KR20200015524A

KR20200015524A - 박테리아 협막 폴리사카라이드 기반 제제로부터의 불순물의 제거 방법

Info

Publication number: KR20200015524A
Application number: KR1020197035993A
Authority: KR
Inventors: 라지브 말라사칸트 데레; 삼바지 산카르 피살; 다타트레야 사르마 안남라주
Original assignee: 세럼 인스티튜트 오브 인디아 프라이비트 리미티드
Priority date: 2017-05-05
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2020-02-12
Also published as: US20240026405A1; JP2020518707A; AU2018262438B2; UA125937C2; CN110831980B; CA3062399A1; EA201992636A1; JP7319929B2; EP3619241A1; KR102565771B1; MD20190088A2; MX2023013110A; CU20190090A7; JP2023017929A; WO2018203268A1; GEP20227408B; BR112019022868A2; AU2018262438A1; ZA201908038B; US20200190549A1

Abstract

본 발명은 박테리아 협막 폴리사카라이드, 보다 특히 그람 음성 박테리아의 협막 폴리사카라이드를 정제하는 개선된 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 수거물을 농축 및 투석여과하고, 음이온성 세제 및 강한 알칼리로 처리한 후, 원심분리하고, 투석여과하고, 박테리아 폴리사카라이드를 양이온성 세제에 기반하여 침전시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 내독소, 단백질 및 핵산 불순물을 상당히 감소시키므로 목적하는 O-아세틸 수준을 갖는 협막 폴리사카라이드의 더 높은 회수를 제공한다. 상기 방법은 확장 가능하고, 비-효소적이며, 더 적은 정제 단계를 필요로 한다.

Description

박테리아 협막 폴리사카라이드 기반 제제로부터의 불순물의 제거 방법

본 발명은 광범위하게는 생명공학 분야에 속하며, 구체적으로 박테리아 협막 폴리사카라이드 정제를 위한 수거 및 다운스트림 처리에 관한 것이다.

나이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis)는 뇌 및 척수를 둘러싼 막 (수막) 및 뇌척수액 (CSF) 감염의 주요 원인으로 전 세계적으로 사망 및 장애를 초래한다.

수막구균으로도 알려진 나이세리아 메닌기티디스는 그람 음성 박테리아이다. 폴리사카라이드 협막의 구조에 따라, 엔. 메닌기티디스의 13개의 혈청군이 동정되었으며, 이 중 6개의 혈청군 (A, B, C, W, X 및 Y)은 유행병을 일으킬 가능성이 있다 (참조: Lee Harrison et al 2011).

수막염은 전 세계의 작은 집단들에서 발생하며 다양한 비율의 유행성 박테리아 수막염이 계절적으로 발생한다. 수막구균성 질환의 가장 큰 부담은 아프리카 대륙, 특히 수막염 벨트로 공지된 사하라 이남의 아프리카에서 관찰되었다. "질병관리예방센터 (CDC)" 및 "세계보건기구"는 2000년에 수막구균성 질환이 전 세계적으로 171,000명의 사망을 초래한 것으로 추정하였다. 또한, CDC 보고서는 미국의 어린이 및 청년에서 수막염 및 패혈증의 주요 원인으로 나이세리아 메닌기티디스의 출현을 입증한다. 따라서, 나이세리아 메닌기티디스는 선진국 및 개발 도상국 둘 다에서 여전히 공중 보건 문제이다.

1996-1997년, 질환 건수가 250,000을 초과하고 사망자가 25,000명이 넘는 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 A에 의한 유행병이 보고되었으며; 세계 보건 공동체는 아프리카에서 그룹 A 수막염 유행병을 제거할 백신 개발을 약속할 것을 촉구한다.

2010년, 수막구균 A 폴리사카라이드 접합체 백신, 즉 메나프리박 (Menafrivac)이 아프리카 대륙에 성공적으로 도입되어 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 A에 의해 야기되는 유행병이 거의 사라졌다. 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 A의 영향이 감소함에 따라, Men-C, Men-W, Men-X 및 Men-Y와 같은 다른 수막구균 혈청군의 영향이 증가하고 있다. 이러한 극적인 효과에 대응하기 위해, 상기 언급된 혈청군을 포함하는 다양한 1가 및 다가 백신이 개발되어 시판되고 있다. 다가 A, C, Y 및 W 접합체 백신이 2005년 이후 캐나다, 미국 및 유럽에서 어린이 및 성인에서의 사용이 허가되었으며 (메낙트라 (Menactra)®, 멘베오 (Menveo)®); 이들은 시장에서 매우 높은 비용으로 이용 가능하므로 세계 다른 지역사회에서는 감당할 수 없다.

혈청군 A 협막은 O-아세틸환된 (α1-6)-연결된 N-아세틸-만노스아민-1-포스페이트의 반복 단위로 구성된다. 혈청군 B, C, W 및 Y의 협막 폴리사카라이드는 시알산 유도체로 구성되며; 혈청군 B 및 C는 (α2 → 8)- 및 (α2 → 9)-연결된 시알산 단독중합체를 나타내고, d-갈락토스 또는 d-글루코스 및 시알산의 교대 서열은 혈청군 W 및 Y에 의해 나타내어진다. 발효 브로쓰의 오염물은 협막 폴리사카라이드에 존재하는 반복 모이어티와 상이하게 상호작용한다. 따라서, 상이한 혈청군으로부터 상이한 박테리아 협막 폴리사카라이드를 단리하기 위해 이들 차이를 이용하는 공정이 필요하다.

수막구균 접합체 백신에 관한 WHO 기술 보고서 시리즈에 따라, 하기 사양이 단리된 폴리사카라이드에 의해 충족되어야 한다:

<표 1>

백신에 사용되는 박테리아 협막 PS의 고전적인 정제 공정은 에탄올 및/또는 양이온성 세제로의 몇몇 선택적 침전에 이어 연속 원심분리, 초원심분리 및 페놀로의 단백질제거를 포함한다.

혈청군 A, B 및 C로부터 나이세리아 메닌기티디스 폴리사카라이드의 단리에 대한 최초의 문헌은 고쉴리크 등 (Gotschlich et al (1969))에 의해 공개되었다. 고쉴리크 등은 양이온성 세제 세카블론 (Cetavlon: 헥사데실 트리메틸암모늄 브로마이드)을 사용하여 전체 배양물로부터 음으로 하전된 폴리사카라이드를 빠르게 침전시키고 이어 0.9 M CaCl₂ 추출 및 원심분리를 이용하여 세제-폴리사카라이드 복합체를 해리시켰으며, 핵산 제거에 대해 에탄올 침전 기술을 이용하였으며, 단백질은 아세트산나트륨으로 폴리사카라이드를 처리하고 이어 클로로포름-함유 부탄올로 균질화하여 제거되었으며, 뜨거운 페놀-물 혼합물의 대안적인 사용도 보고된다. 최종 정제 방법은 에탄올 (4-5회) 및 아세톤으로의 폴리사카라이드 침전을 수반하였다. 이 방법은 클로로포름 및 다량의 에탄올을 사용하는 불편함을 수반한다 (참조: T.P. Pato, Master's thesis, Instituto de Quimica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2003, p. 95).

타니자키 등 (Tanizaki et al.)은 나이세리아 메닌기티디스 C 폴리사카라이드에 대한 정제 공정을 보고하였으며, 여기서 페놀 추출은 프로테이나제 K, 나가르제 및 트립신의 혼합물을 사용하는 프로테이나제 분해로 대체되었으며; 초원심분리 대신 중공 섬유 100 kDa 컷-오프에서의 접선 초미세여과; 이어 100 kDa 컷-오프 막을 사용하는 광법위한 투석여과가 0.5%의 데옥시콜레이트를 함유하는 20 mM 트리스-HCl 완충액에서 수행되어 저분자량 단백질 및 리포폴리사카라이드 (LPS)를 제거하였다. 상기 변형의 사용에도 불구하고, 단리된 폴리사카라이드 제제는 각각 2% (w/w) 및 1.5% (w/w)의 단백질 및 핵산 값을 함유하였다 [참조: Tanizaki et al; Journal of Microbiological Methods Volume 27, Issue 1, September 1996, Pages 19-23 & Goncalves et al 2007;Formatex; Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology].

티피 파토 등 (TP Pato et al (2006))은 세포 제거를 위한 배양물의 연속적인 유동 원심분리; 접선 여과 (100 kDa 컷-오프)에 의한 상청액 농축; 0.5% DOC의 첨가, 30분 동안 55℃로 가열 및 접선 여과 (100 kDa 컷오프); 음이온 교환 크로마토그래피 (소스 (Source) 15Q) 및 크기 배제 크로마토그래피 (세파로스 CL-4B)를 포함하는 나이세리아 메닌기티디스 C 폴리사카라이드에 대한 변형된 정제 공정을 개시한다 [참조: T.P. Pato et al./J. Chromatogr. B 832 (2006) 262-267].

US7491517B2는 나이세리아 메닌기티디스 C 폴리사카라이드의 정제 동안 불순물 제거를 위한 CTAB, 에탄올, 프로테이나제 K, 활성탄 및 겔 여과의 사용을 개시한다. 그러나, 이러한 다단계 공정은 폴리사카라이드 회수 손실을 초래하고 사용된 활성탄은 바람직하지 않은 침출물을 야기할 수 있다.

WO2017006349는 엔. 메닌기티디스 수거된 추출물로부터 단백질 오염물을 제거하기 위한 아세트산아연/황산암모늄/시트르산나트륨의 사용을 개시한다. 또한, 이는 잔류 단백질 및/또는 핵산 물질의 분해를 위한 벤조나제, 프로테이나제 K 또는 나르가제와 같은 효소의 사용, 이어 크로마토그래피 정제를 개시한다.

WO2015128798A1은 나이세리아 메닌기티디스 C 폴리사카라이드로부터 불순물을 제거하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 나트륨 데옥시콜레이트 또는 HEPES와 같은 음이온성 세제의 존재 하에 50-60℃에서 인큐베이션, 50℃에서 30분 내지 10시간 동안 0.5-1.5 M NaOH를 사용한 조 (crude) 폴리사카라이드의 탈아세틸화, 및 투석여과 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의한 추가 정제를 이용한다.

티안 (Tian) 등은 CTAB, 에탄올, DOC, 캅토 어드히어 (Capto Adhere) (다중모드 음이온 교환 크로마토그래피), 캅토 DEAE (약한 음이온) 및 세파덱스 G25의 사용을 포함하는 나이세리아 메닌기티디스 C, W 및 Y 혈청군 폴리사카라이드의 정제 방법을 개시하며, 여기서 내독소 함량은 25 EU/mg 미만, 단백질 함량은 10 mg/g 미만, 핵산 함량은 1-7mg/g이다 [참조: Tian et al 2013 GE Healthcare; Application note, 29216880 AA].

다단계 공정인 고쉴리크 절차는 생성물 회수의 실질적인 손실, 즉 약 37%를 초래한다. 또한, 페놀과 같은 화학물질을 사용하면 폴리사카라이드 또는 단백질 캐리어에 원치않는 구조적 변화가 초래될 수 있으며 또한 바람직하지 않은 페놀성 독성 폐기물이 생성된다.

US7491517B2, WO2017006349 및 티피 파토 등 (TP Pato et al (2006))의 절차는 단백질 및 핵산 오염물의 분해를 돕는 효소를 사용하지만, 효소 및 가수분해된 물질의 제거는 어려운 과제이며 관심 생성물의 손실을 초래할 수 있다. 또한, 규제 기관은 프리온으로 오염될 위험 때문에 인간을 위한 제품에 동물 효소의 사용을 제한하였다. 효소의 사용은, 고비용 외에, cGMP 프레임워크에서 더 많은 규제 문제, 예컨대 효소의 기원 (동물 또는 재조합 유래), 상이한 판매지와 로트 간의 효소 활성 변화 등을 야기할 것이다.

WO2017006349 및 US4686102A는 단백질 및 핵산 오염물의 침전을 위한 황산암모늄의 사용을 개시한다. 그러나, 이는 때때로 협막 폴리사카라이드를 침전시켜 총 폴리사카라이드가 손실된다.

나트륨 데옥시콜레이트 (DOC)는 약한 세제이며, 폴리사카라이드 정제에서 가장 일반적으로 사용되는 세제 중 하나이다. 코어 스테로이드 구조를 갖는 나트륨 데옥시콜레이트는 변성이 적고 이의 가용화 강도가 제한되어 있으며; 화학 구조에 영향을 미치지 않으면서 내독소를 파괴하며; 따라서, 나트륨 데옥시콜레이트의 제거 시, 내독소는 생물학적 활성을 회복한다. 또한, DOC 기반 절차는 폴리사카라이드, 특히 시알산 함유 폴리사카라이드로부터 오염물을 제거하는데 효율적으로 작동하지 않는다. 이는 다운스트림 처리 동안 형성된 리포폴리사카라이드-단백질 연합에 대한 DOC의 약한 세제 활성에 기인할 수 있으며, 이로써 최종의 단리된 폴리사카라이드에 높은 수준의 내독소 및 단백질 함량을 초래한다. 추가로, 나트륨 데옥시콜레이트는 동물-기원 생성물이며, 심지어 최종 제품에서 이의 잔류에 의해 규제 기관 및 특정 종교 단체는 제품을 받아들이지 않을 수 있다.

크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 기술은 단백질 및 핵산 오염물의 효과적인 제거와 함께 박테리아 폴리사카라이드를 단리하는데 성공적으로 사용되어 왔다. 크로마토그래피 기술은 박테리아 폴리사카라이드를 WHO 사양으로 성공적으로 단리하지만, 이의 사용은 다단계 노동 및 시간이 걸리는 샘플 준비를 수반하고, 확장성 문제를 포함하며, 협막 폴리사카라이드의 회수를 크게 손상시키므로 산업 규모 다운스트림 처리에 적합한 저렴한 옵션이 아니다.

생물학적 제제의 다운스트림 처리는 총 생산 비용의 20%-80%에 대한 근본 요인이며 (Ansejo and Patrick, 1990), 새로운 다운스트림 전략의 개발은 생산 비용을 줄이고 공중 보건 시스템에 의해 전체 인구에게 백신의 배포를 가능하게 하는데 필수적이다.

현재, 정제된 형태의 폴리사카라이드를 수득하기 위해 이용되는 방법은 몇몇 단계의 세제 처리 및 에탄올과 같은 유기 용매를 사용한 수거 브로쓰의 분별 침전을 포함한다.

그러나, 하기 2가지의 주요 제약에 따라 대안적 정제 방법을 찾아야 한다.

현재, 불순물 (단백질, 핵산 및 내독소)의 초기 제거 단계로서 음이온성 세제 나트륨 데옥시콜레이트 (DOC)가 사용된다. DOC는 코어 스테로이드 구조를 갖는 동물 기원 담즙-세제이다. 이의 큰부피 구조로 인해, 생물학적 거대분자에 대해 제한된 가용화 세기 및 적은 변성 능력을 갖는다. 또한, 필수 규제 인증을 갖는 이의 지속적인 공급이 단일 판매자/공급자로 제한된다.

에탄올을 많이 소비하고 중복 단계 (탄소 여과)를 포함하면 공정이 지루하고 시간 소모적이며 비용이 많이 든다.

더 높은 폴리사카라이드 회수를 얻기 위해 박테리아 폴리사카라이드를 정제하기 위한 대안적이고 간단하고 확장 가능하며 비용-효과적인 방법이 여전히 상당히 필요하다. 본 발명은 박테리아 협막 폴리사카라이드의 단리를 위한 강력하고 저렴한 다운스트림 정제 공정을 제공하며, 여기서 상기 공정은 내독소, 단백질 및 핵산 불순물을 현저하게 감소시킴으로써 더 높은 폴리사카라이드의 회수 및 WHO 사양에 따른 목적하는 O-아세틸 수준 유지를 가능하게 한다.

본 발명은 박테리아 협막 폴리사카라이드, 보다 구체적으로 엔. 메닌기티디스의 협막 폴리사카라이드에 대한 대안적인 정제 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 수거물을 100 kD 접선 유동 여과를 통해 농축 및 투석여과한 후 단백질, 핵산 및 리포폴리사카라이드의 변성을 위해 음이온성 세제 및 강한 알칼리를 첨가하는 것을 포함한다. 이후, 생물학적 추출물을 원심분리하고, 투석여과하고, 박테리아 폴리사카라이드를 CTAB에 기반하여 침전시킨다. 상기 방법은 개선된 폴리사카라이드 회수를 초래하고, 확장 가능하고, 비-효소적이며, 비용 효율적인 더 적은 수의 정제 단계를 필요로 한다. 상기 방법은 내독소, 단백질 및 핵산 불순물을 상당히 감소시키므로, 폴리사카라이드의 더 높은 회수 및 목적하는 O-아세틸 수준의 유지를 가능하게 한다.

i. 도 1: Men-C 폴리사카라이드의 NMR 스펙트럼
ii. 도 2: Men-Y 폴리사카라이드의 NMR 스펙트럼
iii. 도 3: Men-W 폴리사카라이드의 NMR 스펙트럼
iv. 도 4: Men-A 폴리사카라이드의 NMR 스펙트럼
v. 도 5: Men-X 폴리사카라이드의 NMR 스펙트럼

본 발명의 일반적 측면에 따라, 관심의 박테리아 혈청군 중 하나를 적합한 배지에서 성장시키고 포름알데하이드 또는 종래 기술에서 임의의 일반적으로 공지된 방법을 이용하여 불활성화시키고; 추가로 정제된 협막 폴리사카라이드의 단리를 위한 다운스트림 처리를 수행한다. 본 발명의 협막 폴리사카라이드의 단리를 위한 관심 박테리아는 에쉐리키아, 나이세리아, 해모필루스, 슈도모나스 등을 포함하나 이로 제한되지 않는 속으로부터 선택되는 그람 음성 박테리아로부터 수득되었다; 보다 바람직하게는, 나이세리아 메닌기티디스의 혈청군에 의해 나타내어지는 협막 폴리사카라이드. 본 발명의 다른 측면에서, 폴리사카라이드는 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori), 클라미디아 뉴모니애 (Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 우레아플라스마 우레알리티쿰 (Ureaplasma urealyticum), 미코플라스마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae), 스타필로코쿠스 종 (Staphylococcus spp.), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 종 (Streptococcus spp.), 그룹 A 스트렙토코쿠스 (Group A Streptococcus), 그룹 B 스트렙토코쿠스 (Group B Streptococcus) Ia, Ib, II, III, V, VI, 또는 VIII; 그룹 C 스트렙토코쿠스 (Group C Streptococcus), 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 아갈락티애 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 디스갈락티애 (Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코쿠스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 비리단스 (Streptococcus viridans), 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 나이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis), 나이세리아 고노르호에애 (Neisseria gonorrhoeae), 바실루스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 살모넬라 종 (Salmonella spp.), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 비브리오 콜레래 (Vibrio cholerae), 파스퇴렐라 페스티스 (Pasteurella pestis), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 캄필로박터 종 (Campylobacter spp.), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 클로스트리듐 종 (Clostridium spp.), 클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile), 미코박테리움 종 (Mycobacterium spp.), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 트레포네마 종 (Treponema spp.), 보렐리아 종 (Borrelia spp.), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 렙토스피라 종 (Leptospira spp.), 헤모필루스 두크레이 (Hemophilus ducreyi), 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria), 보르데텔라 페르투씨스 (Bordetella pertussis), 보르데텔라 파라페르투씨스 (Bordetella parapertussis), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 헤모필루스 인플루엔재 (Hemophilus influenzae), 에쉐리키아 콜리 (Escherichia coli), 쉬겔라 종 (Shigella spp.), 에를리치아 종 (Ehrlichia spp.) 및 리케차 종 (Rickettsia spp.)을 포함하는 군으로부터 유래될 수 있다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 유형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9A, 9F, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B, 38 및 45의 폴리사카라이드; 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 A, B, C, D, W135, X, Y, Z, 29E의 폴리사카라이드; 및 에이치. 인플루엔재 유형 b.

실험 동안 사용된 생물학적 물질은 하기와 같았다:

폴리사카라이드는 하기로부터 단리되었다:

<표 2>

접합되지 않은 캐리어 단백질, 즉 CRM197 또는 TT. CRM197은 페넥스 USA (Pfenex USA)로부터의 슈도모나스 플루오레슨스 (Pseudomonas fluorescens)의 재조합 균주 CS463-003 (MB101)으로부터 유래되었다. TT는 CRI (국립통제청, 인도 히마찰 프라데시 카사울리)으로부터 수득된 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani) (하버드 번호 49205)로부터 유래되었다. CRI는 이 균주를 NVI (네델란드)로부터 입수하였다.

본 발명의 제1 실시양태에서 따라, 박테리아 협막 폴리사카라이드를 원심분리를 이용하여 불활성화된 수거물로부터 정화하고; 상청액을 100 kD 접선 유동 여과 유닛을 사용하여 투석여과하였다. 박테리아 협막 폴리사카라이드의 농축을 위해 원심분리 및 투석여과 대신 임의의 다른 적합한 방법을 이용할 수 있다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 매우 잘 이해된다. 이 실시양태의 바람직한 측면 중 하나에서, 협막 폴리사카라이드는 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 A, C, W, Y & X로부터 유래되었다.

본 발명의 제2 실시양태에 따라, 제1 실시양태에서 수득된 잔류물을 음이온성 계면활성제/세제로 처리하였다. 음이온성 세제는 알킬 술페이트, 나트륨 도데실 술페이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 도데실 술포네이트, 나트륨 s-알킬 술페이트, 나트륨 지방 알콜 폴리옥시에틸렌 에테르 술페이트, 나트륨 올레일 술페이트, N-올레오일 폴리(아미노산) 나트륨, 나트륨 알킬벤젠 술포네이트, 나트륨 .알파.-올레핀 술포네이트, 나트륨 알킬 술포네이트, 알파-술포 모노카르복실산 에스테르, 지방산 술포알킬 에스테르, 숙시네이트 술포네이트, 알킬 나프탈렌 술포네이트, 나트륨 알칸 술포네이트, 나트륨 리그닌술포네이트, 및 나트륨 알킬 글리세릴 에테르 술포네이트를 포함하는 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 상기 음이온성 계면활성제는 알킬 술페이트, 보다 바람직하게는 나트륨 도데실 술페이트이며, 0.1% 내지 4%의 범위, 보다 바람직하게는 1%의 최종 농도로 잔류물에 첨가하였으며, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. SDS의 양친매성 특성은 단백질을 파괴할 뿐만 아니라 그들을 용해시키는 강력한 카오트로픽제이도록 한다.

제2 실시양태의 또 다른 측면에서, 불활성화된 수거물을 음이온성 계면활성제로 직접적으로 처리하고 추가로 협막 폴리사카라이드를 농축시켜 불순물을 충분히 감소시킴으로써 양이온성 세제를 사용하는 후속 단계를 필요하지 않게 할 수 있다.

본 발명의 제3 실시양태에 따라, 강한 알칼리를 상기 실시양태로부터 수득된 혼합물에 첨가하였으며, 실온에서 1시간 동안 일정하게 교반하면서 pH를 9-11로 조절하였다. 상기 강한 알칼리는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 히드록실 아민, 트리에틸 아민 및 수산화리튬을 포함하는 군으로부터 선택되었다.

본 발명의 제3 실시양태의 바람직한 측면에 따라, 상기 강한 알칼리, 즉 수산화나트륨을 상기 실시양태에 따라 수득된 혼합물에 5-20 M의 최종 농도로 첨가하였으며 실온에서 1시간 동안 일정하게 교반하면서 pH 10.5로 조절하였다.

본 발명의 제3 실시양태의 또 다른 측면에서, 대안적으로, 알칼리 대신에, EDTA 및 아세트산나트륨을 실온에서 1시간 동안 일정하게 교반하면서 제2 실시양태로부터 수득된 혼합물에 첨가하였다.

본 발명의 제4 실시양태에 따라, 상기 실시양태로부터 수득된 용액을 약한 유기산을 첨가함으로써 중화시켰다 (pH 7.0). 상기 약한 유기산은 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산 등을 포함하는 하나 이상의 산의 조합이다. 이러한 중화된 혼합물에, 친수성 알콜, 바람직하게는 에탄올을 30-35%의 최종 농도로 첨가하고 2시간 (couple of hours) 동안 실온에서 일정하게 교반하면서 인큐베이션하였다. 친수성 알콜은 메탄올, 에탄올, n-프로필 알콜, 이소프로필 알콜, 아세톤, 및 t-부틸 알콜 중 하나; 또는 이의 2개 이상의 조합으로부터 선택되며; 이의 농도는 <65% 또는 >95%이다.

본 발명의 제5 실시양태에 따라, 과량의 음이온성 세제를 용액으로 제거하였다. 상기 실시양태로부터 수득된 용액을 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 0.1 M 칼륨 염을 상청액과 혼합하고, 이의 용해 시, 혼합물을 2-8℃에서 >3시간 동안 인큐베이션하였다. 칼륨 염은 염화칼륨, 아세트산칼륨, 황산칼륨, 탄산칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 인산수소칼륨, 인산이수소칼륨, 질산칼륨, 및 다른 칼륨 염 중 하나, 또는 이의 2개 이상의 조합으로부터 선택된다. 이 단계는 칼륨 도데실 술페이트의 낮은 용해도를 이용한다. 칼륨 염, 바람직하게는 KCl 첨가 시, 용액 중의 SDS는 가용성이 덜하고 쉽게 침전되는 칼륨 도데실 술페이트로 전환되어, SDS의 완전한 제거를 초래한다. KCl의 농도는 목적하는 결과를 얻기 위해 변할 수 있다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 매우 잘 이해된다. 본 발명의 이 실시양태에서 언급된 프로토콜은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의한 요구에 따라 변형될 수 있다.

제5 실시양태의 또 다른 측면에서, 과량의 음이온성 세제를 겔 여과, 에탄올 침전, 및 이온 교환 수지/엠버라이트 컬럼을 이용하여 용액으로부터 제거할 수 있다.

본 발명의 제6 실시양태에 따라, 상기 실시양태로부터 수득된 용액을 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 상청액을 0.2 μ 필터를 통과시키고, 잔류물을 100 kDa 접선 유동 여과를 통해 투석여과하였다.

본 발명의 제7 실시양태에 따라, 상기 실시양태로부터 수득된 잔류물을 25 mM의 최종 농도의 트리스-HCl 완충액을 사용하여 투석여과하였다. 이어서, 양이온성 세제를 1-2%의 최종 농도로 첨가하고, RT에서 1시간 동안 일정하게 교반하면서 인큐베이션하였다. 양이온성 세제(들)는 세틸트리메틸암모늄 염, 테트라부틸암모늄 염, 미리스틸트리메틸암모늄 염 및 헥사디메트린 브로마이드 중 하나; 또는 이의 2개 이상의 조합으로부터 선택된다. 양이온성 세제의 농도는 목적하는 결과를 얻기 위해 0.1% 내지 4% 범위에서 변할 수 있다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 매우 잘 이해된다. 바람직하게는, 양이온성 세제는 CTAB이다.

본 발명의 제8 실시양태에 따라, 상기 실시양태로부터 수득된 용액을 원심분리하고 침전된 CTAB-폴리사카라이드를 수집하고 30-64% 에탄올에 용해시킬 수 있다. 용해되지 않은 잔사를 제거하기 위해 용해된 혼합물을 추가로 원심분리할 수 있다.

본 발명의 제9 실시양태에 따라, NaCl을 상기 실시양태로부터 수득된 상청액에 일정하게 교반하면서 0.1 M의 최종 농도로 첨가하였다. 침전된 폴리사카라이드를 수집하고 1 M NaCl에 용해시킨 후 알콜 침전시켰다 (30-64%).

본 발명의 제10 실시양태에 따라, 상기 실시양태로부터 수득된 용액을 100 kDa 접선 유동 여과를 이용하여 WFI (주사용수)에 의해 광범위하게 투석여과하고, 0.2 μ 필터를 통과시키고, -20℃ 이하에서 최종 벌크로서 저장하였다.

본 발명의 제11 실시양태에 따라, 엔. 메닌기티디스 혈청군 C, W 및 Y의 정제된 협막 폴리사카라이드를 하기 절차에 따라 수득하였다:

ㆍ엔. 메닌기티디스의 혈청군 C, W 및 Y를 각각 적합한 배지에서 성장시키고 포름알데하이드를 사용하여 불활성화시켰다;

ㆍ나트륨 도데실 술페이트를 1%의 최종 농도로 이러한 불활성화된 수거물에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다;

ㆍ수산화나트륨을 05-20 mM의 최종 농도로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 일정하게 교반하면서 pH 10.5로 조절하였다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 약한 유기산, 즉 아세트산을 첨가함으로써 중화시켰다.

ㆍ이러한 중화된 용액에 에탄올을 30-35%의 최종 농도로 첨가하고 2시간 동안 일정하게 교반하면서 인큐베이션하였다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 원심분리하고 상청액을 수집하였다.

ㆍ0.1 M KCL을 상청액에 첨가하고 2-8℃에서 3시간 이상 동안 인큐베이션하였다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 상청액을 0.2 μ 필터를 통과시키고 잔류물을 100 kDa MWCO 필터 접선 유동 여과를 통해 트리스-HCl 완충액을 사용하여 투석여과하였다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 잔류물에 트리스-HCl 완충액을 25 mM의 최종 농도로 첨가한 후; 추가로 CTAB를 2%의 최종 농도로 첨가하고; RT에서 1시간 이상 동안 인큐베이션하였다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 원심분리하고 침전물을 수집하고 30-64% 에탄올에 용해시켰다. 용해되지 않은 잔사를 제거하기 위해 용해된 혼합물을 추가로 원심분리하였다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 상청액에 NaCl을 0.1-0.3 M의 최종 농도로 첨가하였다. 침전된 PS를 1 M NaCl에 용해시킨 후 30-64% 알콜 침전시켰다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 100 KDa 접선 유동 여과를 이용하여 WFI에 대해 투석여과하고 0.2 μ 필터를 통과시키고 최종 벌크로서 -20℃에서 저장하였다.

본 발명의 제12 실시양태에 따라, 제11 실시양태에서 언급된 정제 공정은 하기를 제공한다:

ㆍ내독소 함량이 50 EU/mg 미만이고 단백질 함량이 0.50% 미만이고 핵산 함량이 0.20% 미만인, 60-80%의 회수율을 갖는 엔. 메닌기티디스 혈청군 C 폴리사카라이드.

ㆍ내독소 함량이 50 EU/mg 미만이고 단백질 함량이 0.50% 미만이고 핵산 함량이 0.30% 미만인, 60-80%의 회수율을 갖는 엔. 메닌기티디스 혈청군 Y 폴리사카라이드.

ㆍ내독소 함량이 50 EU/mg 미만이고 단백질 함량이 0.5% 미만이고 핵산 함량이 0.2% 미만인, 60-80%의 회수율을 갖는 엔. 메닌기티디스 혈청군 W 폴리사카라이드.

본 발명의 제13 실시양태에 따라, 엔. 메닌기티디스 혈청군 A & X의 정제된 협막 폴리사카라이드를 하기 절차에 따라 수득하였다:

ㆍ엔. 메닌기티디스의 혈청군 A & X를 각각 적합한 배지에서 성장시키고 포름알데하이드를 사용하여 불활성화시켰다;

ㆍEDTA & 아세트산나트륨을 이러한 불활성화된 수거물에 1%의 최종 농도로 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다;

ㆍ에탄올을 30-35%의 최종 농도로 첨가하고 일정하게 교반하면서 2시간 동안 인큐베이션하였다.

ㆍ0.1 M KCL을 상청액에 첨가하고 2-8℃에서 >3시간 동안 인큐베이션하였다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 상청액을 0.2 μ 필터를 통과시키고 잔류물을 100 kDa MWCO 접선 유동 여과를 통해 25 mM 트리스-HCl를 사용하여 농축 및 투석여과하였다.

ㆍCTAB를 1-2%의 최종 농도로 첨가하고; RT에서 1시간 이상 동안 인큐베이션하였다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 100 kDa 접선 유동 여과를 이용하여 WFI에 대해 광범위하게 투석여과하고 0.2 μ 필터를 통과시키고 최종 벌크로서 -20℃ 이하에서 저장하였다.

본 발명의 제14 실시양태에 따라, 제13 실시양태에서 언급된 정제 공정은 하기를 제공한다:

ㆍ내독소 함량이 50 EU/mg 미만이고 단백질 함량이 0.50% 미만이고 핵산 함량이 0.20% 미만인, 60-80%의 회수율을 갖는 엔. 메닌기티디스 혈청군 A 폴리사카라이드.

ㆍ내독소 함량이 50 EU/mg 미만이고 단백질 함량이 0.50% 미만이고 핵산 함량이 0.30% 미만인, 60-80%의 회수율을 갖는 엔. 메닌기티디스 혈청군 X 폴리사카라이드.

본 발명의 제15 실시양태에 따라, 상기 정제된 폴리사카라이드는 캐리어 단백질에 접합된다. 폴리사카라이드와의 접합에 사용되는 캐리어 단백질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의한 요구에 따라 관련 기술분야에 공지된 임의의 캐리어 단백질일 수 있다는 것은 매우 잘 이해된다. 캐리어 단백질의 비-특정 예는 CRM197, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 페르투씨스 톡소이드, 이. 콜리 LT, E: 콜리 ST, 슈도모나스 아에루기노사로부터의 외독소 A, 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트란스페린 결합 단백질, 폐렴구균용혈소, 폐렴구균 표면 단백질 A (PspA), 폐렴구균 부착소 단백질 (PsaA), 폐렴구균 표면 단백질 BVH-3 및 BVH-11, 바실루스 안트라시스의 방어 항원 (PA), 탈독화된 부종 인자 (EF), 바실루스 안트라시스의 치사 인자 (LF), 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 인긴 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 (BSA) 및 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD)의 군으로부터의 캐리어 단백질을 포함하나 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 제15 실시양태의 다른 측면에서, 접합 전, 본 방법에 의해 정제된 폴리사카라이드를 초음파, 마이크로파, 오존분해, 이온화 방사선, 고압 세포 파괴, 균질화기, 미세유동화기, 아세트산나트륨, 메타과아이오딘산나트륨, 진공 중 가열 등을 포함하나 이로 제한되지 않는 화학적 또는 기계적 수단에 의해 크기 분류하였다.

제15 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 방법에 의해 정제된 폴리사카라이드는 환원적 아미노화, 시아닐화, 카보디이미드 접합 화학을 이용하여 캐리어 단백질에 접합될 수 있다.

본 발명의 제16 실시양태에 따라, 면역원성 조성물을 제조하였다. 조성물은 하기를 포함하였다:

(a) (i) 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 A의 협막 사카라이드 및 (ii) 파상풍 톡소이드의 접합체;

(b) (i) 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 C의 협막 사카라이드 및 (ii) CRM197의 접합체;

(c) (i) 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 Y의 협막 사카라이드 및 (ii) CRM197의 접합체;

(d) (i) 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 W135의 협막 사카라이드 및 (ii) CRM197의 접합체; 및

(e) (i) 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 X의 협막 사카라이드 및 (ii) 파상풍 톡소이드의 접합체.

본 발명의 제17 실시양태에 따라, 내독소 함량은 "동역학 혼탁도 검정 (KTA)에 의한 박테리아 내독소 시험" 또는 토끼 발열원성 시험에 의해 측정될 수 있고; 단백질 함량은 로리 (Lowry) 방법에 의해 측정될 수 있고; 핵산 함량은 분광광도법에 의해 측정될 수 있다. 임의의 다른 적합한 방법이 내독소, 단백질 및 핵산 함량의 정량화에 이용될 수 있다는 것은 매우 잘 이해된다.

제17 실시양태의 또 다른 측면에서, 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 A, C, W, Y & X의 정제된 폴리사카라이드의 분자 크기 분포는 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 수행될 수 있다.

제16 실시양태의 또 다른 측면에서, O-아세틸 함량은 비색 헤스트린 (Hestrin) 검정을 이용하여 측정될 수 있다.

실시예:

실시예 1: 박테리아 폴리사카라이드의 생성 (엔. 메닌기티디스 혈청군 C의 업스트림 공정)

하기 언급된 발효 공정을 이용하여, 폴리사카라이드를 생성하였다.

발효 규모: 300 리터

ㆍ발효조의 제자리 세정 (CIP), 압력 유지 시험 및 제자리 멸균 (SIP)를 수행하였다.

ㆍSIP 완료 후, 멸균 발효 배지를 무균적으로 발효조로 옮겼다.

ㆍ배지 조성

혈청군 C 발효 배지

<표 3>

혈청군 C 피드 (feed) 배지

<표 4>

ㆍ용존 산소 수준을 목적하는 수준으로 조절하였다.

ㆍ발효 배지에 배양 유기체를 접종하였다. 발효조를 11 내지 14시간 동안 유가 배양 방식으로 작동시켰다.

ㆍ배양물이 590 nm에서 목적하는 OD에 도달한 후, 발효조의 배양물을 포름알데하이드를 사용하여 불활성화시켰다.

ㆍ인큐베이션 완료 후, 온도를 10 ± 5℃로 설정한 후 원심분리를 이용하여 세포를 분리하였다.

ㆍ상청액을 수집하고 심층 여과하고; 정화된 수거물을 0.2 μ 필터를 사용하여 여과시키고, 정제를 위해 옮겼다.

결과:

<표 5>

실시예 2: 협막 폴리사카라이드의 생성 (엔. 메닌기티디스 혈청군 A, W, X & Y의 업스트림 공정)

실시예 1에서 언급된 프로토콜을 이용하여, 엔. 메닌기티디스 혈청군 A, W, X & Y의 협막 폴리사카라이드를 생성하였다.

혈청군 Y 발효 배지

<표 6>

혈청군 Y 피드 배지

<표 7>

혈청군 W 발효 배지

<표 8>

혈청군 W 피드 배지

<표 9>

결과:

<표 10>

정화된 수거물을 수득하고, 시험 시 1-6 gm/l의 PS (폴리사카라이드) 함량이 관찰되었다. 이러한 정화된 수거물을 추가로 정제하였다.

실시예 3: SDS에 이어 알콜 침전을 이용하는 협막 폴리사카라이드의 정제 (엔. 메닌기티디스 혈청군 C의 다운스트림 공정)

실시예 1에 따라 수득된 조 폴리사카라이드를 다양한 농도의 SDS와 혼합하였다. 이어서, 에탄올을 폴리사카라이드가 침전되기 시작하는 농도보다 약 10% 낮은 최종 농도로 첨가하였다. 이를 추가로 여과시켰다.

시험된 SDS의 농도:

0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 및 10%

상기 언급된 모든 SDS 농도는 불순물 감소와 관련하여 효능을 나타내었다. 4% SDS 초과에서는 불순물 프로파일에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

최적의 불순물 감소, 특히 단백질은 1% SDS에서 관찰되었다.

정제된 폴리사카라이드는 폴리사카라이드 μg당 >100 EU의 내독소 불순물을 가진 반면, WHO 한계는 폴리사카라이드 μg당 <100 EU이다.

실시예 4: 협막 폴리사카라이드의 정제 (엔. 메닌기티디스 혈청군 C의 다운스트림 공정)

프로토콜:

5 L 및 300 L 발효 규모의 2개의 상이한 실험 세트를 수행하였다.

하기 언급된 정제 공정을 이용하여, 폴리사카라이드를 정제하였다.

ㆍ실시예 1에 따라 수득된 조 폴리사카라이드를 용기에 담았다.

ㆍ조 폴리사카라이드를 100 kDa 카세트를 사용하여 TFF에 의해 3-6배 농축하였다.

ㆍ나트륨 도데실 술페이트를 이러한 불활성화된 수거물에 1%의 최종 농도로 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다;

ㆍ수산화나트륨을 08-20 mM의 최종 농도로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 일정하게 교반하면서 pH 10.5로 조절하였다;

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 아세트산을 첨가하여 중화시켰다.

ㆍ이러한 중화된 용액에 에탄올을 33%의 최종 농도로 첨가하고 일정하게 교반하면서 2시간 동안 인큐베이션하였다.

ㆍ에탄올 농도를 40%로 증가시켰다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 에탄올의 최종 농도를 65%로 증가시킴으로써 폴리사카라이드를 침전시켰다.

ㆍ폴리사카라이드 펠렛을 1 M NaCl에 용해시켰다. 상청액을 0.2 μ 필터를 통과시키고 잔류물을 100 kDa 접선 유동 여과를 통해 25 mM 트리스-HCl 완충액을 사용하여 투석여과하여 정제된 폴리사카라이드를 수득하였다 (단계 I).

ㆍCTAB를 2%의 최종 농도로 첨가하고; RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 원심분리하고 침전물을 수집하고 96% 에탄올에 용해시켰다. 용해되지 않은 잔사를 제거하기 위해 용해된 혼합물을 추가로 원심분리하였다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 상청액에, NaCl을 0.2 M의 최종 농도로 첨가하였다. 침전된 PS를 1 M NaCl에 용해시킨 후 65% 알콜을 사용하여 PS 침전시켰다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 100 kD 접선 유동 여과를 이용하여 0.5 M NaCl에 이어 WFI에 대해 광범위하게 투석여과하고, 0.2 μ 필터를 통과시키고, 최종 벌크로서 -20℃에서 저장하였다.

결과:

<표 11>

참고: NA = 해당 사항 없음

음이온성 세제 및 알칼리의 조합 사용은 불순물 프로파일의 감소에 지대한 영향을 갖는 것으로 관찰되었다. 정제 단계 I & 단계 II에서의 불순물 수준은 Men-C 폴리사카라이드에 대해 WHO 사양 한계보다 훨씬 낮다.

5 L 및 300L 규모에서, 단백질 불순물 (%) = <1%; 핵산 불순물 (%) = <0.3%; 내독소 불순물 (EU/㎍의 PS) = <40EU/㎍의 PS.

두 규모에서 및 정제 단계 I & 단계 II에서, 조 샘플과 비교하여, 정제된 폴리사카라이드의 회수율은 60% 초과였다.

실시예 5: 협막 폴리사카라이드의 정제 (엔. 메닌기티디스 혈청군 W & Y의 다운스트림 공정)

프로토콜:

5 L 및 300L 발효 규모의 2개의 상이한 실험 세트를 수행하였다.

ㆍ실시예 2에 따라 수득된 조 폴리사카라이드를 용기에 담았다.

ㆍ0.1 M KCL을 상청액에 첨가하고 2-8℃에서 ~8시간 동안 인큐베이션하였다.

ㆍ상청액을 0.2 μ 필터를 통과시키고 잔류물을 100 kDa 접선 유동 여과를 통해 25 mM 트리스-HCl 완충액을 사용하여 투석여과하여 정제된 폴리사카라이드를 수득하였다 (단계 I).

ㆍ상기 단계로부터 수득된 상청액에, NaCl을 0.25 M의 최종 농도로 첨가하였다. 침전된 PS를 1 M NaCl에 용해시킨 후 65% 알콜을 사용하여 PS 침전시켰다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 용액을 100 kD 접선 유동 여과를 이용하여 WFI에 대해 광범위하게 투석여과하고, 0.2 μ 필터를 통과시키고, 최종 벌크로서 -20℃에서 저장하였다 (단계 II).

결과:

<표 12>

<표 13>

비교 시, 정제 단계 I & 단계 II에서 불순물 수준은 Men-Y & Men-W 폴리사카라이드에 대해 WHO 사양 한계보다 훨씬 낮은 것으로 관찰되었다.

5 L 및 300L 규모에서, 단백질 불순물 (%) = <3.5%; 핵산 불순물 (%) = <1.5%; 내독소 불순물 (EU/㎍의 PS) = <60EU/㎍의 PS.

실시예 6: 협막 폴리사카라이드의 정제 (엔. 메닌기티디스 혈청군 A & X의 다운스트림 공정)

프로토콜:

ㆍ아세트산나트륨, EDTA & 나트륨 도데실 술페이트를 각각 6%, 2 mM & 1%의 최종 농도로 일정하게 교반하면서 실온에서 1시간 동안 첨가하였다;

ㆍ0.1 M KCL을 상청액에 첨가하고 2-8℃에서 ~3시간 동안 인큐베이션하였다.

ㆍ상기 단계로부터 수득된 상청액에, NaCl을 0.2 M의 최종 농도로 첨가하였다. 침전된 PS를 1 M NaCl에 용해시킨 후 65% 알콜 침전시켰다.

결과:

<표 14>

<표 15>

비교 시, 정제 단계 I & 단계 II에서 불순물 수준은 Men-A & Men-X 폴리사카라이드에 대해 WHO 사양 한계보다 훨씬 낮은 것으로 관찰되었다.

음이온성 세제의 사용은 불순물 프로파일의 감소에 지대한 영향을 갖는 것으로 관찰되었다. 정제 단계 I & 단계 II에서의 불순물 수준은 Men-A & Men-X 폴리사카라이드에 대해 WHO 사양 한계보다 훨씬 낮다.

300 L 규모에서, 단백질 불순물 (%) = <2.5%; 핵산 불순물 (%) = <1%; 내독소 불순물 (EU/㎍의 PS) = <40 EU/㎍의 PS.

두 규모에서 및 정제 단계 I & 단계 II에서, 조 샘플과 비교하여, 혈청군 X의 정제된 폴리사카라이드의 회수율은 60% 초과이고 혈청군 A의 정제된 폴리사카라이드의 회수율은 50% 초과였다.

실시예 7: 단리된 폴리사카라이드 (PS)의 구조적 통합성

NMR 스펙트럼에 대해 도 1-5를 참조한다.

엔. 메닌기티디스 혈청군 A, C, W, Y & X의 단리된 폴리사카라이드의 구조적 통합성을 핵 자기 공명 (NMR)을 이용하여 검증하였다.

기록된 NMR 스펙트럼은 비교가능하였으며, 그들의 체류를 부분적으로 혈청군 A, C, W, & Y의 O-아세틸화된 수막구균 폴리사카라이드 및 혈청군 X의 N-아세틸화된 폴리사카라이드로 확증하였다.

실시예 8: 폴리사카라이드 정제에 대한 나트륨 데옥시콜레이트 (DOC) 기반 정제 공정 및 청구된 공정의 비교 분석

나트륨 데옥시콜레이트 (DOC) 기반 공정 "수막구균 폴리사카라이드 정제를 위한 개선된 방법 (Tanizaki et al (Conjugate and Polysaccharide Vaccines, Poster 79), http://neisseria.org/ipnc/1996/Neis1996-chap4.pdf)"은 하기와 같이 최적화되었다:

100 kD 수거; DOC + EDTA + NaOAc + 에탄올 (40%) 처리; 원심분리, 상청액 수집 및 0.2 μ 여과; 농축 및 투석여과; RT에서 CTAB (3%) 처리; 원심분리 및 CTAB-PS 펠렛 수집; 96% 에탄올에 CTAB-PS 펠렛 용해 및 0.1 M NaCl에 의한 침전; 40% 에탄올에 침전물 용해 및 1 M NaCl 첨가 (2-8℃); 원심분리 및 상청액 수집; 탄소 여과; 에탄올 농도 증가에 의한 PS 침전; WFI에 PS 펠렛 용해 및 WFI로 투석여과 및 0.2 μ 후 -20℃에서 저장.

DOC 기반 공정은 백신 항원으로 사용될 폴리사카라이드의 정제를 위해 산업 전반에 걸쳐 널리 사용되고 있다.

DOC 기반 방법에 의해 수득되는 폴리사카라이드의 불순물 프로파일을 청구된 발명 공정과 비교하였다.

결과:

<표 16>

SDS 기반의 창의적인 방법 및 DOC 기반의 방법은 혈청군 A & C에 대해서는 유사한 결과를 나타낸 반면, 혈청군 W, Y & X에 대해서는 SDS 방법은 DOC 방법과 비교하여 개선된 최종 회수를 나타내었다.

상기 결과에 의해 알 수 있는 바와 같이, 변형된 SDS 공정은 조작의 용이성 측면에서의 분명한 이점 뿐만 아니라 하기와 같은 몇몇 다른 이점을 갖는다: DOC는 동물 유래 성분이며 할랄 (HALAL)을 준수하지 않는다. DOC는 세계적으로 단일 판매자에 의해 제조 및 공급되는 반면, SDS는 합성 세제이고 할랄 인증을 받았으며 세계적으로 이용 가능한 여러 판매자가 있다. DOC는 화학 조성에 영향을 미치지 않으면서 내독소를 분해하고 세제가 제거되면 생물학적 활성을 회복할 수 있는 반면, SDS는 그의 양친매성 특성 및 더 높은 응집 개수 때문에 단백질을 잘 변성시키고 용해시키며 또한 내독소를 그의 단량체 단위로 불가역적으로 파괴한다.

SDS 사용에 의한 화학물질 및 소모품 (에탄올, 울트라- 필터, 카본 필터 등)의 소비 감소는 뚜렷한 이점이다. 또한, 대체물로서 SDS의 사용은 폴리사카라이드의 구조적 통합성에 대해 비-침습적이었다.

실시예 9:

하기에 나타낸 면역원성 조성물을 제조하여 면역원성에 대해 시험하였다.

조성물은 하기를 포함하였다:

(e) (i) 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 X의 협막 사카라이드 및 (ii)파상풍 톡소이드의 접합체.

결과:

면역원성 조성물은 면역원성인 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 이점:

상기 방법은 내독소, 단백질 및 핵산 불순물을 현저히 감소시켜 원하는 O-아세틸 수준을 갖는 협막 폴리사카라이드의 더 높은 회수를 제공한다. 상기 결과에 의해 알 수 있는 바와 같이, 청구된 방법은 조작의 용이성 측면에서의 분명한 이점 뿐만 아니라 하기와 같은 몇몇 다른 이점을 갖는다:

▶ 규제 문제: DOC는 동물 유래 성분이며 할랄을 준수하지 않는다. 이는 세계적으로 단일 판매자에 의해 제조 및 공급되는 반면, SDS는 합성 세제이고 할랄 인증을 받았으며 세계적으로 이용 가능한 여러 판매자가 있다.

▶기능 문제: DOC는 화학 조성에 영향을 미치지 않으면서 내독소를 분해하고 세제가 제거되면 생물학적 활성을 회복할 수 있는 반면, SDS는 그의 양친매성 특성 및 더 높은 응집 개수 때문에 단백질을 잘 변성시키고 용해시키며 또한 내독소를 그의 단량체 단위로 불가역적으로 파괴한다.

▶ SDS를 사용함으로써 화학물질 및 소모품 (에탄올, 울트라- 필터, 카본 필터 등)의 소비 감소는 뚜렷한 이점이었다.

▶ 본 특허 출원의 창의적인 방법은 다른 세포 불순물을 상당히 감소시킨다. 또한, 상기 방법은 업스트림 및 다운스트림 처리 동안 사용되는 시약의 효과적인 제거를 제공한다.

▶ 또한, 본 특허 출원의 창의적인 방법은 폴리사카라이드의 구조적 통합성에 대해 비-침습적이어서 이의 면역원성을 유지시켰다.

개시된 발명의 원리가 적용될 수 있는 많은 가능한 실시양태를 고려할 때, 예시된 실시양태는 본 발명의 바람직한 예일 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 인식해야 한다.

Claims

a) 조 폴리사카라이드 용액을 음이온성 세제와 혼합하는 단계;
b) 알칼리를 용액에 첨가하는 단계;
c) 용액의 pH를 중화시키는 단계;
d) 용액을 알콜에 기반하여 침전시킨 후 원심분리하고 상청액을 체류시키는 단계;
e) 상청액에 존재하는 세제를 제거하는 단계;
f) 폴리사카라이드를 농축 및 투석여과하는 단계
를 포함하고;
여기서 수득된 정제된 폴리사카라이드는 60-80%의 회수율; 최적 O-아세틸화 수준 및 최소의 내독소, 단백질 및 핵산 포함 불순물을 갖는 것인,
생물학적 샘플로부터 폴리사카라이드를 단리하는 방법.
제1항에 있어서,
g) 폴리사카라이드 용액을 양이온성 세제와 혼합하는 단계;
h) 용액을 원심분리하고 펠렛을 수집하는 단계;
i) 펠렛을 알콜에 용해시킨 후 폴리사카라이드를 염에 기반하여 침전시키는 단계
를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 알킬 술페이트, 나트륨 도데실 술페이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 도데실 술포네이트, 나트륨 s-알킬 술페이트, 나트륨 지방 알콜 폴리옥시에틸렌 에테르 술페이트, 나트륨 올레일 술페이트, N-올레오일 폴리(아미노산) 나트륨, 나트륨 알킬벤젠 술포네이트, 나트륨 .알파.-올레핀 술포네이트, 나트륨 알킬 술포네이트, 알파-술포 모노카르복실산 에스테르, 지방산 술포알킬 에스테르, 숙시네이트 술포네이트, 알킬 나프탈렌 술포네이트, 나트륨 알칸 술포네이트, 나트륨 리그닌술포네이트, 및 나트륨 알킬 글리세릴 에테르 술포네이트를 포함하는 군으로부터 선택되는 음이온성 세제.
제3항에 있어서, 음이온성 세제가 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)인 방법.
제3항에 있어서, 용액 중의 음이온성 세제 (SDS)의 최종 농도가 0.1-4.0%의 범위, 바람직하게는 1% 미만인 방법.
제1항에 있어서, 알칼리가 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 히드록실 아민, 트리에틸 아민 및 수산화리튬을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 알칼리가 수산화나트륨인 방법.
제1항에 있어서, 용액 중의 알칼리의 최종 농도가 5-50 mM의 범위, 바람직하게는 5-20 mM의 범위, 가장 바람직하게는 8-15 mM의 범위인 방법.
제1항에 있어서, 알칼리 첨가 후 용액의 pH가 pH 9-11의 범위, 바람직하게는 pH 10.5인 방법.
제1항에 있어서, 용액이 약한 유기산의 첨가에 의해 중화 (pH 7.0)되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 약한 유기산이 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산 중 하나; 바람직하게는 아세트산인 방법.
제1항에 있어서, 세제의 제거가 칼륨 염 처리, 겔 여과, 에탄올 처리, 및 이온 교환 수지/엠버라이트 컬럼 중 적어도 하나 이상을 이용하여 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 세제의 제거가 칼륨 염을 사용하여 세제를 침전시킴으로써 수행되는 것인 방법.
제13항에 있어서, 칼륨 염이 염화칼륨, 아세트산칼륨, 황산칼륨, 탄산칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 인산수소칼륨, 인산이수소칼륨, 질산칼륨, 및 다른 칼륨 염 중 하나, 또는 이의 2개 이상의 조합인 방법.
제14항에 있어서, 칼륨 염이 염화칼륨인 방법.
제13항에 있어서, 용액 중의 칼륨 염의 최종 농도가 음이온성 계면활성제가 충분히 침전되는 농도보다 높거나 같은 것인 방법.
제13항에 있어서, 용액 중의 칼륨 염의 최종 농도가 300 mM 미만, 바람직하게는 100 mM인 방법.
제1항에 있어서, 폴리사카라이드가 생물학적 공급원으로부터 유래되는 것인 방법.
제1항 또는 제18항에 있어서, 폴리사카라이드가 그람 음성 박테리아로부터 유래되는 것인 방법.
제1항 또는 제18항에 있어서, 폴리사카라이드가 시알산 잔기의 중합체인 방법.
제1항 및 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드가 나이세리아 메닌기티디스로부터 유래되는 것인 방법.
제1항 및 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드가 나이세리아 메닌기티디스 혈청형 B, 나이세리아 메닌기티디스 혈청형 C, 나이세리아 메닌기티디스 혈청형 W, 나이세리아 메닌기티디스 혈청형 Y로부터 유래되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 양이온성 세제(들)가 세틸트리메틸암모늄 염, 테트라부틸암모늄 염, 미리스틸트리메틸암모늄 염 및 헥사디메트린 브로마이드 중 하나; 또는 이의 2개 이상의 조합인 방법.
제23항에 있어서, 양이온성 세제(들)가 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)인 방법.
제24항에 있어서, 양이온성 세제(들)의 농도가 3% 미만, 바람직하게는 1%인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 알콜이 친수성 알콜인 방법.
제26항에 있어서, 친수성 알콜이 메탄올, 에탄올, n-프로필 알콜, 이소프로필 알콜, 아세톤, 및 t-부틸 알콜 중 하나; 또는 이의 2개 이상의 조합이고; 이의 농도가 <65% 또는 >95%인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 알콜이 에탄올인 방법.
제1항에 있어서, 폴리사카라이드의 농축 및 투석여과가 100 kDa MWCO 막을 사용하는 접선 유동 여과를 이용하여 수행되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 침전에 사용되는 염이 염화나트륨, 염화암모늄, 염화칼륨 중 하나, 또는 이의 2개 이상의 조합인 방법.
제2항 또는 제30항에 있어서, 침전에 사용되는 염이 염화나트륨인 방법.
제2항, 제30항 및 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 염의 농도가 0.25 M 내지 2 M 범위인 방법.
a) 조 폴리사카라이드 용액을 음이온성 세제와 혼합하는 단계;
b) EDTA 및 아세트산나트륨을 용액에 첨가하는 단계;
c) 용액을 알콜 침전시킨 후 원심분리하고 상청액을 체류시키는 단계;
d) 상청액에 존재하는 세제를 제거하는 단계;
e) 박테리아 폴리사카라이드를 농축 및 투석여과하는 단계
를 포함하고,
여기서 수득된 정제된 폴리사카라이드는 60-80%의 회수율; 최적 O-아세틸화 프로파일 및 최소의 내독소, 단백질 및 핵산 포함 불순물을 갖는 것인,
폴리사카라이드를 단리하는 방법.
제33항에 있어서,
a) 박테리아 폴리사카라이드 용액을 양이온성 세제와 혼합하는 단계;
b) 용액을 원심분리하고 펠렛을 수집하는 단계;
c) 펠렛을 알콜에 용해시킨 후 염에 기반하여 침전시키는 단계
를 더 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 세제가 음이온성 세제인 방법.
제35항에 있어서, 음이온성 세제가 알킬 술페이트, 나트륨 도데실 술페이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 도데실 술포네이트, 나트륨 s-알킬 술페이트, 나트륨 지방 알콜 폴리옥시에틸렌 에테르 술페이트, 나트륨 올레일 술페이트, N-올레오일 폴리(아미노산) 나트륨, 나트륨 알킬벤젠 술포네이트, 나트륨 .알파.-올레핀 술포네이트, 나트륨 알킬 술포네이트, .알파.-술포 모노카르복실산 에스테르, 지방산 술포알킬 에스테르, 숙시네이트 술포네이트, 알킬 나프탈렌 술포네이트, 나트륨 알칸 술포네이트, 나트륨 리그닌술포네이트, 나트륨 알킬 글리세릴 에테르 술포네이트, 및 다른 음이온성 세제 중 하나, 또는 이의 2개 이상의 조합인 방법.
제35항에 있어서, 음이온성 세제가 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)인 방법.
제35항에 있어서, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)의 최종 농도가 0.1-4.0%의 범위, 바람직하게는 1% 미만인 방법.
제33항에 있어서, 세제의 제거가 칼륨 염 처리, 겔 여과, 에탄올 처리 및 이온 교환 수지/엠버라이트 컬럼 중 적어도 하나 이상을 이용하여 수행되는 것인 방법.
제33항에 있어서, 세제의 제거가 칼륨 염을 사용하여 세제를 침전시킴으로써 수행되는 것인 방법.
제33항에 있어서, 용액 중의 칼륨 염의 최종 농도가 음이온성 계면활성제가 충분히 침전되는 농도보다 높거나 같은 것인 방법.
제40항에 있어서, 칼륨 염이 염화칼륨, 아세트산칼륨, 황산칼륨, 탄산칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 인산수소칼륨, 인산이수소칼륨, 질산칼륨, 및 다른 칼륨 염 중 하나, 또는 이의 2개 이상의 조합인 방법.
제34항에 있어서, 양이온성 세제(들)가 세틸트리메틸암모늄 염, 테트라부틸암모늄 염, 미리스틸트리메틸암모늄 염 및 헥사디메트린 브로마이드 중 하나; 또는 이의 2개 이상의 조합인 방법.
제42항에 있어서, 양이온성 세제(들)가 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)인 방법.
제35항에 있어서, CTAB의 최종 농도가 0.5-3.0%의 범위, 바람직하게는 1% 미만인 방법.
제1항 내지 45항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드가 헬리코박터 필로리, 클라미디아 뉴모니애, 클라미디아 트라코마티스, 우레아플라스마 우레알리티쿰, 미코플라스마 뉴모니애, 스타필로코쿠스 종, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 종, 그룹 A 스트렙토코쿠스, 그룹 B 스트렙토코쿠스 Ia, Ib, II, III, V, VI, 또는 VIII; 그룹 C 스트렙토코쿠스, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 아갈락티애, 스트렙토코쿠스 디스갈락티애, 스트렙토코쿠스 뉴모니애, 스트렙토코쿠스 비리단스, 엔테로코쿠스 페칼리스, 나이세리아 메닌기티디스, 나이세리아 고노르호에애, 바실루스 안트라시스, 살모넬라 종, 살모넬라 티피, 살모넬라 파라티피, 비브리오 콜레래, 파스퇴렐라 페스티스, 슈도모나스 아에루기노사, 캄필로박터 종, 캄필로박터 제주니, 클로스트리듐 종, 클로스트리듐 디피실레, 미코박테리움 종, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 트레포네마 종, 보렐리아 종, 보렐리아 부르그도르페리, 렙토스피라 종, 헤모필루스 두크레이, 코리네박테리움 디프테리아, 보르데텔라 페르투씨스, 보르데텔라 파라페르투씨스, 보르데텔라 브론키셉티카, 헤모필루스 인플루엔재, 에쉐리키아 콜리, 쉬겔라 종, 에를리치아 종, 및 리케차 종, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 유형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9A, 9F, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B, 38 및 45의 폴리사카라이드; 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 A, B, C, D, W135, X, Y, Z, 29E의 폴리사카라이드; 및 에이치. 인플루엔재 유형 b를 포함하는 군으로부터 유래되는 것인 방법.
제1항 내지 46항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드가 생물학적 공급원으로부터 유래되는 것인 방법.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에서 언급된 방법에 의해 수득되는 폴리사카라이드.
제48항에 있어서, 협막 폴리사카라이드, 서브-협막 폴리사카라이드 또는 엑소폴리사카라이드인 폴리사카라이드.
제48항에 있어서, 화학적 또는 기계적 수단에 의해 크기 분류되는 폴리사카라이드.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에서 언급된 방법에 의해 수득되는 폴리사카라이드 항원을 포함하는 백신.
제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 캐리어 단백질에 접합되고, 여기서 캐리어 단백질은 CRM197, 폐렴구균 표면 부착소 A (PsaA), 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT), 파상풍 톡소이드의 단편 C, 페르투씨스 톡소이드, 에이치. 인플루엔재의 단백질 D, 이. 콜리 LT, 이. 콜리 ST, 슈도모나스 아에루기노사로부터의 외독소 A, 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트란스페린 결합 단백질, 폐렴구균용혈소, 폐렴구균 표면 단백질 A (PspA), 폐렴구균 표면 부착소 A (PsaA), 폐렴구균 PhtD, 폐렴구균 표면 단백질 BVH-3, BVH-11, 바실루스 안트라시스의 방어 항원 (PA), 탈독화된 부종 인자 (EF), 바실루스 안트라시스의 치사 인자 (LF), 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 인긴 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 (BSA), 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD) 중 하나; 특히 CRM197, 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드 및/또는 PsaA인 폴리사카라이드.
제48항 내지 제50항 및 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 환원적 아미노화, 시아닐화 또는 카보디이미드 화학을 이용하여 캐리어 단백질에 접합되는 폴리사카라이드.
제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따라 수득되고, 여기서 상기 접합체는 혈청군 A, B, C, D, X, Y, Z, 29E 및 W-135로부터 선택되는 나이세리아 메닌기티데스 (엔. 메닌기티디스)의 협막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
a) (i) 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 A의 협막 사카라이드 및 (ii) 파상풍 톡소이드의 접합체;
b) (i) 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 C의 협막 사카라이드 및 (ii) CRM197의 접합체;
c) (i) 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 Y의 협막 사카라이드 및 (ii) CRM197의 접합체;
d) (i) 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 W135의 협막 사카라이드 및 (ii) CRM197의 접합체; 및
e) (i) 나이세리아 메닌기티디스 혈청군 X의 협막 사카라이드 및 (ii) 파상풍 톡소이드의 접합체
중 적어도 하나를 포함하는 면역원성 조성물.
제54항 또는 제55항에 있어서,
a) 적어도 하나의 폴리사카라이드-단백질 접합체;
b) 약 3% w/v 농도의 수크로스; 및
c) 약 0.5% w/v 농도의 시트르산나트륨을 포함하고,
여기서 폴리사카라이드는 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 정제되는 것인 면역원성 조성물.