CN107556396A - 一种非均一组分珊瑚菌精制多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药的技术领域，公开了一种非均一组分珊瑚菌精制多糖及其制备方法与应用。所述方法为：(1)将珊瑚菌在蒸馏水中进行回流提取，脱色处理，沉淀，离心，收集沉淀物并干燥，得到珊瑚菌粗多糖；(2)将珊瑚菌粗多糖配制成多糖溶液，转入装有经过预处理的DEAE‑52树脂的层析柱中，用蒸馏水或低浓度盐溶液洗脱，再用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，收集0.1mol/L NaCl溶液洗脱的洗脱液，检测洗脱液，测定490nm下的吸光度，绘制曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并；浓缩，干燥，得到非均一组分精制多糖。本发明的多糖具有抗氧化、抗肿瘤和免疫增强活性，且使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。

Description

一种非均一组分珊瑚菌精制多糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药的技术领域，具体涉及一种非均一组分珊瑚菌精制多糖及其制备方法与应用。

背景技术

多糖是除了蛋白质和核酸以外的一类重要的生物高分子化合物。现代药理研究表明多糖具有多种生理活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、延缓衰老、增强免疫功能等。免疫调节作用是多糖最重要的生物活性功能，一直是人们研究的热点。免疫细菌多糖和人工合成的化合物，其不良反应和副作用已引起人们广泛注意。而大多数高等植物来源的多糖均为无不良反应的物质，不会对机体产生较大的副作用，因此，从植物中分离的多糖在生物医学上引起极大关注。目前已对百余种植物多糖进行了活性相关的研究报道。研究表明植物多糖可通过与免疫细胞表面的多种受体结合、激活不同的信号通路来调控动物机体内的免疫系统，包括：刺激巨噬细胞、T/B淋巴细胞、自然杀伤细胞的分泌或增殖；调节细胞因子的释放；促进抗体的分泌；激活补体系统等。

对这些活性物质的作用机制也在不断发展，其中多糖对非特异性诱导的免疫机制更受到人们的重视。植物多糖是最理想的免疫候选药物。

珊瑚菌(Ramaria botrytoides)属于多孔菌目Aphyllophorales，珊瑚菌科Clavariaceae，又名扫帚菌，含有多种氨基酸、矿质元素、维生素及碳水化合物。目前国内外对珊瑚菌的研究主要研究其挥发油、内酯、甾醇类、有机酸、萜类、以及蛋白类等成分。而对珊瑚菌多糖的研究报道几乎没有。大多数天然活性多糖是无毒副作用的天然绿色产品。随着研究的不断深入，天然多糖越来越成为食品、保健品、医药等领域的研究热点。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种非均一组分珊瑚菌精制多糖的制备方法。

本发明的另一目的在于提供由上述制备方法制备得到的非均一组分珊瑚菌精制多糖。

本发明的再一目的在于提供上述非均一组分珊瑚菌精制多糖的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种非均一组分珊瑚菌精制多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)将珊瑚菌(Ramaria botrytoides)在蒸馏水中进行回流提取，采用大孔吸附树脂对提取液进行脱色处理，再采用沉淀剂进行沉淀，离心，收集沉淀物并干燥，得到珊瑚菌粗多糖；

(2)将珊瑚菌粗多糖配制成多糖溶液，转入装有经过预处理的DEAE-52树脂的层析柱中，先用蒸馏水或低浓度盐溶液洗脱，再用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，收集0.1mol/L NaCl溶液洗脱的洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，测定490nm下的吸光度，绘制洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并；然后旋蒸浓缩，真空冷冻干燥，得到精制多糖，其中，0.1mol/LNaCl洗脱得到的精制多糖命名为RBP-II。所述低浓度盐溶液为浓度≤0.08mol/L的NaCl溶液。

步骤(2)中所述的DEAE-52树脂预处理的方法为：将DEAE-52树脂用水4～40℃浸泡12～24h；再用0.5mol/L的盐酸溶液浸泡0.5～2h；0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.5～2h，过滤，水洗至中性，得到经过预处理的DEAE-52树脂；

步骤(2)中所述的旋蒸浓缩的温度为40～60℃。

步骤(2)中所述层析柱为Z型层析柱。步骤(2)中所述蒸馏水或低浓度盐溶液洗脱，0.1mol/L NaCl溶液进行洗脱时流速为5～10s/滴。

步骤(2)中所述装有经过预处理的DEAE-52树脂的层析柱是通过以下方法装填而成：将经过预处理的DEAE-52树脂于40～60℃旋转蒸发除气泡后转入Z型层析柱中，用恒流泵泵送蒸馏水以使填料装柱均匀，平衡后流速5～10s/滴。

步骤(1)中所述珊瑚菌粗多糖的具体制备方法为：

(1-1)将珊瑚菌(Ramaria botrytoides)粉碎后过筛，得到珊瑚菌粗粉；向珊瑚菌粗粉中加入蒸馏水进行加热回流提取，离心，并将上清液浓缩，得到浓缩的珊瑚菌粗多糖溶液；

(1-2)将珊瑚菌粗多糖溶液和经过预处理的大孔吸附树脂混合，脱色处理，过滤出多糖溶液，并用水反复洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖溶液合并，减压浓缩，得到浓缩糖液；

(1-3)向浓缩糖液中加入沉淀剂进行沉淀，离心，收集沉淀物并干燥，得到珊瑚菌多糖(RBPs)。

步骤(1)和(1-1)所述加热回流的温度为75～100℃；步骤(1)和(1-1)所述的热水回流提取的时间为1～4h；步骤(1)和(1-1)中加热回流提取的次数为2～4次；

步骤(1)和(1-1)中所述珊瑚菌粗粉与蒸馏水的质量比为1:20～1:40；热水回流提取多次时，珊瑚菌粗粉与每一次使用的蒸馏水的质量比为1:20～1:40。

步骤(1-1)中所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为40～60℃；步骤(1-2)中所述减压浓缩的温度为40～60℃。

步骤(1)和(1-2)所述脱色处理的条件为于40～60℃水浴2～4h；

步骤(1)和(1-2)中所述大孔吸附树脂为D354FD树脂；

步骤(1)和(1-2)中所述大孔吸附树脂在使用前需进行预处理，预处理的方法为：将大孔吸附树脂依次采用蒸馏水、盐酸浸泡，洗涤至中性，再用氢氧化钠溶液浸泡，再洗涤至中性，得到经过预处理的大孔吸附树脂。所述蒸馏水浸泡的时间为12～24h，盐酸的浓度为3～5wt％，盐酸浸泡的时间为0.5～3h，氢氧化钠溶液的浓度为3～5wt％，氢氧化钠溶液浸泡的时间为0.5～3h。

步骤(1)和(1-3)中所述沉淀剂为无水乙醇或体积分数为90～100％的乙醇溶液；

步骤(1)和(1-3)中所述沉淀的时间为8～24h；

步骤(1)和(1-3)中所述沉淀的温度为0～4℃。

步骤(1-3)中所述沉淀剂的加入量为浓缩糖液体积的3～5倍；

步骤(1)和(1-3)中所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为12～15min；步骤(1)和(1-3)中所述干燥的温度为40～60℃，干燥至恒重。

步骤(1-1)中所述的离心的转速为3000～5000r/min；所述的离心的时间为8～12min；所述过滤的次数为2～4次。

所述的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)为非均一组分。

所述非均一组分珊瑚菌制多糖，通过上述制备方法制备得到；

所述非均一组分珊瑚菌精制多糖在制备抗癌、抗氧化和/或免疫增强药物中的应用。

本发明的原理：植物来源的多糖具有抗氧化、抗肿瘤和增强免疫功能等多种生物活性。多糖尤其能通过调节巨噬细胞的免疫功能体现出各种有益的药理作用。本发明通过体外实验发现和确证植物粗多糖具有抗氧化、抗肿瘤和免疫增强活性，且使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对DPPH和ABTS+·自由基具有一定的清除和抑制作用；

(2)本发明的精制多糖(RBP-II)能增强RAW264.7巨噬细胞NO的释放；

(3)本发明的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)能增强RAW264.7巨噬细胞IL-6及TNF-α的释放；

(4)非均一组分的珊瑚菌精制多糖的用药剂量比较低，而且在有效用药剂量范围内毒性较低。

附图说明

图1是实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)的离子交换柱层析洗脱曲线图；

图2是实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)的高效凝胶渗透色谱(GPC)图；

图3是实施例4制备的珊瑚菌粗多糖(RBP-II)对ABTS+·自由基抑制率的影响图；

图4是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对DPPH自由基抑制率的影响图；

图5是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对Fe²⁺自还原能力的曲线图；

图6是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制率的曲线图；

图7是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响图；

图8是实施例1制备的珊瑚菌实施例4制备的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对RAW264.7巨噬细胞释放NO的影响图；

图9是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖(RBP-II))对RAW264.7巨噬细胞释放IL-6的影响图；

图10是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对RAW264.7巨噬细胞释放TNF-α的影响图；

图11是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖RBP-II对RAW264.7巨噬细胞IL-6mRNA表达的影响图；

图12是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖RBP-II对RAW264.7巨噬细胞TNF-αmRNA表达的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中，人乳腺癌细胞MCF-7和小鼠巨噬细胞RAW 264.7购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；珊瑚菌购于云南滇彩农产品公司，产地为云南。

实施例1从珊瑚菌中制备得到珊瑚菌粗多糖(RBPs)：

(1)珊瑚菌粉碎后过20目筛，称取100g，用蒸馏水加热回流提取，其中，水料比为30:1(质量比)，回流提取温度为90℃，回流提取时间为1h，回流提取次数3次；然后合并提取液，4000r/min下离心10min，取上层澄清液，滤纸过滤3次，将滤液用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至200mL，得到多糖溶液；

(2)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡12h，然后依次用质量分数为5％的盐酸溶液、质量分数为5％的氢氧化钠溶液各自浸泡0.5h，200目纱布过滤，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的D354FD树脂；

(3)将步骤(1)制备得到的多糖溶液和200mL经过预处理的D354FD树脂混合，置于50℃恒温水浴锅中恒温水浴3h进行脱色，间隔搅拌，然后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗5次洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；

(4)在步骤(3)制备得到的浓缩糖液中加入4倍体积的无水乙醇，边加边磁力搅拌，于4℃条件下醇沉8h，然后4000rpm下离心分离15min，弃去上清液，取出沉淀物于45℃烘干，得到珊瑚菌粗多糖(RBPs)。

实施例2从珊瑚菌中制备得到珊瑚菌粗多糖(RBPs)：

(1)珊瑚菌粉碎后过20目筛，称取100g，然后蒸馏水加热回流提取，其中，水料比30:1(质量比)，回流提取温度为90℃，回流提取时间为1h，回流提取次数2次；然后合并提取液，3000r/min下离心8min，取上层澄清液，滤纸过滤2次，将滤液用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩至200mL，得到多糖溶液；

(2)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡24h，然后依次用质量分数为5％的盐酸溶液、质量分数为5％的氢氧化钠溶液各自浸泡2h，200目纱布过滤，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的D354FD树脂；

(3)将步骤(1)制备得到的多糖溶液和200mL经过预处理的D354FD树脂混合，置于40℃恒温水浴锅中恒温水浴2h进行脱色，间隔搅拌，然后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗4次洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；

(4)在步骤(3)中制备得到的浓缩糖液中加入3倍体积的体积分数为95％的乙醇，边加边磁力搅拌，于0℃条件下醇沉12h，然后3000rpm下离心分离12min，弃去上清液，取出沉淀物于50℃烘干，得到珊瑚菌粗多糖(RBPs)。

实施例3从珊瑚菌中制备得到珊瑚菌粗多糖(RBPs)：

(1)珊瑚菌粉碎后过20目筛，称取100g，用蒸馏水加热回流提取，其中，水料比为30:1(质量比)，回流提取温度为95℃，回流提取时间为2h，回流提取次数4次，然后合并提取液，5000/min下离心12min，取上层澄清液，滤纸过滤4次，将滤液用旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩至200mL，得到多糖溶液；

(2)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡18h，然后依次用质量分数为5％的盐酸溶液、质量分数为5％的氢氧化钠溶液各自浸泡3h，200目纱布过滤，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的D354FD树脂；

(3)将步骤(1)中制备得到的多糖溶液和200mL经过预处理的D354FD树脂混合，置于60℃恒温水浴锅中恒温水浴4h进行脱色，间隔搅拌，之后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗5次洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；

(4)在步骤(3)制备得到的浓缩糖液中加入5倍体积的体积分数为95％的乙醇，边加边磁力搅拌，于4℃条件下醇沉24h，然后5000rpm下离心分离14min，弃去上清液，取出沉淀物于60℃烘干，得到珊瑚菌粗多糖(RBPs)。

实施例4珊瑚菌精制多糖(RBP-II)的制备：

(1)DEAE-52预处理：取70g的DEAE-52，用蒸馏水4℃浸泡24h，然后小心将上层水倒出，除去杂质，再用0.5mol/L的盐酸溶液浸泡0.5h，将上层酸液小心倒出，抽滤至干后用蒸馏水洗脱至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.5h，小心倒出上层碱液，抽滤至干后用蒸馏水洗至中性，备用；

(2)将经过预处理的DEAE-52于48℃旋转蒸发除气泡后玻璃棒引流转入2.6×30cm规格的Z型层析柱中，用恒流泵泵送蒸馏水以使填料装柱均匀，平衡后7s/滴；

(3)称取100mg实施例1中制备得到的珊瑚菌粗多糖(RBPs)，采用蒸馏水配制成多糖溶液，玻璃棒引流至层析柱中，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液洗脱，自动收集0.1mol/L NaCl溶液洗脱的洗脱液，每根管收集大约5mL，苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，测定490nm处的吸光度，绘制洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并；然后洗脱液40℃旋蒸浓缩，真空冷冻干燥，得到珊瑚菌精制多糖。RBPs经过DEAE-52离子交换柱层析后得到1个组分，其中0.1mol/L NaCl洗脱得到的珊瑚菌精制多糖命名为RBP-II，其中，图1为本实施例制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)的离子交换柱层析洗脱曲线图。

实施例5珊瑚菌精制多糖(RBP-II)的制备：

(1)DEAE-52预处理：取70g的DEAE-52，用蒸馏水20℃浸泡12h，然后小心将上层水倒出，除去杂质，再用0.5mol/L的盐酸溶液浸泡1h，将上层酸液小心倒出，抽滤至干后用蒸馏水洗脱至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡1h，小心倒出上层碱液，抽滤至干后用蒸馏水洗至中性，备用；

(2)将经过预处理的DEAE-52于48℃旋转蒸发除气泡后玻璃棒引流转入2.6×30cm规格的Z型层析柱中，用恒流泵泵送蒸馏水以使填料装柱均匀，平衡后7s/滴；

(3)称取100mg实施例1中制备得到的珊瑚菌粗多糖(RBPs)，采用蒸馏水配制成多糖溶液，玻璃棒引流至层析柱中，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液洗脱，自动收集0.1mol/L NaCl溶液洗脱的洗脱液，每根管收集大约5mL，苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，测定490nm处的吸光度，绘制洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并；然后洗脱液50℃旋蒸浓缩，真空冷冻干燥，得到珊瑚菌精制多糖。RBPs经过DEAE-52离子交换柱层析后得到1个组分，其中，0.1mol/L NaCl溶液洗脱得到的精制多糖命名为RBP-II，其中，本实施例的离子交换柱层析洗脱结果同实施例4。

实施例6珊瑚菌精制多糖(RBP-II)的制备：

(1)DEAE-52预处理：取70g的DEAE-52，用蒸馏水25℃浸泡20h，然后小心将上层水倒出，除去杂质，再用0.5mol/L的盐酸溶液浸泡0.8h，将上层酸液小心倒出，抽滤至干后用蒸馏水洗脱至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.8h，小心倒出上层碱液，抽滤至干后用蒸馏水洗至中性，备用；

(2)将经过预处理的DEAE-52于48℃旋转蒸发除气泡后玻璃棒引流转入2.6×30cm规格的Z型层析柱中，用恒流泵泵送蒸馏水以使填料装柱均匀，平衡后7s/滴；

(3)称取100mg实施例1中制备得到的珊瑚菌粗多糖(RBPs)，采用蒸馏水配制成多糖溶液，玻璃棒引流至层析柱中，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液洗脱，自动收集0.1mol/L NaCl溶液洗脱的洗脱液，每根管收集大约5mL，苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，测定490nm处的吸光度，绘制洗脱曲线同一吸收峰内的洗脱液合并；然后洗脱液60℃旋蒸浓缩，真空冷冻干燥，得到珊瑚菌精制多糖。RBPs经过DEAE-52离子交换柱层析后得到1个组分，其中，0.1mol/L NaCl洗脱得到的精制多糖命名为RBP-II。其中，本实施例的离子交换柱层析洗脱结果同实施例4。

实施例7珊瑚菌精制多糖RBP-II的GPC分析

采用高效液相色谱仪分别对实施例4～6制备得到的RBP-II的分子量及其纯度进行测定。色谱条件：TSK G-5000PXL column(7.8×300mm)和TSK G-3000PXL column(7.8×300mm)串联，流动相为0.02mol/L的KH₂PO₄缓冲溶液，流速为0.6mL/min，2414示差检测器，柱温35℃。图2是实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)的高效凝胶渗透色谱(GPC)图。

结果分析：

(1)实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖RBP-II(图2)的GPC图均不是单一对称峰，表明RBP-II为非均一组分。实施例5和6结果同实施例4。

实施例8珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对ABTS+·自由基的抑制作用

溶液配制：ABTS母液配制：先配置7mmol/L的ABTS水溶液及4.9mmol/L的过硫酸钾水溶液，将二者等体积混合，即得ABTS母液，4℃避光过夜保存备用。

ABTS工作液配制(现用现配)：将ABTS母液用无水乙醇稀释，使得在734nm处吸光度值在0.7±0.02，此时ABTS溶液的浓度即为ABTS溶液的工作浓度，得到ABTS工作液浓度为0.2626mmol/L。

配置不同浓度的样品(实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II))和标准品(抗坏血酸VC)溶液，分别取20μL样品或标准品溶液，再加入0.2626mmol/L的ABTS工作液180μL，37℃避光振荡反应6min后在最大吸收波长734nm处测定吸光度值。空白对照组及阳性对照组分别用蒸馏水及VC代替珊瑚菌多糖样品。

ABTS+·清除率(％)＝[1－(A样品－A空白对照)/A空白对照]×100％。

测试结果如图3所示，图3是实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对ABTS+·自由基抑制率的影响图。结果显示由实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对ABTS+·自由基具有微弱的清除和抑制作用(图3)。

实施例9珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对DPPH自由基的抑制作用

标准曲线的制作:准确称取19.7mg DPPH先用少量无水乙醇溶解，再以无水乙醇定容至250ml，配成200μmol/L的标准溶液，置棕色瓶中于冰箱内保存。分别取1.5ml浓度为0，10，20，50，100，150，200μmol/L DPPH标准溶液，和0.5ml无水乙醇混匀后，静置30min，然后在最大吸收波长517nm处测定吸光值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标制作DPPH·标准曲线，选择合适的DPPH·浓度作为测定样品中的DPPH·标准溶液实验浓度。

配置不同浓度的样品(实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II))和标准品(抗坏血酸VC)溶液，分别取0.5ml样品或标准品溶液，加入1.5ml选择好的合适浓度的DPPH·标准液(现配现用)，以无水乙醇代替样品作为空白对照，以无水乙醇代替DPPH溶液作为本底对照，将混合溶液摇匀后静置30min，用比色皿在517nm波长处测定吸光值。样品对DPPH自由基的清除率按如下公式计算：

DPPH清除率(％)＝[1－(A样品－A本底对照)/A空白对照]×100％。

测试结果如图4所示，图4是实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对DPPH自由基抑制率的影响图。结果显示由实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对DPPH自由基具有微弱的清除和抑制作用(图4)。

实施例10珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对Fe2+还原能力

TPTZ工作液配制：首先分别配制10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L氯化铁溶液、0.3mol/L醋酸钠缓冲液，再将三者按体积比TPTZ溶液：氯化铁溶液：醋酸钠缓冲液＝1:1:10混合，配制成TPTZ终浓度为0.83mmol/L的工作液。

FeSO4标准曲线绘制：于96孔板中加依次加入不同浓度的FeSO4标准溶液(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L)20μL，再分别加入180μL TPTZ工作液，37℃避光振荡反应10min后在最大吸收波长595nm处测定吸光度值，以FeSO4的微摩尔数为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线。

配置不同浓度的样品(实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II))和标准品(抗坏血酸VC)溶液，分别取20μL样品或标准品溶液，再依次加入180μL TPTZ工作液，37℃避光振荡反应10min后在最大吸收波长595nm处测定吸光度值。空白对照组及阳性对照组分别用蒸馏水及VC代替珊瑚菌多糖样品。

测试结果如图5所示，图5是实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对Fe²⁺还原能力的曲线图。

实施例11珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对人乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制作用

将人乳腺癌细胞MCF-7细胞以1×10⁵个/ml浓度接种于96孔细胞培养板(100μL/孔)，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，加入不同浓度(62.5，,125，250，500和1000μg/m L)的样品溶液(实施例4制备的珊瑚菌精制多糖)100μl。同时设细胞对照组(空白对照组)，即加入与样品液等量体积的完全培养液；阳性对照组，加与样品同浓度同体积的五-氟尿嘧啶作为阳性对照。每个浓度设6个平行。在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，24h后取出，倒置显微镜观察细胞形态的变化。用注射器小心吸弃96孔板中培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/m L的MTT溶液20μL(需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。

癌细胞的增殖抑制率＝(空白对照组吸光度值-样品组吸光度值)/空白对照组的吸光值。

测试结果如图6所示；图6是实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制率的曲线图。

由实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对MCF-7细胞具有一定程度的抑制作用。

实施例12珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对RAW264.7细胞存活率的影响

将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7以1×10⁶个/ml浓度接种于96孔细胞培养板(100μL/孔)，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，加入100μL实施例4制备的珊瑚菌精制多糖RBP-II(25，50，100，150，200和250μg/m L)，每个浓度设6个平行，同时设细胞空白对照组。在37℃，5％CO2培养箱中继续培养，24h后取出，倒置显微镜下观察细胞的形态变化。用注射器小心吸弃孔内上层培养液，用PBS清洗两遍，再用MTT法进行细胞存活率检测，即每孔加入5mg/m L的MTT溶液20μL和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养4h。然后小心吸弃孔内的上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值，根据下面公式计算细胞的存活率:

相对增殖度(PGR)＝实验组平均吸光度值/空白对照组吸光度值。

实验组为加入珊瑚菌精制多糖。

测试结果如图7所示；图7是实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响图。

由实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)在31.25～500μg/mL对RAW264.7巨噬细胞没有明显的毒性作用可用于下一步实验研究。

实施例13 Griess法检测珊瑚菌精制多糖RBP-II

培养细胞，取对数生长期的RAW264.7细胞，吹打细胞成单细胞悬液，显微镜下用血细胞计数板计数后，1000r/min，离心5min去上清，培养基重悬并调整细胞浓度，按20万个/孔的细胞密度接种于24孔培养板，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，贴壁24h，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组设3个复孔：Control组(空白对照组)，脂多糖(LPS，终浓度为1μg/mL)组，多糖样品组(实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)(终浓度为31.25、62.5、125、250和500μg/mL)组，对照组添加同体积的培养基。给药后，置于37℃，5％CO₂培养箱，继续培养24h。分别取各孔细胞上清100μL，相应加入另一新的96孔板中。每孔加50μL Griess试剂A和50μL Griess试剂B，然后置于37℃培养箱中反应10min，立即置板于多标记微孔板检测仪上，在550nm波长下检测各孔吸光度值。

测试结果如图8所示；图8是实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对RAW264.7巨噬细胞释放NO的影响图。

实施例14 Elisa法检测珊瑚菌精制多糖RBP-II细胞释放IL-6及TNF-α的影响

常规培养细胞，取对数生长期的RAW264.7细胞，吹打细胞成单细胞悬液，显微镜下用血细胞计数板计数后，1000r/min，离心5min去上清，培养基重悬并调整细胞浓度，按20万个/孔的细胞密度接种于24孔培养板，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，贴壁24h，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组设3个复孔：Control组(空白组)，脂多糖(LPS，终浓度为1μg/mL)组，RBP-II组(实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)，终浓度为31.25、62.5、125、250、500μg/mL)，对照组添加同体积的培养基。给药后，置于37℃，5％CO₂培养箱，继续培养24h。分别取各孔细胞上清按照小鼠IL-6ELISA试剂盒和小鼠TNF-αELISA试剂盒操作方法检测细胞因子的释放情况。

测试结果如图9～10所示：图9是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖RBP-II对RAW264.7巨噬细胞释放IL-6的影响图；图10是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖RBP-II对RAW264.7巨噬细胞释放TNF-α的影响图。

珊瑚菌精制多糖RBP-II能够促进RAW264.7巨噬细胞NO、IL-6及TNF-α的释放，从而对其进行进一步研究。

实施例15珊瑚菌精制多糖RBP-II对RAW264.7细胞IL-6和TNF-αmRNA表达的影响

常规培养细胞，取对生长数期的细胞，按100万/孔细胞数接种于6孔板，孵育24h后，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组设3个复孔。Control组(空白对照组)，脂多糖(LPS，终浓度为1μg/mL)组，RBP-II组(实施例4制备得到的珊瑚菌精制多糖(RBP-II))，终浓度为125、250、500μg/mL)，对照组添加同体积的培养基。给药后，置于37℃，5％CO₂培养箱，继续培养24h。作用24h后，吸弃细胞上清，PBS洗2次。每孔加入Trizol 1mL，静置5min，吸管吹打至液体无粘稠物，吸取细胞裂解液转入EP管，每管加入0.2mL氯仿，盖上EP管盖，手持用力上下震荡10s，室温静置5min，4℃以12,000r/min离心15min，离心后转移上层水相至另一EP管中，加入0.5mL异丙醇，室温静置10min，4℃离心机以12,000r/min离心10min，小心吸弃去上清，用冷75％乙醇1mL清洗2次，分别4℃条件下以7,500r/min离心5min，小心吸弃上清，空气吹干，约15min，加入0～50μL RNase-free纯水，60℃加热10min溶解沉淀。测定mRNA的纯度和浓度。并用RevertAid First Str and cnthesis Kit(Thermo公司)反转录试剂盒，20μL反应体系，对RNA进行逆转录。采用DyNAmo Flash SYRB Green qPCR Kit(Thermo公司)试剂盒，ABI实时荧光定量PCR仪(Rrism 7500，Applied Biosystems，Foster City，CA,USA)对mRNA进行扩增，扩增后用ABI PRISM 7500SDS软件中Relative Quantification(ddCt)Study法进行自动分析以获得目的基因的相对表达量。相关基因mRNA引物序列为GAPDH(forward(序列1),5′-TGAAGGGCTGCTTCCAAACCTTTGACC-3′,reverse(序列2),5′–TGTCCATTGAGGTGGAGAGCTTTCAGC-3′),IL-6(forward(序列3),5′-CGGCAA ACATGACTTCAGGC-3′,reverse(序列4),5′-GCACATCAAAGCGGCCATAG-3′)和TNF-α(forward(序列5),5′-GGGGATTATGGCTCAGGGTC-3′,reverse(序列6),5′-CGAGGCTCCAGTGAATTCGG-3′)。

测试结果如图11和12所示，图11是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖(RBP-II)对RAW264.7巨噬细胞IL-6mRNA表达的影响图，图12是实施例4制备的珊瑚菌精制多糖RBP-II对RAW264.7巨噬细胞TNF-αmRNA表达的影响图。

与control组相比，珊瑚菌精制多糖RBP-II可以显著促进IL-6和TNF-α，并呈现梯度依赖性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种非均一组分珊瑚菌精制多糖及其制备方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgaagggctg cttccaaacc tttgacc 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtccattga ggtggagagc tttcagc 27

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggcaaacat gacttcaggc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcacatcaaa gcggccatag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggattatg gctcagggtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgaggctcca gtgaattcgg 20

Claims (10)

1.一种非均一组分珊瑚菌精制多糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将珊瑚菌在蒸馏水中进行回流提取，采用大孔吸附树脂对提取液进行脱色处理，再采用沉淀剂进行沉淀，离心，收集沉淀物并干燥，得到珊瑚菌粗多糖；

(2)将珊瑚菌粗多糖配制成多糖溶液，转入装有经过预处理的DEAE-52树脂的层析柱中，用蒸馏水或低浓度盐溶液洗脱，再用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，收集0.1mol/L NaCl溶液洗脱的洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，测定490nm下的吸光度，绘制洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并；然后旋蒸浓缩，真空冷冻干燥，得到非均一组分的精制多糖，其中，0.1mol/L NaCl溶液洗脱得到的非均一组分的精制多糖记为RBP-II。

2.根据权利要求1所述非均一组分珊瑚菌精制多糖的制备方法，其特征在于：

所述珊瑚菌粗多糖的具体制备方法为；

(1-1)将珊瑚菌粉碎后过筛，得到珊瑚菌粗粉；向珊瑚菌粗粉中加入蒸馏水进行加热回流提取，离心，并将上清液浓缩，得到浓缩的珊瑚菌粗多糖溶液；

(1-2)将珊瑚菌粗多糖溶液和经过预处理的大孔吸附树脂混合，脱色处理，过滤出多糖溶液，并用水反复洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖溶液合并，减压浓缩，得到浓缩糖液；

(1-3)向浓缩糖液中加入沉淀剂进行沉淀，离心，收集沉淀物并干燥，得到珊瑚菌多糖。

3.根据权利要求1或2所述非均一组分珊瑚菌精制多糖的制备方法，其特征在于：所述脱色处理的条件为于40～60℃水浴2～4h；

所述沉淀剂为无水乙醇或体积分数为90～100％的乙醇溶液；所述沉淀的温度为0～4℃；

所述大孔吸附树脂为D354FD树脂。

4.根据权利要求1或2所述非均一组分珊瑚菌精制多糖的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂在使用前需进行预处理，预处理的方法为：将大孔吸附树脂依次采用蒸馏水、盐酸浸泡，洗涤至中性，再用氢氧化钠溶液浸泡，再洗涤至中性，得到经过预处理的大孔吸附树脂。

5.根据权利要求4所述非均一组分珊瑚菌精制多糖的制备方法，其特征在于：所述蒸馏水浸泡的时间为12～24h，盐酸的浓度为3～5wt％，盐酸浸泡的时间为0.5～3h，氢氧化钠溶液的浓度为3～5wt％，氢氧化钠溶液浸泡的时间为0.5～3h。

6.根据权利要求2所述非均一组分珊瑚菌精制多糖的制备方法，其特征在于：

步骤(1-1)中所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为40～60℃；步骤(1-2)中所述减压浓缩的温度为40～60℃；

步骤(1-3)中所述沉淀剂的加入量为浓缩糖液体积的3～5倍。

7.根据权利要求1或2所述非均一组分珊瑚菌精制多糖的制备方法，其特征在于：所述加热回流的温度为75～100℃；所述加热回流提取的时间为1～4h；所述加热回流提取的次数为2～4次；

所述珊瑚菌与蒸馏水的质量比为1:20～1:40；热水回流提取多次时，珊瑚菌与每一次使用的蒸馏水的质量比为1:20～1:40；

所述沉淀的时间为8～24h；

所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为12～15min；所述干燥的温度为40～60℃。

8.根据权利要求1所述非均一组分珊瑚菌精制多糖的制备方法，其特征在于：所述低浓度盐溶液为浓度≤0.08mol/L的NaCl溶液。

9.一种非均一组分珊瑚菌精制多糖由权利要求1～8任一项所述制备方法得到。

10.根据权利要求8所述非均一组分珊瑚菌精制多糖的应用，其特征在于：所述非均一组分珊瑚菌精制多糖在制备抗癌、抗氧化和/或免疫增强药物中的应用。