CN102690339B - 鼠尾藻凝集素及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种鼠尾藻凝集素及制备方法，其特征在于是以鼠尾藻为原料，经冻干、粉碎、浸泡、离心、硫酸铵分级，DEAE-52离子交换层析和SephadexG-200凝胶过滤层析而得到，其分子量为17kD。所凝集的细胞广泛，对于兔、狗、羊、鲫鱼、鸡及人（A、B、AB）等红细胞均有凝集作用，其中对兔及鸡红细胞凝集反应的最低浓度分别为4.4mg/ml、0.55mg/ml，即使在100℃30min热处理后仍然对兔红细胞显示出血凝活性（活性下降75%）。糖抑制性实验表明，鼠尾藻凝集素仅被糖蛋白牛甲状腺球蛋白和γ-球蛋白所抑制，最小抑制浓度分别为1.25mg.mL^-1和2.5mg.mL^-1。

Description

鼠尾藻凝集素及制备方法

技术领域

本发明涉及一种凝集素及制备方法，尤其是一种凝集细胞广泛的鼠尾藻凝集素及制备方法。

背景技术

凝集素（Lectin）是非免疫起源的具有糖专一性、可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白。凝集素在自然界中分布极广，从病毒到人类，几乎所有的物种中，均已分离得到了凝集素，其中最初发现的是植物凝集素。1966年，Boyd等人在一些热带海藻中发现了海藻凝集素的存在，此后Blunden和Rogers等对英国沿海的海藻检测了提取物的凝集活性，但是发现只有很少的一些海藻提取物对未经处理的人血红细胞有一定的凝集作用，之后Hori等又对越南海藻凝集素进行了筛选。Hori报道：至1994年，人们从10种绿藻、13种红藻中分离纯化出凝集素，并且从其中5种红藻中得到了部分纯化制品。之后，人们又对隅江蓠（Gracilaria cornea）、绒线藻(Dasya villosa ) 等进行了分离纯化及其性质的研究，发现所提取的凝集素具有凝集细胞、参与原生质体形成、抑制肿瘤细胞增殖、激活淋巴细胞、抑制血小板凝集等多种功能的生物活性。褐藻虽然也是一种海藻，但是由于常规提取物中含有多酚，故人们一直偏见地认为褐藻提取物凝集细胞现象只是多酚凝集血细胞的一种假凝集现象，以至于迄今为止，对海藻凝集素的研究主要集中在红藻、绿藻，而关于褐藻门圆子纲马尾藻属鼠尾藻（Sargassum thunbergii O’Kuntze）凝集素的分离纯化未见报道。

发明内容

本发明克服了现有技术所存在的上述技术偏见，提供一种凝集细胞广泛的鼠尾藻凝集素及制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种鼠尾藻凝集素，其特征在于是以鼠尾藻为原料，经冻干、粉碎、浸泡、离心、硫酸铵分级，DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析而得到，其分子量为17kD。

上述的鼠尾藻凝集素的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a. 以新鲜鼠尾藻为原料，冻干、粉碎成粗粉，按质量体积（g/ml）比为1：10~20向鼠尾藻粗粉中添加含0.15mol.L^-1NaCl的PBS缓冲液，4℃~30℃浸泡16~24h，5000r/min离心30min，取上清液；

b. 在冰水浴及搅拌条件下，添加硫酸铵粉末至上清液中，使上清液中硫酸铵饱和度达65~85％，搅拌混匀后，5000r/min离心30min，收集沉淀，弃去上清；

c. 用生理盐水溶解沉淀并用生理盐水透析至无SO₄ ^2-后，采用1.6×20cm DEAE-52纤维素离子交换层析柱，用梯度混合仪进行线性梯度洗脱，所述梯度混合仪混合瓶中的洗脱液Ⅰ是pH 7.5的0.01mol.L^-1Tris-HCl缓冲液，所述梯度混合仪储藏瓶的梯度洗脱液Ⅱ是pH 7.5含有0.8mol.L^-1 NaCl的0.15mol.L^-1 Tris-HCl缓冲液，洗脱流速为3ml/10min，按每管3ml分管，收集23~31管的洗脱产物并浓缩；

d. 将上述浓缩的洗脱产物，上1.6×90cm Sephadex G-200凝胶过滤层析柱，洗脱液为pH7.2的0.015mol/LPBS缓冲液，流速2ml/10min，按每管2ml分管，收集第51~59管的洗脱产物，冷冻干燥。

本发明首次以鼠尾藻为原料，分离、纯化出凝集细胞活性强的鼠尾藻凝集素，所凝集的细胞广泛，对于兔、狗、羊、鲫鱼、鸡及人（A、B、AB）等红细胞均有凝集作用，其中对兔及鸡红细胞凝集反应的最低浓度分别为4.4mg/ml、0.55 mg/ml，即使在100℃ 30min热处理后仍然对兔红细胞显示出血凝活性（活性下降75%），而在25℃～50℃保温30min，活性均未见改变。糖抑制性实验表明，鼠尾藻凝集素仅被糖蛋白牛甲状腺球蛋白和γ-球蛋白所抑制，最小抑制浓度分别为1.25mg.mL^-1和2.5mg.mL^-1。本发明的鼠尾藻凝集素在pH6.5～7范围内活性最高。

附图说明

图1是本发明实施例经凝胶过滤所测分子量谱图。

图2是本发明实施例DEAE-52纤维素离子交换层析的谱图。

图3是本发明实施例Sephadex G-200凝胶过滤层析谱图。

具体实施方式

a. 鼠尾藻采回后立即用过滤海水洗净，用纱布或滤纸吸干水分，放入-20℃冰箱中冷冻，然后置于冷冻干燥机中冻干，研磨成粉末，按质量体积（g/ml）比为1：20向鼠尾藻粗粉中添加含0.15mol.L^-1NaCl的PBS缓冲液，4℃浸泡16h，5000r/min离心30min，取上清液；

b. 在冰水浴及搅拌条件下，添加硫酸铵粉末至上清液中，使上清液中硫酸铵饱和度达85％，搅拌混匀后，5000r/min离心30min，收集沉淀，弃去上清；

c. 用生理盐水溶解沉淀并用生理盐水透析至无SO₄ ^2-后，采用1.6×20cm 的DEAE-52纤维素离子交换层析柱，用pH值7.5，0.01mol/L^-1 Tris-HCl缓冲液平衡至A₂₈₀<0.01再上样，用梯度混合仪进行线性梯度洗脱，所述梯度混合仪混合瓶中的洗脱液Ⅰ是pH 7.5的0.01mol.L^-1Tris-HCl缓冲液，所述梯度混合仪储藏瓶的梯度洗脱液Ⅱ是pH 7.5含有0.8mol.L^-1 NaCl的0.15mol.L^-1 Tris-HCl缓冲液，梯度混合瓶与恒流泵相连，恒流泵与层析柱顶端相连，调好流速为3ml/10min ，按每管3ml分管，收集23~31管的洗脱产物并浓缩；

DEAE-52纤维素离子交换层析的谱图如图2所示：经线性离子梯度洗脱，可得两个蛋白吸收峰，经紫外分光光度计检测在280nm时的吸光值后，对各蛋白质吸收峰进行凝集活性测定，用兔血红细胞进行检测，表明第一个蛋白峰（相对于23~31管）有凝血活性。

d. 将上述浓缩的洗脱产物，上1.6×90cm Sephadex G-200凝胶过滤层析柱，洗脱液为pH7.2的0.015mol/LPBS缓冲液（0.015mol/L，Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH 7.2），流速2ml/10min，按每管2ml分管，收集第51~59管的洗脱产物，冷冻干燥得白色样品，即鼠尾藻凝集素。

Sephadex G-200凝胶过滤层析谱图如图3所示：可以分出两个吸收峰，经紫外分光光度计检测在280nm时的吸光值后，对各蛋白质吸收峰进行凝集活性测定，用兔血红细胞进行检测，表明第二个蛋白峰（相对于51~59管）有凝血活性。

将所得产物经凝胶过滤分析其分子量为17kD，其谱图如图1所示，图中1是牛甲状腺球蛋白（MW669000D），2是胰蛋白酶（MW23300D），3是细胞色素C（Cytochrome C）（MW12200D），4是本发明实施例的鼠尾藻凝集素。

实验及结果：

凝集活性的测定方法：

在96孔 V型血凝板上用40μl本发明实施例凝集素溶液与等量生理盐水系列倍比稀释后，加入2%红细胞悬液40μl，振匀，室温放置2h后，肉眼观察，无凝集现象时红细胞沉积在V 型孔底部呈大红点状，有凝集现象时呈网状不下沉，血凝活力以产生凝集现象时的最小凝集素量或凝集素最大稀释倍数表示。本发明实施例的鼠尾藻凝集素对10种红细胞有凝集作用，其中对鸡血细胞的凝集活力却高达2⁷，实验结果见表1：

表1 鼠尾藻凝集素血凝活性

糖抑制试验：

选择以下糖类: α-乳糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、蔗糖、麦芽糖、D-葡萄糖，起始浓度为80mmol/L；选择的糖蛋白：γ-球蛋白、牛甲状腺球蛋白，起始浓度为20g/L。在96孔V型血凝板中加入糖或糖蛋白溶液40μL，用生理盐水进行倍比稀释，然后加入40μL能凝集兔红细胞的最小浓度2倍的本发明鼠尾藻凝集素，静置15min（室温），再加入40μL，2%兔红细胞悬液振匀，静置2h，观察糖抑制兔红细胞凝集的最小浓度。

结果表明本发明鼠尾藻凝集素不被所测试的单糖、二糖、聚糖所抑制，仅被糖蛋白（牛甲状腺球蛋白和γ-球蛋白）所抑制，最小抑制浓度分别为1.25mg.mL^-1和2.5mg.mL^-1。结果见表2。

表2糖和糖蛋白对本发明实施例血凝活性的抑制作用

注:“—”表示无抑制作用

热稳定性实验：

将本发明鼠尾藻凝集素分成若干份，每份1ml，分别在25℃～100℃的不同条件下温育，于30min后取样，冷却，测定血凝活性。

将鼠尾藻凝集素进行热稳定性实验，结果表明：在100℃ 30min热处理后仍然对兔红细胞显示出血凝活性，活性仅下降75%。在25℃～50℃保温30min，活性均未见改变。结果见表3。

表3 鼠尾藻凝集素的热稳定性

 pH对血凝活性的影响：

参照Ahmed和Chatterjee 方法配制 pH4.0～10.14的系列缓冲液，测定不同条件下血凝活性。pH4.0～6.0采用0.015mol/L的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液；pH6.50～7.50采用0.015mol.L^-1磷酸盐缓冲液；pH8.0～9.0采用0.015mol.L^-1的Tris-HCl缓冲液pH9.51～10.14 采用0.015mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。

在96孔V型血凝板上用40μL pH缓冲液与等量的本发明鼠尾藻凝集素系列倍比稀释后, 加入40μl，2%兔红细胞悬液, 振匀, 静置2h, 观察缓冲溶液对血凝活性的影响。

本发明的鼠尾藻凝集素在pH4.0～10.55缓冲系统中，25℃静置2h，用兔红细胞测定其血凝活性，在pH≥7.5或pH≤6.0时，其活性下降50%，在pH6.5～7.0范围内活性最高。结果见表4

表4 鼠尾藻凝集素的pH稳定性

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Claims (1)

1.一种鼠尾藻凝集素的制备方法，是以鼠尾藻为原料，经冻干、粉碎、浸泡、离心、硫酸铵分级，DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析而得到，其分子量为17kD，其特征在于按如下步骤进行：

a. 以新鲜鼠尾藻为原料，冻干、粉碎成粗粉，按质量体积（g/ml）比为1：10~20向鼠尾藻粗粉中添加含0.15mol.L^-1NaCl的PBS缓冲液，4℃~30℃浸泡16~24h，5000r/min离心30min，取上清液；

b. 在冰水浴及搅拌条件下，添加硫酸铵粉末至上清液中，使上清液中硫酸铵饱和度达65~85％，搅拌混匀后，5000r/min离心30min，收集沉淀，弃去上清；

c. 用生理盐水溶解沉淀并用生理盐水透析至无SO₄ ^2-后，采用1.6×20cm DEAE-52纤维素离子交换层析柱，用梯度混合仪进行线性梯度洗脱，所述梯度混合仪混合瓶中的洗脱液Ⅰ是pH 7.5的0.01mol.L^-1Tris-HCl缓冲液，所述梯度混合仪储藏瓶的梯度洗脱液Ⅱ是pH 7.5含有0.8mol.L^-1 NaCl的0.15mol.L^-1 Tris-HCl缓冲液，洗脱流速为3ml/10min，按每管3ml分管，收集23~31管的洗脱产物并浓缩；

d. 将上述浓缩的洗脱产物，上1.6×90cm Sephadex G-200凝胶过滤层析柱，洗脱液为pH7.2的0.015mol/LPBS缓冲液，流速2ml/10min，按每管2ml分管，收集第51~59管的洗脱产物，冷冻干燥。