CN101422134A - 组织培养叶片法大量繁育鼠尾藻幼苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鼠尾藻的繁育，具体地说是组织培养叶片法大量繁育鼠尾藻幼苗的方法。1)挑选鼠尾藻样品中完整的主枝用消毒海水消毒；2)然后用AgCl消毒处理，用手术刀取下主枝中下部宽大的叶片，用镊子放入事前准备好的培养液中；培养温度从13～20℃，光照强度为15～50μmol/m2per s，光照周期的光照∶黑暗＝8－10∶16－14h；3)培养前7－10天无须通气，7－10天后，叶片的伤口愈合完毕开始通气培养，培养液35－45天更换一次，培养3个月后，叶片中下部生出数簇萌芽；培养5个月后可以采集再生植株进行定植培养。本发明需要的植物材料少、养殖空间少、可以长期进行种质保存、繁殖量大、苗质纯等。
Description
技术领域
本发明涉及鼠尾藻的繁育，具体地说是组织培养叶片法大量繁育鼠尾藻幼苗的方法。
背景技术
鼠尾藻[Sargassum thunbergii(Mert.)O.Kuntze]隶属于褐藻门、无孢子纲、马尾藻科、马尾藻属，是我国沿海常见的一种暖温带海藻。集生于中潮带和低潮带岩石或在高、中潮带的水陆或石沼中，部分植株可以常时间暴露于日光下，而不影响其生长发育。鼠尾藻除在海洋生态系统中占有重要的地位外，在水产养殖、医药、保健以及化学工业等行业中也具有重要的应用价值。因此，鼠尾藻具有非常广阔的市场开发前景
鼠尾藻为海参、皱纹盘鲍养殖的重要饵料。稚参养殖期除继续投喂单细胞藻以外，宜增喂鼠尾藻的磨碎液，这样可以增加海参的成色并提高抗病能力；海参保苗后期除投喂新鲜海泥外，也可混合鼠尾藻的磨碎液一起投喂；鼠尾藻结合其他成分制成的混合饲料完全可以替代单细胞藻类饲养海湾扇贝的亲贝以及面盘幼虫。
鼠尾藻在中药上常用于甲状腺肿大、淋巴结核，心绞痛等的治疗。其体内所含的多糖类物质具有免疫促进作用。这些多糖类物质常被用做免疫增强剂。另外，鼠尾藻体内的褐藻多酚是一类海洋生物天然抗氧化剂。鼠尾藻资源在医药与保健食品上具有相当的开发前景。
鼠尾藻是生产代血浆的重要原料。从鼠尾藻中提取褐藻胶后再经过一系列的工序，可以制成褐藻胶代血浆。这种代血浆具有不在体内积蓄、不影响内脏器官、对循环系统有充实作用和加快体内毒素排出的特点，并且升压效果明显，可以加速组织胺的排除。另外，从鼠尾藻中可提取经济价值较大的甘露醇、碘等化工原料；鼠尾藻也是凝集素的重要生产原料。
自然条件下，鼠尾藻采用有性和营养两种繁殖方式。鼠尾藻的有性繁殖季节性特别强，因此，很难采用人为控制其有性生殖节奏的方式大量生产幼苗。脱落主枝后的固着器仍然可以萌发形成新的主枝，这种营养的繁殖方式为我们实施多茬养殖提供方便。然而，现有的鼠尾藻养殖技术需要带有固着器的整株藻类，因此，鼠尾藻的人工繁殖用苗需要全部从自然界中获得，大量的夹苗养殖给自然生态系统带来了巨大的破坏作用。由于鼠尾藻具有较高的价值，大量的野生苗被采集直接用于饲料加工或工业原料。现在，已经很难在潮间带区域发现较大面积的野生鼠尾藻。因此，我们急需一种新的鼠尾藻繁育方式，这种方式可以长期大量生产藻苗并给自然环境带来较少的压力。
组织培养技术被越来越多地应用于植物的育苗研究，而且效果明显。然而，海洋生物技术发展相对滞后，很少有研究采用组织培养的方式来繁殖经济藻类幼苗。未见采用组织培养鼠尾藻叶片的方法来繁育幼苗的相关报道。
发明内容
本发明采用组织培养鼠尾藻叶片的方法来繁育幼苗，其需要的植物材料少、养殖空间少、可以长期进行种质保存、繁殖量大、苗质纯等。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
组织培养叶片法大量繁育鼠尾藻幼苗的方法，具有如下步骤，
1)挑选鼠尾藻样品中完整的主枝用消毒海水冲洗，用含有混合灭菌剂的消毒海水浸泡样品4～6个小时后，用消毒海水冲洗2-4次；
混合灭菌剂的组成：ampicillin、penicillin、rifampicin和nystatin分别0.18-0.22mg/L以及0.08-0.12g/L GeO2；
2)然后用质量浓度0.8-1.2％的AgCl消毒处理2-4分钟后，用大量消毒海水冲洗2-4次；用手术刀取下主枝中下部宽大的叶片，用镊子放入事前准备好的培养液中；培养液采用ES培养基+BG-11海水化营养液组成；
培养温度从13～20℃，光照强度为15～50μmol/m2per s，光照周期的光照：黑暗＝8-10：16-14h；
3)培养前7-10天无须通气，7-10天后，叶片的伤口愈合完毕开始通气培养，培养液35-45天更换一次，培养个3月后，叶片中下部生出数簇萌芽；培养5个月后可以采集再生植株进行定植培养。
步骤3)中的所述定植培养，培养液为煮沸的海水，内含0.08-0.12mol/LNaNO3以及0.08-0.12mol/L NaH2PO4，室温下充气培养，自然光照，培养液25-35天更换一次；培养7-8个月后，可采用天然海水在自然条件下培养鼠尾藻。
步骤2)中的培养温度可为15～17℃，光照强度为25～35μmol/m2pers。
步骤1)中的鼠尾藻样品采集到后挑出完整且发育良好的植株，将藻株在解剖镜下用毛刷清除杂质以及其上的附着生物，用消毒海水冲洗2～4次；再用超声波清洗1-2分钟，然后用消毒海水清洗2～4次。
步骤1)中的鼠尾藻样品采集到后通常不能立即使用，组织培养前需要进行样品暂养，样品暂养培养液为消毒海水，内含0.08-0.12mol/L NaNO3和0.08-0.12mol/L NaH2PO4；光照周期为光照：黑暗＝9：15h，光照强度为18-22μmol/m2per s，由白色荧光灯提供。
本发明具有如下优点：
(1)使用样品量少，对生态环境的保护起到积极的作用。本发明仅用叶片为材料进行扩增繁殖，而单株主枝上就拥有上千的叶片，所以实验中使用的野生材料相当少。
(2)节约空间而且效率高，样品可以循环利用，无需再采集野生藻。5L的三角烧瓶就可以培养150多簇再生个体，而每簇又可以分生数十株幼苗。
(3)培养条件容易控制。本发明可以调节培养条件以达到不同的实验目的。如某些条件下需要产生更多的次生代谢物质，则调节至相应的培养条件。
(4)可长期对种质进行保存，育苗过程不受自然条件的限制。实验结果显示，发育成簇的再生幼体可以常年保存。
附图说明
图1为鼠尾藻(Sargassum thunbergii)叶片组织培养育苗技术示意图；其中，A：实验室条件下大量繁殖再生个体并可长期进行种质保存；B：取出再生个体并进行分株附着培养；C：将定植的再生个体转移到室外条件下进行培养并使其发育成熟。
图2为实验室条件下鼠尾藻(Sargassum thunbergii)叶片的再生过程；其中，A：野生条件下鼠尾藻的丝状主枝；B：用于再生培养的主枝中下部叶片；C：基部萌芽的母体叶片，叶片一直于营养液中充气培养，培养时间为3个月；D：发育中的再生个体，培养时间为4个月；E：移植到培养基(石块)上的再生个体，培养时间为6个月；F：再生个体萌发形成新的主枝，培养时间为8个月；G：发育成熟的叶片再生植株，培养时间为10个月。比例尺，1cm。
具体实施方式
本发明的设计思路可参见图1所示，
(1)实验室条件下采用简单生物反应器组织培养鼠尾藻叶片，使其再生并形成大量幼苗(图1A)。
(2)取出并分离幼苗，使分离的幼苗附着在培养基质上；保留或添加适量的组织培养体，循环培养(图1B)。
(3)将幼苗连同幼苗附着基质一起移至室外条件下(养殖区)并养殖幼苗，使其发育成熟(图1C)。
实验操作
1)预用样品清洗。采集到鼠尾藻样品后挑出完整且发育良好的植株。这些藻株需要在解剖镜下用毛刷清除杂质以及其他较大的附着生物，用消毒海水冲洗2～4次。用低频超声波清洗1-2分钟，然后用消毒海水清洗2～4次去除其它的较大的生物与杂质。
2)样品暂养。组织培养前，样品暂养条件为：圆形水族缸内(r＝20cm，h＝35cm)培养，培养液为消毒海水，内含0.1mol/L NaNO3以及0.1mol/LNaH2PO4。光照周期为9：15h(光照：黑暗)，光照强度为～20μmol/m2pers，由白色荧光灯提供。
消毒海水为在0.1MPa-0.15MPa压力条件下灭菌25-40分钟的高压灭菌天然海水；
3)组织培养操作过程。挑选样品中完整的主枝用消毒海水冲洗数次。用含有混合灭菌剂[ampicillin，penicillin，rifampicin，nystatin(各0.2mg/L，氨苄青霉素Ampicillin；青霉素Penicillin；利福平Rifampicin；制霉菌素nystatin)以及0.1g/L GeO2]的消毒海水浸泡样品4～6个小时后，用消毒海水冲洗数次，然后用1％的AgCl消毒处理3分钟后，用大量消毒海水冲洗数次。用手术刀取下主枝中下部宽大的叶片(注意保持叶片的完整性)，用镊子放入事前准备好的培养液中。所有器具以及培养消毒用品均高压灭菌，超净工作台紫外照射4小时后用于操作，用前台面75％酒精消毒。
组织培养条件。培养液采用通用的ES海水培养液并附加BG-11配方的微量元素。培养温度从13～20℃均可，但15～17℃效果最好，叶片再生率可以达到30％。光照强度为15～50μmol/m2per s，30μmol/m2per s效果最好。光照周期需要短日照：9：15h或者10：14h或者8：16h(光照：黑暗)。以上三种光照周期结果差别不大。
采用的培养液为：ES培养基+BG-11海水化营养液，即于通用的ES海水培养液中加入BG-11配方的成份；
BG-11配方：H3BO3 2.86μg/l，MnCl.4H2O 1.81μg/l，ZnSO4.7H2O0.222μg/l，NaMoO4.2H2O 0.39μg/l，CuSO4.5H2O 0.079μg/l，Co(NO3)2.6H2O 0.0494μg/l；
附ES培养基(即通用的ES海水培养液)组成：
| 成分 | 100毫升蒸馏水 |
| NaNO3 | 350mg |
| Na2glycerophosphate5 H2O | 50mg |
| Fe-solution | 25mL |
| PII metal-solution | 25mL |
| vitamin B12 | 10microg |
| thiamine | 0.5mg |
| biotin | 5microg |
| Tris buffer(SigmaCo.) | 500mg |
Fe-solution：
在500毫升溶解351毫克Fe(NH4)2(SO4)26H2O以及300毫克Na2EDTA.
PII metal solution：
| 成分 | 100毫升蒸馏水 |
| Na2EDTA | 100mg |
| H3BO3 | 114mg |
| FeCl3·6H2O | 4.9mg |
| MnSO4H2O | 16.4mg |
| ZnSO4·7H2O | 2.2mg |
| CoSO4.7H2O | 0.48mg |
4)组织培养管理。培养前10天无须通气培养。10天后，伤口愈合完毕开始通气培养。培养液40天更换一次。培养个3月后，叶片中下部生出数簇萌芽；培养5个月后可以采集再生组织进行定植培养，定植培养液为煮沸的海水，内含0.1mol/L NaNO3以及0.1mol/L NaH2PO4，室内温度下充气培养，自然光照，培养液每月更换一次。培养7-8个月后，采用天然海水在自然条件下培养。
实验结果
组织培养结果显示，一个单独的鼠尾藻叶片可以产生大量的再生簇状分蘖，每一个分蘖的叶片或小簇叶片均可以再生形成新的鼠尾藻植株。
实施例
本次实验从2005年6月24号开始，到2006年4月11号止。鼠尾藻样品于2005年6月24号采自青岛第二海水浴场潮间带(35.35°N，119.30°E，水面以下10-35cm)。样品清洗、暂养以及操作过程同上述实验操作。培养液采用通用的ES海水培养液并附加微量元素(按BG-11配方的成份附加)。培养温度为17℃。叶片再生率为33％。光照强度为35μmol/m2per s。光照周期为9：15h(光照：黑暗)。组织培养管理同上述。叶片的再生过程见图2。
Claims (5)
1.组织培养叶片法大量繁育鼠尾藻幼苗的方法，具有如下步骤，
1)挑选鼠尾藻样品中完整的主枝用消毒海水冲洗，用含有混合灭菌剂的消毒海水浸泡样品4～6个小时后，用消毒海水冲洗2-4次；
混合灭菌剂的组成：ampicillin、penicillin、rifampicin和nystatin分别0.18-0.22mg/L以及0.08-0.12g/L GeO2；
2)然后用质量浓度0.8-1.2％的AgCl消毒处理2-4分钟后，用大量消毒海水冲洗2-4次；用手术刀取下主枝中下部宽大的叶片，用镊子放入事前准备好的培养液中；培养液采用ES培养基+BG-11海水化营养液组成；
培养温度从13～20℃，光照强度为15～50μmol/m2per s，光照周期的光照：黑暗＝8-10：16-14h；
3)培养前7-10天无须通气，7-10天后，叶片的伤口愈合完毕开始通气培养，培养液35-45天更换一次，培养个3月后，叶片中下部生出数簇萌芽；培养5个月后可以采集再生植株进行定植培养。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中的所述定植培养，培养液为煮沸的海水，内含0.08-0.12mol/L NaNO3以及0.08-0.12mol/L NaH2PO4，室温下充气培养，自然光照，培养液25-35天更换一次；培养7-8个月后，可采用天然海水在自然条件下培养鼠尾藻。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中的培养温度可为15～17℃，光照强度为25～35μmol/m2per s。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中的鼠尾藻样品采集到后挑出完整且发育良好的植株，将藻株在解剖镜下用毛刷清除杂质以及其上的附着生物，用消毒海水冲洗2～4次；再用超声波清洗1-2分钟，然后用消毒海水清洗2～4次。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中的鼠尾藻样品采集到后通常不能立即使用，组织培养前需要进行样品暂养，样品暂养培养液为消毒海水，内含0.08-0.12mol/L NaNO3和0.08-0.12mol/LNaH2PO4；光照周期为光照：黑暗＝9：15h，光照强度为18-22μmol/m2per s，由白色荧光灯提供。
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