CN103983749B - 一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析快速检测方法，包括如下步骤：一、待测样品处理：将鱼肉与Tris-HCl混合匀浆，过滤，水浴加热，离心，收集上清液为作为测试样品；二、样品检测：将胶体金标记的一抗与测试样品混合均匀得混合液，取5-15μl混合液注入毛细免疫层析管的检测区端，静置4min后用移液器推动混合液向下移动流经至免疫层析毛细管的质控区，同样在此区停留4min，将多余的液体排出毛细管外，然后免疫层析毛细管浸入在PBST缓冲液中抽动清洗，最后通过裸眼定性获得检测结果。本发明的反方法，检测灵敏度好，重复性高，检测时间快，稳定性好适合用于即时的快速检测。

Description

一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种小清蛋白的检测方法，特别涉及一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析检测方法。

背景技术

随着我国经济的快速稳定增长，人民生活质量不断提高，对食物消费的要求也越来越高。但是环境污染、农兽药残留、食物中过敏原等引起的危害食品安全的事件不断见诸报道，已引起人们的广泛关注。

20世纪80年代初期，免疫胶体金层析技术以其灵敏度高、特异性强、操作简捷、不需要仪器等特点在医学、环境、食品检测及农牧业等领域广泛应用。胶体金免疫层析方法的核心技术是以条状纤维层析材料为基底通过毛细管作用使金标材料混合物泳动，移动至固定抗原或抗体的区域时，待检物与金标的结合物被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。基于硝酸纤维素膜的高蛋白结合能力和易处理的性质被广泛用作免疫层析的基底材料。然而，硝酸纤维素膜较薄、韧性小且结构复杂，因而在处理过程中易破碎，且易受环境温度和湿度的影响进而影响检测的灵敏度、重复性和贮存寿命（Fu, E.; Liang, T.; Houghtaling, J.; Ramachandran, S.; Ramsey, S. A.; Lutz, B.; Yager, P. Enhanced sensitivity of lateral flow tests using a two-dimensional paper network format. Anal. Chem.2011, 83, 7941-7946）。

鱼肉中含有丰富的蛋白质和硫胺素、核黄素、尼克酸、维生素D和一定量的钙、磷、铁等矿物质，且鱼肉中脂肪含量低深受消费者的喜爱。但据调查显示，鱼类也是最易引起过敏的八种食物之一。研究发现肌浆蛋白中的小清蛋白，是鱼类的主要过敏原，分子量约为12 kDa左右，能引起IgE介导的过敏反应对人体的器官和免疫系统造成严重损伤，对进出口贸易产生较大影响。小清蛋白是一种钙离子结合的酸性蛋白，对热、蛋白酶的水解作用及化学变性都比较稳定，因此灭活和脱除方法的效果不好，建立一种灵敏、可靠、快速的小清蛋白检测方法成为大家关注的焦点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析检测方法，灵敏度好，重复性高，检测时间快，稳定性好适合用于即时的快速检测。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析检测方法，包括如下步骤：

一、待测样品处理：将鱼肉与Tris-HCl按照1:2-3（w/v）的比例混合匀浆，将匀浆后的样品过滤后，95-100℃下水浴加热5-25min，离心，收集上清液为作为测试样品。

本步骤主要目的是从鱼肉中提取纯化小清蛋白，常规的小清蛋白的提取方法一般要经过组织匀浆，抽提步骤，而小清蛋白的纯化过程则非常复杂，经过对粗提蛋白液进行离心，硫酸铵沉淀，透析，离子交换柱洗脱，离心等一系列步骤才能得到较纯的小清蛋白。这样的提取纯化方法较为复杂不适合现场快速检测，因此本发明为适应快速检测的需求，改进了小清蛋白的提取纯化方法。

二、样品检测：将胶体金标记的一抗与测试样品按1:1-1.5的体积比混合均匀得混合液，取5-15μL混合液注入免疫层析毛细管的检测区端，静置4min后用移液器推动混合液向下移动流经至免疫层析毛细管的质控区，同样在此区停留4min，将多余的混合液排出免疫层析毛细管，然后免疫层析毛细管浸入在PBST缓冲液中抽动清洗3-5min，最后通过裸眼定性获得检测结果。

作为优选，所述一抗为兔抗小清蛋白。

作为优选，所述免疫层析毛细管的组装方法包括如下步骤：

（1）毛细管的处理：将毛细管浸入piranha溶液中超声清洗15-20min，超纯水清洗至中性，干燥，冷却，然后将毛细管依次浸入KOH溶液、超纯水、HCl溶液、超纯水及有机溶剂中分别超声清洗10-15min，然后烘干。

利用piranha溶液的强氧化性去除毛细管上的有机残留物，同时对毛细管的玻璃表面进行羟基化，使得毛细管的玻璃表面上具有亲水性。

将毛细管依次浸入KOH溶液、超纯水、HCl溶液、超纯水及有机溶剂中分别超声清洗，以进一步清洗玻璃表面去除酸、碱和表面的活性基团，同时稳定玻璃表面上的羟基。

（2）毛细管的修饰：将GPTMS和三乙胺溶于无水甲苯中得修饰液，使得GPTMS的终浓度为8vol%-15vol%，三乙胺的终浓度为1vol%-2vol%，将步骤（1）处理所得毛细管浸没于修饰液中室温下干燥环境中反应18h-25h，排出毛细管内的修饰液，室温下干燥环境中保持2-3h，然后将毛细管浸入无水甲苯中上下抽动清洗5-7min，接着将毛细管浸入丙酮中上下抽动清洗5-7min，氮气气氛下干燥。

GPTMS（3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷）含有丰富的环氧基团，通过修饰液处理，将GPTMS的环氧基团固定在毛细管的内壁。排出毛细管内的修饰液，室温下干燥环境中保持2-3h，是为了毛细管内壁上固定的基团更稳定，以保证检测时的稳定性。

（3）免疫层析毛细管的组装：将作为检测区的抗原和作为质控区的二抗分别注入步骤（2）处理得到的毛细管的两端，25-30℃下固定1.5-2.5 h，将毛细管浸入于PBST缓冲液中抽动清洗3-5min，重复清洗三次，1-2wt%的BSA溶液注满毛细管，在30-37℃下反应1.5-2h，将毛细管浸入于PBST缓冲液中抽动清洗3-5min，重复清洗三次，干燥后获得免疫层析毛细管。

作为检测区的抗原是能与胶体金标记的一抗特异性结合的抗原，作为质控区的二抗是能与胶体金标记的一抗特异性结合的抗体。

1-2wt%的BSA溶液注满毛细管，在30-37℃下反应1.5-2h，以封闭毛细管内壁上没有连接蛋白的非特异性位点。

玻璃材质具有很多适合作为基底的优点，如廉价、表面均一光滑、无渗透、耐高温、能承受高离子强度漂洗、荧光背景低和样品使用量少等优点。

本发明针对传统免疫层析材料的不足和玻璃材质自身的优点，利用玻璃毛细管为层析反应器，将胶体金免疫层析检测方法成功转移至毛细管中，建立了一种新型毛细管免疫层析方法。将二抗和抗原固定在特定区域为质控区和检测区，应用直接竞争的方法组装了免疫层析毛细管。

作为优选，步骤（1）中的有机溶剂为丙酮或乙醇；KOH溶液浓度为0.8-1.2mol/L，HCl溶液浓度为0.8-1.2mol/L。

作为优选，步骤（1）中所述piranha溶液的制备方法为：95 wt %-98wt%浓硫酸与30wt%双氧水按照3-4:1的体积比混合，混合时将双氧水溶液缓慢加入浓硫酸中，不断搅拌以保持混合液的温度在80℃以下。

作为优选，步骤（2）无水甲苯的制备方法为：甲苯中加入无水硫酸钠静置10-24h，抽滤除去无水硫酸钠，然后加入金属钠丝，同时加入二苯甲酮作为指示剂，加热回流2-3h，然后常压蒸馏，收集111±1℃的馏分得无水甲苯。

作为优选，无水硫酸钠用量为5-10g/100mL甲苯，金属钠丝用量为0.5-1g/100mL甲苯，二苯甲酮用量为0.1-0.5g/100mL甲苯。

作为优选，所述抗原为小清蛋白，二抗为羊抗兔二抗。抗原为小清蛋白，二抗为羊抗兔二抗是针对小清蛋白的检测而设计的，用于与被检测物（小清蛋白）混合的一抗：为保证检测结果的精确和稳定性选用单克隆抗体，可以选择兔抗小清蛋白，鼠抗小清蛋白等，对应的二抗可以选择羊抗兔或者羊抗鼠、兔抗鼠等二抗。

作为优选，小清蛋白与PBS缓冲液配制成浓度0.1-0.25 mg/mL的小清蛋白溶液后注入毛细管，羊抗兔二抗与PBS缓冲液配制成浓度0.2-0.3 mg/mL的羊抗兔二抗溶液后注入毛细管。

作为优选，小清蛋白溶液注入毛细管的用量为3-6μL，羊抗兔二抗溶液注入毛细管的用量为3-6μL。

本发明的有益效果是：

1、本发明的前处理方法相对简单，根据小清蛋白为热稳定性蛋白通过水浴加热的途径除去杂蛋白，获得了纯度较高的小清蛋白，降低了其他杂蛋白与抗体的交叉结合影响，提高了对实际样品的检测准确性。

2、检测快速可在30min内得到实验结果，且实验结果可通过裸眼方便观察。

3、首次采用毛细管为免疫层析的反应器，将质控区和检测区固定在刚性的玻璃基底上，避免了传统基地材料如硝酸纤维素膜因材质复杂而引起的拖带、稳定性和重复性差的缺点。

4、由于玻璃基底表面均一光滑、无渗透、耐高温、能承受高离子强度漂洗等克服了硝酸纤维素膜、棉线、纸质等基质材料不稳定性和复杂性，可以显著地减少批间和批内差异，使检测灵敏度有了较大的提高。

5、以毛细管为免疫层析反应的容器，由于其微小的管径和可控的长度可以减少样品的使用量，十几微升甚至几微升的样品即可完成检测。

6、使用GPTMS作为将二抗和抗原固定在毛细管内壁上的交联剂，由于其末端的环氧基团提高了蛋白质的结合能力，并同时尽可能地保持了抗原抗体的活性。

7、使用毛细管作为免疫层析的反应容器成本较低，且材质较均一，利于较长时间储藏。

附图说明

图1是本发明免疫层析毛细管的组装流程图，图中a、毛细管的清洗；b、环氧基团的修饰；c、抗原和二抗的固定；d、非特异位点的封闭。

图2是本发明免疫层析毛细管的组装效果。

图3是免疫层析毛细管对小清蛋白检测结果的扫描图片，两端分别为控制区和检测区，小清蛋白的浓度为从0到10⁶ ng/mL。

图4是小清蛋白提取液的纯化在不同加热时间的凝胶电泳图，

图中泳道： 1道: 无加热；2道: 98℃，5 min水浴处理；Lane 3道: 98℃，10min水浴处理； 4道: 98℃，15 min水浴处理；5道: 98℃，25min水浴处理。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

1、仪器和试剂

 TDL-5M台式大容量冷冻离心机   湘仪离心机有限公司

超声清洗仪KQ 5200B      昆山市超声仪器有限公司

分析天平  北京赛多利斯仪器系统有限公司

MS1 Minshaker涡旋振荡器           IKA公司

电热恒温鼓风干燥箱     上海精宏实验设备有限公司

自动超纯水仪(Ro DI digital)     北京康铭泰克科技发展有限公司

pHs-3C 型pH计     上海伟业仪器厂

蛋白A柱        GE Healthare

毛细管（d=0.9mm）华西医科大学仪器厂

氯金酸（HAuCl4） 中国国药集团

兔抗小清蛋白     华大蛋白提供

羊抗兔二抗       北京中杉金桥生物技术有限公司

3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane (GPTMS)   Sigma试剂公司

BSA （牛血清白蛋白）索莱宝生物科技有限公司

三乙胺         中国国药集团

Tris-HCL        Solarbio公司。

2、免疫层析毛细管的组装

方法1：

（1）毛细管的处理：

piranha溶液的配制：95 wt %浓硫酸与30wt%双氧水按照4:1的体积比混合，混合时将双氧水溶液缓慢加入浓硫酸中，不断搅拌以保持混合液的温度在80℃以下。

将毛细管迅速浸入上述热的piranha溶液中超声清洗15min，超纯水清洗至中性，105℃的烘箱中干燥2h，冷却，然后将毛细管依次浸入浓度为0.8mol/L的KOH溶液（200mL）、超纯水（200mL，中间更换两次）、浓度为0.8mol/L的HCl溶液（200mL）、超纯水（200mL，中间更换两次）及丙酮（200mL）中分别超声清洗15min，然后在105℃的烘箱中干燥1h以上，以完全除去水分。

（2）毛细管的修饰：

无水甲苯的制备：300mL甲苯（分析纯）中加入15 g无水硫酸钠静置10h，抽滤除去无水硫酸钠，然后加入2g金属钠丝，同时加入0.5g二苯甲酮作为指示剂，将回流装置中的空气用氮气置换，加热回流2h，使溶液变蓝；停止加热，改为蒸馏装置，然后常压蒸馏，收集111±1℃的馏分得无水甲苯。

将GPTMS和三乙胺溶于无水甲苯中得修饰液，使得GPTMS的终浓度为8vol%，三乙胺的终浓度为1vol%，将步骤（1）处理所得毛细管浸没于修饰液中室温下干燥环境中反应25h，排出毛细管内的修饰液，室温下干燥环境中保持2h，然后将毛细管浸入无水甲苯中上下抽动清洗5min，接着将毛细管浸入丙酮中上下抽动清洗5min，氮气气氛下干燥。

（3）免疫层析毛细管的组装：

将作为检测区的抗原（浓度0.1mg/mL的小清蛋白溶液，小清蛋白与PBS缓冲液（PH7.4，0.01mol/L）配制而成）和作为质控区的二抗（浓度0.2mg/mL的羊抗兔二抗溶液，羊抗兔二抗与PBS缓冲液（PH7.4，0.01mol/L）配制而成）分别注入步骤（2）处理得到的毛细管的两端，小清蛋白溶液注入毛细管的用量为6μL，羊抗兔二抗溶液注入毛细管的用量为6μL，25℃下固定2.5h，将毛细管浸入于PBST缓冲液（PH7.4）中抽动清洗3min，重复清洗三次，1wt%的BSA溶液（BSA与PBS缓冲液（PH7.4，0.01mol/L）配制而成）注满毛细管，在30℃下反应2h，将毛细管浸入于PBST缓冲液中抽动清洗3min，重复清洗三次，干燥后获得免疫层析毛细管。

方法2：

（1）毛细管的处理：

piranha溶液的配制：98wt%浓硫酸与30wt%双氧水按照3:1的体积比混合，混合时将双氧水溶液缓慢加入浓硫酸中，不断搅拌以保持混合液的温度在80℃以下。

将毛细管迅速浸入上述热的piranha溶液中超声清洗20min，超纯水清洗至中性，105℃的烘箱中干燥1h，冷却，然后将毛细管依次浸入浓度为1.2mol/L的KOH溶液（200mL）、超纯水（200mL，中间更换两次）、浓度为1.2mol/L的HCl溶液（200mL）、超纯水（200mL，中间更换两次）及乙醇（200mL）中分别超声清洗15min，然后在105℃的烘箱中干燥1h以上，以完全除去水分。

（2）毛细管的修饰：

无水甲苯的制备：300mL甲苯（分析纯）中加入30 g无水硫酸钠静置24h，抽滤除去无水硫酸钠，然后加入1.5g金属钠丝，同时加入1.5g二苯甲酮作为指示剂，将回流装置中的空气用氮气置换，加热回流3h，使溶液变蓝；停止加热，改为蒸馏装置，然后常压蒸馏，收集111±1℃的馏分得无水甲苯。

将GPTMS和三乙胺溶于无水甲苯中得修饰液，使得GPTMS的终浓度为15vol%，三乙胺的终浓度为2vol%，将步骤（1）处理所得毛细管浸没于修饰液中室温下干燥环境中反应18h，排出毛细管内的修饰液，室温下干燥环境中保持3h，然后将毛细管浸入无水甲苯中上下抽动清洗7min，接着将毛细管浸入丙酮中上下抽动清洗7min，氮气气氛下干燥。

（3）免疫层析毛细管的组装：

将作为检测区的抗原（浓度0.25 mg/mL的小清蛋白溶液，小清蛋白与PBS缓冲液（PH7.4，0.01mol/L）配制而成）和作为质控区的二抗（浓度0.3mg/mL的羊抗兔二抗溶液，羊抗兔二抗与PBS缓冲液（PH7.4，0.01mol/L）配制而成）分别注入步骤（2）处理得到的毛细管的两端，小清蛋白溶液注入毛细管的用量为3μL，羊抗兔二抗溶液注入毛细管的用量为3μL，30℃下固定1.5h，将毛细管浸入于PBST缓冲液（PH7.4）中抽动清洗5min，重复清洗三次， 2wt%的BSA溶液注满毛细管，在37℃下反应1.5h，将毛细管浸入于PBST缓冲液中抽动清洗5min，重复清洗三次，干燥后获得免疫层析毛细管。

方法3：

（1）毛细管的处理：

piranha溶液的配制： 98wt%浓硫酸与30wt%双氧水按照3:1的体积比混合，混合时将双氧水溶液缓慢加入浓硫酸中，不断搅拌以保持混合液的温度在80℃以下。

将毛细管迅速浸入上述热的piranha溶液中超声清洗18min，超纯水清洗至中性，105℃的烘箱中干燥3h，冷却，然后将毛细管依次浸入浓度为1mol/L的KOH溶液（200mL）、超纯水（200mL，中间更换两次）、浓度为1mol/L的HCl溶液（200mL）、超纯水（200mL，中间更换两次）及丙酮（200mL）中分别超声清洗12min，然后在105℃的烘箱中干燥1h以上，以完全除去水分。

（2）毛细管的修饰：

无水甲苯的制备：300mL甲苯（分析纯）中加入20 g无水硫酸钠静置18h，抽滤除去无水硫酸钠，然后加入1.5g金属钠丝，同时加入1g二苯甲酮作为指示剂，将回流装置中的空气用氮气置换，加热回流2.5h，使溶液变蓝；停止加热，改为蒸馏装置，然后常压蒸馏，收集111±1℃的馏分得无水甲苯。

将GPTMS和三乙胺溶于无水甲苯中得修饰液，使得GPTMS的终浓度为10vol%，三乙胺的终浓度为1.5vol%，将步骤（1）处理所得毛细管浸没于修饰液中室温下干燥环境中反应20h，排出毛细管内的修饰液，室温下干燥环境中保持2.5h，然后将毛细管浸入无水甲苯中上下抽动清洗6min，接着将毛细管浸入丙酮中上下抽动清洗6min，氮气气氛下干燥。

（3）免疫层析毛细管的组装：

将作为检测区的抗原（浓度0.2mg/mL的小清蛋白溶液，小清蛋白与PBS缓冲液（PH7.4，0.01mol/L）配制而成）和作为质控区的二抗（浓度0.3mg/mL的羊抗兔二抗溶液，羊抗兔二抗与PBS缓冲液（PH7.4，0.01mol/L）配制而成）分别注入步骤（2）处理得到的毛细管的两端，小清蛋白溶液注入毛细管的用量为4μL，羊抗兔二抗溶液注入毛细管的用量为4μL，28℃下固定2h，将毛细管浸入于PBST缓冲液（PH7.4）中抽动清洗4min，重复清洗三次，1.5wt%的BSA溶液注满毛细管，在32℃下反应1.8h，将毛细管浸入于PBST缓冲液中抽动清洗4min，重复清洗三次，干燥后获得免疫层析毛细管。

毛细管的清洗、管内壁的修饰及质控区和检测区的组装过程如图1所示。通过piranha溶液、KOH及HCl溶液的清洗使毛细管内壁上固定上稳定的羟基基团。GPTMS为毛细管内壁连结上丰富的环氧基基团，环氧基相比较于氨基和羧基提供更优异的蛋白质固定基团，并能尽可能的保证蛋白质的活性。GPTMS将二抗和抗原固定在特定区域作为质控区和检测区，BSA将没有连结二抗、抗原的非特异性位点环氧基团进行封闭。至此，免疫层析毛细管的组装过程结束，4℃下储存备用。

免疫层析毛细管的具体组装效果如图2，当金标一抗和待检测物同时进入免疫层析毛细管进行免疫反应后，通过颜色现象分析其测试结果。a为固定好质控区和检测区的免疫层析毛细管；b为对阴性样品的检测，当进入免疫层析毛细管的混合液中没有待测物时，金标一抗和检测区上固定的抗原结合，当到达质控区时同样和管壁上的二抗结合，因此可以同时在检测区和质控区看到由于金标一抗聚集呈现两条红色；c为对阳性样品的检测，由于待测样品中的抗原与免疫层析毛细管检测区上固定的抗原与金标一抗发生竞争性结合，因此金标一抗就无法或者只有少量能结合到检测区上固定的抗原，因此，检测区的颜色相对质控区明显减弱或者完全没有颜色，只出现金标一抗聚集在质控区的一条红色区域。

3、毛细管检测条件的优化

设置了一系列的环氧基硅烷（GPTMS）修饰时间实验，结果表明随着固定时间的延长，免疫反应后显色逐渐加深，当固定时间超过18h后显色深度逐渐不发生变化，且随着时间的增长管内壁上开始出现固定不均匀的情况，因此修饰时间确定为18h-25h。

对修饰液的比例进行选择，将GPTMS配置成一系列浓度的混合液（5 vol %-25 vol %），把前处理过的毛细管浸入此混合液中固定18h。免疫反应后可以观察到当GPTMS的浓度达到8vol%-15vol%后，随着GPTMS浓度的增大，颜色深度将不再增加。因此，在本发明中GPTMS的浓度选为8vol%-15vol%。

封闭液和封闭时间的选择，配置成一系列浓度的BSA溶液（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，4%，5%），对固定有质控区、检测区的毛细管进行不同时间的封闭：1h, 1.5h, 2h, 2.5h, 3h。以质控区和阴性样品的检测区边界清晰，对阳性检测完全没有颜色为标准，最终选择的封闭液的浓度为1%-2%，封闭时间为1.5-2h。

质控区和检测区固定二抗和抗原浓度的选择：将二抗和抗原的浓度分别稀释为0.1-0.5 mg/mL，检测阴性样品时质控区和检测区的颜色基本相同，阳性样品时检测区完全没有颜色，同时保证两者的用量最小及尽量低的检测限。经过优化后固定二抗的浓度约为0.2-0.3 mg/mL，抗原的浓度约为0.1-0.25 mg/mL。

将制备好的免疫层析毛细管用于阴性样品的检测，在反应之初质控区和检测区的颜色随着显色时间的增加而加深，4min后颜色的深浅基本上不发生变化，说明金标一抗已稳定结合在管壁上，因此显色时间为4min。

4、对小清蛋白的检测

4.1胶体金标记的一抗（金标一抗）的制备

胶体金的制备：将实验中用到的玻璃仪器和转子等在新配置的王水（HCl：HNO₃＝3：1）中至少浸泡15min，然后依次用大量的去离子水冲洗干净，100℃以上干燥。向双颈瓶中加入100mL 1mM HAuCl₄，在冷凝条件下使用磁力搅拌器搅拌下均匀加热。充分沸腾后，快速加入10mL38.8mM 柠檬酸钠溶液，溶液的颜色会发生快速的变化，其顺序应为：淡黄色→无色→黑色→紫色→深红色。继续加热回流15-20min后停止加热，持续搅拌使反应系统自然冷却至室温。将冷却好的溶液过孔径为0.45μm的醋酸滤膜。制备好的纳米金溶液4℃条件下避光保存。

胶体金标记的一抗的制备：使用蛋白A柱对兔抗小清蛋白（一抗）进行纯化，3000g离心15min除去沉淀。0.1M的K₂CO₃将上述纳米金溶液调至pH 8.2，缓慢加入兔抗小清蛋白至终浓度为20μg/mL，缓慢均匀搅拌2h，接下来加入10wt% BSA至终浓度为1 wt %，以及 1 wt % 的聚乙二醇（PEG20000）至最终体积的1/10，继续搅拌30min封闭纳米金粒子上的非特异性位点。然后2500 g 离心15 min除去聚集的沉淀， 10000 g 离心1h 收集沉淀，将沉淀复溶于pH8.2的含有1wt% BSA和0.02 wt % NaN₃的Tris-HCl缓冲液，复溶至原体积（纳米金溶液的体积）的1/10得金标兔抗小清蛋白（胶体金标记的一抗），4℃保存。

4.2检测

实施例1

一、待测样品处理：将鱼肉（从佳世客超市（青岛）中购买的大菱鲆）与Tris-HCl（pH 7.5）按照1:2（w/v）的比例混合匀浆，将匀浆后的样品过滤后，95℃下水浴加热25min，3800g离心5min，收集上清液（提取的小清蛋白）为作为测试样品。

二、样品检测：将4.1节制备的胶体金标记的一抗（金标兔抗小清蛋白）与测试样品按1:1的体积比混合均匀得混合液，取5μL混合液注入免疫层析毛细管的检测区端，静置4min后用移液器推动混合液向下移动流经至免疫层析毛细管的质控区，同样在此区停留4min，将多余的混合液排出免疫层析毛细管，然后免疫层析毛细管浸入在PBST缓冲液（PH7.4）中抽动清洗3min，最后通过裸眼定性获得检测结果。

实施例2

一、待测样品处理：将鱼肉（从佳世客超市（青岛）中购买的大菱鲆）与Tris-HCl（pH 7.5）按照1: 3（w/v）的比例混合匀浆，将匀浆后的样品过滤后，100℃下水浴加热5min，3800g离心5min，收集上清液（提取的小清蛋白）为作为测试样品。

二、样品检测：将4.1节制备的胶体金标记的一抗（金标兔抗小清蛋白）与测试样品按1:1.5的体积比混合均匀得混合液，取15μL混合液注入免疫层析毛细管的检测区端，静置4min后用移液器推动混合液向下移动流经至免疫层析毛细管的质控区，同样在此区停留4min，将多余的混合液排出免疫层析毛细管，然后免疫层析毛细管浸入在PBST缓冲液（PH7.4）中抽动清洗5min，最后通过裸眼定性获得检测结果。

实施例3

一、待测样品处理：将鱼肉（从佳世客超市（青岛）中购买的大菱鲆）与Tris-HCl（pH 7.5）按照1:2（w/v）的比例混合匀浆，将匀浆后的样品过滤后，98℃下水浴加热10min，3800g离心5min，收集上清液（提取的小清蛋白）为作为测试样品。

二、样品检测：将4.1节制备的胶体金标记的一抗（金标兔抗小清蛋白）与测试样品按1:1的体积比混合均匀得混合液，取10μL混合液注入免疫层析毛细管的检测区端，静置4min后用移液器推动混合液向下移动流经至免疫层析毛细管的质控区，同样在此区停留4min，将多余的混合液排出免疫层析毛细管，然后免疫层析毛细管浸入在PBST缓冲液（PH7.4）中抽动清洗4min，最后通过裸眼定性获得检测结果。

免疫反应后通过观察质控区和检测区的颜色判定结果。当两部分均呈现红色且颜色几乎相同时为阴性结果；只有质控区呈现红色，检测区为无色或者是检测区的颜色比质控区浅时为阳性结果；质控区未呈现红色的免疫层析毛细管为失效。

4.3不同浓度小清蛋白的检测分析

将鱼肉（从佳世客超市（青岛）中购买的大菱鲆）与Tris-HCl（pH 7.5）按照1:2（w/v）的比例混合匀浆，将匀浆后的样品过滤后，98℃下水浴加热5min，3800g离心5min，收集上清液即为提取的小清蛋白，用考马斯亮蓝法（现有常规方法）测定小清蛋白的浓度，然后用PBS（ PH7.4，0.01mol/L）将小清蛋白配置成一系列浓度梯度的溶液，金标兔抗小清蛋白（胶体金标记的一抗）与不同浓度的小清蛋白溶液按1:1的体积比混合混匀，取5μL的前述混合液从检测区端注入免疫层析毛细管，静置4min后用移液器推动混合液向下移动流经至免疫层析毛细管的质控区，同样在此区停留4min，将多余的混合液排出毛细管，然后用PBST（pH7.4）注满全管后甩出清洗，重复此清洗步骤三次，观察显色情况。其结果如图3所示，当小清蛋白的浓度升高至70ng/mL时检测区的颜色开始明显浅于质控区的颜色，当浓度继续升高时颜色越来越浅，因此本发明的免疫层析毛细管的视觉检测限为70ng/mL，即当小清蛋白的浓度高于70ng/mL检测区的颜色明显浅于质控区或检测区无颜色为阳性，反之为阴性。此检测限显著低于对鱼过敏的消费者的最低预期值5 mg/kg。

4.4毛细层析管的稳定性和重复性

将同一批次制备的毛细层析管4 ℃条件下分别储存2, 4, 8 天，和2, 4 周，进行阴性样本检测，其检测区和控制区的颜色均没有明显变化，说明储存稳定性良好。原因可能是由于玻璃毛细管可以有效的保护检测区不被环境的温度、湿度、氧气和光线所破坏。小清蛋白通过环氧基团共价固定在检测区，此共价结合力明显牢固于传统的电子吸引力和疏水作用力，因此增强了检测的稳定性。

5、实际样品的检测验证

大菱鲆被选作研究对象以检测本发明的方法对小清蛋白的实际检测性能。将鱼肉（从佳世客超市（青岛）中购买的大菱鲆）与Tris-HCl（pH 7.5）按照1:2（w/v）的比例混合匀浆，将匀浆后的样品过滤后，98℃下水浴加热5min，3800g离心5min，收集上清液即为提取纯化的小清蛋白，用考马斯亮蓝法（现有常规方法）测定小清蛋白的浓度，小清蛋白浓度为2.19 mg/mL。

小清蛋白是一种热稳定蛋白，且抗体结合能力不会随着热处理而降低。 通过对匀浆、过滤后的样品进行98℃水浴加热5-25min以纯化小清蛋白，将小清蛋白浓度调至1mg/mL，SDS-PAGE用来表征其小清蛋白的纯化结果（见图4），其结果证明经过5min的加热杂蛋白几乎全部出去。

本发明的方法用于检测由大菱鲆中提取纯化的不同浓度的小清蛋白，用PBS对提取纯化后的小清蛋白进行6个10倍梯度稀释，然后用本发明的方法定性检测，结果见表1，结果所示前4个稀释梯度均呈现阳性，至第5个稀释梯度时检测结果呈现阴性，此时小清蛋白的浓度为219 ng/mL，与接近于在标准溶液中的视觉检测限70 ng/mL。

表1本发明的方法检测大菱鲆中不同稀释浓度的小清蛋白

a: 无红色条带

b: 明显的红色条带

6、与现有方法的比较

本发明的方法对小清蛋白检测的效果与现有技术的其他方法（如ELISA，免疫层析）描述的对小清蛋白的检测效果进行比较，结果见表2，由表2可知，本发明的方法具有较低的检测限和需要较短的时间。

表2 小清蛋白检测方法的比较

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参考文献1：Cheng Zheng, Xichang Wang, Ying Lu, Yuan Liu. Rapid detection of fish major allergen using superparamagnetic nanoparticle-based lateralflow immunoassay, Food Control 26 (2012) 446-452。

参考文献2：Christiane K. F??ste, Christin Plassen. Quantitative sandwich ELISA for the determination of fish in foods. Journal of Immunological Methods 329 (2008) 45–55。

参考文献3：Qiu-Feng Cai, Xi-Chang Wang, Guang-Ming Liu, Lin Zhang, Mi-Mi Ruan, Yuan Liu, Min-Jie Cao. Development of a monoclonal antibody-based competitive enzyme linked-immunosorbent assay (c-ELISA) for quantification of silver carp parvalbumin. Food Control 29 (2013) 241-247。

参考文献4：Yusuke Shibahara, Yoshihiko Uesaka, Jun Wang, Shoichi Yamada, Kazuo Shiomi. A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of fish protein in processed foods. Food Chemistry 136 (2013) 675–681。

参考文献5：Akiyama, H., Imai, T., & Ebisawa, M. (2011). Japan food allergen labeling regulation –History and evaluation.Advances in Food and Nutrition Research, 62, 139–171。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (9)

1.一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

一、待测样品处理：将鱼肉与Tris-HCl按照1:2-3（w/v）的比例混合匀浆，将匀浆后的样品过滤后，95-100℃下水浴加热5-25min，离心，收集上清液为作为测试样品；

二、样品检测：将胶体金标记的一抗与测试样品按1:1-1.5的体积比混合均匀得混合液，取5-15μL混合液注入免疫层析毛细管的检测区端，静置4min后用移液器推动混合液向下移动至免疫层析毛细管的质控区，同样在此区停留4min，将多余的混合液排出免疫层析毛细管，然后免疫层析毛细管浸入在PBST缓冲液中抽动清洗3-5min，最后通过裸眼定性获得检测结果；

所述免疫层析毛细管的组装方法包括如下步骤：

（1）毛细管的处理：将毛细管浸入piranha溶液中超声清洗15-20min，超纯水清洗至中性，干燥，冷却，然后将毛细管依次浸入KOH溶液、超纯水、HCl溶液、超纯水及有机溶剂中分别超声清洗10-15min，然后烘干；

（2）毛细管的修饰：将GPTMS和三乙胺溶于无水甲苯中得修饰液，使得GPTMS的终浓度为8vol%-15vol%，三乙胺的终浓度为1vol%-2vol%，将步骤（1）处理所得毛细管浸没于修饰液中室温下干燥环境中反应18h-25h，排出毛细管内的修饰液，室温下干燥环境中保持2-3h，然后将毛细管浸入无水甲苯中上下抽动清洗5-7min，接着将毛细管浸入丙酮中上下抽动清洗5-7min，氮气气氛下干燥；

（3）免疫层析毛细管的组装：将作为检测区的抗原和作为质控区的二抗分别注入步骤（2）处理得到的毛细管的两端，25-30℃下固定1.5-2.5 h，将毛细管浸入于PBST缓冲液中抽动清洗3-5min，重复清洗三次，1-2wt%的BSA溶液注满毛细管，在30-37℃下反应1.5-2h，将毛细管浸入于PBST缓冲液中抽动清洗3-5min，重复清洗三次，干燥后获得免疫层析毛细管。

2.根据权利要求1所述的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于：所述一抗为兔抗小清蛋白。

3.根据权利要求1所述的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于：步骤（1）中的有机溶剂为丙酮或乙醇；KOH溶液浓度为0.8-1.2mol/L，HCl溶液浓度为0.8-1.2mol/L。

4.根据权利要求1所述的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述piranha溶液的制备方法为：95wt%-98wt%浓硫酸与30wt%双氧水按照3-4:1的体积比混合，混合时将双氧水溶液缓慢加入浓硫酸中，不断搅拌以保持混合液的温度在80℃以下。

5.根据权利要求1所述的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于：步骤（2）无水甲苯的制备方法为：甲苯中加入无水硫酸钠静置10-24h，抽滤除去无水硫酸钠，然后加入金属钠丝，同时加入二苯甲酮作为指示剂，加热回流2-3h，然后常压蒸馏，收集111±1℃的馏分得无水甲苯。

6.根据权利要求5所述的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于：无水硫酸钠用量为5-10g/100mL甲苯，金属钠丝用量为0.5-1g/100mL甲苯，二苯甲酮用量为0.1-0.5g/100mL甲苯。

7.根据权利要求1所述的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于：所述抗原为小清蛋白，二抗为羊抗兔二抗。

8.根据权利要求7所述的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于：小清蛋白与PBS缓冲液配制成浓度0.1-0.25 mg/mL的小清蛋白溶液后注入毛细管，羊抗兔二抗与PBS缓冲液配制成浓度0.2-0.3 mg/mL的羊抗兔二抗溶液后注入毛细管。

9.根据权利要求8所述的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于：小清蛋白溶液注入毛细管的用量为3-6μL，羊抗兔二抗溶液注入毛细管的用量为3-6μL。