CN107722128A - 一种非均一组分的树蝴蝶精制多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品的技术领域，公开了一种非均一组分的树蝴蝶精制多糖及其制备方法与应用。所述方法为：(1)将树蝴蝶在蒸馏水中进行回流提取，脱色处理，沉淀，离心，收集沉淀物并干燥，得到树蝴蝶粗多糖；(2)将树蝴蝶粗多糖配制成多糖溶液，转入装有经过预处理的DEAE‑52树脂的层析柱中，依次用0～0.2mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl溶液洗脱，收集0.3mol/L NaCl溶液洗脱的，检测洗脱液，测定490nm下的吸光度，绘制曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并；浓缩，干燥，得到精制多糖。本发明的多糖具有抗氧化、抗肿瘤和免疫增强活性，且使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。

Description

一种非均一组分的树蝴蝶精制多糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于食品的技术领域，具体涉及一种非均一组分的树蝴蝶精制多糖及其制备方法与应用。

背景技术

多糖是除了蛋白质和核酸以外的一类重要的生物高分子化合物。现代药理研究表明多糖具有多种生理活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、延缓衰老、增强免疫功能等。而大多数高等植物来源的多糖均为无不良反应的物质，不会对机体产生较大的副作用，因此，从植物中分离的多糖在生物医学上引起极大关注。目前已对百余种植物多糖进行了活性相关的研究报道。研究表明植物多糖可通过与免疫细胞表面的多种受体结合、激活不同的信号通路来调控动物机体内的免疫系统，包括：刺激巨噬细胞、T/B淋巴细胞、自然杀伤细胞的分泌或增殖；调节细胞因子的释放；促进抗体的分泌；激活补体系统等。

对这些活性物质的作用机制也在不断发展，其中多糖对非特异性诱导的免疫机制更受到人们的重视。植物多糖是最理想的免疫候选药物。

树蝴蝶为子囊地衣类(Ascolichenes)茶渍目(Lecanorales)牛皮叶科(Stictaceae)肺衣属(Lobaria Hoffm)植物光肺衣、裂芽肺衣和网肺衣的干燥叶状地衣体，具有良好的药理作用，具有健脾利水、祛风止痒等功效。对树蝴蝶多糖的研究报道几乎没有。大多数天然活性多糖是无毒副作用的天然绿色产品。随着研究的不断深入，天然多糖越来越成为食品、保健品、医药等领域的研究热点。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种非均一组分的树蝴蝶多糖的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的非均一组分的树蝴蝶精制多糖，使其多糖获得率高。

本发明的再一目的在于提供上述非均一组分的树蝴蝶精制多糖的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种非均一组分的树蝴蝶精制多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)将树蝴蝶在蒸馏水中进行回流提取，采用大孔吸附树脂对提取液进行脱色处理，再采用沉淀剂进行沉淀，离心，收集沉淀物并干燥，得到树蝴蝶粗多糖；

(2)将树蝴蝶粗多糖配制成多糖溶液，转入装有经过预处理的DEAE-52树脂的层析柱中，依次用0～0.28mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液洗脱，收集0.3mol/L NaCl溶液洗脱的洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，测定490nm下的吸光度，绘制洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并；然后旋蒸浓缩，真空冷冻干燥，得到非均一组分组分的精制多糖，0.3mol/L NaCl洗脱得到的精制多糖记为LKY-III。

步骤(2)中所述的DEAE-52树脂预处理的方法为：将DEAE-52树脂用水4～40℃浸泡12～24h；再用0.5mol/L的盐酸溶液浸泡0.5～2h；0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.5～2h，过滤，水洗至中性，得到经过预处理的DEAE-52树脂；

步骤(2)中所述的旋蒸浓缩的温度为40～60℃。

步骤(2)中所述层析柱为Z型层析柱。步骤(2)中所述0～0.28mol/L NaCl溶液(0mol/L NaCl溶液为蒸馏水)、0.3mol/L NaCl溶液进行洗脱时流速为5～10s/滴。

步骤(2)中所述装有经过预处理的DEAE-52树脂的层析柱是通过以下方法装填而成：将经过预处理的DEAE-52树脂于40～60℃旋转蒸发除气泡后转入Z型层析柱中，用恒流泵泵送蒸馏水以使填料装柱均匀，平衡后流速5～10s/滴。

步骤(1)中所述树蝴蝶粗多糖的具体制备方法为：

(1-1)将树蝴蝶粉碎过筛，得到树蝴蝶粗粉；向树蝴蝶粗粉中加入蒸馏水进行超声处理，加热回流提取，抽滤，并将滤液浓缩，得到浓缩的树蝴蝶粗多糖溶液；

(1-2)将树蝴蝶粗多糖溶液和经过预处理的大孔吸附树脂混合，脱色处理，过滤出多糖溶液，并用水反复洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖溶液合并，减压浓缩，得到浓缩糖液；

(1-3)向浓缩糖液中加入沉淀剂进行沉淀，离心，收集沉淀物并干燥，得到树蝴蝶粗多糖。

步骤(1-1)中所述超声时间为10～20min；超声功率为60～400W；

步骤(1)和(1-1)所述加热回流的温度为75～100℃；步骤(1)和(1-1)所述的热水回流提取的时间为2～4h；步骤(1)和(1-1)中热水回流提取的次数为2～4次；

步骤(1)和(1-1)中所述树蝴蝶粗粉与蒸馏水的质量比为1:20～1:30；热水回流提取多次时，树蝴蝶粗粉与每一次使用的蒸馏水的质量比为1:20～1:30。

步骤(1-1)中所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为40～60℃；步骤(1-2)中所述减压浓缩的温度为40～60℃。

步骤(1)和(1-2)所述脱色处理的条件为于40～60℃水浴2～4h；

步骤(1)和(1-2)中所述大孔吸附树脂为D354FD树脂；

步骤(1)和(1-2)中所述大孔吸附树脂在使用前需进行预处理，预处理的方法为：将大孔吸附树脂依次采用蒸馏水、盐酸浸泡，洗涤至中性，再用氢氧化钠溶液浸泡，再洗涤至中性，得到经过预处理的大孔吸附树脂。所述蒸馏水浸泡的时间为12～24h，盐酸的浓度为3～5wt％，盐酸浸泡的时间为0.5～3h，氢氧化钠溶液的浓度为3～5wt％，氢氧化钠溶液浸泡的时间为0.5～3h。

步骤(1)和(1-3)中所述沉淀剂为无水乙醇或体积分数为90～100％的乙醇溶液；

步骤(1)和(1-3)中所述沉淀的时间为8～24h；

步骤(1)和(1-3)中所述沉淀的温度为0～4℃。

步骤(1-3)中所述沉淀剂的加入量为浓缩糖液体积的3～5倍；

步骤(1)和(1-3)中所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为12～15min；步骤(1)和(1-3)中所述干燥的温度为40～60℃，干燥至恒重。

所述的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)为非均一组分。

所述非均一组分的树蝴蝶精制多糖，通过上述制备方法制备得到。

所述非均一组分的树蝴蝶精制多糖在制备抗癌、抗氧化免疫增强药物中的应用。

本发明的原理：植物来源的多糖具有抗氧化、抗肿瘤和增强免疫功能等多种生物活性。多糖尤其能通过调节巨噬细胞的免疫功能体现出各种有益的药理作用。本发明通过体外实验发现和确证植物粗多糖具有抗氧化、抗肿瘤和免疫增强活性，且使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的精制多糖(LKY-III)对DPPH自由基、ABTS自由基具有一定的清除和抑制作用；

(2)本发明的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)对人乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞HCC827和肝癌HepG-2具有一定的增殖抑制作用；

(3)本发明的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)能显著增强RAW264.7巨噬细胞NO的释放；

(4)本发明的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)能显著增强RAW264.7巨噬细胞IL-6及TNF-α的释放；

(5)本发明的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)能显著增加RAW264.7巨噬细胞iNOS、IL-6、TNF-α的表达

(6)树蝴蝶精制多糖的用药剂量比较低，而且在有效用药剂量范围内毒性较低。

附图说明

图1是实施例4制备得到的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)的离子交换柱层析洗脱曲线图；

图2是实施例4制备得到的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)的高效凝胶渗透色谱(GPC)图；

图3实施例4制备的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)对DPPH抑制率的曲线图；

图4实施例4制备的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)对ABTS自由基抑制率的曲线图；

图5是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖LKY和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制率的影响图；

图6是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖LKY和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)对肺癌细胞HCC827的增殖抑制率的影响图；

图7是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖LKY和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)对肺癌细胞HepG-2的增殖抑制率的影响图；

图8是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖LKY和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响图；

图9是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖LKY和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)对RAW264.7巨噬细胞释放NO的影响图；其中，*：与control组(Negative control)比较，P<0.05；**：与control组比较，P<0.01；

图10是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖LKY和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)对RAW264.7巨噬细胞释放IL-6的影响图；其中，*：与control组(Negative control)比较，P<0.05；**：与control组比较，P<0.01；

图11是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖LKY和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖(LKY-I)对RAW264.7巨噬细胞释放TNF-α的影响图；其中，*：与control组(Negative control)比较，P<0.05；**：与control组比较，P<0.01。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中，人乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞HCC827、肝癌细胞HepG-2和小鼠巨噬细胞RAW 264.7购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；树蝴蝶购于广州清平药材市场。

实施例1从树蝴蝶中制备得到树蝴蝶粗多糖(LKY)：

(1)树蝴蝶粉碎后过20目筛，称取100g，加入蒸馏水，以60W功率超声处理20min，加热回流提取，其中，水料比为20:1(质量比)，回流提取温度为75℃，回流提取时间为4h，回流提取次数3次；然后合并提取液真空抽滤，将滤液用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至200mL，得到多糖溶液；

(2)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡12h，得到经过预处理的D354FD树脂；

(3)将步骤(1)制备得到的多糖溶液和200g经过预处理的D354FD树脂混合，置于50℃恒温水浴锅中恒温水浴3h进行脱色，间隔搅拌，然后过滤出多糖溶液，并用水反复清洗(5次)出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；

(4)在搅拌的条件下，向步骤(3)的浓缩糖液中加入4倍体积的无水乙醇，于4℃条件下醇沉8h，然后4000rpm下离心分离15min，弃去上清液，取出沉淀物于45℃烘干，得到树蝴蝶粗多糖(LKY)，粗多糖的得率为4.06％。

实施例2从树蝴蝶中制备得到树蝴蝶粗多糖(LKY)：

(1)树蝴蝶粉碎后过20目筛，称取100g，加入蒸馏水，以80W功率超声处理15min，加热回流提取，水料比20:1(质量比)，回流提取温度为80℃，回流提取时间为3h，回流提取次数2次；然后合并提取液，真空抽滤，将滤液用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩至200mL，得到多糖溶液；

(2)将D354FD树脂用蒸馏水浸泡24h，用质量分数为5％的盐酸溶液质量分数为5％的氢氧化钠溶液浸泡2h，200目纱布过滤，得到经过预处理的D354FD树脂；

(3)将步骤(1)制备得到的多糖溶液和200g经过预处理的D354FD树脂混合，置于40℃恒温水浴锅中恒温水浴2h进行脱色，间隔搅拌，然后过滤出多糖溶液，并用水反复清洗(4次)出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；

(4)在搅拌的条件下，向步骤(3)的浓缩糖液中加入3倍体积的体积分数为95％的乙醇溶液，于0℃条件下醇沉12h，然后3000rpm下离心分离12min，弃去上清液，取出沉淀物于50℃烘干，得到树蝴蝶粗多糖(LKY),粗多糖的得率为4.23％。

实施例3从树蝴蝶中制备得到树蝴蝶粗多糖(LKY)：

(1)树蝴蝶粉碎后过20目筛，称取100g，加入蒸馏水，以100W功率超声处理10min，加热回流提取，其中，水料比为20:1(质量比)，回流提取温度为95℃，回流提取时间为2h，回流提取次数4次，然后合并提取液，真空抽滤，将滤液用旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩至200mL，得到多糖溶液；

(2)将D354FD树脂用蒸馏水浸泡18h，用质量分数为5％的盐酸溶液3质量分数为5％的氢氧化钠溶液浸泡3h，200目纱布过滤，得到经过预处理的D354FD树脂；

(3)将步骤(1)中制备得到的多糖溶液和200g经过预处理的D354FD树脂混合，置于60℃恒温水浴锅中恒温水浴4h进行脱色，间隔搅拌，之后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗(5次)洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；

(4)在搅拌的条件下，向步骤(3)的浓缩糖液中加入5倍体积的体积分数为95％的乙醇，于4℃条件下醇沉24h，然后5000rpm下离心分离14min，弃去上清液，取出沉淀物于60℃烘干，得到树蝴蝶粗多糖(LKY)，粗多糖的得率为4.39％。

实施例4树蝴蝶精制多糖(LKY-III)的制备：

(1)DEAE-52预处理：取70g的DEAE-52，用蒸馏水40℃浸泡24h，然后小心将上层水倒出，除去杂质，再用0.5mol/L的盐酸溶液浸泡0.5h，将上层酸液小心倒出，抽滤至干后用蒸馏水洗脱至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.5h，小心倒出上层碱液，抽滤至干后用蒸馏水洗至中性，备用；

(2)将经过预处理的DEAE-52于48℃旋转蒸发除气泡后玻璃棒引流转入2.6×30cm规格的Z型层析柱中，用恒流泵泵送蒸馏水以使填料装柱均匀，平衡后7s/滴；

(3)称取100mg实施例1中制备得到的树蝴蝶粗多糖(LKY)，采用蒸馏水配制成多糖溶液，玻璃棒引流至层析柱中，依次用0.1mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl溶液洗脱，流速为1.2ml/min，自动收集0.3mol/L NaCl溶液洗脱的洗脱液，每根管收集大约5mL，苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，测定490nm处的吸光度，绘制洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并；然后洗脱液40℃旋蒸浓缩，真空冷冻干燥，得到树蝴蝶精制多糖。LKY经过DEAE-52离子交换柱层析后得到非均一组分，0.3mol/L NaCl洗脱得到的精制多糖命名为LKY-III，质量占上样量的5.0％。图1为本实施例制备得到的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)的离子交换柱层析洗脱曲线图。

实施例5树蝴蝶精制多糖(LKY-III)的制备：

(1)DEAE-52预处理：取70g的DEAE-52，用蒸馏水20℃浸泡12h，然后小心将上层水倒出，除去杂质，再用0.5mol/L的盐酸溶液浸泡1h，将上层酸液小心倒出，抽滤至干后用蒸馏水洗脱至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡1h，小心倒出上层碱液，抽滤至干后用蒸馏水洗至中性，备用；

(2)将经过预处理的DEAE-52于48℃旋转蒸发除气泡后玻璃棒引流转入2.6×30cm规格的Z型层析柱中，用恒流泵泵送蒸馏水以使填料装柱均匀，平衡后7s/滴；

(3)称取100mg实施例1中制备得到的树蝴蝶粗多糖(LKY)，采用蒸馏水配制成多糖溶液，玻璃棒引流至层析柱中，依次用0.1mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液洗脱，自动收集0.3mol/L NaCl溶液洗脱的洗脱液，每根管收集大约5mL，苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，测定490nm处的吸光度，绘制洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并；然后洗脱液50℃旋蒸浓缩，真空冷冻干燥，得到树蝴蝶精制多糖。LKY经过DEAE-52离子交换柱层析后得到非均一组分，0.3mol/L NaCl洗脱得到的精制多糖命名为LKY-III，质量占上样量的5.0％。本实施例的离子交换柱层析洗脱结果同实施例4。

实施例6树蝴蝶精制多糖(LKY-III)的制备：

(1)DEAE-52预处理：取70g的DEAE-52，用蒸馏水25℃浸泡20h，然后小心将上层水倒出，除去杂质，再用0.5mol/L的盐酸溶液浸泡0.8h，将上层酸液小心倒出，抽滤至干后用蒸馏水洗脱至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.8h，小心倒出上层碱液，抽滤至干后用蒸馏水洗至中性，备用；

(2)将经过预处理的DEAE-52于48℃旋转蒸发除气泡后玻璃棒引流转入2.6×30cm规格的Z型层析柱中，用恒流泵泵送蒸馏水以使填料装柱均匀，平衡后7s/滴；

(3)称取100mg实施例1中制备得到的树蝴蝶粗多糖(LKY)，采用蒸馏水配制成多糖溶液，玻璃棒引流至层析柱中，依次用0mol/L NaCl水溶液(蒸馏水)、0.3mol/L NaCl溶液洗脱，自动收集0.3mol/L NaCl溶液洗脱的洗脱液，每根管收集大约5mL，苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，测定490nm处的吸光度，绘制洗脱曲线同一吸收峰内的洗脱液合并；然后洗脱液60℃旋蒸浓缩，真空冷冻干燥，得到树蝴蝶精制多糖。LKY经过DEAE-52离子交换柱层析后得到非均一组分，0.3mol/L NaCl洗脱得到的精制多糖命名为LKY-III，质量占上样量的5.0％。本实施例的离子交换柱层析洗脱结果同实施例4。

实施例7LKY-III的GPC分析

采用高效液相色谱仪分别对实施例4～6制备得到的树蝴蝶精制多糖LKY-III的分子量及其纯度进行测定。色谱条件：TSK G-5000PXL column(7.8×300mm)和TSK G-3000PXLcolumn(7.8×300mm)串联，流动相为0.02mol/L的KH₂PO₄缓冲溶液，流速为0.6mL/min，2414示差检测器，柱温35℃。图2是实施例4制备得到的树蝴蝶精制多糖(LKY-III)的高效凝胶渗透色谱(GPC)图。

结果分析：

(1)实施例4制备得到的树蝴蝶精制多糖LKY-III的GPC图均不是单一对称峰，表明LKY-III非均一组分。实施例5和6结果同实施例4。

实施例8树蝴蝶精制多糖LKY-III对DPPH、ABTS+·自由基的清除作用

DPPH标准曲线的制作:准确称取19.7mg DPPH先用少量无水乙醇溶解，再以无水乙醇定容至250ml，配成200μmol/L的标准溶液，置棕色瓶中于冰箱内保存。分别取1.5ml浓度为0，10，20，50，100，150，200μmol/L DPPH标准溶液，和0.5ml无水乙醇混匀后，静置30min，然后在最大吸收波长517nm处测定吸光值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标制作DPPH·标准曲线，选择合适的DPPH·浓度作为测定样品中的DPPH·标准溶液实验浓度。

依次加20μL不同浓度(0.25、0.50、1、2、4、6、8、10mg/mL)的树蝴蝶精制多糖LKY-III溶液和180μL的150μmol/L DPPH溶液于96孔板中，517nm处测吸光度值，空白对照组及阳性对照组分别用蒸馏水及Vc代替。

DPPH·清除率(％)＝(A₀-A₁)/A₀×100

式中，A₀—空白对照孔的吸光度；A₁—样品孔的吸光度。

ABTS工作液配制(现用现配)：将ABTS母液用无水乙醇稀释，使得在734nm处吸光度值在0.7±0.02，此时ABTS溶液的浓度即为ABTS溶液的工作浓度，得到ABTS工作液浓度为0.2626mmol/L

最大吸收波长确定：于96孔板中加20μL蒸馏水，再加0.25mmol/L ABTS溶液180μL，振荡，500～800nm全波段扫描，因而确定最大吸收波长为734nm。

ABTS母液配制：先配置7mmol/L的ABTS水溶液及4.9mmol/L的过硫酸钾水溶液，将二者等体积混合，即得ABTS母液，4℃避光过夜保存备用。

树蝴蝶多糖样品测定：于96孔板中依次加入不同浓度的树蝴蝶多糖样品(250、500、1000、2000、4000、6000、8000、10000ug/mL)20μL，再加入0.2626mmol/L的ABTS工作液180μL，37℃避光振荡反应6min后在最大吸收波长734nm处测定吸光度值。空白对照组及阳性对照组分别用蒸馏水及VC代替珊瑚菌多糖样品。ABTS+清除率计算公式：

ABTS+清除率(％)＝(A₀-A₁)/A0×100

式中，A₀—空白对照孔的吸光度；A₁—样品孔的吸光度。

测试结果如图3、4所示，图3、4分别是实施例4制备的树蝴蝶精制多糖LKY-III对DPPH(图3)、ABTS+(图4)自由基抑制率的曲线图。结果显示树蝴蝶纯化多糖均可以提供清除DPPH·自由基的氢供体且具有一定清除效果，且高浓度LKY-Ⅲ多糖对DPPH自由基的清除能力优于其他多糖组分。树蝴蝶多糖对ABTS+自由基的清除能力均随多糖的浓度增大而增加，树蝴蝶多糖有一定清除ABTS+自由基的能力。

实施例9树蝴蝶粗多糖(LKY)和树蝴蝶精制多糖LKY-III对人乳腺癌细胞MCF-7和肺癌细胞HCC827、肝癌细胞HepG-2的增殖抑制作用

将人乳腺癌细胞MCF-7和肺癌细胞HCC827细胞、肝癌细胞HepG-2、以1×10⁵个/ml浓度接种于96孔细胞培养板(100μL/孔)，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，加入不同浓度(125，250，500，1000，2000μg/m L)的样品溶液100μl。每个浓度设6个平行。在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，24h后取出，倒置显微镜观察细胞形态的变化。用注射器小心吸弃96孔板中培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/m L的MTT溶液20μL(需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。

癌细胞的增殖抑制率＝(空白对照组吸光度值-样品组吸光度值)/空白对照组的吸光值。样品组为加入树蝴蝶多糖，空白对照组为完全培养基。

测试结果如图5、图6和图7所示；图5是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖(LKY)和实施例4制备的LKY-III对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制率的影响图；图6是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖(LKY)和实施例4制备的LKY-I、LKY-II、LKY-III对肺癌细胞HCC827的增殖抑制率的影响图；图7是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖(LKY)和实施例4制备的LKY-III对肝癌细胞HepG-2的增殖抑制率的影响图。

实施例1制备的树蝴蝶粗多糖(LKY)和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖LKY-III对癌细胞的抑制率随浓度的增大而增大，LKY-Ⅲ对HCC827、HepG-2的抑制能力较强；综上可知，树蝴蝶纯化多糖LKY-III具有较强抗肿瘤活性。

实施例10树蝴蝶多糖LKY和LKY-III对RAW264.7细胞存活率的影响

将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7以1×10⁶个/ml浓度接种于96孔细胞培养板(100μL/孔)，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，加入100μL不同浓度的树蝴蝶多糖(31.25，62.5125，250，500，1000μg/mL)同时设细胞空白对照组。在37℃，5％CO2培养箱中继续培养，24h后取出，倒置显微镜下观察细胞的形态变化。用注射器小心吸弃孔内上层培养液，用PBS清洗两遍，再用MTT法进行细胞存活率检测，即每孔加入5mg/m L的MTT溶液20μL和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养4h。然后小心吸弃孔内的上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值，根据下面公式计算细胞的存活率:

相对增殖度(PGR)＝实验组平均吸光度值/空白对照组吸光度值×100％。

实验组为加入树蝴蝶多糖，空白对照组为完全培养基。

测试结果如图8所示；图8是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖LKY和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖LKY-III对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响图。

结果表明：浓度在500μg/mL以下的树蝴蝶多糖对RAW264.7细胞无明显毒性，然而，当多糖浓度超过1000μg/mL，产生明显毒性。因此，四种多糖样品在31.25～500μg/mL浓度范围内可进行后续细胞免疫活性的研究。

实施例11 Griess法检测LKY和LKY-III对RAW264.7细胞释放NO的影响

常规培养细胞，取对数生长期的RAW264.7细胞，吹打细胞成单细胞悬液，显微镜下用血细胞计数板计数后，1000r/min，离心5min去上清，培养基重悬并调整细胞浓度，按20万个/孔的细胞密度接种于24孔培养板，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，贴壁24h，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组设3个复孔：Control组，脂多糖(LPS，终浓度为1μg/mL)组，多糖样品组(实施例1制备得到的树蝴蝶粗多糖LKY(终浓度为31.25、62.5、125、250和500μg/mL)组，多糖样品组(实施例4制备得到的树蝴蝶精制多糖LKY-III(终浓度为31.25、62.5、125、200和250μg/mL)组，对照组添加同体积的培养基。给药后，置于37℃，5％CO₂培养箱，继续培养24h。分别取各孔细胞上清100μL，相应加入另一新的96孔板中。每孔加50μL Griess试剂A和50μL Griess试剂B，然后置于37℃培养箱中反应10min，立即置板于多标记微孔板检测仪上，在550nm波长下检测各孔吸光度值。

测试结果如图9所示；图9是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖LKY和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖LKY-III对RAW264.7巨噬细胞释放NO的影响图。树蝴蝶多糖具有促进RAW264.7产生NO的作用，且在31.25～500μg/mL浓度范围内，NO的释放量随浓度增大而增大，树蝴蝶多糖LKY-Ⅲ的作用较粗多糖更为明显，LKY虽能刺激巨噬细胞产生NO，但作用效果明显不如LKY-Ⅲ三种纯化多糖。

实施例12 Elisa法检测LKY和LKY-III对RAW264.7细胞释放IL-6及TNF-α的影响

常规培养细胞，取对数生长期的RAW264.7细胞，吹打细胞成单细胞悬液，显微镜下用血细胞计数板计数后，1000r/min，离心5min去上清，培养基重悬并调整细胞浓度，按20万个/孔的细胞密度接种于24孔培养板，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，贴壁24h，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组设3个复孔：Control组，脂多糖(LPS，终浓度为1μg/mL)组，LKY组(实施例1制备得到的树蝴蝶粗多糖LKY，终浓度为31.25、62.5、125、250、500μg/mL)，LKY-III组(实施例4制备得到的树蝴蝶精制多糖LKY-III，终浓度为31.25、62.5、125、200、250μg/mL)，对照组添加同体积的培养基。给药后，置于37℃，5％CO₂培养箱，继续培养24h。分别取各孔细胞上清按照小鼠IL-6ELISA试剂盒和小鼠TNF-αELISA试剂盒操作方法检测细胞因子的释放情况。

测试结果如图10～11所示；图10是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖LKY和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖LKY-III对RAW264.7巨噬细胞释放IL-6的影响图。图11是实施例1制备的树蝴蝶粗多糖LKY和实施例4制备的树蝴蝶精制多糖LKY-III对RAW264.7巨噬细胞释放TNF-α的影响图。

结果表明，在31.25～500μg/mL浓度范围内，树蝴蝶多糖LKY-Ⅲ及LKY对RAW264.7产生IL-6、TNF-α均有一定作用，且随多糖浓度增大作用增强，各浓度下皆具有极显著性(p<0.01)，粗多糖LKY对RAW264.7产生IL-6、TNF-α的作用最小，显著性比较低。过高浓度的LKY-Ⅲ多糖反而会抑制巨噬细胞产生IL-6、TNF-α的能力(图10～11)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种非均一组分的树蝴蝶精制多糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将树蝴蝶在蒸馏水中进行回流提取，采用大孔吸附树脂对提取液进行脱色处理，再采用沉淀剂进行沉淀，离心，收集沉淀物并干燥，得到树蝴蝶粗多糖；

(2)将树蝴蝶粗多糖配制成多糖溶液，转入装有经过预处理的DEAE-52树脂的层析柱中，依次用0～0.28mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液洗脱，收集0.3mol/L NaCl溶液洗脱的洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，测定490nm下的吸光度，绘制洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并；然后旋蒸浓缩，真空冷冻干燥，得到非均一组分组分的精制多糖，0.3mol/L NaCl洗脱得到的精制多糖记为LKY-III。

2.根据权利要求1所述非均一组分的树蝴蝶精制多糖的制备方法，其特征在于：

所述树蝴蝶粗多糖的具体制备方法为；

(1-1)将树蝴蝶粉碎过筛，得到树蝴蝶粗粉；向树蝴蝶粗粉中加入蒸馏水进行超声处理，加热回流提取，抽滤，并将滤液浓缩，得到浓缩的树蝴蝶粗多糖溶液；

(1-2)将树蝴蝶粗多糖溶液和大孔吸附树脂混合，脱色处理，过滤出多糖溶液，并用水反复洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖溶液合并，减压浓缩，得到浓缩糖液；

(1-3)向浓缩糖液中加入沉淀剂进行沉淀，离心，收集沉淀物并干燥，得到树蝴蝶粗多糖。

3.根据权利要求1或2所述非均一组分的树蝴蝶精制多糖的制备方法，其特征在于：所述脱色处理的条件为于40～60℃水浴2～4h；

所述沉淀剂为无水乙醇或体积分数为90～100％的乙醇溶液；所述沉淀的温度为0～4℃；

所述大孔吸附树脂选用为D354FD树脂。

4.根据权利要求1或2所述非均一组分的树蝴蝶精制多糖的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂在使用前需进行预处理，预处理的方法为：将大孔吸附树脂依次采用蒸馏水、盐酸浸泡，洗涤至中性，再用氢氧化钠溶液浸泡，再洗涤至中性，得到经过预处理的大孔吸附树脂。

5.根据权利要求4所述非均一组分的树蝴蝶精制多糖的制备方法，其特征在于：所述蒸馏水浸泡的时间为12～24h，盐酸的浓度为3～5wt％，盐酸浸泡的时间为0.5～3h，氢氧化钠溶液的浓度为3～5wt％，氢氧化钠溶液浸泡的时间为0.5～3h。

6.根据权利要求2所述非均一组分的树蝴蝶精制多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1-1)中所述超声功率为60～400W，超声时间是10～20min；

步骤(1-1)中所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为40～60℃；步骤(1-2)中所述减压浓缩的温度为40～60℃；

步骤(1-3)中所述沉淀剂的加入量为浓缩糖液体积的3～5倍。

7.根据权利要求1或2所述非均一组分的树蝴蝶精制多糖的制备方法，其特征在于：所述加热回流的温度为75～100℃；所述加热回流提取的时间为2～4h；所述加热回流提取的次数为2～4次；

所述树蝴蝶与蒸馏水的质量比为1:20～1:30；热水回流提取多次时，树蝴蝶与每一次使用的蒸馏水的质量比为1:20～1:30；

所述沉淀的时间为8～24h；

所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为12～15min；所述干燥的温度为40～60℃。

8.根据权利要求1所述非均一组分的树蝴蝶精制多糖的制备方法，其特征在于：

所述记为LKY-III的树蝴蝶精制多糖为非均一组分。

9.一种非均一组分的树蝴蝶精制多糖由权利要求1～8任一项所述制备方法得到。

10.根据权利要求9所述非均一组分的树蝴蝶精制多糖的应用，其特征在于：所述非均一组分的树蝴蝶精制多糖在制备抗癌、抗氧化和/或免疫增强药物中的应用。