发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种方法设计合理、所加工的产品有效成份高且易保存的龙葵鲜果的加工方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了上述方法所加工的产品的提取物颗粒。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了上述方法所加工的产品及其提取物颗粒的用途。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种龙葵鲜果的加工方法,其特点是,选取茄科植物龙葵Solanum nigrum L或少花龙葵S. photeinocarpum Nakamura
et Odashima未成熟龙葵果进行加工,其步骤如下:
(1)摘取6~8月未成熟龙葵果,龙葵果颜色青绿、青黄色;果实硬度为7~2Kg•cm-1;采摘前取少量果实,加入等倍量水,匀浆破碎,过滤后,滤液青绿色至棕绿色,且不出现红棕色、玫瑰色;
(2)采摘后龙葵果,去杂质与果柄后,挑选未损伤果皮、无浆汁析出、形状饱满果实,经检测果实硬度为7~2Kg•cm-1;以水洗净,沥干,得龙葵果。
以上为本发明第一种加工方法技术方案。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还提供了另一种龙葵鲜果的加工方法,其特点是,其步骤如下:
(1)摘取6~8月未成熟龙葵果,龙葵果颜色青绿、青黄色;果实硬度为7~2Kg•cm-1;采摘前取少量果实,加入等倍量水,匀浆破碎,过滤后,滤液青绿色至棕绿色,且不出现红棕色、玫瑰色;
(2)采摘后龙葵果,去杂质与果柄后,挑选未损伤果皮、无浆汁析出、形状饱满果实,经检测果实硬度为7~2Kg•cm-1;以水洗净,沥干;
(3)取步骤(2)的处理得到的净果置沸水中0.5~10分钟,取出,沥干;或者再置冷水中0.5~20分钟,取出沥干;
(4)取步骤(2)或(3)处理后的果实,置阴凉通风处0.5~10日,或以循环热风干燥处理,使果实脱水5%~50%;
(5)取步骤(2)沥干后果实,或者取步骤(4)处理后无霉变、无破损的脱水后果实,按重量体积比1:0.5~10,每1千克果实加入0.5~10L白酒或食用酒精浸泡,白酒酒精度V/V为20~65 %,食用酒精浓度为15%~85%。浸泡时间为0.5天以上;
(6)应在洁净级环境中,分批次整容器取步骤(5)处理后的果实,沥干液体,通风去残余酒份,待处理;收集全部浸泡用白酒或食用酒精,回收乙醇,浓缩至相对密度1.01~1.08,取浓缩液均匀喷在待处理的果实上,边喷边轻轻搅拌和干燥,干燥温度40~80℃,至果实表面无明显水分,不出现滴水现象,即得成品龙葵果。
以上为本发明第二种加工方法技术方案。
经本发明方法加工后的成品特征:果体柔软,无果柄;果皮皱缩,表面颜色青黄;气有醇味。长期保存,色泽,形状和有效组分含量无明显变化。
以上所述的本发明方法加工得到的龙葵果可以用来制备肿瘤治疗或者肿瘤治疗增效减毒的药物。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还公开了一种如以上技术方案所述方法加工得到的龙葵果提取物颗粒,其特点是,其制备方法如下:取以上技术方案加工得到的龙葵果,按重量体积比1g:5~12mL加水煎煮2~3次,每次煎煮0.5~2小时,合并煎煮液,浓缩至相对密度1.01~1.05,加入药用辅料,进行干燥,制成龙葵果提取物颗粒。
本发明提供的一种龙葵鲜果加工方法,通过该方法获得的原料有效组分高;加工后的产品易于保存、运输。产品以水煎煮或以水溶解后,有效组分含量明显高于鲜果水煎汁和干燥果实水煎汁;产品以水煎煮或以水溶解后应用,具有抗肿瘤治疗作用。
以下是发明人所做的相关实验及其结果。
实验一:不同生长期龙葵果有效组分含量
1)供试品:
A、取如本第一种加工方法选取的原料果实,果实颜色青绿、青黄,果实硬度≥2Kg•cm-1,果汁颜色棕绿色;
B、果实颜色棕红色,果实硬度≤2Kg•cm-1,果汁颜色玫瑰红色;
C、果实颜色深紫色,果实硬度≤1Kg•cm-1,果汁颜色深紫色;
以上均为净果。
2)检测方法:
照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录
D)。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.002mol/L磷酸氢二钠溶液(37:63)为流动相;检测波长为203nm;柱温:30℃。理论板数按澳洲茄碱峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备 精密称取澳洲茄碱、澳洲茄边碱对照品适量,分别加甲醇制成每1ml 含0.1mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 分别取供试品A、B、C各50g加入适量的水,匀浆,浓缩,干燥,加甲醇混匀,转移至500ml量瓶中,超声30min,加甲醇定容至刻度,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
试验结果如下:
样品名称
|
澳洲茄碱(mg/g
)
|
澳洲茄边碱(mg/g
)
|
A
|
7.54
|
9.04
|
B
|
2.89
|
1.51
|
C
|
1.81
|
0.95
|
以澳洲茄碱和澳洲茄边碱为观察指标,结果显示,随着果实成熟度增加,果实硬度减少,果汁颜色加深,果实中甾体类生物碱苷类有效组分显著降低。
实验二:采摘后一般条件下储存时间及有效组分含量比较(0、3、6、9天)。
1、储存时间观察
取如实验一的A类果实10颗,于25℃置托盘中,分别于第0、3、6、9、12日观察色泽、硬度。
研究显示,大多数青果在放置6天后出现显著颜色变化和硬度变化,在12天出现霉变现象,说明鲜果在一般包装环境下保存时间较短。
2、不同保存时间下有效组分含量变化
取四组A类果实,每组各50g,分别于0、3、6、9日观察有效组分含量变化。检测方法如案例一。结果如下:
结果显示龙葵鲜果在一般储存条件下,有效组分随时间而下降。
实验三: 龙葵鲜果及两种龙葵鲜果加工精制品有效组分含量测定
一、龙葵鲜果及两种龙葵鲜果加工精制品的加工方法
1、龙葵鲜果:(1)摘取6~8月未成熟龙葵果,龙葵果颜色青绿、青黄色;果实硬度为7~2Kg•cm-1;采摘前取少量果实,加入等倍量水,匀浆破碎,过滤后,滤液青绿色至棕绿色,且不出现红棕色、玫瑰色;(2)采摘后龙葵果,去杂质与果柄后,挑选未损伤果皮、无浆汁析出、形状饱满果实,以水洗净,沥干,得龙葵鲜果。
2、龙葵鲜果加工精制品-1
(1)取上述龙葵鲜果,置沸水中0.5~10分钟,取出,沥干;或者再置冷水中0.5~20分钟,取出沥干;
(2)取步骤(1)处理后的果实,置阴凉通风处0.5~10日,或以循环热风干燥处理,使果实脱水5%~50%;
(3)取步骤步骤(2)处理后无霉变、无破损的脱水后果实,按重量体积比1:0.5~10,每1千克果实加入0.5~10L白酒或食用酒精浸泡,白酒酒精度V/V为20~65 %,食用酒精浓度为15%~85%。浸泡时间为0.5天以上;
(4)在洁净级环境中,分批次整容器取步骤(3)处理后的果实,沥干液体,通风去残余酒份,待处理;收集全部浸泡用白酒或食用酒精,回收乙醇,浓缩至相对密度1.01~1.08,取浓缩液均匀喷在待处理的果实上,边喷边轻轻搅拌和干燥,干燥温度40~80℃,至果实表面无明显水分,不出现滴水现象,即得。
3、龙葵鲜果加工精制品-2
(1)取上述龙葵鲜果,置阴凉通风处0.5~10日,或以循环热风干燥处理,使果实脱水5%~50%;
(2)取步骤(1)处理后无霉变、无破损的脱水后果实,按重量体积比1:0.5~10,每1千克果实加入0.5~10L白酒或食用酒精浸泡,白酒酒精度V/V为20~65 %,食用酒精浓度为15%~85%。浸泡时间为0.5天以上;
(3)在洁净级环境中,分批次整容器取步骤(2)处理后的果实,沥干液体,通风去残余酒份,待处理;收集全部浸泡用白酒或食用酒精,回收乙醇,浓缩至相对密度1.01~1.08,取浓缩液均匀喷在待处理的果实上,边喷边轻轻搅拌和干燥,干燥温度40~80℃,至果实表面无明显水分,不出现滴水现象,即得。
二、龙葵鲜果及两种龙葵鲜果加工精制品有效组分含量测定
1、龙葵果供试品溶液配制方法:取龙葵鲜果50g,加入适量的水,匀浆,浓缩,干燥,加甲醇混匀,转移至500ml量瓶中,超声30min,加甲醇定容至刻度,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
2、龙葵鲜果加工精制品-1供试品溶液配制方法:龙葵鲜果加工精制品-1 50g,加入适量的水,煎煮两次,煎煮液过滤蒸干,残渣加甲醇混匀,转移至100ml量瓶中,超声30min,加甲醇定容至刻度,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
3、龙葵鲜果加工精制品-2供试品溶液配制方法:龙葵鲜果加工精制品-2 50g,加入适量的水,煎煮两次,煎煮液过滤蒸干,残渣加甲醇混匀,转移至100ml量瓶中,超声30min,加甲醇定容至刻度,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
检测结果如下:
样品名称 |
澳洲茄碱(mg/g) |
澳洲茄边碱(mg/g) |
鲜龙葵果
|
7.71 |
9.28 |
龙葵鲜果加工精制品-1
|
8.36 |
11.57 |
龙葵鲜果加工精制品-2
|
8.44 |
11.70 |
检测显示,两种龙葵鲜果加工精制品有效组分含量无明显差异。但从成品色泽上观察,龙葵鲜果加工精制品-2颜色为黄绿色,龙葵鲜果加工精制品-1颜色则偏黄。
实验四:鲜龙葵果、鲜龙葵果汁、鲜龙葵果煎汁、龙葵干果、龙葵鲜果加工精制品、鲜龙葵果加工精制品颗粒(鲜龙葵果提取物颗粒)有效组分含量测定
鲜龙葵果、鲜龙葵果汁、鲜龙葵果煎汁、龙葵干燥果、鲜龙葵果加工精制品煎汁、鲜龙葵果加工精制品颗粒(鲜龙葵果提取物颗粒)分别按序列为样品1~6。
样品1供试品溶液配制方法:取如实验三的龙葵鲜果50g,加入适量的水,匀浆,浓缩,干燥,加甲醇混匀,转移至500ml量瓶中,超声30min,加甲醇定容至刻度,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
样品2供试品溶液配制方法:取如实验三的龙葵鲜果50g加入适量的水,匀浆,过滤,滤汁蒸干,残渣加甲醇混匀,转移至500ml量瓶中,超声30min,加甲醇定容至刻度,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
样品3供试品溶液配制方法:取如实验三的龙葵鲜果50g加入适量的水,煎煮两次,煎煮液过滤蒸干,残渣加甲醇混匀,转移至100ml量瓶中,超声30min,加甲醇定容至刻度,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
样品4供试品溶液配制方法:取取如实验三的龙葵鲜果50g,通风,阴干,烘干至含水量小于15%,制成龙葵干燥果;加入适量的水,煎煮两次,煎煮液过滤,蒸干,残渣加甲醇混匀,转移至100ml量瓶中,超声30min,加甲醇定容至刻度,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
样品5供试品溶液配制方法:取龙葵鲜果加工精制品-2 50g,加入适量的水,煎煮两次,煎煮液过滤蒸干,残渣加甲醇混匀,转移至100ml量瓶中,超声30min,加甲醇定容至刻度,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
样品6供试品溶液配制方法:取以龙葵鲜果加工精制品-2加工所得的龙葵提取物颗粒1g(相当于5克龙葵果加工精制品),加甲醇混匀,转移至100ml量瓶中,超声30min,加甲醇定容至刻度,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
检测结果(折算成龙葵果)如下:
样品名称 |
澳洲茄碱(mg/g) |
澳洲茄边碱(mg/g) |
鲜龙葵果
|
7.71 |
9.28 |
鲜龙葵果汁
|
3.25 |
4.05 |
鲜龙葵果煎汁
|
5.13 |
4.28 |
龙葵干果
|
1.35 |
2.35 |
鲜龙葵果加工精制品
|
8.44 |
11.70 |
鲜龙葵果加工精制品颗粒(鲜龙葵果提取物颗粒
|
8.13 |
10.95 |
试验显示,精制加工后的龙葵果经煎煮或制成提取物颗粒后,澳洲茄碱与澳洲茄边碱含量与鲜龙葵果含量相比,无显著降低。而鲜龙葵果汁、鲜龙葵果煎汁、龙葵干燥果三种样品检测数据明显低于鲜龙葵果的澳洲茄碱与澳洲茄边碱含量,说明这三种加工方法不能有效的保留鲜龙葵果中的有效组分。
实验五:鲜龙葵果加工精制品、鲜龙葵果提取物颗粒保存期试验观察
取龙葵鲜果加工精制品-2及其提取物颗粒分别于0、3、6、9月观察有效组分含量变化。检测方法如案例四。结果如下:
试验表明,鲜龙葵果加工精制品、鲜龙葵果提取物颗粒在保存9个月时,未见有效组分明显变化。
实验六:鲜龙葵果加工精制品、鲜龙葵果提取物颗粒抗肿瘤试验观察
1、试验:鲜龙葵果加工精制品、鲜龙葵果提取物颗粒体外对肿瘤细胞的影响:
①接种细胞:用0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的肿瘤细胞,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液,以每孔0.4×104个(2×104个/ml,0.2ml)细胞接种于96孔板中,将培养板移入CO2孵箱中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24小时后加药。
② 以龙葵鲜果加工精制品-2及其提取物颗粒研究。取鲜龙葵果加工精制品50g,加入适量的水,煎煮两次,煎煮液合并,过滤,浓缩至适量;取鲜龙葵果提取物颗粒,加适量水充分溶解。两种溶液分别按澳洲茄碱与澳洲茄边碱含量之和计算总碱含量,并分别稀释为0.4、2、10、40、120µg/ml五个浓度。
加药:0.4、2、10、40、120µg/ml(终浓度)每个浓度平行6孔,用培养基稀释后加入(空白对照孔:不加细胞,只加培养液;阴性对照孔:除不加药物外,其余操作相同),细胞继续培养24小时。
③呈色:弃上清,每孔加200µl新鲜配制的含0.4mg/ml MTT的无血清培养基,继续培养4h,然后弃上清加200µl DMSO溶解MTT甲簪沉淀,用微型振荡器振荡混匀。
④比色:酶标仪测定490nm处光密度值(以空白对照孔调零),按下式计算肿瘤细胞抑制率[1]:
细胞抑制率(%) =(对照组OD值-试验组OD值)/ 对照组OD值×100%
LOGIT法计算半数抑制浓度IC50。
龙葵鲜果加工精制品、龙葵鲜果提取物颗粒各分为五组剂量(0.4、2、10、40、120µg/ml),分别体外作用于3种肿瘤细胞。试验显示,在120µg/ml剂量下,鲜龙葵果加工精制品、鲜龙葵果提取物颗粒对于3种肿瘤细胞的均表现出很强的抑制作用:
鲜龙葵果加工精制品水煎液对(人肝癌细胞)SMMC-7721l两次试验的抑制率分别为86.28%和89.16%,对(人胃癌细胞)BGC-803两次试验的抑制率分别为79.58%和77.86%,对(人肺癌细胞)A549两次试验的抑制率分别为85.75%和87.52%,SNSA对各种肿瘤细胞的半数抑制率经计算分别为14.13 µg/ml(SMMC-7721)、16.26 µg/ml(BGC-803)、14.55 µg/ml(A549)。
鲜龙葵果提取物颗粒对(人肝癌细胞)SMMC-7721l两次试验的抑制率分别为84.20%和88.36%,对(人胃癌细胞)BGC-803两次试验的抑制率分别为81.43%和81.81%,对(人肺癌细胞)A549两次试验的抑制率分别为86.94%和86.10%,SNSA对各种肿瘤细胞的半数抑制率经计算分别为14.26 µg/ml(SMMC-7721)、15.93 µg/ml(BGC-803)、14.78 µg/ml(A549)。
随着两种溶液浓度的降低,肿瘤抑制率逐渐下降。当两种溶液浓度降至0.4µg/ml时,肿瘤细胞基本不受影响。
从肿瘤细胞形态上看,在两种溶液120µg/ml及40µg/ml剂量作用下,肿瘤细胞结构均遭到破坏,细胞数量稀少;随着两种溶液剂量的降低,肿瘤细胞形态趋于完整,但数量仍较少;在0.4µg/ml剂量下,两种溶液对肿瘤的抑制作用消失,细胞形态完整,数量较多。综上所述,鲜龙葵果加工精制品、鲜龙葵果提取物颗粒对于各种肿瘤细胞在体外均有较强的抑制作用,能明显抑制肿瘤细胞在体外的生长,改变肿瘤细胞的形态,引起肿瘤细胞的死亡。