CN102128738B - 一种鱼过敏原标准物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种鱼过敏原标准物的制备方法，属于生物技术领域。本发明涉及从鱼中将小清蛋白这种过敏原物质进行有效的提取、分离和纯化的方法，所述小清蛋白的提纯采取低温搅拌浸提、分级盐析、低温离心和凝胶过滤层析等多种技术相结合的手段，将高致敏性蛋白组分从鱼中分离出来，最大程度的保留了蛋白质的生物活性。本发明方法获得的蛋白质有助于鱼过敏的诊断并可用于免疫学来检测食品中的鱼过敏原物质。
Description
技术领域
一种鱼过敏原标准物的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
近年来，食物过敏已成为一个公众性的食品安全问题，而鱼是最常见的八大食品过敏原之一。过敏疾病严重危害人们的身体健康，虽然激发过敏反应的最低过敏原的量随着人群的不同而不同，但是微量的过敏原就可以使绝大部分患者产生过敏症状。研究鱼过敏原的检测与控制，必须首先获得高纯度的过敏原组分，它可以更为细致地了解鱼过敏原的生化特征及各种加工过程中对其致敏性的影响提供实验材料，从而有助于低过敏或无过敏的鱼制品以及鱼过敏原的检测。而当前对于研究过敏原检测的关键问题就是没有标准物质，所以制备标准物质有着非常重要的意义。
发明内容
要解决的技术问题
本发明所要解决的技术问题是要提供一种鱼过敏原标准物的制备方法，同时该方法不能破坏所制备物质的生物活性。
技术方案
一种鱼过敏原标准物的制备方法，该制备方法采取低温搅拌浸提、分级盐析、低温离心和凝胶过滤层析等多种技术相结合的手段，将高致敏性蛋白组分从鱼中分离出来，最大程度的保留了蛋白质的生物活性。制备步骤为：
（1）脱脂
鱼肉捣碎均质后，用60～90℃石油醚脱脂，按鱼肉质量︰石油醚体积比为1︰10（W/V），在低于60℃下进行搅拌萃取12h，4℃ 6000r/min离心15min，弃上清，沉淀置于通风橱使石油醚挥发，得脱脂鱼肉；
（2）浸提
将脱脂鱼肉溶解于4℃预冷的0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液中，鱼肉质量︰磷酸盐缓冲液体积比为1︰20（W/V），4℃磁力搅拌4h，4℃ 7000r/min离心20min，收集上清，得鱼蛋白浸提液；
（3）加热
将鱼蛋白浸提液加热但不沸腾，加热30min后，4℃ 7000r/mim离心20min，收集上清；去除了不耐热杂蛋白，得耐热鱼蛋白浸提液；
（4）饱和硫酸铵分级沉淀
在所得耐热鱼蛋白浸提液中缓慢加入硫酸铵，边加边搅拌，直至溶液中硫酸铵饱和度达30%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/min离心20min，离心后的上清液中继续缓慢加入硫酸铵直至饱和度达50%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/mim离心20min，收集沉淀，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶；
（5）凝胶过滤层析
将50%饱和度的蛋白组分装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液于4℃透析48h，然后使用AKTA蛋白纯化系统进行凝胶过滤层析；条件：经Superdex 75 10/300 GL凝胶柱层析，以0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速0.4mL/min，2mL间隔自动收集，280nm紫外吸收监测，收集所需出峰样品，合并后于4℃超纯水透析24h；样品冷冻干燥后即为所制备的鱼过敏原蛋白标准品。
所述的鱼过敏原标准物的制备方法，第（1）步中所用石油醚为60～90℃的石油醚，第（2）步中获得的鱼蛋白浸提液、第（3）步中获得的耐热鱼蛋白浸提液、第（4）步中获得的饱和硫酸铵分级沉淀组分、第（5）步中获得的凝胶过滤各峰组分都要进行变性聚丙烯酰胺电泳SDS-PAGE鉴定，电泳条件为：13.5%分离胶，5%浓缩胶，恒压100V，步骤（5）中冷冻干燥后获得的条带单一、相对分子量12kDa的蛋白质组分即为鱼过敏原标准物。
本发明的有益效果在于：所制备的鱼过敏原标准物质最大程度的保留了其生物活性，可用于免疫学来检测食品中的鱼过敏原物质，同时还有助于在医学上对鱼过敏的诊断分析。
附图说明
图1所制备的鱼过敏原标准物SDS-PAGE鉴定图。
具体实施方式
实施例1：鱼过敏原标准物的制备，步骤如下：
（1）脱脂
鱼肉捣碎均质后，用60～90℃石油醚脱脂，按鱼肉质量︰石油醚体积比为1︰10（W/V），在低于60℃下进行搅拌萃取12h，4℃ 6000r/min离心15min，弃上清，沉淀置于通风橱使石油醚挥发，得脱脂鱼肉。
（2）浸提
将脱脂鱼肉溶解于4℃预冷的0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液中，鱼肉质量︰磷酸盐缓冲液体积比为1︰20（W/V），4℃磁力搅拌4h，4℃ 7000r/min离心20min，收集上清，得鱼蛋白浸提液。
（3）加热
将鱼蛋白浸提液加热但不沸腾，加热30min后，4℃ 7000r/min离心20min，收集上清。去除了不耐热杂蛋白，得耐热鱼蛋白浸提液。
（4）饱和硫酸铵分级沉淀
在所得耐热鱼蛋白浸提液中缓慢加入硫酸铵，边加边搅拌，直至溶液中硫酸铵饱和度达30%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/min离心20min，离心后的上清液中继续缓慢加入硫酸铵直至饱和度达50%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/min离心20min，收集沉淀，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶。
（5）凝胶过滤层析
将50%饱和度的蛋白组分装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液透析48h（4℃），然后使用AKTA蛋白纯化系统进行凝胶过滤层析。条件：经Superdex 75 10/300 GL凝胶柱层析，以0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速0.4mL/min，2mL间隔自动收集，280nm紫外吸收监测，收集所需出峰样品，合并后超纯水透析24h（4℃）。样品冷冻干燥后即为所制备的鱼过敏原蛋白标准品。
实施例2：鱼过敏原蛋白的SDS-PAGE鉴定
对实施例1中第（2）、（3）、（4）、（5）步所获得的鱼蛋白浸提液、耐热鱼蛋白浸提液、饱和硫酸铵分级沉淀组分、凝胶过滤各峰组分进行SDS-PAGE鉴定。电泳条件为：13.5%分离胶，5%浓缩胶，恒压100V。图1中所制备的标准物质条带单一，相对分子量12kDa，与文献报道相一致。
Claims (2)
1.一种鱼过敏原标准物的制备方法，其特征在于制备步骤为：
（1）脱脂
鱼肉捣碎均质后，用60～90℃石油醚脱脂，按鱼肉质量︰石油醚体积比W/V为1︰10，在低于60℃下进行搅拌萃取12h，4℃ 6000r/min离心15min，弃上清，沉淀置于通风橱使石油醚挥发，得脱脂鱼肉；
（2）浸提
将脱脂鱼肉溶解于4℃预冷的0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液中，鱼肉质量︰磷酸盐缓冲液体积比W/V为1︰20，4℃磁力搅拌4h，4℃ 7000r/min离心20min，收集上清，得鱼蛋白浸提液；
（3）加热
将鱼蛋白浸提液加热但不沸腾，加热30min后，4℃ 7000r/min离心20min，收集上清；去除了不耐热杂蛋白，得耐热鱼蛋白浸提液；
（4）饱和硫酸铵分级沉淀
在所得耐热鱼蛋白浸提液中缓慢加入硫酸铵，边加边搅拌，直至溶液中硫酸铵饱和度达30%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/min离心20min，离心后的上清液中继续缓慢加入硫酸铵直至饱和度达50%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/min离心20min，收集沉淀，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶；
（5）凝胶过滤层析
将50%饱和度的蛋白组分装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液于4℃透析48h，然后使用AKTA蛋白纯化系统进行凝胶过滤层析；条件：经Superdex 75 10/300 GL凝胶柱层析，以0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速0.4mL/min，2mL间隔自动收集，280nm紫外吸收监测，收集所需出峰样品，将出峰样品合并后于4℃超纯水透析24h；样品冷冻干燥后即为所制备的鱼过敏原标准物。
2.根据权利要求1所述的鱼过敏原标准物的制备方法，其特征在于，第（1）步中所用石油醚为60～90℃的石油醚，第（2）步中获得的鱼蛋白浸提液、第（3）步中获得的耐热鱼蛋白浸提液、第（4）步中获得的沉淀、第（5）步中获得的凝胶过滤出峰样品都要进行变性聚丙烯酰胺电泳SDS-PAGE鉴定，电泳条件为：13.5%分离胶，5%浓缩胶，恒压100V，步骤（5）中冷冻干燥后获得的条带单一、相对分子量12kDa的蛋白质组分即为鱼过敏原标准物。
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