CN102051346A - 海产贝类中病毒的浓缩方法及病毒浓缩回收率的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种海产贝类中病毒的浓缩方法及病毒浓缩回收率的测定方法。其方法包括组织匀浆、差速离心、氯仿去除脂蛋白。以甲型肝炎病毒为实施例，采用荧光定量PCR方法进行病毒回收率的测定，回收率达62.7％。该方法可用于贝类中病毒的直接浓缩，以利于开展海产贝类食用安全监测与评价。
Description
技术领域
本发明涉及海产贝类中病毒的浓缩方法，具体涉及到海产贝类中病毒的浓缩方法和贝类体内甲型肝炎病毒(Hepatitis A viruses，HAV)浓缩方法的回收率测定。
背景技术
贝类是富集病毒的重要载体，以往的研究是通过细胞培养来进行病毒的增殖和检测，但是细胞培养的方法不但耗时耗资，并且许多病毒找不到合适的细胞系进行培养，致使贝类体内许多病毒的研究滞后。PCR方法的应用解决了上述难题，但是在病毒的检测过程中又经常出现两种问题：一是由于含量太低而不能直接被检测到，二是必须除去或者尽量减少在RT-PCR反应过程中的RNA抑制剂，发明一种贝类体内病毒的浓缩方法是十分必要的。
贝类中的病毒浓缩是一个理化过程，常用的贝类浓缩方法一是沉淀法，organic-occulation(OF)和PEG是两种常用的絮凝剂，是具有强烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，此方法首先要改变样品pH值(硼酸盐、甘氨酸、牛肉膏、牛肉膏-二氯二氟是四种常用的缓冲液)，使病毒粒与样品微粒分开，利用OF和PEG把病毒粒沉淀下来，最终通过氯仿抽提的方法将病毒抽提出来。有学者比较这四种缓冲液和OF、PEG-6000和PEG-8000三种絮凝剂，得出四种缓冲液对浓缩效率没有多大影响，这三种絮凝剂中PEG-8000的浓缩效率最高，但是该方法在透析之后需要洗膜，并且需要过夜处理，既费时工作量又大，所以在处理大批样品时该方法并不实用。近来又有学者提出将PEG和Pro-cipitate两种透析方法同时使用，该方法浓缩效率较高，但是比PEG-8000方法更耗时。第二种常用的方法是差速离心，此方法通过调节pH和离心速度来达到将病毒粒子和组织分开的目的，但是该方法获得的最终产物中抑制剂比较多。本方法综合了上述两种方法的优点，在差速离心的基础上再进行氯仿抽提，既节约了时间又提高了浓缩效率。
发明内容
本发明提供一种海产贝类中病毒的浓缩方法，该方法包括：取25g贝肉组织于匀浆器中快速匀浆，将匀浆液放入50mL的灭菌离心管中并加入等体积的甘氨酸缓冲液(pH9.0)；调整pH至7.2±0.4，室温条件下震荡30min左右，4℃条件下，5,000×g离心15min，取上清液；上清液于4℃条件下，10,000×g离心1h，再次收集上清液；上清液在超速离心机中140,000×g离心1.5h，弃上清；沉淀用1mL PB S(pH7.4)重悬，以溶解沉淀；将重悬液加入一个2mL的灭菌离心管中并加入等量体积的氯仿，震荡30min，然后4,000×g离心30min；吸取上清液，上层液相即为病毒抽提样，得到约500μL浓缩样品，冻存备检。
本发明还提供一种海产贝类中病毒浓缩回收率的测定方法，该方法包括：
(1)取2mL的病毒减毒活疫苗添加到25g匀浆的贝肉中，作为试验样品，用病毒减毒活疫苗作为浓缩前的阳性对照，用未添加病毒减毒活疫苗的贝肉样品作为阴性对照；
(2)用上述浓缩方法将添加病毒减毒活疫苗的贝肉和未添加病毒减毒活疫苗的贝肉进行浓缩，得到浓缩样品；
(3)采用Trizol的方法进行贝类体内病毒RNA的提取；
(4)病毒PCR引物设计位于HAV基因组中编码V1-V3衣壳蛋白的区域，目的片段长度为76bp；
(5)病毒标准曲线的建立，用EASY-Dillution将已知拷贝数的重组质粒作102～1076个梯度的稀释；
20μL RT-PCR反应体系为：10.0μL的SYBR Premix Ex Taq(2×)、引物各0.4μL、0.4μL的ROX Reference Dye II(50×)、质粒模板2.0μL和灭菌水6.8μL；
反应条件：95℃10s，95℃15s，60℃1min，40个循环，熔解曲线分析条件为95℃10s，60℃1min，95℃15s；
(6)根据标准曲线计算样品中病毒的拷贝数，从而计算贝类样品中病毒的回收率。
在上述方法中，病毒的实例为甲型肝炎病毒。
附图说明
图1是HAV实时定量RT-PCR标准曲线图；
图2是HAV实时定量RT-PCR扩增曲线图；
图3是HAV实时定量RT-PCR熔解曲线图。
具体实施方式
(一)浓缩方法：
1、取25g贝肉组织于匀浆器中快速匀浆，将匀浆液放入50mL的灭菌离心管中并加入等体积的甘氨酸缓冲液(pH9.0)；
2、调整pH至7.2±0.4，室温条件下震荡30min左右，4℃条件下，5,000×g离心15min，取上清液；
3、上清液于4℃10,000×g离心1h，收集上清液；
4、上清液在超速离心机中140,000×g离心1.5h，弃上清；
5、沉淀用1mL PB S(pH7.4)重悬，一般以溶解沉淀为宜；
6、将重悬液加入一个2mL的灭菌离心管中并加入等量体积的氯仿，震荡30min，然后4,000×g离心30min；
7、吸取上清液，上层液相即为病毒抽提样，得到约500μL浓缩样品，冻存备检。
(二)回收率的测定：
用荧光实时定量RT-PCR方法计数(以甲型肝炎病毒的计数为例)
1、样品的制备：取2mL的甲型肝炎减毒活疫苗添加到25g匀浆的贝肉中，作为试验样品，用甲型肝炎减毒活疫苗作为浓缩前的对照，用未添加甲型肝炎减毒活疫苗的贝肉样品作为阴性对照；
2、用上述贝类浓缩方法将添加甲型肝炎减毒活疫苗的贝肉和未添加甲型肝炎减毒活疫苗的贝肉进行浓缩，得到两份大约2mL左右的浓缩样品；
3、甲型肝炎病毒(HAV)RNA的提取
提取甲型肝炎减毒活疫苗(A)、添加甲型肝炎减毒活疫苗的贝肉浓缩样(B)和未添加甲型肝炎减毒活疫苗贝肉浓缩样(C)的RNA。具体方法如下：
(1)于贝类浓缩样中加入1mL Trizol，30℃孵育5min；
(2)然后4℃低温下12,000×g转速离心10分钟，取上清液；
(3)上清液中加入0.2mL氯仿，30℃孵育3min；
(4)之后4℃低温12,000×g转速离心15min，取上清液；
(5)上清液中加入0.5mL异丙醇，30℃孵育10min，12000×g离心10min，取沉淀；
(6)沉淀中加入1mL 75％乙醇，4℃8000×g离心5min，取沉淀；
(7)室温放置5-10分钟晾干沉淀，加入50μL RNase-free水，-80℃保存。
4、引物的设计
甲型肝炎(HAV)PCR引物设计位于HAV基因组中编码V1-V3衣壳蛋白的区域，目的片段长度为76bp。
引物序列为：HAV(+)：ACA×GA×GCA×GAAT×GTTCCT×GATCC
HAV(-)：TCCCCTATT×G×GCTTTCCCTT。
5、反转录体系为：2.0μL的5×PrimeScript Buffer、0.5μL的PrimeScript RTEnzyme Mix I、0.5μL的Random 6mers、1.5μL的总RNA和5.5μL的无RNase灭菌水。
反转录条件为：37℃15min，85℃15s，合成甲型肝炎病毒cDNA的第一条链。
6、反应体系为：2.5μL的10×Ex Taq buffer、1.0μL的引物、2.0μL的dNTP、0.5μL的Taq酶、2.0μL的cDNA和16.0μL的DEPC水。
7、循环参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性20s；60℃复性1min，72℃延伸30s，共40个循环；最后72℃延伸5min。
8、目的片段克隆
PCR产物经2％琼脂糖凝胶回收纯化得到76bp的目的片段，切下琼脂糖凝胶中的目的条带，与pMD 18-T载体连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃培养12～16h，挑白色单菌落用载体引物进行扩增，从而获得阳性克隆，对阳性克隆进行LB液体培养基培养。
9、标准阳性对照质粒的制作
利用质粒小量提取试剂盒提取含有目的片段的重组质粒，重组质粒的浓度用紫外分光光度计检测，OD260/OD280为1.99，表明该重组质粒的纯度很高。
10、HAV标准曲线的建立
用EASY-Dillution将上述已知拷贝数的重组质粒作102～1076个梯度的稀释。20μL Real-time PCR反应体系为：10.0μL的SYBRPremix Ex Taq(2×)、0.4μL的引物、0.4μL的ROX ReferenceDye II(50×)、2.0μL的质粒模板和6.8μL的灭菌水
以起始模板数的对数为X轴，以临界循环数(Ct)为Y轴，建立实时定量PCR的标准曲线(图1)。线性回归方程为y＝-3.217x+39.425，标准曲线斜率为-3.217，R2＝0.999，表明RT-PCR扩增该标准样品的线性关系良好，符合制备实时定量PCR标准曲线的要求，熔解曲线分析表明扩增产物非常单一，特异性好。
反应条件：95℃10s，95℃15s，60℃1min，40个循环。得到的扩增曲线和熔解曲线见图2、图3。熔解曲线分析条件为95℃10s，60℃1min，95℃15s。
11、HAV回收率的计算
将上述三份甲型肝炎减毒活疫苗(A)、添加甲型肝炎减毒活疫苗的贝肉浓缩样(B)和未添加甲型肝炎减毒活疫苗的贝肉浓缩样(C)的RNA样品按照上述建立的Real-time RT-PCR检测，每个样品重复三次。根据标准曲线计算3个样品中甲型肝炎病毒的拷贝数(分别记为a、b、c)，由公式(b-c)/(a-c)×100％计算贝类样品中甲型肝炎病毒的回收率。
12、回收率测定结果
以甲型肝炎病毒为实施例测定贝类浓缩的回收率，此浓缩方法的回收率达62.7％。
Claims (3)
1.一种海产贝类中病毒的浓缩方法，该方法包括：
取25g贝肉组织于匀浆器中快速匀浆，将匀浆液放入50mL的灭菌离心管中并加入等体积的甘氨酸缓冲液(pH9.0)；调整pH至7.2±0.4，室温条件下震荡30min左右，4℃条件下，5,000×g离心15min，取上清液；上清液于4℃条件下，10,000×g离心1h，再次收集上清液；上清液在超速离心机中140,000×g离心1.5h，弃上清；沉淀用1mL PBS(pH7.4)重悬，以溶解沉淀；将重悬液加入一个2mL的灭菌离心管中并加入等量体积的氯仿，震荡30min，然后4,000×g离心30min；吸取上清液，上层液相即为病毒抽提样，得到约500μL浓缩样品，冻存备检。
2.海产贝类中病毒浓缩回收率的测定方法，该方法包括：
(1)取2mL的病毒减毒活疫苗添加到25g匀浆的贝肉中，作为试验样品，用病毒减毒活疫苗作为浓缩前的阳性对照，用未添加病毒减毒活疫苗的贝肉样品作为阴性对照；
(2)用权利要求1所述的浓缩方法将添加病毒减毒活疫苗的贝肉和未添加病毒减毒活疫苗的贝肉进行浓缩，得到浓缩样品；
(3)采用Trizol的方法进行贝类体内病毒RNA的提取；
(4)病毒PCR引物设计位于HAV基因组中编码V1-V3衣壳蛋白的区域，目的片段长度为76bp；
(5)病毒标准曲线的建立，用EASY-Dillution将已知拷贝数的重组质粒作102～1076个梯度的稀释；
20μL RT-PCR反应体系为：10.0μL的SYBR Premix Ex Taq(2×)、引物各0.4μL、0.4μL的ROX Reference Dye II(50×)、质粒模板2.0μL和灭菌水6.8μL；
反应条件：95℃10s，95℃15s，60℃1min，40个循环，熔解曲线分析条件为95℃10s，60℃1min，95℃15s；
(6)根据标准曲线计算样品中病毒的拷贝数，从而计算贝类样品中病毒的回收率。
3.根据权利要求2所述的病毒浓缩回收率的测定方法，其中病毒为甲型肝炎病毒。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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