CN104892734A - 疏水作用层析提纯口蹄疫灭活病毒抗原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从细胞培养液中提纯口蹄疫灭活病毒抗原的方法。该方法通过口蹄疫病毒表面的疏水基团和疏水作用色谱填料上的疏水基团之间的相互作用，将口蹄疫灭活病毒抗原吸附在色谱柱上，从而与溶液中的杂质分开。采用温和的洗脱条件就可以把吸附在色谱柱上的口蹄疫灭活病毒抗原洗脱下来，达到提纯的目的。该方法速度快，操作步骤少，工艺稳定，口蹄疫灭活病毒抗原收率高，且易于放大与工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。

Description

疏水作用层析提纯口蹄疫灭活病毒抗原的方法
技术领域
本发明涉及疫苗抗原分离纯化领域，具体地，涉及一种从细胞培养液中分离纯化口蹄疫灭活病毒疫苗抗原的色谱分离方法。
背景技术
口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的烈性传染病，主要感染对象为牛、羊、猪等偶蹄类动物，非偶蹄类动物也会被感染，但症状相对较轻。口蹄疫疫情往往会给畜牧业带来了巨大的损失。由于口蹄疫传染性强、传播速度快、危害性大，自20世纪初开始，口蹄疫一直是国际卫生界关注的焦点，各国纷纷建立研究机构以找到控制口蹄疫的方法。一直到19世纪末，口蹄疫病毒才真正被人类被发现。
最早关于口蹄疫病毒疫苗是法国Vallée、Carré等人于1926年发明的，他们已经测试了甲醛对于不同口蹄疫病毒灭活的作用，并最终通过在20℃用0.5％的甲醛灭活病毒4-7天，将灭活的病毒作为疫苗，达到了较好的保护水平。截止到今天，常用的口蹄疫疫苗依然是基于化学方法灭活的口蹄疫病毒，首先通过摇瓶或悬浮法大规模的培养幼仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)，之后将活的口蹄疫病毒接种到细胞中，再将病毒收获后浓缩、化学试剂灭活，与缓冲液和佐剂混合后制成口蹄疫疫苗。
随着科学技术的发展，人们对疫苗的质量要求也越来越高。目前口蹄疫苗存在主要两个问题：1.免疫保护力不稳定，免疫后检测不到抗体或产生抗体的水平低，或者免疫期较短；2.安全性差，副反应强，表现为动物在注射疫苗后出现减食，停食甚至死亡等情况。其主要原因是现有的口蹄疫疫苗制备工艺多为传统方法，纯化工艺简单，细胞培养液及宿主细胞中的多种杂质及过敏性物质并未除去，且抗原含量较低。这一现状对我国口蹄疫疫情的控制及兽用疫苗产业的发展带来极大影响。
口蹄疫灭活病毒抗原主要是146S，其纯化方法主要包括聚乙二醇沉淀，超滤除杂，双水相萃取等。这些方法难以获得高纯度的口蹄疫疫苗抗原。蔗糖密度梯度离心法能获得高纯度的口蹄疫灭活病毒，但这种方法不仅成本高，且难以应用于工业化生产。
色谱技术是一种易于工业放大，且能进行精度纯化的技术。目前色谱技术已经 用于多种人用疫苗及蛋白质药物的分离纯化，但在兽用疫苗领域应用尚较少。最近有专利报道采用凝胶过滤的方法来纯化口蹄疫病毒抗原(内蒙古必威安泰生物科技有限公司.口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用.中国发明专利:CN 102988970 B,2014-06-18.)。凝胶过滤处理量小，料液的进料量仅为凝胶过滤柱体积的1/10，而且经过凝胶过滤后抗原的浓度会进一步下降，这些都是本领域研究人员都知晓的有关凝胶过滤存在的问题。这些问题导致加工时间长，材料成本高，而且抗原在长时间的加工中也容易失去免疫活性。
本发明涉及一种适合于大规模从细胞培养液中提纯口蹄疫灭活病毒抗原的方法。该方法通过口蹄疫病毒表面的疏水基团和疏水作用色谱填料上的疏水基团之间的相互作用，将口蹄疫灭活病毒抗原吸附在色谱柱上，从而与溶液中的杂质分开。采用温和的洗脱条件就可以把吸附在色谱柱上的口蹄疫灭活病毒抗原洗脱下来，达到提纯的目的。该方法速度快，操作步骤少，工艺稳定，口蹄疫灭活病毒抗原收率高，且易于放大于工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从细胞培养液中分离纯化口蹄疫病毒抗原146S，同时具有高抗原收率的纯化方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
1.本技术发明的主要原理是根据疏水相互作用提纯口蹄疫灭活病毒抗原，以疏水作用色谱为工具，通过口蹄疫灭活病毒抗原表面的疏水基团与疏水作用色谱填料上的疏水基团之间的相互作用，实现口蹄疫灭活病毒抗原在色谱填料上的吸附，从而与原料溶液中不发生吸附和吸附较弱的杂质分开，采用温和的洗脱条件就可以把吸附在色谱柱上的口蹄疫灭活病毒抗原洗脱下来，达到提纯的目的；
2.这种疏水作用色谱的模式可以是将疏水作用色谱填料加入到含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液中，然后再将填料装入色谱柱中进行色谱操作，或者是将含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液直接加入到装有疏水作用色谱填料的色谱柱中进行色谱操作；
3.所采用的疏水作用色谱填料表面的疏水基团为丁基(Butyl)、丁硫基(Butyl-S)苯基(Phenyl)或辛基(Octyl)；
4.细胞培养液中的口蹄疫灭活病毒抗原146S的浓度为2-100μg/ml；为缩短色谱操作时间，可以采用截留分子量为50～300kDa的超滤膜对原料液进行超滤浓缩， 以减少细胞培养液的体积；超滤时膜表面的切向流速为10～100cm/s，操作压力在0.3MPa以下；
5.在进行疏水色谱分离之前，调节含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液的电导为50～150mS/cm，pH为7.2～9.0；调节调节电导所用的盐为硫酸铵、氯化钠、磷酸盐，优选的为硫酸铵；
6.色谱操作包括疏水作用色谱填料的平衡、进料、淋洗、洗脱和填料的再生。具体可以将(5)所得的口蹄疫灭活病毒抗原物料进料至预先平衡的装有丁基(Butyl)、丁硫基(Butyl-S)苯基(Phenyl)或辛基(Octyl)的疏水色谱柱中。经淋洗后，进行洗脱，收集洗脱峰进行146S抗原及蛋白浓度的检测；或将(5)所得物料与预先平衡的疏水色谱填料混合后再装入色谱柱中，再进行淋洗和洗脱操作。
7.上述平衡和淋洗所用的溶液的电导为30～300mS/cm，优选的为50～150mS/cm，pH 7.2～9.0；洗脱液的电导为5-150mS/cm，pH 7.2～9.0；调节调节电导所用的盐为硫酸铵、氯化钠、磷酸盐，优选的为硫酸铵；疏水作用色谱填料再生所用的溶液为0.5～1M NaOH或20～40wt％异丙醇。
本发明具有以下特点：
(1)抗原活性回收率高，最高可达90％；
(2)纯化工艺操作步骤少，步骤间衔接紧凑；
(3)避免使用超速离心等价格昂贵的设备，成本相对较低；
(4)易于放大到工业化规模生产。
综上所述于，本发明提供了一种简便、快速、易于放大的分离纯化获得高收率的口蹄疫病毒抗原的方法，具有较大的实际应用价值。
附图说明
图1为实施例1中，疏水色谱纯化口蹄疫病毒抗原色谱图；
图2为实施例1中的SDS-PAGE电泳图，1为细胞培养液上清，2为疏水色谱收集的组分；
图3为实施例1中，经过纯化后的口蹄疫病毒抗原高效液相凝胶过滤色谱检测结果。
具体实施方式
本发明的方法通过以下实施例进行详细说明。
实施例1
取1000mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.47g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.1μg/mL。
使用截留分子量为300kDa的板式超滤膜(Sartorius)将细胞上清液一次浓缩到20mL左右，样品中蛋白浓度为100μg/mL左右；超滤时膜流速为100cm/s，压力控制在0.3MPa以下。
在上清液中依次用硫酸铵和氢氧化钠溶液分别调至电导率和pH，使电导率至100mS/cm以上，pH 8.0左右。然后进料到预先用硫酸铵调至电导100mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 8.0)平衡的Butyl Sepharose 4FF疏水色谱柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，依次用硫酸铵调至电导为70mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 8.0)和5mS/cm磷酸钠缓冲液(pH 8.0)分别洗脱，收集洗脱峰。色谱图见图1。色谱填料采用0.5M氢氧化钠溶液再生。
分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为92％，纯化倍数为8.8，并对所得纯化的样品进行SDS-PAGE检测(图2)，检测到分子量介于25～35kDa的146S的三条亚基蛋白VP1，VP2，VP3，表明表明收集到的为146S抗原组分。高效液相凝胶过滤色谱检测表明纯化所得抗原为且为完整的病毒颗粒(图3)。
为进一步得到更高纯度的146S抗原，取6mL疏水色谱洗脱液，进料到Superdex 200凝胶过滤柱(GE Healthcare，60cm×1.6cm I.D.)，流速为1ml/min，流动相为含有0.15M氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液，pH 8.0。分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到纯度大于98％以上的口蹄疫病毒抗原，所得抗原总收率为75％，纯化倍数为247。
实施例2
取100mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.47g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.1μg/mL。
在上清液中依次用硫酸铵和氢氧化钠溶液分别调至电导率和pH，使电导率至100mS/cm以上，pH 7.2左右，然后进料到预先用硫酸铵调至电导100mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 7.2)平衡的Butyl Sepharose 4FF疏水色谱柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，分别用硫酸铵调至电导为5～100mS/cm磷 酸钠缓冲液(pH 7.2)进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。色谱填料采用1M氢氧化钠溶液再生。
分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为91％，纯化倍数为7.2。
实施例3
取100mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.47g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.1μg/mL。
使用截留分子量为50kDa的板式超滤膜(Sartorius)将细胞上清液一次浓缩到10mL左右，样品中口蹄疫病毒抗原浓度为20μg/mL左右；超滤时膜流速为100cm/s，压力控制在0.3MPa以下。
在上清液中依次用氯化钠和氢氧化钠溶液分别调至电导率和pH，使电导率至50mS/cm以上，pH 9.0左右。然后加入10ml预先用硫酸铵调至电导50mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 9.0)平衡过的Phenyl Sepharose 6FF疏水色谱填料，100～200rpm搅拌吸附30min后，加至色谱柱中(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)。经继续淋洗后，分别用硫酸铵调至电导为5～50mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 9.0)进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。色谱填料采用20wt％异丙醇再生。
分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为56％，纯化倍数为3.2。
实施例4
取200mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.42g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.8μg/mL。
使用截留分子量为300kDa的板式超滤膜(Sartorius)将细胞上清液一次浓缩到10mL左右，样品中蛋白浓度为40μg/mL左右；超滤时膜流速为50cm/s，压力控制在0.3MPa以下。
在上清液中依次用硫酸铵和氢氧化钠溶液分别调至电导率和pH，使电导率至100mS/cm以上，pH 9.0左右，然后进料到预先用硫酸铵调至电导为100mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 9.0)平衡的Octyl Sepharose 4FF疏水色谱柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，分别用硫酸铵调至电导为5～100mS/cm磷 酸钠缓冲液(pH 9.0)进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。色谱填料采用40wt％异丙醇再生。
分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为79％，纯化倍数为6.5。
实施例5
取200mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.42g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.8μg/mL。
使用截留分子量为100kDa的板式超滤膜(Sartorius)将细胞上清液一次浓缩到10mL左右，样品中蛋白浓度为40μg/mL左右；超滤时膜流速为10cm/s，压力控制在0.3MPa以下。
在上清液中依次用硫酸铵和氢氧化钠溶液分别调节电导率和pH，使电导率至150mS/cm以上，pH 8.0左右。然后进料到预先用硫酸铵调至电导为150mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 8.0)平衡的Butyl-S Sepharose 6FF疏水色谱柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，分别用硫酸铵调至电导为5～150mS/cm磷酸钠缓冲液(pH 9.0)进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。色谱填料采用20wt％异丙醇再生。
分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为64％，纯化倍数为3.5。

Claims (10)

1.一种根据疏水相互作用原理提纯口蹄疫灭活病毒抗原的方法，该方法以疏水作用色谱为工具，通过口蹄疫灭活病毒抗原表面的疏水基团与疏水作用色谱填料上的疏水基团之间的相互作用，实现口蹄疫灭活病毒抗原在色谱填料上的吸附，从而与原料溶液中不发生吸附和吸附较弱的杂质分开，采用温和的洗脱条件就可以把吸附在色谱柱上的口蹄疫灭活病毒抗原洗脱下来，达到提纯的目的。
2.根据权利要求1，疏水作用色谱的模式可以是将疏水作用色谱填料加入到含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液中，然后再将填料装入色谱柱中进行色谱操作，或者是将含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液直接加入到装有疏水作用色谱填料的色谱柱中进行色谱操作。
3.根据权利要求1，疏水作用色谱填料表面的疏水基团为丁基(Butyl)、丁硫基(Butyl-S)苯基(Phenyl)或辛基(Octyl)。
4.根据权利要求1，细胞培养液中的口蹄疫灭活病毒抗原146S的浓度为2-100μg/ml；为缩短色谱操作时间，可以采用超滤浓缩的方法减少细胞培养液的体积。
5.根据权利要求4，超滤浓缩所用的超滤膜截留分子量为50～300kDa，超滤时膜表面的切向流速为10～100cm/s，操作压力在0.3MPa以下。
6.根据权利要求1，含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液的电导为50～150mS/cm，pH为7.2～9.0。
7.根据权利要求1和2，色谱操作包括疏水作用色谱填料的平衡、进料、淋洗、洗脱和填料的再生。
8.根据权利要求7，平衡和淋洗所用的溶液的电导为30～300mS/cm，优选的为50～150mS/cm，pH 7.2～9.0，调节电导所用的盐为硫酸铵、氯化钠、磷酸盐，优选的为硫酸铵。
9.根据权利要求7，洗脱液的电导为5-150mS/cm，pH 7.2～9.0。
10.根据权利要求7，再生液采用0.5～1M NaOH或20～40wt％异丙醇溶液。
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