KR102581571B1

KR102581571B1 - 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매의 복합추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102581571B1
Application number: KR1020210023476A
Authority: KR
Inventors: 김정현
Original assignee: 주식회사 네이처팩토리
Priority date: 2021-02-22
Filing date: 2021-02-22
Publication date: 2023-09-25
Also published as: KR20220119961A

Abstract

본 발명은 마디풀(Polygonum aviculare), 탱자나무 열매(Poncirus trifoliata fruit) 및 헛개나무 열매(Hovenia dulcis fruit) 복합추출물을 유효성분으로 함유함으로써 피부 히알루론산 합성효소-3의 유전자 발현 증가 및 히알루로니다제 효소 활성 감소를 통한 보습력 증대, 인볼루크린 유전자 발현 증가를 통한 피부장벽 강화, 산화질소 및 프로스타글란딘 E₂ 생성 억제를 통한 항염증 효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매의 복합추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing the mixed extract of Polygonum aviculare, Poncirus trifoliata fruit and Hovenia dulcis fruit}

본 발명은 식물 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 마디풀(Polygonum aviculare), 탱자나무 열매(Poncirus trifoliata fruit) 및 헛개나무 열매(Hovenia dulcis fruit) 복합추출물을 유효성분으로 함유하여 피부보습 증대, 피부장벽 강화 및 항염증 효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품 개발에 있어서 피부 최외각층인 피부장벽의 기능 강화 효능이 매우 중요하게 다루어진다. 그 이유는 피부장벽이 피부 건강과 노화의 척도인 보습을 유지하는 기능을 하기 때문이다. 피부장벽이 손상되어 보습력이 떨어지는 경우 피부건조를 유발하게 되고 가려움증뿐만 아니라 아토피와 같은 질병을 악화시키기도 한다. 피부장벽은 각질형성세포(keratinocyte)의 분열, 성장 및 분화 과정을 통해 형성되는데, 각질형성세포가 최종적으로 분화되어 형성된 각질세포(corneocyte)로 구성되어 있다(박장서, 2007). 각질형성세포가 분화되는 과정에서 인볼루크린(involucrin), 로리크린(loricrin), 필라그린(filaggrin) 등의 분화를 촉진하는 인자들이 발현하여 각질 내 케라틴 세섬유(keratin filament)를 응집함으로써 단단하고 편평한 구조인 각질세포막(cornified envelope)을 형성, 피부장벽 기능 강화에 기여하게 된다. 또한 히알루론산(hyaluronic acid), 우레아(urea), 시트레이트(citrate), 락테이트(lactate), 글리세롤(glycerol) 등의 다양한 함습인자도 보습장벽 기능을 수행한다. 이 중 히알루론산은 주로 각질형성세포의 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase)에 의해 합성되는 분자량이 20~40만에 이르는 고분자화합물로 표피의 수분 증발을 막아 피부의 탄력성을 유지하는 기능을 한다(Hak Yin Yu et al., 2015).

피부가 장벽기능을 수행함에도 불구하고 자외선, 오염물질, 미세먼지, 미생물 등의 다양한 요인에 의해 손상받기 쉽다. 이러한 외부 스트레스에 의한 면역조절 이상으로 피부염증, 아토피성 피부염 등의 염증성 피부질환이 증가하고 있다. 염증은 다양한 유형의 감염이나 자극에 의해 생성되는 우리 몸의 방어기작으로, 염증 매개체를 분비하는 대식세포(macrophage)에 의해 활성화된다. 자극원에 의해 Toll-like receptor, mitogen-activated protein kinase와 같은 대식세포 내 염증신호체계가 활성화되고, 산화질소(nitric oxide), 프로스타글란딘(prostaglandin)과 같은 염증성 매개인자를 분비하게 된다. 이렇게 생성된 인자들은 주변세포의 면역기능을 활성화시키는 중요한 역할을 하기도 하지만, 과량으로 생성될 경우 질병 악화의 원인이 된다(Joong Hyun Shim, 2017).

본 발명자들은 다양한 천연물들을 탐색하여 피부개선 화장료를 개발하고자 노력하였으며, 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매를 혼합하여 추출한 복합추출물에서 우수한 피부장벽기능 강화, 보습 및 항염활성을 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(0001)대한민국 공개특허 10-2017-0044455 (2017.04.25) (0002)대한민국 공개특허 10-2017-0133721 (2017.12.06)

본 발명은 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부 장벽강화 효과, 피부 보습효과 및 항염증 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 복합추출물은 건조된 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매가 각각 1~5:1~5:1~5의 중량비율로 혼합 추출되어 제조되는 것이다.

유효성분으로서의 상기 복합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 함유된다.

상기 화장료 조성물은 피부장벽강화용, 피부보습용 또는 항염증용인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 천연 추출물을 함유하여 안전하며, 그 상승작용에 의하여 우수한 피부보습 증대, 피부장벽 강화 및 항염증 효능을 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 발명의 내용을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따르면 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물을 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

마디풀은 마디풀과(Polygonaceae), 마디풀속(Polygonum)의 한해살이풀로 우리나라 전역에서 자생하며 길가나 풀밭에서 쉽게 목격된다(국립생물자원관, 2016). 편축, 분절초(粉節草)라는 생약명을 가지고 있는 마디풀은 면역증강, 간 보호 효과 등이 알려져 있다. 주성분 myricitin과 그 배당체인 myricetin, quercetin, kaempferol 등의 플라보노이드류 성분이 확인되었으며, 이들이 우수한 항산화 활성 및 세포보호 효과를 갖는다는 것이 확인되었다(한샛별 등, 2014).

탱자나무는 운향과(Rutaceae), 귤나무속(Citrus)에 속하는 낙엽활엽 작은키나무이다. 열매는 9-10월에 노랗게 익으며, 향기가 좋다. 귤나무의 대목으로 쓰고, 열매를 약용한다. 우리나라 중부 이남에 식재한다(국립생물자원관, 2020). 한방에서는 탱자나무의 미성숙한 열매를 지실(枳實), 성숙한 열매를 지각(枳殼)이라고 하며 동의보감 등에서 식중독과 명치 끝이 아픈 증상, 복부가 창만해지는 현상을 완화시키는데 쓰인다고 하였다. 피부와 관련해서는 미백효과가 보고된 바 있다(김란, 2012).

헛개나무는 갈매나무과(Rhamnaceae), 헛개나무속(Hovenia)에 속하는 낙엽활엽 큰키나무로 열매는 둥글며 10월에 익는다. 열매를 지구자라고 하여 한약재로 이용하며, 민간에서 잎, 줄기 및 열매로 만든 차를 황달, 지방간, 간경화증, 위장병 및 대장염 등에 사용한다. 우리나라 중부 이남에 자생한다(국립생물자원관, 2020). 헛개나무의 잎은 염증성 인자인 산화질소의 생성을 강하게 억제하였으나, 열매는 그러한 효능이 거의 나타나지 않은 것으로 보고된 바 있다(김현준 등, 2013). 그러나 헛개나무 열매 추출물은 glutathione S-tranferase의 활성을 증가시킴으로써 우수한 해독작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(이미경 외, 1999).

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물은 다음과 같이 제조된다. 먼저 건조된 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매를 각각 1~5:1~5:1~5의 중량비율로 혼합한다. 이어서 상기 혼합물 또는 상기 혼합물에 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매를 가한 후 추출하고 여과, 농축하여 복합추출물을 제조한다.

이때, 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매를 각각 3~5:3~5:1의 중량비율로 혼합하여 추출하는 경우에 더 우수한 활성을 나타내었으며, 각각 5:5:1의 중량비율로 혼합하여 추출하는 경우에 가장 우수한 활성을 나타내었다.

이와 같이 제조되는 상기 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물은 마디풀, 탱자나무 열매 또는 헛개나무 열매 각각의 추출물에 비하여 우수한 피부보습, 피부장벽 강화 및 항염증 효능을 나타내어, 혼합에 따른 활성성분 간의 상승효과를 확인할 수 있었다.

본 발명의 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물은 피부유래 세포주의 생존률에 영향을 미치지 않으면서(시험예 1), 피부보습에 관여하는 히알루론산 합성효소-3의 유전자 발현을 증가시키고(시험예 2), 히알루로니다제의 효소 활성을 억제하였다(시험예 3). 또한 피부장벽 기능에 관여하는 인볼루크린의 유전자 발현을 증가시켰다(시험예 4). 뿐만 아니라 염증성 매개인자인 산화질소와 프로스타글란딘 E₂의 생성을 감소시켰다(시험예 5 및 6). 이 복합추출물을 세럼 및 크림 제형에 적용하였을 때 실온, 냉장, 항온 조건에서 제형안전성을 나타내었다(시험예 7). 그러므로 상기 화장료 조성물은 피부 보습용, 피부장벽 강화용 및 항염증용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 여성청결제, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발병의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

제조예 1 - 3: 마디풀, 탱자나무 열매 또는 헛개나무 열매 추출물의 제조

건조된 마디풀(제조예 1), 탱자나무 열매(제조예 2), 헛개나무 열매(제조예 3) 각각 100 g에 추출용매로서 정제수 : 에탄올 = 50:50 (w/w) 혼합용액 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80~100℃로 가열하여 2시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출분말을 얻었다.

실시예 1 - 7: 마디풀, 탱자 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물의 제조

건조된 마디풀, 탱자 열매 및 헛개나무 열매를 하기 표 1의 중량비로 혼합하여 100g으로 복합물을 제조한 후, 추출용매로서 정제수 : 에탄올 = 50:50 (w/w) 혼합용액 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80~100℃로 가열하여 2시간씩 총 3회 추출하였다.

중량비	마디풀	탱자나무 열매	헛개나무 열매
실시예 1	1	1	1
실시예 2	1	3	3
실시예 3	1	5	5
실시예 4	3	1	3
실시예 5	5	1	5
실시예 6	3	3	1
실시예 7	5	5	1

시험예 1: 세포 독성 여부 확인

세포 독성 여부를 확인하기 위해 각질형성세포주인 HaCaT와 섬유아세포인 NHDF(normal human dermal fibroblast)를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 배양하였으며 96 well plate에 각각 5×10⁵및 3×10⁴의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 상기 제조예 및 실시예에서 제조한 추출물을 시료농도가 0.1 또는 1% 가 되도록 처리하고 24시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium boromide, Sigma) 용액을 각 well에 100㎖씩 첨가한 후(3 ㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150 ㎕의 디메틸 설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존률은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 2에 나타내었다.

세포생존률(%) = 시료첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

구분	세포생존률(%)
	HaCAT		NHDF
	0.1 %	1 %	0.1 %	1 %
제조예 1	101	98	99	97
제조예 2	100	99	100	100
제조예 3	101	101	101	103
실시예 1	99	97	99	98
실시예 2	100	102	100	100
실시예 3	103	99	101	100
실시예 4	100	98	99	98
실시예 5	101	98	101	99
실시예 6	100	101	100	102
실시예 7	100	98	99	97

상기 표 2의 결과에서 보는 바와 같이, 제조예 및 실시예 모두에서 95% 이상의 세포생존율을 나타냄에 따라 세포 독성에는 영향을 미치지 않았고, 이에 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 2: 히알루론산 합성효소-3(HAS-3)의 유전자 발현 증가효과 확인

인간 각질형성세포 HaCaT을 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후 12 well plate에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 제조예 및 실시예를 처리한 후 24시간 동안 5% CO₂및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA를 분리하였으며, cDNA 합성 및 RT-PCR을 수행하였다. 히알루론산 합성 효소 (Hyaluronan synthase-3, HAS-3) 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 3에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25 units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인하였으며, HAS-3 발현 증가율은 아래의 식에 따라 계산하였고 그 결과는 하기의 표 4에 나타내었다.

HAS-3 발현 증가율(%) = (시료첨가군의 HAS-3 발현양/ 대조군의 HAS-3 발현양) × 100

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Forward : CAAAGTTGTCATGGATGACC
GAPDH	Reverse : CCATGGAGAAGGCTGGGG
HAS-3	Froward : CCCAGCCAGATTTGTTGATG
HAS-3	Reverse : AGTGGTCACGGGTTTCTTCC
Involucrin	Forward : ACCTAGCGGACCCGAAATAA
Involucrin	Reverse : TGGAACAGCAGGAAAAGCAC

구분	HAS-3 발현 증가율(%)
구분	0.1%	1 %
제조예 1	12	19
제조예 2	16	21
제조예 3	14	22
실시예 1	29	38
실시예 2	31	43
실시예 3	30	37
실시예 4	32	44
실시예 5	28	39
실시예 6	41	63
실시예 7	46	69

상기 표 4에서 확인되는 바와 같이 마디풀, 탱자나무 열매 또는 헛개나무 열매 각각의 추출물인 제조예보다 이들의 복합추출물인 실시예에서 더 우수한 HAS-3 발현 증가 효능을 확인할 수 있었으며, 특히 실시예 6~7에서 가장 우수한 효능을 확인할 수 있었다.

시험예 3 : 히알루로니다제의 활성 억제 효과 확인

히알루로니다제 활성억제 효과는 모르간-엘손(Morgan-Elson)법을 응용하여 다음과 같이 확인하였다. 히알루로니다제의 최종 효소 활성을 400 NF unit/㎖, HA의 최종농도를 0.4 ㎎/㎖로 하고 활성제인 Compound 48/80 완충(buffer) 용액 (0.1 ㎎/㎖)을 사용하여 불활성형 히알루로니다제의 활성화 단계의 저해작용을 중심으로 히알루로니다제 활성을 측정하였다. 시료는 완충용액 (buffer)에 용해하여 시료 용액으로 하고 대조군은 시료 용액 대신에 완충 용액을 사용하였다. 대조군으로는 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 사용하였다. 히아루로니다아제의 활성 저해율(%)은 아래의 수학식으로 계산하였으며, 그 결과는 표 5에 나타내었다.

히알루로니다제 활성 저해율(%)= [(대조군의 히알루로니다제 활성 - 시료첨가군의 히알루로니다제 활성) / 대조군의 히알루로니다제 활성]×100

구분	히알루로니다제 활성 저해율(%)
구분	0.1%	1%
제조예 1	21	29
제조예 2	23	34
제조예 3	19	32
실시예 1	30	41
실시예 2	29	40
실시예 3	32	44
실시예 4	28	41
실시예 5	31	46
실시예 6	41	59
실시예 7	48	64

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이 마디풀, 탱자나무 열매 또는 헛개나무 열매 각각의 추출물인 제조예보다 이들의 복합추출물인 실시예에서 더 우수한 히알루로니다제 활성 억제 효능을 확인할 수 있었다.

시험예 4 : 인볼루크린 (Involucrin)의 유전자 발현 증가 효과

HaCaT 세포에 제조예 및 실시예를 처리한 후 24시간 동안 5% CO₂및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA를 분리하였으며, cDNA 합성 및 RT-PCR을 시험예 2와 동일하게 수행하였다. 인볼루크린(Involucrin, IVN) 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였으며, IVN 유전자의 프라이머 서열은 표 3에 나타내었다. IVN 발현 증가율은 아래의 식에 따라 계산하였고 그 결과는 하기의 표 6에 나타내었다.

IVN 발현증가율(%) = (시료첨가군의 IVN 발현양/대조군의 IVN 발현양)×100

구분	IVN 발현 증가율(%)
구분	0.1%	1 %
제조예 1	7	15
제조예 2	10	16
제조예 3	11	18
실시예 1	19	31
실시예 2	18	29
실시예 3	21	33
실시예 4	22	35
실시예 5	24	34
실시예 6	34	48
실시예 7	39	53

상기 표 6에서 확인되는 바와 같이 마디풀, 탱자나무 열매 또는 헛개나무 열매 각각의 추출물인 제조예보다 이들의 복합추출물인 실시예에서 피부장벽 기능 강화에 작용하는 IVN 발현이 더욱 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 실시예 6~7에서 더욱 우수한 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 5: 산화질소(Nitric oxide) 생성 억제 효과

마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 항습배양기에 배양하였다. Raw 264.6 세포주를 96-well plate에 3×10⁵ cells/well density로 분주하여 24시간 동안 플레이트에 부착시켰다. 염증반응을 유발하기 위해 100 ng/ml 농도의 LPS(lipopolysaccharide)와 0.1% 및 1% 농도의 시료를 함유한 새로운 배지를 처리하여 24시간 배양하였다. 양성대조군인 N-monomethyl-L-arginine(NMMA)은 25 μM의 농도로 처리하였다.

세포에서 생성되어 배양액에 존재하는 산화질소(Nitric oxide) 수준을 그리스(Griess) 반응을 이용하여 측정하였다. 배양액을 96-well plate에 50 ㎕씩 분주한 후 sulfanil amide 용액 25 ㎕ 및 naphthyl ethylene diamine 용액 25 ㎕를 넣고 10분간 실온에서 반응시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 NO 생성량은 아질산염 기준(nitrite standard)을 이용하여 얻은 표준검량곡선을 이용하여 산출하였으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다.

구분	NO 생성량 (Nitrite, μM)
구분	0.1%	1.0%
Control	2
LPS	43
제조예 1	37	30
제조예 2	35	30
제조예 3	34	28
실시예 1	30	21
실시예 2	27	19
실시예 3	28	22
실시예 4	31	20
실시예 5	29	20
실시예 6	18	13
실시예 7	14	9
NMMA	7

상기 표 7의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예의 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물은 제조예의 각각의 추출물과 비교해 볼 때, 과도하게 활성화된 대식세포주에서 염증매개인자인 NO 생성량을 더욱 감소시키는 것으로 나타났다. 특히 실시예 6~7에서 더욱 우수한 NO 억제 효능을 확인할 수 있었다.

시험예 6: 프로스타글란딘 E ₂ 생성 억제 효과

RAW 264.7 세포의 배양은 시험예 5와 동일하게 실험하였다. Raw 264.6 세포주를 48-well plate에 5×10⁵ cells/well density로 분주하여 24시간 동안 플레이트에 부착시켰다. 염증반응을 유발하기 위해 100 ng/ml 농도의 LPS와 0.1% 및 1% 농도의 시료를 함유한 새로운 배지를 처리하여 24시간 배양하였다. 양성대조군으로는 dexamethasone을 사용하였다.

세포에서 생성되어 배양액에 존재하는 프로스타클란딘 E₂(Prostaglandin E₂₎의 양은 competitive enzyme immuno assay kit(Cayman Chemical)을 구입하여 사용법에 따라 측정하였다. 각 PGE₂의 생성량은 kit에 첨가되어있는 표준품을 이용하여 표준검량곡선을 그려 산출하였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

구분	PGE₂ 생성량(pg/ml)
구분	0.1%	1.0%
Control	73
LPS	397
제조예 1	362	335
제조예 2	351	324
제조예 3	347	328
실시예 1	287	258
실시예 2	295	251
실시예 3	274	239
실시예 4	277	244
실시예 5	263	237
실시예 6	220	196
실시예 7	208	181
Dexamethasone	153

상기 표 8의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예의 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물은 제조예의 각각의 추출물과 비교해 볼 때, 과도하게 활성화된 대식세포주에서 염증 매개인자인 PGE₂의 생성량을 더욱 감소시키는 것으로 나타났다. 실시예 6~7에서 더욱 우수한 PGE₂생성 억제 효능을 확인할 수 있었으며, 실시예 7에서 가장 우수한 효능을 나타내었다.

실시예 8: 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물을 함유하는 세럼의 제조

상기 실시예 7의 복합추출물을 함유한 세럼을 하기의 표 9의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	중량 %
복합추출물(실시예 7)	1.0
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
미네랄 오일	10.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.1
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

실시예 9: 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물을 함유하는 크림의 제조

상기 실시예 7의 복합추출물을 함유한 크림을 하기의 표 10의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	중량 %
복합추출물(실시예 7)	1.0
시어버터	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.8
미네랄 오일	10.0
디메치콘	3.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
세테아릴알코올	2.0
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.25
트리에탄올아민	0.25
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

시험예 7 : 제형안정도 확인

상기 실시예 8 및 9에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(55℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하며, 안정성을 확인 하였으며, 결과는 표 11에 나타내었다.

온도조건	안정성 확인(12주 보관)
	실시예 8			실시예 9
	변색	변취	분리	변색	변취	분리
실온(25℃)	0	0	0	0	0	0
냉장(4℃)	0	0	0	0	0	0
항온(55℃)	0	0	0	0	0	0

< 제형 안정 등급 >

0: 변화 없음 1: 미세한 변화 2: 변화 3: 극심한 변화

상기 표 11에서 나타낸 바와 같이 실시예 8 및 9 제형 모두 25℃, 4℃ 및 55℃ 온도 조건 하에서 변색 변취 및 분리 현상이 나타나지 않고 안정함이 확인되었다.

Claims

마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매가 각각 5:5:1의 중량비율로 혼합되어 추출 제조되는 마디풀, 탱자나무 열매 및 헛개나무 열매 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 복합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부장벽 강화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.