기 톳의 발효물 제조용 생촉매를 발효대상, 구체적으로 톳에 첨가하고 발효시켜 발효된 톳의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물일 수 있다.
상기 항염 조성물은 염증을 억제하거나 염증을 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 염증은 일반적인 염증질환을 포함하는 개념이며, 일 예로 상기 염증질환은 각종 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 낭창, 망막염, 위염, 간염, 장염, 췌장염 및 신장염으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 상기 알레르기는 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기(urticaria), 곤충 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지를 포함한다. 따라서, 본 발명의 항염 조성물은 염증질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물로 응용되거나, 상기 염증질환의 예방 또는 개선용 식품조성물로 응용될 수 있다. 상기 식품조성물은 일 예로 상기 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물일 수 있다.
상기 항염 조성물은 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물을 전체 식품 중량의 0.001 중량% 내지 99.9 중량% 또는 0.01 중량% 내지 50 중량% 또는 0.1 중량% 내지 30 중량% 또는 0.1 중량% 내지 15 중량% 포함될 수 있다.
상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하고, 소화기관, 배설기관 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하며, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물은 상기 항염 조성물 내에 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물을 포함하는 조성물이 약제로 사용되거나, 의약 또는 약학적 용도로 사용되는 경우, 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물은 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용될 수 있다.
이 경우 상기 조성물 내 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물의 함량은 0.001 중량 % 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량% 또는 1 중량% 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 화합물의 함량은 바람직한 함량으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다.
또한, 상기 약학 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 공지의 항염효과가 있는 것으로 인정된 물질, 일 예로 NO 저해제, COX-2 저해제, 또는 항염증제 등으로 사용되는 물질을 더욱 포함할 수 있다.
상기 조성물이 약제로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 일 예로는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.
또한, 상기 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
일반적으로는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제(TABLETS), 알약, 연질 또는 경질 캅셀제(CAPSULES), 환제(PILLS), 산제(POWDERS) 및 과립제(GRANULES) 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제(SUSTESIONS), 내용액제, 유제(EMULSIONS) 및 시럽제(SYRUPS) 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 형태는 크림(CREAM), 로션제(LOTIONS), 연고제(ONITMENTS), 경고제(PLASTERS), 액제(LIQUIDS AND SOULTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 유동엑스제(FRUIDEXTRACTS), 엘릭서(ELIXIR), 침제(INFUSIONS), 향낭(SACHET), 패취제(PATCH) 또는 주사제(INJECTIONS) 등의 형태일 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 제형화될 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 일 예로 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물 또는 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증제를 제공한다.
상기 항염증제는 상기 유효성분을 단독으로 포함할 수 있으며, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 혼합물로 제공되는 경우, 상기 유효성분은 항염증제 전체에 대해 0.1 중량% 내지 99.9 중량%로 포함될 수 있으나, 통상 0.001 중량% 내지 50 중량%의 함량으로 포함되는 것이 일반적이다.
상기 항염제는 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증과 같은 각종 만성 염증 질환, 패혈증, 쇼크, 장기이식의 거부반응과 같은 각종 급성 염증 질환, 안과질환, 기관지염, 또는 염증성 장질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용가능하다.
상기 담체 또는 부형제의 일예로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 담체 또는 부형제는 2종이상 사용될 수 있다.
또한 항염증제를 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 항염증제는, 상기 유효성분 이외에 공지의 항염활성을 갖는 화합물 또는 천연 발효물이나 천연 추출물을 더욱 포함할 수 있으며, 상기 유효성분 100 중량부에 대하여 각각 5 중량부 내지 20 중량부로 포함될 수 있다.
상기 항염증제의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.
본 발명에 따른 항염증제는 경구 또는 비경구로 사용될 수 있으며, 예컨대 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 코안, 경막외 및 구강경로를 통하여 사용될 수 있으며, 이의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일예로, 본 발명의 항염증제는 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 ㎎/㎏(체중) 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기한 투여량은 예시하기 위한 일예에 불과하며 상기 범위에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한, 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물 또는 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물은 천연물질 유래이므로 부작용이 문제되지 아니하고, 세포독성도 없을 뿐만 아니라, 염증 억제 효과가 뛰어나기 때문에 항염 및 항자극 활성이 뛰어나므로, 화장품에 포함된 성분들에 의해 유도되는 염증 및 외부 환경에 의해 유도되는 염증을 효과적으로 제어할 수 있다. 따라서, 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물 또는 상기 톳 발효물의 추출물 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물은 염증 개선 및 완화효과를 갖는 화장료 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 기초 화장료, 메이크업 화장료, 바디 화장료, 두발용 화장료, 두피용 화장료, 면도용 화장료 또는 구강용 화장료의 용도로 제공될 수 있다.
상기 기초 화장료의 예로는 크림, 화장수, 팩, 마사지 크림, 유액 등이 있고, 상기 메이크업 화장료의 예로는 파운데이션, 메이크업 베이스, 립스틱, 아이섀도, 아이라이너, 마스카라, 아이브로우 펜슬 등이 있으며, 상기 바디 화장료의 예로는 비누, 액체 세정제, 입욕제, 선스크린 크림, 선 오일 등이 있고, 상기 두발용 화장료의 예로는 샴푸, 린스, 헤어 트리트먼트, 헤어 무쓰, 헤어 리퀴드, 포마드, 헤어 칼라제, 헤어 블리치제 또는 칼라 린스 등이 있으며, 상기 두피용 화장료의 예로는 헤어 토닉 또는 스칼프 트리트먼트 등이 있고, 상기 면도용 화장료의 예로는 애프터셰이브로션 또는 셰이빙 크림 등이 있으며, 상기 구강용 화장료의 예로는 치약 또는 마우스 워셔 등이 있다.
상기 화장료 조성물에는 유효성분 외에 사용용도 및 화장료 조성물의 성질에 따라 통상 화장료 조성물에 배합되고 있는 성분, 일예로 보습제, 자외선 흡수제, 비타민류, 동식물 추출성분, 소화제, 미백제, 혈관확장제, 수렴제, 청량제, 호르몬제 등을 추가로 배합될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 약물 또는 유효성분을 피부조직으로 침투 또는 이행시키기 위해서 필요한 기제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형은 사용용도 및 화장료 조성물의 성질에 따라 적절한 형태를 취할 수 있으며, 일예로 수용액계, 가용화계, 유화계, 유액계, 겔계, 페이스트계, 연고계, 에어졸계, 물-기름 2층계 또는 물-기름-분말 3층계일 수 있으며, 상기 제형의 예는 단순한 예시일 뿐, 상기 예시에 의해 본 발명의 화장료 조성물의 제형 및 형태가 제한되는 것은 아니다.
상기 유효성분은 상기 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하기로는 0.01 중량% 내지 20 중량%일 수 있으나, 상기 함량은 제형 또는 화장료 조성물에 함유되는 유효성분외의 성분의 함량에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 상기 함량에 의해 본 발명에 포함되는 유효성분의 함량이 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시 할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 실험은 각각 동일한 실험을 3회 수행하였으며, 각각의 실험결과로 얻어진 자료는 SPSS+/WIN12.0(Statistical Package for Social Science, version 12.0, IBM, Armonk, NY, USA) 통계프로그램을 이용하여 평균 및 표준편차(Mean ± SEM)로 표시하였다. 집단간의 유의성 검증 위해, 일원배치 분산분석(ANOVA)을 통해 분석하였고, 사후검증은 Duncan's multiple range test를 실시하여 P < 0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
실시예
1. 전통식품으로부터 톳의 발효 균주의 분리 및 동정
본 실험에 사용한 톳(Hizikia fusiformis)은 파라제주(Parajeju, 대한민국)에서 판매하는 것을 구입하여 사용하였으며, 톳 시료는 탈염된 톳을 건조시킨 후, 건조된 톳을 초미세 기류식 분쇄기(KMS-200, Korea Medi Co., 대한민국)로 분쇄하여 제조하였고, 상기 제조된 톳 시료는 밀봉하여 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다
또한, 톳 발효를 위한 최적 발효균주 분리를 위해, 다양한 한국 전통 발효식품, 구체적으로 물김치, 김치 및 염장 해산물 시료로부터 균주를 수집하였다.
구체적으로, 상기 발효식품 시료의 상등액을 멸균수로 희석하여 희석 현탁액(10-1 내지 10-3)을 제조한 후, 탄소원 대체제(substitute of carbon source)로 갈조류 분말(brown alga powder) 1%(w/v)와 지시제(indicator)로 브로모크레졸 퍼플(bromocresol purple) 0.002%(w/v)이 포함된 MRS 한천배지에 도말하였다. 도말한 배지는 37℃ 배양기에서 2일간 배양하였으며, 노란색의 군락(yellow-colored colonies)을 형성한 집락을 대상으로 균주를 선별하였다.
상기 선별된 균주는 1%(w/v) 갈조류 분말(brown alga powder), 0.01%(w/v) 효모 추출물(yeast extract) 및 0.5%(w/v) NaCl이 포함된 해조류 추출물 배지(seaweed extract media, SEM)을 이용하여, 37℃ 배양기에서 1일간 배양하였다. 배양 결과, 형성된 50개의 노란색 콜로니 중에서 그람 양성 균으로 확인된 콜로니 중, 균주가 가장 잘 성장한 균주를 순수분리하여, 상기 분리된 세균을 배양 균주로 선정하여 SH-1번으로 이름을 명명하였다.
상기 배양된 균주를 동정하기 위하여, 상기 배양된 균주에 대한 총 세포 DNA(genomic DNA)를 분리하여 16S rRNA 서열을 분석하였다(도 1).
우선, 상기 선정된 4개의 균주를 MRS 액체배지(Difco Co., USA)를 이용하여, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 원심 분리하여 각각의 균체를 회수하였다. 상기 회수한 균체로부터 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, USA)를 사용하여 총 세포 DNA를 분리하였다.
상기 분리된 총 세포 DNA(도 1)를 주형으로, 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해서 하기 표 1에 기재된 universal primer인 27F 프라이머와 1492R 프라이머를 사용하여, MyGenie96 Thermal Block(Bioneer, 대한민국)을 이용하여 PCR을 수행하였다.
| Primers | 서열 (5′→3′) |
| 27F | AGA GTT TGA TCC/A TGG CTC AG |
| 1492R | GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
상기 증폭된 PCR 산물은 PCR/Gel Combo Kit(NucleoGen, 대한민국)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 DNA 시료를 이용한 염기서열 분석은 코스모진텍사(Cosmo Gene Tech, 대한민국)에 의뢰하여 수행하였으며, National Center for Biotechnology Information(NCBI, USA)의 BLAST를 사용하여 16S rRNA 유전자 단편의 염기서열의 상동성을 근거로 분리된 균주들을 동정하였다.
염기서열 분석은 코스모진텍사(Cosmo Gene Tech, Korea)에 의뢰하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA)의 BLAST를 사용하여 16S rRNA 유전자 단편의 염기서열의 상동성을 근거로 분리된 균주들을 동정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 1번 균주는 16S rRNA의 서열이 Weissella 속의 한 종과 일치하여, 웨이셀라 속(Weissella sp. SH-1)으로 동정되었다.
실시예
2.
웨이셀라
속
SH
-1 균주를 이용한 톳
발효물의
추출물 기능성 향상 확인
2-1. 톳
발효물의
추출물의 제조
상기 실시예 1에서 분리된 유산균의 발효효능을 확인하기 위하여, 기존 해조류 발효용으로 사용된 균주인 Bifidobacterium . longum(B. longum) 와 비교하여 톳 발효물의 추출물을 제조하였다.
상기 발효균주인 Weissella sp. SH-1과 B. longum를 유산균 선택배지인 MRS 액체배지를 이용하여 30℃에서 정치 배양하였다. 톳 발효액의 제조는 물(ddH2O) 200 ml에 건조 톳분말 10 g을 첨가한 후, 탄소원으로 glucose(1%, w/v)와 유기산으로 lactate(0.5%, w/v)를 첨가하고, 121℃의 가압 조건에서 30분간 멸균하였다. 상기 멸균된 배지에 여기에 정치 배양된 발효균주 배양액을 0.05%(v/v)의 농도로 접종한 후, 30℃에서 사전 검토 결과 항염 효과 개선 효과가 가장 우수한 것으로 확인된 발효기간인 30일간 배양하여 톳 발효액을 제조하였다.
상기 발효가 완료된 톳 발효액을 감압조건 하에서 농축시킨 다음 동결건조장치(FD8518, Ilshin BioBase, 대한민국)를 이용하여 동결건조하여 발효톳 건조시료 즉, 톳 발효물을 수득하였다.
상기 톳 발효물에 10배량(w/w)의 에탄올을 첨가한 후, 80℃에서 4시간씩 2회 추출을 수행하였으며 진공농축기를 이용하여 농축시켜 추출물을 얻었다.
2-2. 톳
발효물의
추출물의 항염 활성
개선능
확인
RAW264.7 대식세포는 10% fetal bovin serum(FBS, Atlas biologicals, USA)과 1% L-glutamine penicillin streptomycin solution(Sigma-Aldrich Co., USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Corning, USA)을 배양액으로 하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
우선, 각각의 발효균주로 발효시킨 톳 발효물의 추출물의 세포독성을 RAW264.7 대식세포주를 이용하여 확인하였다.
상기 RAW264.7 대식세포주에 대한 세포독성은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, RAW264.7 세포를 1×103 cells/well이 되도록 96 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서, 24시간 배양한 후 상기 톳 발효물의 에탄올 추출물을 50, 100 및 500 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 각각의 배양된 well에 배지를 제거한 후 MTT 용액을 1 mg/mL의 농도로 첨가하여 동일한 배양 조건에서 3시간 동안 배양하여, formazan crystal의 생성을 유도하였다. 상기 각 well에 생성된 formazan crystal에 100 μg/mL의 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich Co., USA) 용액을 가하여 환원반응으로 생성된 보라색의 formazan crystal을 완전히 용해한 후 ELISA Reader(Multiskan GO, Thermo Scientific, 핀란드)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 생존율(%)을 하기 계산식 1로 구하였다. 상기 측정결과를 도 3에 나타내었다.
[계산식 1]
Cell viability(%) = (대조군 흡광도－시료군 흡광도)/ 대조군 흡광도 × 100
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Weissella sp. SH-1 를 이용하여 발효한 톳 발효물의 추출물을 처리한 결과, 각각 50, 100 및 500 μg/mL의 처리 농도에서 모두 세포 독성을 보이지 않아 안전한 것으로 확인되었으며, 이 농도에서 항염증 활성을 확인하였다.
상기 안전성이 확인된 톳 발효물의 추출물에 대해 항염 효과를 확인하기 위하여, 우선 Nitric oxide(NO) 함량에 대한 영향을 측정하였다.
구체적으로, 상기 RAW264.7 대식세포를 1×103 cells/well이 되도록 96 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서, 10% FBS와 1% L-glutamine penicillin streptomycin이 함유된 DMEM으로 24시간 동안 배양하였다.
페놀레드가 제거된 새로운 배지로 교체한 다음 1 μg/mL의 LPS(Sigma-Aldrich Co.)와 상기 톳 발효물의 에탄올 추출물을 50, 100 및 500 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 각각의 배양된 well의 세포배양액을 수거하여 Griess reagent(Sigma-Aldrich Co.)와 1:1의 비율로 혼합하고 15분 동안 실온에 암반응시킨 후 ELISA Reader(Multiskan GO, Thermo Scientific, 핀란드)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 농도(μM)는 sodium nitrite(NaNO2) 용액의 표준곡선을 기준으로 하여 계산하였다. 상기 측정결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 대식세포의 procytokine을 증가시켜 NO와 같은 염증반응 매개물질을 분비시키는 LPS 처리에 의한 NO의 생성억제여부가 확인되었다. 구체적으로, 아무런 시료를 처리하지 않은 무처리군의 경우, NO 함량이 현저히 증가하였으며(83.8±4.3 μM), 톳 발효물의 추출물 자체를 처리한 경우에도 항염 효과는 인정되었으나, 유산균으로 발효처리한 경우에 더 우수한 항염 효과가 확인되었다.
추가로, 상기와 같은 실험방법으로, 해조류에 서식하거나 해조류 발효에 사용하는 여러 미생물을 이용하여 톳 발효물을 제조한 후, 상기 추출공정으로 추출하여 톳 발효물의 추출물을 제조하고, 이에 따른 항염 개선 효과를 확인하였다.
우선, 유산균으로 발효시킨 톳 발효물의 추출물을 처리한 결과, 전체 처리 농도에서 유의적으로, Weissella sp. SH-1으로 발효한 톳 발효물이 Leuconostoc sp. 보다 항염 효과를 개선시키는 것으로 확인되었다(도 5). 또한, 해조류에서 분리되거나 해조류 발효에 사용되는 미생물인 B. longum나 S. thermophillus으로 발효한 톳 발효물과 비교해서도, Weissella sp. SH-1으로 발효한 톳 발효물의 추출물히 더 우수한 NO 생성 억제 효과 즉, 항염 효과가 확인되었다(도 6). 구체적으로, 톳 미생물 발효 추출물을 처리한 군 중에서, 미생물 발효 처리를 하지 않은 톳 추출물과 비교한 결과, 낮은 농도에서 NO 생성 억제 효과가 그다지 개선되지 않은 B. longum나 S. thermophillus로 발효시킨 경우, 특히 오히려 더 낮은 것으로 확인된 B. longum으로 발효시킨 발효물과 달리 Weissella sp. SH-1로 발효시킨 발효물의 추출물은 모든 농도에서 우수한 개선 효과가 확인되었다(도 6).
이러한 측면에서, 톳을 발효시키는 경우, 웨이셀라 속 SH-1 균주로 발효시키는 것이, 최종 산물인 발효물의 발효 제조수율도 우수하고, 항염 효과도 우수하여, 기능성 개선뿐만 아니라 경제적인 측면에서도 가장 바람직한 것으로 확인되었다.
상기 가장 우수한 발효 균주로 선발된 상기 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1)에 대해 대한민국 서울시 서대문구에 위치한 한국미생물보존센터에 2016년 2월 12일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM 11813P를 부여받았다.
Claims (9)
- 김치로부터 분리된 웨이셀라 속 균주로, 상기 균주를 톳에 접종하고 발효를 수행하는 경우, 톳의 발효물의 항염 활성을 개선하는 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 톳에 접종하고 발효시켜 톳 발효물을 제조하는 톳 발효물 제조단계; 및 상기 제조된 톳 발효물에 에탄올을 첨가하고 추출하여 톳 발효물 에탄올 추출물을 제조하는 톳 발효물 추출물 제조단계
를 포함하는 항염 활성을 갖는 톳 발효물의 추출물 제조방법. - 제1항의 제조방법에 있어서,
상기 톳 발효물 제조단계는 톳(Hizikia fusiformis) 분말을 포함하는 용액에 상기 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 접종하고 발효시켜 톳 발효액을 제조하는 톳 발효액 제조과정 및 상기 톳 발효액을 건조시켜 톳 발효물을 제조하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 항염 활성을 갖는 톳 발효물의 추출물 제조방법. - 제2항의 제조방법에 있어서,
상기 톳 발효액 제조과정은 물에 톳(Hizikia fusiformis) 건조 분쇄물 5%(w/v), 포도당(glucose) 1%(w/v) 및 젖산(lactate) 0.5%(w/v)을 첨가하고 혼합시킨 톳 용액에 상기 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 접종하고 발효시켜 톳 발효액을 제조하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 것인 항염 활성을 갖는 톳 발효물의 추출물 제조방법. - 제3항의 제조방법에 있어서,
상기 톳 발효액 제조과정은 상기 톳 용액에 상기 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P)을 접종하고 30℃에서 30일 동안 발효시켜 톳 발효액을 제조하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 것인 항염 활성을 갖는 톳 발효물의 추출물 제조방법. - 제1항의 제조방법에 있어서,
상기 톳 발효물 추출물 제조단계는 상기 제조된 톳 발효물에 톳 발효물 100 중량부를 기준으로 900 내지 1,000 중량부의 에탄올을 첨가하고 80℃에서 추출하여 톳 발효물 에탄올 추출물을 제조하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 것인 항염 활성을 갖는 톳 발효물의 추출물 제조방법. - 제1항의 제조방법에 의해 제조된 톳 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물.
- 김치로부터 분리된 웨이셀라 속 균주로, 상기 균주를 톳에 접종하고 발효를 수행하는 경우, 톳의 발효물의 항염 활성을 개선하는 기탁번호 KCCM 11813P인 웨이셀라 속 SH-1(Weissella sp. SH-1, KCCM 11813P) 균주.
- 제7항의 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 배양물의 농축액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 항염 활성을 가진 톳의 발효물 제조용 생촉매(biocatalyst).
- 제8항의 톳의 발효물 제조용 생촉매를 톳에 첨가하고 발효시키는 단계를 포함하는 항염 활성이 개선된 톳의 발효물의 제조방법.
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| KR1020160048502A KR20170120269A (ko) | 2016-04-21 | 2016-04-21 | 항염 활성을 가진 톳 발효물의 제조방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200046398A (ko) | 2018-10-24 | 2020-05-07 | 목포대학교산학협력단 | 지충이 추출물을 유효성분으로 포함하는 장 건강 개선용 조성물 |
-
2016
- 2016-04-21 KR KR1020160048502A patent/KR20170120269A/ko active Search and Examination
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