KR102334376B1 - 붉나무 추출물을 포함하는 염증성 피부트러블 완화용 화장품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 붉나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선 화장료 복합 조성물을 제공함으로써, 최소의 용량으로도 생리활성이 우수한 성분이 다량 포함되어 있고, 상기 복합 조성물에 포함되는 붉나무 및 천연 한방 소재의 보조 추출물의 최적 배합 비율을 통해 화장품 제조 시 높은 안정성과 효용성이 향상되는 효과가 있다.

Description

붉나무 추출물을 포함하는 염증성 피부트러블 완화용 화장품 조성물{Cosmetic composition for skin improvement using Rhus javanica L.}

본 발명은 현대인들의 과도한 화학제품에 대한 노출로 인해 발생하는 문제성 피부의 개선효과를 줄 수 있는 천연물인 붉나무(Rhus javanica L.) 추출물을 유효성분으로 하고 복합 한방 소재를 포함하는 보조추출물이 더 추가되어 문제성 피부개선 효능이 우수한 혼합 조성물을 제공함으로써 이를 포함하는 기초 화장품으로 제조가 가능한 피부 개선 복합 화장료 조성물에 관한 것이다.

붉나무(japanese sumac, Rhus javanica)는 오배자 나무, 염부목, 소금나무 등으로 불리우며, 산지에 자생하는 무독성의 옻나무과 낙엽관목의 하나이다. 붉나무는 한국, 일본, 중국 등에 분포하는 낙엽소교목에 속하고 붉나무에서 기생하는 붉나무진딧물(Melaphis chinensis) 벌래집을 오배자라는 한약재로도 유명하다. 오배자는 한의약에서 이질이나 설사 치료에 사용 되었으며 때로는 잉크나 염료 원료로도 사용되어져 왔던 재료이다.

붉나무는 옻나무과에 속하는 속씨식물으로서 핵과 형태의 열매를 맺는다. 옻나무과로서 일부 종에서는 알러지 유발성이 강한 우루시올(uruciol)을 형성 한다.붉나무의 민간적 용법으로 새순은 나물로 식용하고, 잎은 봄에 채취하여 기침 가래에 복용하고, 붉나무의 열매에는 흰색 가루가 형성되는데 이것은 소금 성분으로 두부용 간수를 만들거나 마른 열매는 가루로 가려움, 습진, 건선 등 피부염에 바르기도 한다. 뿌리와 줄기 껍질은 고열감기, 황달, 자궁출혈 등에 달여서 복용한다.

붉나무의 민간적 요법 뿐 아니라 최근에는 붉나무의 성부이나 함량, 각종 기능활성에 대한 연구가 시도되어 붉나무의 천연자원으로서의 유용성이 점점 규명되고 있다. 최근에 연구 결과로는 붉나무 수피로부터 항산화 물질을 분리하여 천연 항산화제로서의 기능성을 밝힌 바 있고, 붉나무 가지를 물과 에탄올로 추출한 추출물의 항노화 및 항염증 효과를 측정한 바 있다.

한편, 자연에서 얻어지는 천연 원료는 다양하고 복합적인 기능을 갖는 것이 수없이 존재 한다. 예부터 한의학에서는 이들의 특성을 파악하고 고유한 성질을 활용하여 질병의 치료에 활용하였다. 현대에 이르러서는 기능성이 확보된 천연 원료의 복합적 사용에 따른 최적의 비율 결정을 통해 그 기능을 최적화 하고자 하는 노력을 시도하고 있다.

통상적인 화장품에 사용되는 천연 한방 원료는 우수한 기능을 갖고 있다 하더라도 원료가 가지고 있는 고유의 색상이나 냄새로 인해 효능을 나타내는 높은 농도로 첨가 되었을 시 발생하는 갈변현상으로 인해 적정 용량을 사용하지 못하고 단지 컨셉 원료로만 사용된다.

이에 본 발명은 붉나무가 갖는 약재로서의 가치 향상과 천연 한방 원료와의 상호 및 상승 작용을 가지고 있고, 염증성 피부 개선효과가 우수한 복합 조성물을 제공하고자 한다.

국내 등록특허번호 제10-1617152호에는 붉나무 미숙과 천연물을 용매를 이용하여 추출하고, 농축 및 동결건조하여 제조된 붉나무 미숙과 추출물을 0.001 ~ 1.0중량%를 함유하며 활성산소 소거효과, 피부 주름 개선효과, 피부 탄력 개선효과, 광노화 방지 효과, 미백효과가 우수한 붉나무 미숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-1803757호에는 지실, 식방풍, 치자열매, 우슬, 붉나무 미숙과, 붉나무 성숙과, 찔레나무 미숙과, 찔레나무 성숙과 및 수세미로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재 추출물을 얻는 단계; 상기 추출물에 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 균사체의 전 배양액을 혼합한 본 배양한 후, 본 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거하여 생약재 발효 추출물을 얻는 단계; 상기 수득한 생약재 발효 추출물에 제주 오메기주를 혼합하여 배양한 배양액으로부터 누룩균을 제거하는 단계;로부터 수득된 생약재 복합 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-1471818호에는 피부자극완화 및 피부염증완화용 화장료 조성물은 마가목, 쐐기풀, 오배자 및, 대나무의 추출 혼합물을 유효 성분으로 함유하는 화장료 조성물은 염증 유도 사이토카인의 발현을 효과적으로 억제하여 우수한 피부자극완화 및 피부염증완화 효과를 나타내므로, 피부 트러블 예방 및 개선, 홍조 개선, 피부염 예방 및 개선 등의 용도에 효과적으로 적용할 수 있는 피부자극완화 및 피부염증완화용 화장료 조성물에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-0997641호에는 사이클로덱스트린 유도체에 붉나무 추출 발효물을 분자캡슐화한 복합체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하고 기존의 4-n-부틸레조시놀 함유 화장료조성물에 비하여 미백 및 항산화 효능이 뛰어나며, 안정성이 우수하며 천연물에서 유래된 조성물로 피부자극도 월등히 적어 미백 또는 항산화 기능성 화장품 제조에 효과가 있는 분자캡슐화 된 붉나무 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관하여 개시하고 있다.

본 발명은 문제성 피부의 개선에 도움을 될 수 있는 천연 원료을 개발 하고자 붉나무 소재의 항염에 대한 우수한 효능을 확인하고 더불어 붉나무 천연 소재의 기능을 더욱 활성화 시킬 수 있는 추가적인 소재와 복합물 조성물과 상기 조성물을 포함하는 천연 한방 화장품을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부개선 화장료 복합 조성물은 붉나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다. 붉나무 추출물은 붉나무 잎 추출물, 붉나무 줄기 추출물, 붉나무 목질부 추출물 중 하나 이상 선택되는 추출물 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다. 붉나무 추출물은 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜 또는 이들의 혼합 용매 중에서 선택되는 어느 하나로부터 가용한 추출물인 것일 수 있다. 상기 붉나무 추출물은 조성물 총 중량대비 0.125 중량% 포함되는 것일 수 있다.
또 다른 실시예로 붉나무 줄기를 70% EtOH로 추출한 추출물에 보조 추출물로 산조인을 70% EtOH로 추출한 추출물 또는 녹차와 무화과 나무를 각각 70% EtOH로 추출한 추출물을 혼합하여 이루어지되, 상기 붉나무 줄기 70% EtOH 추출물은 12.5중량%로 포함하고, 보조 추출물인 산조인 70% EtOH 추출물은 5중량%로 포함하며, 녹차와 무화과 나무 각각의 70% EtOH 추출물은 각각 2.5중량%로 포함하여 이루어지는 붉나무 추출물을 포함하는 염증성 피부트러블 완화용 화장품 조성물을 제공한다.

또한, 복합 조성물에는 산조인 추출물, 녹차 추출물, 전호 추출물, 무화과나무 추출물 중 하나 이상의 추출물을 선택하여 이루어지는 보조 추출물이 더 추가되는 것일 수 있다. 상기 보조 추출물은 조성물 총 중량대비 0.05 중량% 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 피부 개선 복합 화장료 조성물의 추출물은 최소의 용량으로도 생리활성이 우수한 성분이 다량 포함되어 있고, 상기 복합 조성물에 포함되는 붉나무 및 천연 한방 소재의 보조 추출물의 최적 배합 비율을 통해 화장품 제조 시 높은 안정성과 효용성이 향상되는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실험예에 따라 준비되는 붉나무 천연 소재를 나타낸다.
도 2는 Heat block을 이용하여 용매 증발시킨 후 무게 측정 결과를 나타낸다.
도 3은 붉나무 부위별 추출 효율 측정 결과를 나타낸다.
도 4는 붉나무 부위별 동결건조를 통한 추출 효율측정 결과를 나타낸다.
도 5는 붉나무 잎 추출물의 세포독성시험 결과를 나타낸다.
도 6은 붉나무 줄기 추출물 세포독성 시험 결과를 나타낸다.
도 7은 붉나무 목질부 추출물 세포독성 시험결과를 나타낸다.
도 8은 붉나무 잎 추출물 Griess Assay결과를 나타낸다.
도 9는 붉나무 줄기 추출물 Griess Assay결과를 나타낸다.
도 10은 붉나무 목질부 추출물 Griess Assay결과를 나타낸다.
도 11은 RAW264.7 세포에 염증 유발원인 LPS(lipopolyscaride) 처리군 (C+LPS)과 LPS을 처리하지 않는 negative control(C) 의 실험결과를 나타낸다.
도 12는 줄기 70% 주정알콜 EtOH 추출물의 세포독성시험 및 Greiss assay결과를 나타낸다.
도 13은 검증곡선 그래프를 나타낸다.
도 14는 붉나무 부위별 및 추출조건별 HPLC에 의한 Gallic acid 함량을 나타낸다.
도 15는 붉나무 부위별 및 추출조건별 HPLC에 의한 Gallic acid 함량을 나타낸다.
도 16은 XTT assay 결과를 나타낸다.
도 17은 혼합 추출물 세포독성 실험결과를 나타낸다.
도 18은 혼합 추출물 세포독성 실험결과를 나타낸다.
도 19는 혼합 추출물 세포독성 실험결과를 나타낸다.
도 20은 M19 혼합물의 항염증 효능 평가(Griess assay) 결과를 나타낸다.
도 21은 M27 혼합물의 항염증 효능 평가(Griess assay) 결과를 나타낸다.
도 22는 혼합 추출물의 DPPH 측정 결과를 나타낸다.
도 23은 혼합 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸다.
도 24는 혼합 추출물의 전기영동 결과를 나타낸다.
도 25는 혼합 추출물의 전기영동 결과를 나타낸다.
도 26는 혼합 추출물의 IL-1b, TNF-a cytokine의 발현률 ELISA assay 전기영동 결과를 나타낸다.
도 27은 본 발명에서 제작된 최종 시제품

본 발명의 피부 개선 복합 화장료 조성물을 포함하는 피부 개선 화장료 조성물과 관련한 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명은 피부 개선 복합 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 복합조성물은 붉나무 추출물 및 보조 추출물이 혼합된 추출물을 포함할 수 있다.

본 발명에서 지칭하는 용어, 붉나무(Rhus javanica L.)는 오배자나무, 염부목, 소금나무 등으로 불리우며, 산지에 자생하는 무독성의 옻나무과낙엽관목을 지칭하는 것으로 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 준비되는 붉나무 추출물의 붉나무 천연 소재 부위로는 잎, 줄기, 목질부를 포함하는 것일 수 있다. 상기 붉나무 추출물은 그 추출방법에 있어 추출이 용이하도록 분쇄하여 추출 용매에 의해 추출하고 이를 여과 및 농축하여 수득할 수 있다.

추출 용매로는 물 또는 에탄올 등이 있고 이들 중 2 이상의 용매를 혼합하여 추출 용매로 사용할 수 도 있고 바람직하게는 30%, 70% 주정알콜(EtOH)일 수 있으며 상기 추출 조건은 추출온도 50 내지 80℃는 바람직하게는 65℃이고 추출시간은 9시간일 수 있다.

본 발명의 붉나무 추출물은 조성물 전체 중량 대비 4 내지 1.25 중량% 포함될 수 있다. 또한, 상기 보조 추출물의 한방 소재로는 산조인, 녹차, 전호, 무화과나무 중 1종 이상 선택하여 포함하는 것일 수 있다. 보조 추출물을 조성물 전체 중량 대비 2 내지 0.5 중량% 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일 등으로 제형화 될 수 있다. 구체적으로 유연화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 유액, 화장연고, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 젤, 메이크업 베이스, 파운데이션, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

<제조예 1> 붉나무 추출물의 제조

본 발명에 따른 제조예 1의 붉나무 추출물의 제조는 붉나무 줄기를 준비하고 추출물을 효율적으로 얻기 위하여 건조시킨 후, 파우더 형태로 분쇄하였다. 붉나무 줄기 분쇄물 200g에 70% 주정알콜(EtOH) 4리터를 가하여 65℃에서 9시간 동안 추출하고 여과지로 여과한 뒤 농축하여 붉나무 추출물을 얻었다.

<실험예 1> 붉나무 추출물 적정 추출부위 및 추출조건 확인

본 발명의 실험예 1에 따라 사용한 붉나무 추출물 제조시에 사용하는 붉나무 천연 소재는 화순 백아산에서 채취하여 사용하였다. 도 1은 본 발명의 실험예에 따라 준비되는 붉나무 천연 소재를 나타낸다.

본 발명의 실험예 1에 따른 붉나무 천연 소재는 붉나무 목질부, 잎, 가지를 3가지 부위를 준비하고 항염증 효능에 우수한 성분이 많이 포함되어 있는 부위를 선별하고자 하였다. 붉나무 잎은 잘 건조된 붉나무의 잎 부위만을 선별 하여 손으로 잘게 부수어 약 3킬로 그램을 준비 하고 잎의 크기가 약 1.0cm가 넘지 않도록 작게 분쇄하였다. 붉나무 줄기는 붉나무 잎을 제거한 줄기 부분을 지칭하는 것으로 정전 가위를 활용하여 크기가 약 1.0 센티미터 이하가 되게 잘게 절단하여 약 200g을 준비하였다.

붉나무 목질부는 건조 정도를 체크하여 재료의 균질성을 유지하였다. 도록 기준을 마련한다. 붉나무 목질부를 준비하고 정량하여 추출하기 좋은 크기인 약 0.1mm이하로 잘게 분쇄한다. 최적의 추출이 가능한 붉나무 천연소재 분쇄크기를 확인하기 위해 상기 준비한 붉나무 목질부 천연소재를 1.0mm, 0.5mm, 0.1mm 크기의 미세분말 형태로 분쇄한 후 각각을 추출하여 추출률에 대한 검증하였다. 추출조건은 용매 30-70% 주정알콜 사용하여 65℃에서 9시간 추출 실시 후 Heat block을 이용하여 건조 중량 확인을 통해 추출 효율 측정하였다.

하기의 표 1은 붉나무 목질부 천연소재 크기에 따른 추출 효율을 비교한 결과를 나타낸다. 그 결과 시료의 크기가 가장 작은 형태의 시료가 가장 높은 추출 효율을 나타내었다. 이에 본 발명에 따른 천연 소재는 미세분말 크기로 분쇄한 후 추출하는 것이 적절한 것으로 사료된다.

시료의 크기에 따른 붉나무 목질부 추출 효율 비교

크기(mm)	1.0	0.5	0.1	미세분말
추출효율	3.9±0.2%	4.7±0.3%	5.1±0.2%	5.4±0.3%

통상적인 천연물에 포함되어 있는 구성물들은 온도에 의하여 분자 구조가 변화 할 수 있기 때문에 통상적인 추출온도는 매우 중요한 추출조건 요인이다. 이에 본 발명에 따른 실험예는 Phenolic acids의 최적 효능물질의 함량을 정성 및 정량하여 유용한 천연 구성물의 기능성을 유지 시킬 수 있는 최적의 추출방법을 확인하였다.

통상적인 polyphenol 계통의 phenolic acids의 경우 약 80℃이상의 온도에서 장시간 추출하게 되는 고유의 Phenolic acids의 항산화 능력이나 구조의 변화를 야기하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명에 따른 온도 범위는 저온추출법으로서 70℃이하로 고정 하여 추출 조건을 확립 하였다. 추출기 시행 온도 범위는 50℃~80℃에서 시행 하고 최적의 추출 온도 조건을 65±5℃로 확정하여 모든 시료를 추출 시행하였다. 추출 시간은 최대한 짧은 시간에 원료로부터 최대 많은 추출물을 얻어야 한다. 추출 시간을 최소화하기 위해서는 원료의 크기가 중요한 요인으로 작용 할 것이다. 원료의 표면적을 최대로 늘려주기 위해 원료를 세절(0.1mm 이하) 하여야 한다.

추출 시간은 3시간 6시간 9시간 12시간, 24시간별로 샘플을 채취하여 추출 농도를 비교 하고 추출된 추출물량을 건조된 추출물을 측량하여 추출 수율을 확인 한 결과, 시간이 길수록 추출 수율이 높아지나 9시간과 12시간 24시간 추출 시간에 증가에 따른 추출량 변화가 크지 않아 유효성분의 안전성을 고려하여 9시간 추출 시간이 가장 효율적인 시간으로 사료된다.

본 발명에 따른 붉나무 추출물을 추출하기 하기 위해서 물과 유기용매를 사용하여 붉나무 소재별 최적의 추출 용매와 추출온도를 확인하였다. 통상적인 천연물 내에는 많은 flavonoid 계열의 물질과 acid, phenol 화합물들이 다량 포함되어 있다. 이러한 물질을 효과적으로 추출하기 위해서는 유기 용매를 적정한 농도(30~70%)로 이용함이 효과적이다.

천연 추출물을 획득하기 위해 일반적으로 사용되는 메탄올(MeOH)의 경우 세포에 대한 독성과 동물에 대한 독성이 있어 특히 화장품 원료 또는 식품의 원료로 사용할 경우에는 사용에 대한 제한이 있어 본 발명은 주정알콜을 이용하였다. 본 발명에 따른 유기용매는 알콜(EtOH)을 30%, 70%로 각각을 제조하고, 제조된 용매를 활용하여 추출을 실시하였다.

물을 사용하여 수용성을 갖는 물질에 대한 생리 활성 검사를 같이 수행 하였다. 수용성 물질의 경우 당단백질 및 유기물등 미생물이 자라기 최적의 조건을 갖고 있어 부패에 대한 신경을 쓰기 위해 추출 과정과 정제 과정이 끝난 시료는 곧 바로 동결 시켜 부패를 최대한 방지 하였다.

추출용매 배수는 실시예 1에 따른 붉나무 천연소재(붉나무 잎, 줄기, 목질부) 200g을 정량하여 준비 하고, 용매 4리터로 침지 시켜서 추출을 실시하였다. 상기 용질 및 용매의 추출비율은 부피비를 기준으로 용질의 20배수의 용매를 투입하여 추출을 실시하였는데 이는 용질 중 하나인 붉나무 잎의 부피가 매우 커서 용질을 모두 침지시키기 위해서는 20배수의 용매가 필요하기 때문에 모든 시료를 같은 추출용매 배수인 용매를 20배수로 통일하여 추출을 시행 하였다.

EP 튜브의 각각의 무게를 개별적으로 측정하고 각 튜브에 1ml의 시료를 마이크로 파이펫을 활용하여 적정하고 분주하여 heat block을 80℃의 온도로 셋팅하여 약 5시간 동안 건조 시켜 용매가 모두 증발 할 수 있는 조건으로 만들고 완전 건조 된 시료는 다시 저울로 정밀 측량하여 순수한 추출된 시료의 무게를 측정 하여 추출 효율을 산정 하였다. 상기 건조는 Evaporator을 활용한 농축과 동결 건조를 통한 추출 수율 검증하였다.

도 2는 Heat block을 이용하여 용매 증발시킨 후 무게 측정 결과를 나타내고, 도 3은 붉나무 부위별 추출 효율 측정 결과를 나타낸다. 하기의 표 2는 붉나무 부위별 추출 효율 검증 결과를 나타낸다.

붉나무 부위별 추출 효율 검증 결과

붉나무		tube 무게	Total 무게	추출량	mg 단위 환산	원액100ml당	원액1ml당	효율
줄기	70	12.961	13.101	0.14	140 mg	686 mg	6.9 mg	13.72%
	30	13.031	13.129	0.098	98 mg	823 mg	8.2 mg	16.46%
	w	12.927	12.974	0.047	47 mg	470 mg	4.7 mg	9.40%
목질부	70	12.922	12.975	0.053	53 mg	276 mg	2.8 mg	5.51%
	30	12.955	12.98	0.025	25 mg	213 mg	2.1 mg	4.25%
	w	12.984	13.009	0.025	25 mg	250 mg	2.5 mg	5.00%
잎	70	12.966	13.192	0.226	226 mg	1130 mg	11.3 mg	22.60%
	30	12.978	13.106	0.128	128 mg	1139 mg	11.4 mg	22.78%
	w	12.971	13.058	0.087	87 mg	870 mg	8.7 mg	17.40%

상기 결과, 줄기는 10%이상이고, 붉나무잎은 70% 주정알콜 용매 추출 시에 22.5%의 수율을 나타내고, 30% 주정알콜 용매로 추출하는 경우 19.8%의 수율을 나타내었으며, 물 용매는 14.5%을 나타내나, 목질부의 경우에는 4.2%, 3.7%, 5.8%의 추출수율을 나타내었다.

에탄올 함량에 따는 붉나무 줄기와 잎, 목질부 부위별 추출물 추출 효율을 확인 하였을 때 일반적으로 주정알콜의 함량이 높아질수록 추출물의 추출량이 증가 하는 것으로 나타났다. 단 목질부의 경우 주정 알콜을 용매로 사용한 추출 보다 순수한 물을 용매로 사용 했을 때 더욱 추출 효율이 높음을 확인 할 수 있었다.

도 4는 붉나무 부위별 동결건조를 통한 추출 효율측정 결과를 나타낸다. 동결건조를 위한 evaporator을 활용하여 추출물 시료를 농축 실시하였을 때 주정알콜 함량이 높아질수록 농축 효율이 증가함 붉나무 줄기와 잎을 이용한 추출물에서 확인 할 수 있었으나 목질부 추출에 있어서는 순수한 물을 용매로 사용 하였을 때 가장 높은 추출 효율을 나타내는 것으로 사료된다.

<실험예 2> 붉나무 추출물의 세포독성 및 염증반응

동물세포 배양 조건은 액체 질소에 보관되어 있는 RAW264.7 mouse 대식세포(macrophage)를 미리 37℃로 셋팅한 water bath에서 세포를 신속히 해동 한여 100파이 culture dish에 배양하였다.

배양배지는 DMEM high glucose 배지에 Fetal bovine serum 10%, Pen/Str 1%되게 제조하여 complete media 제조 하여 사용하였다. RPMI1640 배지와 FBS(Fetal Bovine Serum) 10%와 anti-biotics(pen-strep)를 포함하는 배지에서 5% Co²와 37℃의 Co² incubator에서 배양한다. 대식세포는 culture plate에서 세포 confluence 가 80%가 넘지 않도록 유지하며 배양한다.

본 발명의 실험예 2에 따른 RAW264.7 세포는 passage number가 5번으로 매우 어린 세포로서 대식세포의 특성이 우수한 세포주를 실험에 사용하였다.

붉나무 소재의 부위별 항염증 활성 효능 확인하기 위하여 XTT assay 세포 독성 확인을 실시하였다. Raw264.7 세포를 96well plate에 5X104 cells로 계수하여 분주 한다. 세포가 안정화 될 수 있도록 약 24시간 동안 Co2 incubator에서 정치하여 둔다. 실시예 2에 따른 추출물(줄기, 잎, 목질부)을 20mg/ml의 농도로 제조하여 세포에 처리할 샘플로 준비하였다. 상기 시료의 농도는 400, 200, 100, 50, 25, 12.5ug/ml 처리하여 24시간 후 EZ-Cytox 시약을 100ul/5ul씩 처리하여 ELISA leader기에서 450nm의 파장으로 세포 생존률을 확인하였다.

가) 붉나무 잎 추출물의 세포독성시험 결과

붉나무 잎으로부터 추출시 용매로 EtOH(70%,30%)와 증류수 100%을 이용하여 추출 하였으며 각 추출물에 대한 마우스 대식세포에 대한 세포 독성 확인 실험을 수행 하였다.

도 5은 붉나무 잎 추출물의 세포독성시험 결과를 나타낸다. 붉나무 잎 70% EtOH 추출물은 세포 독성이 높게 나타나는 경향을 나타내고 있다 100ug/ml 농도에서 67.92%의 세포생존률이 확인 되었고 30% EtOH 추출물에서는 400ug/ml의 농도에서 67.03%의 세포 생존률이 나타나고 있어 EtOH 농도가 높아 질수록 세포 독성이 강하게 나타 나고 있음을 확인 할 수 있었고, 물 추출물의 경우 400ug/ml의 농도에서도 세포 생존률이 86.62%로 세포 독성이 나타나지 않음을 확인 하였다.

붉나무 줄기를 EtOH(70%,30%)와 증류수 100%을 이용하여 추출 하였으며 각 추출물에 대한 마우스 대식세포에 대한 세포 독성 확인 실험을 수행 하였다.

도 6은 붉나무 줄기 추출물 세포독성 시험 결과를 나타낸다. 붉나무 줄기 70% EtOH 추출물은 세포 독성이 높게 나타나는 경향을 보여주었고, 100ug/ml 농도에서 92.87%의 세포생존률이 확인 되었고 30% EtOH 추출물에서는 200ug/ml의 농도에서 73.92%의 세포 생존률이 나타나고 있어 EtOH 농도가 높아 질수록 세포 독성이 강하게 나타나고 있음을 확인 할 수 있었고, 물 추출물의 경우 400ug/ml의 농도에서도 세포 생존률이 99.41%로 세포 독성이 나타나지 않음을 확인 하였다.

붉나무 목질부를 EtOH(70%,30%)와 증류수 100%을 이용하여 추출 하였으며 각 추출물에 대한 마우스 대식세포에 대한 세포 독성 확인 실험을 수행 하였다.

도 7은 붉나무 목질부 추출물 세포독성 시험결과를 나타낸다. 붉나무 목질부 70% EtOH 추출물은 세포 독성이 높게 나타나는 경향을 보여주었고, 100ug/ml 농도에서 74.74%의 세포생존률이 확인 되었고 30% EtOH 추출물에서는 200ug/ml의 농도에서 85.48%의 세포 생존률이 나타나고 있어 EtOH 농도가 높아 질수록 세포 독성이 강하게 나타나고 있음을 확인 할 수 있었고, 물 추출물의 경우 400ug/ml의 농도에서도 세포 생존률이 73.86%로 붉나무 잎이나 줄기의 물 추출물에 비해 상대적으로 세포독성이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

나) 붉나무 잎 추출물 Griess Assay결과

mouse의 대식세포인 RAW264.7에 천연 추출물(붉나무, 잎, 줄기, 목질부등)의 농도별 시간별로 처리하고 inflammatory factor인 LPS(Lipopolysaccaride)을 처리하여 NO(Nitro -oxide)을 측정함으로서 염증 방호 효능에 대한 기초 자료를 확보 한다.

RAW264.7 대식세포를 96 well culture plate에 각 Well 당 5 X 10⁴개 세포씩 배양 하고 24시간 동안 안정화 시킨 후 NO가 분비 되는 조건을 주기 위하여 염증 유발 물질인 LPS를 처리하고 여기에 시료농도 별로 각각 같이 처리하여 24시간 동안 노출 후 배양된 배지를 수집하여 배양배지와 Griess reagent를 섞어준 후 상온에서 15분간 반응 후 TECAN Elisa leader 장비를 이용하여 흡광도 540nm에서 측정하여 그 값을 확인 하였다.

붉나무 잎 추출시 용매로 EtOH(70%,30%)와 증류수 100%을 이용하여 추출 하였으며 각 추출물에 대한 마우스 대식세포에 대한 항염증 효능 효과에 대한 Nitro-oxide(NO)발생 억제에 관한 실험을 실시하였다.

도 8은 붉나무 잎 추출물 Griess Assay결과를 나타낸다. 붉나무 잎 70% EtOH 추출물은 세포 독성이 높게 나타나는 경향을 보였고 100ug/ml 농도에서 67.92%의 세포생존률이 확인된 농도에서 41.49%의 NO 농도가 측정 되었으며 이것은 negative control(42.9%)보다 높은 항염증 효능 효과의 결과가 관측 되었다.

30% EtOH 추출물에서는 400ug/ml의 농도에서 67.03%의 세포 생존률이 나타내었고, NO 측정 값은 42.13%로 negative control 값보다 낮은 값을 나타내고 있었다. EtOH 농도가 높은 추출물이 낮은(30%) 추출물 보다 높은 세포 독성을 나타 내지만 또한 높은 항염증 효능 효과가 있음을 확인 할 수 있었다. 물 추출물의 경우 400ug/ml의 농도에서도 세포 생존률이 86.62%로 세포 독성이 나타나지 않았으나 NO 억제 효과 또한 67.37%로 항염 효과가 매우 낮음이 확인 되었다.

붉나무 줄기를 EtOH(70%,30%)와 증류수 100%을 이용하여 추출 하였으며 각 추출물에 대한 마우스 대식세포에서 항염증 효능 효과에 대한 실험을 수행하였다.

도 9는 붉나무 줄기 추출물 Griess Assay결과를 나타낸다. 붉나무 줄기 70% EtOH 추출물의 높은 농도에서 세포 독성이 높게 나타나는 경향을 보여주었고, 100ug/ml 농도에서 92.87%의 세포생존률이 확인 되어 이를 기준으로 항염증 실험을 진행 한 결과 상기 농도에서 51.38%(negative control 42.99%)로 높은 항염 효능을 나타내었다.

30% EtOH 추출물에서는 200ug/ml의 농도에서 73.92%의 세포 생존률이 나타나고 있어 실험의 기준으로 삼았으며 이때 Griess assay 결과 49.24%로 항염 효능이 우수하였으나 70% EtOH 추출물 보다는 낮은 결과였다. 물 추출물의 경우 400ug/ml의 농도에서도 세포 생존률이 99.41%로 세포 독성이 나타나지 않았으나 또한 항염증 효능에 있어서도 72.33%로 낮은 항염 효과를 나타내어 붉나무 줄기 추출물의 주요한 항염증 효능을 나타내는 성분이 수용성이 아것으로 판단 되었다.

붉나무 목질부를 EtOH(70%,30%)와 증류수 100%을 이용하여 추출 하였으며 각 추출물에 대한 마우스 대식세포에 대한 항염증 확인 실험을 수행 하였다.

도 10은 붉나무 목질부 추출물 Griess Assay결과를 나타낸다. 붉나무 목질부 70% EtOH 추출물은 줄기나 잎 추출물에 비해 세포 독성이 높게 나타나는 경향을 보여주었고, 100ug/ml 농도에서 74.74%의 세포생존률이 확인되었으며 이때 항염 효과는 40.93%(negative control 42.99%)로 매우 우수한 항염 효능을 보여 주었다.

30% EtOH 추출물에서는 200ug/ml의 농도에서 85.48%의 세포 생존률에서 항염 효과 44.08%를 나타 내었다.EtOH 농도가 높아 질수록 세포 독성이 강하게 나타나고 있음을 확인 할 수 있었고 또한 높은 농도에서 강력항 항염 효능을 나타냄을 보여 주고 있어 항염증 효능 성분이 수용성이 아닌 비수용성 성분이 주요한 항염 성분임을 보여주고 있다. 물 추출물의 경우 400ug/ml의 농도에서도 세포 생존률이 73.86%로 붉나무 잎이나 줄기의 물 추출물에 비해 상대적으로 세포독성이 높게 나타났고 또한 높은 항염 효과(33.85%)을 확인할 수 있었다.

RAW264.7 세포에 염증 유발원인 LPS(lipopolyscaride) 처리군 (C+LPS)을 positive control로 사용하고 이를 NO(nitrooxide) 생성을 100%으로 환산하였고, negative control(C)는 LPS을 처리하지 않는 음성군으로 42.99%로 나타났다.(도 11).

상기 실험예 1 및 2에 따른 붉나무 부위별 세포 독성 시험 결과와 Griess assay 결과, 부위별 추출 효율 등을 고려하여 최적의 붉나무 부위를 설정하였다. 붉나무 추출 효율 및 항염 효과가 우수한 용매 농도로 70% 주정알콜 용매가 가장 높은 항염 효과를 나타내어 70% 주정알콜 용매가 적절한 것으로 사료된다.

또한, 붉나무의 잎, 줄기, 목질부 중에서 적은 용량에도 높은 항염 효능을 나타내는 소재로 붉나무 목질부였으나 추출 효율이 8.0% 이하로 생산량이 높지 않아 선정에서 제외 되었고, 상대적으로 목질부 줄기 부분은 추출 효율과 높은 항염 효과를 충족시킬 수 있는 부위로 판단되어 최종 붉나무의 목질부(70% EtOH)가 적절한 부위로 결정되었다.

도 12는 줄기 70% 주정알콜 EtOH 추출물의 세포독성시험 및 Greiss assay결과를 나타낸다. 줄기 70% EtOH 추출물의 경우 100ug/ml의 농도에서 RAW264.7 세포의 생존률이 약 92.87% Greiss assay 결과는 positive control 대비 약 51.38%로 거의 음성대조군에 가까울 정도로 높은 항염 효능 효과를 나타남을 결과로 확인 되었다 그럼으로 붉나무 소재 부위별 여러 요인들을 고려하였을 때 붉나무 줄기부위 70%EtOH 추출물이 적절한 것으로 사료된다.

<실험예 3> 붉나무(잎, 줄기, 목질부) 추출물의 지표물질 함량 측정

본 발명의 붉나무 추출물에 의한 지표물질 함량 측정을 위한 실험예에 따른 붉나무 추출물은 주정알콜(EtOH)을 사용하였으며 유기 용매는 30% 70%로 각각을 제조하여 추출하였다. 추출 시간은 9시간, 24시간 별로 샘플을 채취하였으며 시료 내 지표물질 분석을 위해 건조 시료를 일정량 취하여 메탄올로 충분히 녹인 후 원침 시키고 상층을 50% Methanol로 일정 희석한 후 5-10 ul을 주입하여 분석하였다.

하기의 표 3은 붉나무 지표물질을 나타낸다. 본 발명의 실험예에 따른 붉나무의 지표 물질 Gallic acid은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며 추출과 분석에 사용되는 actonitrile, methanol은 HPLC용 (Fisher science)을 사용하였다. Formic acid(98%, Kanto chemical), acetone (Sigma) 등 실험에 사용된 모든 시약은 특급 및 그 이상의 수준을 사용하였다.

붉나무의 지표 물질 Gallic acid

Plant	Marker Compound	constitutional formula	CAS Number
붉나무 Gallic acid	Gallic acid (HO) 3 C 6 H 2 CO 2 H=170.12		149-91-7

하기의 표 4는 지표물질을 정략분석하기 위해 사용된 용매 및 기기조건을 나타낸다.각각의 지표 물질을 정량분석하기 위해 LC/MS/MS(AB SCIEX 4000 Q-Trap 질량분석기, Shimadzu LC 20A System)를 이용하여 분석하였다.

추출시료 내 gallic acid의 농도 분석을 위해 50% 메탄올로 희선하여 준비한 검량표준시료(5,20,50,200 ng/ml) 5ul를 주입하여 분석을 실시하였고, 표준검량시료를 분석하여 얻는 gallic acid의 피크 면적값을 가지고 약물농도 역시 (1/X2)로 weight를 주어 검량선을 작성하였다.

용매 및 기기조건

Instrument	Parameter	Conditions
LC parameter	Column	Acclaim TM PolarAvantage Ⅱ C18(PA2)3㎛, 120A x 100mm (Dionex Bonded Silica products)
		Gemini C18 4.0mm x 2.0mm Guard cartridge
	Mobile phase	0.1% formic acid with deionized water (A)
		0.1% formic acid with Acetonitrile (B)
		(A : B = 80 : 20 (V/V))
	Flow rate	0.3 ml/min
	Injection volumn	5ul
MS parameter	mode	Ionization mode
	Spray voltage	-4500V
	Desolvation Temp.	500 ℃
	Polarity	Negative
	Temperature	500℃
	Scan Mode	Multiple reaction monitoring(MRM) m/z
MRM (Multiple Reaction Monitoring)	Gallic acid	168.98>124.8

추출시료 내 gallic acid의 농도 분석을 위해 50% 메탄올로 희선하여 준비한 검량표준시료(5,20,50,200 ng/ml) 5ul를 주입하여 분석을 실시하였고, 표준검량시료를 분석하여 얻는 gallic acid의 피크 면적값을 가지고 약물농도 역시 (1/X2)로 weight를 주어 검량선을 작성하였다.

붉나무 추출물의 Gallic acid 분석을 위한 본 발명의 실험예에 따른 조건으로 붉나무 부위별 30%와 70% 주정알콜(EtOH)를 추출용매로 사용하여 9시간동안 추출한 샘플 총 9샘플을 대상으로 Gallic acid의 함량을 측정하였다.

붉나무 부위별 30%와 70% 주정알콜(에탄올(EtOH))를 추출용매로 사용하여 9시간동안 추출한 샘플 총 9샘플을 대상으로 Gallic acid의 함량을 측정하였다. 붉나무의 부위별 용매 함량별에 따른 Gallic acid의 함량의 상관 관계를 측정 함으로써 지표 물질로서의 사용 가치를 평가 하고자 한 결과, 본 과제에서 중점적으로 사용할 붉나무 줄기 70% EtOH 추출물의 경우 농축에 따른 Gallic acid의 함량 분석을 통해 원료의 표준화를 이루기 위한 자료를 확보 하고자 하였다.

하기의 표 5는 gallic acid의 검증곡선변수(Calibration curve parameter)를 나타내고 표 6은 붉나무 추출물의 Gallic acid 농도를 나타낸다. 도 13은 표 5에 따라 작성한 검증곡선 그래프를 나타내고, 도 14 내지 도 15는 붉나무 부위별 및 추출조건별 HPLC에 의한 Gallic acid 함량을 나타낸다.

gallic acid의 검증곡선변수

Date	Calibration curve equation	r(Correlation coefficient)
2019. 07. 29	y =4650x - 2310	0.9993

도 14 내지 15의 a는 줄기 70% EtOH/9hr, b는 줄기 70% EtOH/9hr를 나타내고 c는 줄기 70% EtOH/9hr를 나타내고, d는 줄기 농축(30%) 70% EtOH/9hr를 나타내고, e는 줄기 농축(50%) 70% EtOH/9hr를 나타내고, f는 줄기 30% EtOH/9hr를 나타내고 g는 잎 70% EtOH/9hr를 나타내고, h는 목질부 70% EtOH/9hr를 나타낸다.

붉나무 줄기 70%EtOH 추출물은 6.9mg/ml 추출물이 갖고 있는 gallic acid의 함량이 평균 약 84.23ug/ml 갖고 있었고, 이를 50% 농축(e) 하였들 때 gallic acid의 함량이 168ug/ml로서 2배수의 함량을 나타내는 것이 확인되어 gallic acid가 붉나무 추출물의 지표 물질로서 적합 하다는 것을 증명 하였다. 붉나무 부위별로 gallic acid의 함량이 각각 다르게 나타났다. 이에 붉나무의 항염증의 효과는 붉나무의 gallica acid가 아닌 다른 성분인 것으로 사료된다.

붉나무 추출물의 Gallic acid 농도

Sample No.	Sample name			농도(ug/ml)
	추출 부위	추출 용매	농축
a	붉나무 줄기	70% Ethanol	6.9mg/ml	85.7
b				87.7
c				79.3
d			1ml→700ul	114
e			1ml→500ul	168
f		30% Ethanol		113
g	붉나무 잎	70% Ethanol		130
h	붉나무 목질부	70% Ethanol		110

붉나무 줄기 70%EtOH 추출물은 6.9mg/ml 추출물이 갖고 있는 gallic acid의 함량이 평균 약 84.23ug/ml 갖고 있었고, 이를 50% 농축(e) 하였들 때 gallic acid의 함량이 168ug/ml로서 2배수의 함량을 나타내는 것을 확인 되어 gallic acid가 붉나무 추출물의 지표 물질로서 적합 하다는 것을 증명 하였다. 붉나무 부위별로 gallic acid의 함량이 각각 다르게 나타났다. 이에 붉나무의 항염증의 효과는 붉나무의 gallica acid가 아닌 다른 성분인 것으로 사료된다.

<실험예 4> 보조 추출물의 독성실험 및 항염증반응 확인

상기 보조 추출물의 제조는 실험예 1에 따라 제조되었고 제조된 붉나무 추출물과 혼합하여 붉나무의 항염증성 효능 효과 및 항산화 효과를 상승 작용시키고 피부에 적합한 보조 추출물을 실험예를 통해 확인하였다. 본 발명의 실험예에 따른 보조 추출물의 천연한방 소재로서 산조인, 녹차, 전호, 무화과나무 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 실험예 3에 따른 세포배양은 RAW264.7 mouse의 대식세포(macrophage)를 RPMI1640 배지와 FBS(Fetal Bovine Serum) 10%와 anti-biotics(pen-strep)를 포함하는 배지에서 5% Co²와 37℃의 Co² incubator에서 배양한다. 대식세포는 culture plate에서 세포 confluence 가 80%가 넘지 않도록 유지 하며 키운다.

RAW264.7 세포에 대한 세포 독성 및 세포성장률 측정하기 위하여 96well plate에 RAW264.7 세포를 5 X 10³개 세포 수로 각 well에 분주한 후 24시간 동안 배양하고 시료를 농도별로(10㎍/mL~300㎍/mL) 세분화 하여 저 농도부터 고농도 까지 처리하고 다시 48시간 동안 노출 시켰다. Tetrazolium salt를 이용한 dehydrogeanse assay (XTT assay) 방법을 이용하여 세포 독성 및 성장률을 측정 하였다.

Griess assay분석은 mouse의 대식세포인 RAW264.7에 천연 추출물(목향)의 농도별 시간별로 처리하고 inflammatory factor인 LPS(Lipopolysaccaride)을 처리하여 NO(Nitro -oxide)을 측정함으로서 염증 방호 효능에 대한 기초 자료를 확보하였다.

RAW264.7 대식세포를 96 well culture plate에 각 Well 당 5 X 10⁴개 세포씩 배양 하고 24시간 동안 안정화 시킨 후 NO가 분비 되는 조건을 주기 위하여 염증 유발 물질인 LPS를 처리하고 여기에 시료농도 별로 각각 같이 처리하여24시간 동안 노출 후 배양된 배지를 수집하여 배양배지와 Griess reagent를 섞어준 후 상온에서 15분간 반응 후 Elisa leader 장비를 이용하여 흡광도 540nm에서 측정하여 그 값을 확인 하였다. 도 16은 XTT assay 결과를 나타낸다.

산조인 추출물은 세포에 대한 독성이 매우 낮은 소재로서 200ug/ml의 농도에도 86.92%의 세포 생존률을 보여 주고 있고 또한 Greiss assay를 통한 NO 생성 억제 효과에 있어서도 대조군 대비 53.87%(NC 40.82%)를 나타내어 안전성과 항염 효과에서 매우 우수한 소재임을 입증 되었다.

녹차 추출물은 녹차잎에서 추출한 것으로서 대표적인 항산화 물질이고 다양한 항염 효능 물질과 항산화 물질이 많이 포함되어져 있다. 통상적인 녹차는 Epigallocatechin이 다량 함유되어져 있다. 본 발명의 실험예에 따라 추출한 녹차잎 추출물은 200ug/ml의 농도(126.3%)에서도 세포 독성이 나타나지 않고 오히려 세포 생장 또는 세포 호흡을 증가 시키는 효능이 있는 것으로 나타났다. 또한 NO 측정에서도 40.77%로 나타나 항염 효능이 아주 우수 한 것으로 사료된다.

전호 추출물은 다른 추출물과 같인 200ug/ml에서도 세포 독성 보다도 세포 활성화 시키는 효과가 나타나는 것처럼 상기 농도에서 179.7%의 세포 생존률을 보여주고 있고 NO 측정에서는 26.73%(NC 40.82%)으로 음성 대조군의 NO 생성률 보다 낮은 수치를 기록 하고 있어 아주 강력한 항염 소재로 사료된다.

무화과나무 추출물은 200ug/ml의 농도에서 세포 생존률이 226.8%로 상기 다른 후보 추출물 보다 높은 세포 생존율를 기록 했고 NO 생성률에서도 42.06%로 강력한 항염 효과를 나타내었다.

상기 결과로 4가지 항염 효능이 우수한 천연 소재중 산조인 추출물이 가장 세포 독성이 낮게 나타났고, 전호, 무화과, 녹차 추출물 또한 우수한 항염 효능 효과가 나타나는 것으로 판명 되었다.

<실험예 5> 혼합 추출물의 세포 독성실험

상기 제조예 1에 따라 제조한 붉나무 추출물에 상기 실험예 4에 따라 제조한 보조 추출물을 혼합하여 혼합 추출물을 제조하였다. 보조 추출물의 농도는 20mg/ml의 농도를 갖고 있는 것을 사용하여 하기 표 7의 volume(ul)으로 혼합 하여 M1~M28로 붉나무 추출물 및 보조 추출물 혼합물을 제조하였다.

도 17 내지 도 19는 혼합 추출물 세포독성 실험결과를 나타낸다. 세포 독성은 각 소재별로 실험한 결과 높은 농도(100ug/ml)에서도 모든 천연 소재에 있어 독성이 나타나지 않았으나 여러 천연 소재 각각을 일정한 비율로 혼합물로 사용함으로써 소재의 특성의 변화가 발생하여 낮은 농도에서도 높은 세포 독성이 나타남이 확인되었다.

M1 ~18번까지 세포 독성을 확인한 결과 모든 혼합물에서 높은 독성이 나타났다. 최고 농도를 15% ~ 0.625%까지 처리 했을 때 강한 세포 독성이 나타나지 않는 농도는 약 1.25% 이하의 농도부터 세포 독성이 나타나지 않는 것으로 나타났다. 상기 결과를 바탕으로 세포 독성 확인하기 위한 처리 농도 설정을 2~0.0078%까지의 농도로 처리하여 최적의 처리 농도를 확인하였다.

여러 천연 소재 혼합물중에서 세포 독성이 낮게 나타나는 혼합물을 1차적으로 선별하고 독성이 낮고 높은 항염증 효능이 있는 혼합물을 선별 하고자하였다.

붉나무 추출물 및 보조 추출물 혼합물

number	붉나무줄기	산조인	녹차	Media	total
M1	50	50	50	50	200
M2	40	40	70	50	200
M3	40	70	40	50	200
	붉	산조인	무화과
M4	50	50	50	50	200
M5	40	40	70	50	200
M6	40	70	40	50	200
	붉	산	전호
M7	50	50	50	50	200
M8	40	40	70	50	200
M9	40	70	40	50	200
	붉	녹	무화과
M10	50	50	50	50	200
M11	40	40	70	50	200
M12	40	70	40	50	200
	붉	녹	전호
M13	50	50	50	50	200
M14	40	40	70	50	200
M15	40	70	40	50	200
	붉	무	전호
M16	50	50	50	50	200
M17	40	40	70	50	200
M18	40	70	40	50	200
number	붉나무줄기	산조인	녹차	Media	total
M19	25	10	0	165	200
M20	25	0	10	165	200
M21	25	5	5	165	200
	붉	산	무
M22	25	0	10	165	200
M23	25	5	5	165	200
	붉	산	전
M24	25	0	10	165	200
M25	25	5	5	165	200
	붉	녹	전
M26	25	5	5	165	200
	붉	녹	무
M27	25	5	5	165	200
	붉	-	-
M28	50	-	-	150	200

세포 독성 연구에서는 M19, M20, M21, M22, M23, M27, M28등 천연 소재 혼합율을 최소화 하고 2가지 혼합물로 이루어진 물질이 낮은 세포 독성이 나타남을 확인 하였다.

M19의 경우 최고 처리 농도인 4% 처리군에서 세포 생존률이 대조군 대비 91.438%로 높은 농도에서도 세포독성이 나타나지 않음을 확인 하였다. 이결과는 붉나무를 단독으로 사용하는 것보다 산조인을 일정량 혼합하는 경우가 세포독성이 감소되는 것으로 확인되었다.

M27의 경우 4%의 처리농도에서는 40.18%, 2% 농도에서 46.01%의 세포 독성이 나타나 높은 농도에서는 세포에 대한 독성이 확인 되었으나 1% 처리농도에서는 대조군 대비 99.67%로 나타나 세포 독성이 전혀 없음이 확인 되어 실험에 사용한 최적의 농도를 1.2%이하의 농도가 적정한 것으로 사료된다.

<실험예 6> 혼합 추출물 항염증 효능 평가 실험

상기 실험예 5에 따라 세포 독성이 낮게 나타난 혼합 추출물 M19와 M27 을 중심으로 본 발명의 실험예 5에서는 상기 추출 혼합물의 항염증 효과와 항산화 효과들에 대한 집중적인 조사를 통해 염증성 피부트러블 완화용 화장품 조성물로 제공하고자 한다.

도 20은 M19 혼합물의 항염증 효능 평가(Griess assay) 결과를 나타낸다. 최종 천연소재 혼합 후보군인 M19는 붉나무줄기 추출물과 산조인 추출물 2가지로 이루어진 천연 추출물 혼합 조성으로서 세포에 미치는 독성 효과가 매우 낮고 4% 농도에서 강력한 항염 효능(NO 생성 억제)을 나타내고 있음이 확인(61.02%) 되었다(음성대조군 65.69%).

도 21은 M27 혼합물의 항염증 효능 평가(Griess assay) 결과를 나타낸다. 최종 천연소재 혼합 후보군중 하나인 M27 혼합물은 붉나무줄기 추출물과 산조인, 무화과 나무 추출물을 포함하고 있고 약간의 독성이 나타나고 있으나 항염 효능이 우수한 것으로 사료된다.

<실험예 7> 혼합 추출물 항산화 효과 및 항염증 유전자 발현 확인

상기 실험예 6에 따라 항염 효능이 우수한 것으로 사료되는 M19 혼합 추출물의 항산화 효과 및 항염증 유전자 발현을 확인하고자 하였다.

가) DPPH radical scavensing activity

혼합 추출물 시료(M19)의 DPPH(2,2-diphenyl-a-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능은 Chungemd(2005)의 방법을 변형하여 측정 하였다. 시료 추출물 100㎕에 메탄올에 녹인 DPPH 시약(200μM)을 900㎕를 가하고 votexing 하였다.

M19추출물과 DPPH의 혼합물을 빛이 차단된 상온에서 30분간 방응 시킨 후 96well plate에 control(샘플을 포함하지 않는 기준 시약)을 포함하여 100㎕씩 분주하여 ELISA leader기를 통해 517nm의 흡광도에서 측정 하였다. DPPH 라디칼 소거능은 다음 식에 따라 계산되었다.

DPPH 소거능(%)=(1-(A-C)/B) x 100 (A: 시료 + DPPH 흡광도; C: 시료 + 메탄올 흡광도 B: 30, 50, 70 %에탄올(각각) + DPPH 흡광도) 표준시약으로 BHA(Butylated hydroxyanisole)(0.1, 0.5, 1.0, 2.0 ㎍/ml)를 사용하였다. DPPH 라디칼 소거능 측정법은 DPPH 라디칼에 대한 환원력(활성산소 저해율(%))을 기준으로 M19 혼합추출물의 항산화력을 측정할 수 있는 방법이다.

상기 혼합 추출물 시료의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 도 22에 나타내었다. DPPH의 표준시약으로 BHA(vitamin C)의 경우 1.0㎍/mL의 처리한 경우를 100%의 radical scavenging activity로 설정하고 실험군을 비교 분석한 결과 M19 추출물 2.5% 처리한 조건의 DPPH radical scavenging activity의 값이 가장 높은 91% 의 활성 효과를 보여 주고 있고 처리 양이 적어질수록 DPPH radical scavenging activity의 값이 점차 줄어드는 경향을 나타내는 것으로 보아 Dose dependant manner한 경향을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.

나) 천연 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS 라디칼 소거능을 측정하기 위해 ABTS (2,2-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt) 양이온의 생성 및 안정화를 위해 7mM ABTS 및 245 mM 페록소이황산칼륨(K₂S₂O₂)의 혼합물을 빛을 차단한 상온에서 16시간 동안 방치 한다. 메탄올로 이 용액의 흡광도가 1.0 ± 0.05 되게 희석한 후 실험에 사용하였다. 시료 20㎕에 ABTS 시약 1.48 mL를 혼합하여 30℃에서 6분 동안 반응시키고 734nm에서 흡광도를 측정하였다.

Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2- carboxylic acid)로 표준검량곡선 (0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mM)을 작성한 후 시료의 ABTS 라디칼 소거능은 μmol trolox/g dry weight으로 나타내었고, 양성 대조군으로 BHA (Butylated hydroxyanisole) (2, 4, 6, 8, 10 ㎍/mL)으로 설정하여 측정값에 활성도를 %로 환산 하여 비교하였다.

도 23은 혼합 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸다. M19 조성물에 대한 free radical 제거 활성 능력을 확인하기 위해 ABTS test를 시행 하였다. M19 조성물1%, 1.5%, 2%, 2.5% 조성물의 함량이 증가 할수록 항산화 효과가 높아지는 경향을 보여 주고 있어 본 물질은 항산화 활성이 우수함을 확인 되었다.

다) 천연 혼합물 M19에 대한 항염증 효능

RAW264.7 대식세포를 6well plate에 배양하고 시료를 LPS 처리 1시간 전에 먼저 처리하고, LPS를 처리하여 6시간 동안 배양하여 Trizol(QIAGEN)시약을 이용하여 세포의 totla RNA를 추출한다. 추출된 total RNA를 reverse transcriptase와 oligo dT를 이용하여 cDNA를 합성한다.

cDNA는 특정유자자의 primer (actin, IL-1β, Cox-2, IL-10, TNF-α iNOS, HO-1)를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)를 시행하고 1.5% agarose gel에 전기영동을 실시하여 특정 유전자의 발현 수준을 확인하였다.

도 24는 혼합 추출물의 전기영동 결과를 나타낸다. 염증 관련한 대표적인 지표 유전자(IL-1b, Cox-2)의 발현 양상을 확인 하였을 때 M19 조성물은 강력한 항염증 기작을 갖고 있는 유효성분이 포함되어 있는 것으로 판단된다. 조성물의 처리한 농도가 높아 질수록 항염증 지표의 수준을 효과적으로 방어 하는 것으로 보여 준다. 조성물 처리 농도 1.5%이상이 되었을 때는 염증성 cytokine인 IL-1b, 와 Cox-2 발현 양상이 음성 대조군에 견줄 정도로 낮은 발현 양상을 확인 되어 M19 조성물이 강력한 항염증 효력이 있음이 증명 되었다. (도 24 상)

염증 관련한 다른 유전자(TNF??a, IL-6) 의 발현 양상을 확인 하였을 때 M19 조성물은 강력한 항염증 기작을 갖고 있는 유효성분이 포함되어 있는 것으로 판단된다. 조성물의 처리한 농도가 높아 질수록 항염증 지표의 수준을 효과적으로 방어 하는 것으로 보여 준다. 조성물 처리 농도 1.5%이상이 되었을 때는 염증성 cytokine인 TNF-a, 와 IL-6 발현 양상이 양성대조군 대비 현격한 감소 양상을 보여 주고 있어 강력한 항염증 작용이 있음이 증명 되었다. (도 24 하)

도 25는 혼합 추출물의 전기영동 결과를 나타낸다. 60 mm culture dish에 RAW 264.7 세포를 배양하여 M19 조성물을 1.0, 1.5, 2.0, 2.5%의 농도로 24시간 처리한 후에 3 mL cold PBS로 washing한 후, RIPA buffer (pH 7.4 50 mM Tris-Hcl, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% NP40, 10% glycerol)를 이용하여 4℃에서 1시간 동안 용해시켰다. Cell lysates를 4℃, 12,000 X g에서 15분 동안 원심분리한 후 동량의 단백질 (30 μg)을 SDS-PAGE에 전기 영동한 후 PVDF membrane에 이동시켜, PVDF membrane을 5% 탈지분유로 상온에서 2시간 blocking 하였다. 다음에는 COX-2, iNOS 및 actin에 대한 1차 항체를 4℃에서 overnight으로 반응시키고, 5분 간격으로 세 번 washing 하고 anti-rabbit, anti-mouse 2차 항체를 상온에서 2시간 반응 시킨 다음 5분 간격으로 3 번 washing하고 나서 Chemiluminescence detection kit 을 membrane에 처리한 후 LAS-3000 luminescent image analyzer를 이용하여 단백질의 발현을 확인하였다.

대표적인 항염증 지표 단백질인 iNOS,와 Cox-2 단백질 발현 양상을 확인한 결과 M19 조성물 1.0, 1.5, 2.0, 2.5% 처리한 농도별 단백질 발현을 억제 하여 염증 발생을 저해 하는 것으로 나타났다. 이러한 현상은 M19 조성물이 강력한 항염증 효력이 있음을 증명하여 주었다.

라) 세포배양 배지에서의 IL-1b, TNF-a cytokine의 발현률 ELISA assay

12well culture dish에서 배양한 RAW264.7 세포에 염증 유발 물질인 LPS를 처리하고 항염증 효과 물질인 M19을 농도별로(1.5, 2.0, 2.5%) 처리 하고 24시간 동안 Co2 incubator에서 배양 한 후 배양 배지를 채취하여 샘플로 준비한다. 대조군으로는 염증유발 물질이 처리되지 않는 음성 대조군과 염증유발 물질인 LPS(200ng/ml)만을 처리한 양성 대조군으로 구분하여 준비 하였다.

R&D systems의 Quantikine ELISA assay kit의 manual book의 절차에 따라 실험을 실행 하고 microplate leader기의 450nm의 파장으로 결과를 확인 하였다. 도 26은 IL-1b Elisa 결과 및 TNF-a Elisa 결과를 나타낸다. Mx19 조성물이 갖는 염증성 사이토카인인 IL-1b에 대한 억제 효능을 확인한 결과 Mx19 조성물이 매우 효과적으로 발현을 억제 하고 있음을 확인 되었고, 처리 농도가 높아 질수록 IL-1b의 발현이 감소 하는 것으로 보아 dose dependent manner을 보이고 있음을 확인 할 수 있었다. (도 26 상)

Mx19 조성물이 갖는 염증성 사이토카인인 TNF-a에 대한 억제 효능을 확인한 결과 Mx19 조성물이 매우 효과적으로 발현을 억제 하고 있음을 확인 되었고, 처리 농도가 높아질수록 TNF-a의 발현이 감소하는 것으로 보아 dose dependent manner를 보이고 있음을 확인 할 수 있었다. (도 26 하)

본 결과를 바탕으로 Mx19의 항염효능 효과에 대한 객관적인 판단을 하기 위하여 KTR(한국화학융합연구소)에 Mx19의 항염증(TNF-a ELISA assay) in vitro 시험을 의뢰하여 in vitro 실험을 실시 하였다.(보고서: TNK-2019- 000046)-Mx19(붉나무 25 : 산조인 10)의 세포내 염증억제에 대한 유효성 평가시험을 실시하여 공인 시험성적서를 발급받았다.

성능지표 항염증 효능평가에 대한 증빙자료 구비 완료 하였고 결과에서도 최종 개발 목표 70%이하 보다 낮은 1.2% 처리군에서 (mean 값 127.97 대비 양성 대조군 mean 값 641.33) 18.71%으로 매우 우수한 항염 효과 나타내었다. 따라서 본 연구에 있어서도 Mx19 조성물이 매우 강력한 항염증 효력이 있음을 다시 한번 확인해 주었다.

<시제품 제조>

본 발명에서 제작된 최종 시제품은 크림 제형을 갖는 시제품으로 크림 제형으로서 백색의 액상 형태을 갖는다. 향취는 특이취가 존재 하지 않고, 크림 제형의 적정 pH는 5.5±1.0(25℃) 이내에서 적정 되었고 끈적임이 최소화, 피부 흡수력 우수, 및 피부 발림성 및 감촉이 우수하도록 제조하였다. (도 27)

본 발명은 전남 남부 지방의 특산물인 붉나무의 효용 가치를 제고 하고, 붉나무의 갖는 약재로서의 가치를 향상 시킬 수 있는 천연 원료를 복합 조성물 형태와 피부 개선 효과를 극대화 하여 문제성 피부에 효과적인 제품을 제공함으로써, 붉나무 자원의 활용으로 인해 농가 소득 증대에 기여 될 것으로 예상 되고 천연 자원의 다양한 활용이 가능하여 관련 산업인의 소득을 증대시킬 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (4)

1. 붉나무 줄기를 70% EtOH로 추출한 추출물에 보조 추출물로 산조인을 70% EtOH로 추출한 추출물 또는 녹차와 무화과 나무를 각각 70% EtOH로 추출한 추출물을 혼합하여 이루어지되,
   상기 붉나무 줄기 70% EtOH 추출물은 12.5중량%로 포함하고, 보조 추출물인 산조인 70% EtOH 추출물은 5중량%로 포함하며, 녹차와 무화과 나무 각각의 70% EtOH 추출물은 각각 2.5중량%로 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 붉나무 추출물을 포함하는 염증성 피부트러블 완화용 화장품 조성물
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