CN115015360A - 一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法 - Google Patents
一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115015360A CN115015360A CN202111652719.XA CN202111652719A CN115015360A CN 115015360 A CN115015360 A CN 115015360A CN 202111652719 A CN202111652719 A CN 202111652719A CN 115015360 A CN115015360 A CN 115015360A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nicotinamide mononucleotide
- solution
- broccoli
- sample
- peak area
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- DAYLJWODMCOQEW-TURQNECASA-O NMN(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O2)O)=C1 DAYLJWODMCOQEW-TURQNECASA-O 0.000 title abstract 10
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 claims abstract description 50
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 claims abstract description 50
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 claims abstract description 50
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 49
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 20
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 4
- DAYLJWODMCOQEW-TURQNECASA-N NMN zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)([O-])=O)O2)O)=C1 DAYLJWODMCOQEW-TURQNECASA-N 0.000 claims description 57
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 44
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 23
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 23
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 23
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 23
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 22
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 15
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 claims description 10
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 claims description 5
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 5
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012875 nonionic emulsifier Substances 0.000 claims description 5
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 8
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 7
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 6
- 229940051841 polyoxyethylene ether Drugs 0.000 description 6
- 229920000056 polyoxyethylene ether Polymers 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 4
- 244000174681 Michelia champaca Species 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 3
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010024137 Nicotinamide-Nucleotide Adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000015597 Nicotinamide-nucleotide adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 1
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N anthracene-2-sulfonyl chloride Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC(S(=O)(=O)Cl)=CC=C3C=C21 FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 1
- 238000009834 vaporization Methods 0.000 description 1
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/34—Purifying; Cleaning
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
- G01N2001/2866—Grinding or homogeneising
Abstract
本发明公开了一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，包括步骤：S1.样品溶液的制备：研磨过筛西兰花样品，得西兰花粉末，液氮冷冻所述西兰花粉末后，加入提取剂升温解冻，再利用超声辅助提取，过滤得西兰花提取液；S2.绘制标准曲线：配制烟酰胺单核苷酸标准品的梯度溶液，并利用毛细管电泳测定所述烟酰胺单核苷酸标准品的峰面积，以烟酰胺单核苷酸标准品的浓度为横坐标，以所测定的烟酰胺单核苷酸标准品的峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线；S3.测试样品中测定烟酰胺单核苷酸含量：利用毛细管电泳测定样品中测定烟酰胺单核苷酸的峰面积，并带入所述标准曲线中，计算得到烟酰胺单核苷酸含量，抗干扰性强、效率高。
Description
技术领域
本发明涉及烟酰胺单核苷酸领域，具体涉及一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，简称NMN)是生物细胞内固有的一种生化物质，它在细胞内可被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化从而转变成生物细胞所赖以生存的重要物质—烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称NAD，又称辅酶I，存在于所有细胞中，参与上千种生物催化反应，在生物细胞能量生成中扮演着重要角色。NMN是NAD的直接前体，其作为生物细胞内NAD补救合成途径的重要中间体，在生物细胞内的水平直接影响到NAD的浓度。
烟酰胺单核苷酸也富含在一些水果和蔬菜中，包括西兰花、卷心菜、黄瓜、毛豆、鳄梨等，目前样品测定方法主要是以高效液相电泳HPLC为主，HPLC分析对象广，它只要求样品能制成溶液，而不需要汽化，因此不受样品挥发性的约束。HPLC是以经典液相色谱法为基础，引入GC的理论与实验方法发展而成的分离分析方法。
但西兰花粗提取液中杂质含量较多且粘度高，而高效液相色谱法对样品纯度及粘度有一定要求，否则会造成色谱柱中毒，而纯化需借助离子交换树脂或色谱硅胶柱，操作复杂、效率低；
如专利CN 112159445 A 烟酰胺单核苷酸的纯化方法和制备方法使用硅胶柱对β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行层析分离，采用醇做流动相进行梯度洗脱后再利用高效色谱进行测定浓度，操作复杂、效率低。
综上，使用HPLC测定含有少量烟酰胺单核苷酸的西兰花等样品，若不对样品提取液进行纯化，则干扰性强，若纯化后再测定分析，则操作复杂、效率低、耗材昂贵。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，抗干扰性强、效率高。
发明人发现，利用毛细管电泳测定样品中的烟酰胺单核苷酸抗干扰性强、样本量要求低，但现有技术中并未使用该方法对西兰花中的烟酰胺单核苷酸进行检测，这是由于使用毛细管电泳方法测定西兰花中的烟酰胺单核苷酸有一定的局限，因为毛细管电泳方法的灵敏度低，因此对于样品中烟酰胺单核苷酸的浓度及粘度都有要求，而天然存在于西兰花中的酰胺单核苷酸含量较少，浓度低，不能直接上样，而若为了提高浓度直接浓缩溶剂则提高了样品的粘度，也不利于检测顺利进行。
因此，为克服上述缺陷使毛细管电泳能运用于西兰花中烟酰胺单核苷酸的检测，并实现抗干扰性强、效率高的效果，本方案先通过特定的提取剂协同超声波提取将烟酰胺单核苷酸从西兰花中溶出浓缩，得到高提取率及高浓度的符合毛细管电泳方法的西兰花提取液，再通过调整毛细管电泳方法的条件使之符合对西兰花样品中烟酰胺单核苷酸的测定。
本发明的技术方案是，提供一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，包括步骤：
S1.样品溶液的制备：研磨过筛西兰花样品，得西兰花粉末，液氮冷冻所述西兰花粉末后，加入提取剂升温解冻，再利用超声辅助提取，过滤得西兰花提取液；
S2.绘制标准曲线：配制烟酰胺单核苷酸标准品的梯度溶液，并利用毛细管电泳测定所述烟酰胺单核苷酸标准品的峰面积，以烟酰胺单核苷酸标准品的浓度为横坐标，以所测定的烟酰胺单核苷酸标准品的峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线；
S3.测试样品中测定烟酰胺单核苷酸含量：利用毛细管电泳测定样品中测定烟酰胺单核苷酸的峰面积，并带入所述标准曲线中，计算得到烟酰胺单核苷酸含量。
本方案中，先利用液氮对西兰花细胞进行冷冻处理，在速冻过程中，细胞壁外面随着温度下降收缩，但此时内部还是热的，故收缩受到约束而产生了拉伸应力，内表面则相反，受压缩应力作用，升温解冻时，外表面由于膨胀受到约束产生压缩应力，内表面则产生拉升应力，由于构成细胞壁的纤维素材料导热系数很小，细胞壁内表面比外表面温度变化要迟很多，使壁两侧产生很大温差，从而产生冲击应力，这种冲击应力壁通常情况下的热应力要大的多，且极速施加在细胞壁上，使其失去延展性并脆化，西兰花细胞壁在交变应力作用下产生疲劳裂纹，裂纹在疲劳过程中逐渐扩展，最终导致细胞壁破裂，西兰花提取物被释放，相较于现有技术中的研磨提取，此种方式细胞壁破碎的更为彻底，因此西兰花提取物释放的也更为彻底，保证了酰胺单核苷酸尽可能的被释放；
再加入提取剂进行解冻后，在细胞壁破裂的瞬间，细胞膜内物质会由于膜内外浓度不同，膜内物质会向膜外渗出，一方面作为解冻液加速了解冻速度，另一方面作为提取剂，使内容物渗出，提高提取效率，得到高提取率及高浓度的西兰花提取液，无需浓缩及纯化，即可直接运用于毛细管电泳法检测；
以已知的烟酰胺单核苷酸标准品的梯度溶液绘制标准曲线后，得到酰胺单核苷酸浓度与峰面积的回归方程，再通过毛细管电泳测试样品中的峰面积，即可得到样品中酰胺单核苷酸的浓度。
优选地，所述毛细管电泳的条件如下：选取内径为10-20μm的熔融石英毛细管柱，缓冲液为 40-60mmol/L 硼砂盐缓冲液，pH：9.0-9.4，电泳温度为 25℃，进样时间为5-10s，进样压力为0.1197MPa，分离电压20-30kV，紫外检测波长218-254nm。
优选地，步骤S1之后还包括：用0.1mol/L NaOH溶液活化所述熔融石英毛细管柱20-30min，再分别依次用超纯水、甲醇、超纯水、1mol/L HCl溶液、超纯水、0.1mol/L NaOH溶液、超纯水及40-60mmol/L硼砂盐缓冲液清洗毛细管5-10min，将毛细管柱进行活化预处理，稳定测试基线。
优选地，所述提取剂包括表面活性剂与乙酸水溶液的混合物。以表面活性剂及乙酸水溶液的混合物作为提取剂，表面活性剂与超声波结合能够产生空化效应，提高提取率，而乙酸一方面可稳定烟酰胺单核苷酸并提高溶解度，另一方面，乙酸属于弱电解质，其存在充当了表面活性剂促进剂的角色，进一步提高提取率。
优选地，所述表面活性剂为非离子乳化剂，水溶液中不电离，因为在溶液中不是离子状态，比离子表面活性剂更稳定，与乙酸的协同作用更好；
优选地，所述非离子乳化剂包括烷基酚聚氧乙烯醚、蓖麻油聚氧乙烯醚中的一种或几种，该种非离子乳化剂具有优秀的发泡性能，因此在超声波的作用下能够产生更大，更多的气泡，在超声波的连续作用下，这些气泡瞬间收缩爆破，产生更高能量的声化学效应，因此，使得烟酰胺单核苷酸能够更大程度的溶出。
优选地，所述液氮冷冻的温度为-180℃至-200℃，冷冻时间为3-5min，该步骤的目的在于，为西兰花分子提供急冻环境。
优选地，所述超声辅助提取的提取温度为55-60℃，提取功率为500-600W。
优选地，所述过滤的滤纸孔径小于等于5um。
优选地，所述烟酰胺单核苷酸标准品的梯度溶液的浓度分别为1μg/ml、2 μg/ml、5μg/ml、10 μg/ml、40 μg/ml、100μg/ml、200μg/ml，所选取的线性范围包含西兰花中烟酰胺单核苷酸含量范围，避免再次稀释。
本发明的有益效果在于：
1.运用毛细管电泳测定西兰花中测定烟酰胺单核苷酸，无需对样品进行纯化，抗干扰性强、效率高；
2.本方案对样品的前处理过程，提高了西兰花中烟酰胺单核苷酸提取率，使得检测的浓度高而粘度低，克服了现有技术中利用毛细管电泳检测西兰花中烟酰胺单核苷酸的缺陷，同时对样品中烟酰胺单核苷酸的定量更为准确。
附图说明
附图1为本方法标准曲线的线性回归方程。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
S1. 样品溶液的制备：取100g西兰花茎叶，用蒸馏水洗涤，切成0.5cm×0.5cm的小块，45-50℃烘箱干燥至恒重，过80目筛网，得到粒径小于等于150μm的西兰花粉末；将所述西兰花粉末投入温度为-180℃液氮罐中，急剧降温冷冻3min后，转移至烧杯中，并加入100ml提取剂，对烧杯进行加热，加热温度为30℃，加热1min，使得西兰花粉末解冻；将被解冻的物质置于超声波清洗器中内，调整提取温度为55℃，提取功率为500W，提取30min后，得到固液混合物，再用孔径小于等于5um的滤纸进行过滤，固液分离取上清液，即得西兰花提取液；
所述提取液的配制方法如下：a.称取0.1g的表面活性剂分散于100ml去离子水中，搅拌充分直至溶解，得到表面活性剂溶液，其中，表面活性剂包括烷基酚聚氧乙烯醚、蓖麻油聚氧乙烯醚中的一种或几种；b.将0.5g乙酸置于100ml去离子水中，搅拌充分直至溶解，得到乙酸水溶液；c．将表面活性剂溶液与乙酸水溶液混合，即为所述提取剂；
S2. 绘制标准曲线：精密称定1mg烟酰胺单核苷酸到1mL的离心管中，用1.0mL超纯水溶解，配成5mg/mL的对照品母液，用0.22μm孔径的水系滤膜过滤备用，剩余放入冰箱4℃避光保存。将烟酰胺单核苷酸对照品母液配成浓度为1μg/ml、2 μg/ml、5μg/ml、10 μg/ml、40 μg/ml、100μg/ml、200μg/ml分别进行进样测定。以对照品浓度x(mg/mL)为横坐标，峰面积y为纵坐标进行线性回归。
所述进样测定步骤为：用0.1mol/L NaOH溶液活化熔融石英毛细管柱20min，再分别依次用超纯水、甲醇、超纯水、1mol/L HCl溶液、超纯水、0.1mol/L NaOH溶液、超纯水及40mmol/L硼砂盐缓冲液清洗毛细管5min后，再将上述标准品溶液进样检测，所述毛细管电泳的条件如下：选取内径为10μm的熔融石英毛细管柱，缓冲液为 40mmol/L 硼砂盐缓冲液，pH：9.0，电泳温度为 25℃，进样时间为5s，进样压力为0.1197MPa，分离电压20kV，紫外检测波长218-254nm。
按照上述步骤，得回归方程，y＝2.16*103x-633.21，R2＝0.9994，如图1所示，表明该曲线的线性关系良好。
S3.吸取步骤S1中西兰花提取液100μl，按照步骤S2中的进样检测方法测定样品中烟酰胺单核苷酸的峰面积，并带入所述标准曲线中，计算得到烟酰胺单核苷酸含量为10.31μg/ml。
实施例2
S1. 样品溶液的制备：取100g西兰花茎叶，用蒸馏水洗涤，切成0.5cm×0.5cm的小块， 50℃烘箱干燥至恒重，过80目筛网，得到粒径小于等于150μm的西兰花粉末；将所述西兰花粉末投入温度-200℃液氮罐中，急剧降温冷冻5min后，转移至烧杯中，并加入100ml提取剂，对烧杯进行加热，加热温度为40℃，加热3min，使得西兰花粉末解冻；将被解冻的物质置于超声波清洗器中内，调整提取温度为60℃，提取功率为600W，提取60min后，得到固液混合物，再用孔径小于等于5um的滤纸进行过滤，固液分离取上清液，即得西兰花提取液；
所述提取液的配制方法如下：a.称取3g的表面活性剂分散于100ml去离子水中，搅拌充分直至溶解，得到表面活性剂溶液，其中，表面活性剂包括烷基酚聚氧乙烯醚、蓖麻油聚氧乙烯醚中的一种或几种；b.将2g乙酸置于100ml去离子水中，搅拌充分直至溶解，得到乙酸水溶液；c．将表面活性剂溶液与乙酸水溶液混合，即为所述提取剂；
S2. 绘制标准曲线：精密称定1mg烟酰胺单核苷酸到1mL的离心管中，用1.0mL超纯水溶解，配成5mg/mL的对照品母液，用0.22μm孔径的水系滤膜过滤备用，剩余放入冰箱4℃避光保存。将烟酰胺单核苷酸对照品母液配成浓度为1μg/ml、2 μg/ml、5μg/ml、10 μg/ml、40 μg/ml、100μg/ml、200μg/ml分别进行进样测定。以对照品浓度x(mg/mL)为横坐标，峰面积y为纵坐标进行线性回归。
所述进样测定步骤为：用0.1mol/L NaOH溶液活化熔融石英毛细管柱30min，再分别依次用超纯水、甲醇、超纯水、1mol/L HCl溶液、超纯水、0.1mol/L NaOH溶液、超纯水及60mmol/L硼砂盐缓冲液清洗毛细管10min后，再将上述标准品溶液进样检测，所述毛细管电泳的条件如下：选取内径为20μm的熔融石英毛细管柱，缓冲液为 60mmol/L 硼砂盐缓冲液，pH： 9.4，电泳温度为 25℃，进样时间为10s，进样压力为0.1197MPa，分离电压30kV，紫外检测波长218-254nm。
按照上述步骤，得回归方程，y＝2.16*103x-633.21，R2＝0.9994，如图1所示，表明该曲线的线性关系良好。
S3.吸取步骤S1中西兰花提取液100μl，按照步骤S2中的进样检测方法测定样品中烟酰胺单核苷酸的峰面积，并带入所述标准曲线中，计算得到烟酰胺单核苷酸含量为9.97μg/ml。
实施例3
S1. 样品溶液的制备：取100g西兰花茎叶，用蒸馏水洗涤，切成0.5cm×0.5cm的小块，45-50℃烘箱干燥至恒重，过80目筛网，得到粒径小于等于150μm的西兰花粉末；将所述西兰花粉末投入温度为-190℃液氮罐中，急剧降温冷冻4min后，转移至烧杯中，并加入100ml提取剂，对烧杯进行加热，加热温度为35℃，加热2min，使得西兰花粉末解冻；将被解冻的物质置于超声波清洗器中内，调整提取温度为58℃，提取功率为550W，提取50min后，得到固液混合物，再用孔径小于等于5um的滤纸进行过滤，固液分离取上清液，即得西兰花提取液；
所述提取液的配制方法如下：a.称取1g的表面活性剂分散于100ml去离子水中，搅拌充分直至溶解，得到表面活性剂溶液，其中，表面活性剂包括烷基酚聚氧乙烯醚、蓖麻油聚氧乙烯醚中的一种或几种；b.将1g乙酸置于100ml去离子水中，搅拌充分直至溶解，得到乙酸水溶液；c．将表面活性剂溶液与乙酸水溶液混合，即为所述提取剂；
S2. 绘制标准曲线：精密称定1mg烟酰胺单核苷酸到1mL的离心管中，用1.0mL超纯水溶解，配成5mg/mL的对照品母液，用0.22μm孔径的水系滤膜过滤备用，剩余放入冰箱4℃避光保存。将烟酰胺单核苷酸对照品母液配成浓度为1μg/ml、2 μg/ml、5μg/ml、10 μg/ml、40 μg/ml、100μg/ml、200μg/ml分别进行进样测定。以对照品浓度x(mg/mL)为横坐标，峰面积y为纵坐标进行线性回归。
所述进样测定步骤为：用0.1mol/L NaOH溶液活化熔融石英毛细管柱25min，再分别依次用超纯水、甲醇、超纯水、1mol/L HCl溶液、超纯水、0.1mol/L NaOH溶液、超纯水及50mmol/L硼砂盐缓冲液清洗毛细管8min后，再将上述标准品溶液进样检测，所述毛细管电泳的条件如下：选取内径为15μm的熔融石英毛细管柱，缓冲液为 50mmol/L 硼砂盐缓冲液，pH：9.2，电泳温度为 25℃，进样时间为8s，进样压力为0.1197MPa，分离电压25kV，紫外检测波长218-254nm。
按照上述步骤，得回归方程，y＝2.16*103x-633.21，R2＝0.9994，如图1所示，表明该曲线的线性关系良好。
S3.吸取步骤S1中西兰花提取液100μl，按照步骤S2中的进样检测方法测定样品中烟酰胺单核苷酸的峰面积，并带入所述标准曲线中，计算得到烟酰胺单核苷酸含量为11.08μg/ml。
测试方法
在实施例1-3所述的西兰花样品提取液中按照各实施例中测定的浓度分别加入200％、100％、50％三种不同量烟酰胺单核苷酸的标准溶液，并进行毛细管电泳进样测定，计算加标的回收率，回收率(％)＝测定浓度/加标浓度。结果见表1，烟酰胺单核苷酸平均回收率在92％-96％。表明该方法不会因杂质的占比多少而影响测量的准确性，抗干扰性强，且无需纯化，可适用于西兰花中烟酰胺单核苷酸的含量检测。
表1 加标回收率测试结果
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其他实施例中所包括的某些特征而不是其他特征，但是不同的实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在权利要求书中，所要求的保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。
本领域普通技术人员可以理解：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请权利要求所限定的范围。
Claims (10)
1.一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，其特征在于，包括步骤：
S1.样品溶液的制备：研磨过筛西兰花样品，得西兰花粉末，液氮冷冻所述西兰花粉末后，加入提取剂升温解冻，再利用超声辅助提取，过滤得西兰花提取液；
S2.绘制标准曲线：配制烟酰胺单核苷酸标准品的梯度溶液，并利用毛细管电泳测定所述烟酰胺单核苷酸标准品的峰面积，以烟酰胺单核苷酸标准品的浓度为横坐标，以所测定的烟酰胺单核苷酸标准品的峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线；
S3.测试样品溶液中烟酰胺单核苷酸含量：利用毛细管电泳测定步骤S1所述西兰花提取液中烟酰胺单核苷酸的峰面积，并带入所述标准曲线中，计算得到烟酰胺单核苷酸含量。
2.根据权利要求1所述的一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，其特征在于，所述毛细管电泳的条件如下：选取内径为10-20μm的熔融石英毛细管柱，缓冲液为 40-60mmol/L 硼砂盐缓冲液，pH：9.0-9.4，电泳温度为 25℃，进样时间为5-10s，进样压力为0.1197MPa，分离电压20-30kV，紫外检测波长218-254nm。
3.根据权利要求2所述的一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，其特征在于，步骤S1之后还包括：用0.1mol/L NaOH溶液活化所述熔融石英毛细管柱20-30min，再分别依次用超纯水、甲醇、超纯水、1mol/L HCl溶液、超纯水、0.1mol/L NaOH溶液、超纯水及40-60mmol/L硼砂盐缓冲液清洗毛细管5-10min。
4.根据权利要求1所述的一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，其特征在于，所述提取剂包括表面活性剂与乙酸水溶液的混合物。
5.根据权利要求4所述的一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，其特征在于，所述表面活性剂为非离子乳化剂。
6.根据权利要求5所述的一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，其特征在于，所述非离子乳化剂包括烷基酚聚氧乙烯醚、蓖麻油聚氧乙烯醚中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，其特征在于，所述液氮冷冻的温度为-180℃至-200℃，冷冻时间为3-5min。
8.根据权利要求1所述的一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，其特征在于，所述超声辅助提取的提取温度为55-60℃，提取功率为500-600W。
9.根据权利要求1所述的一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，其特征在于，所述过滤的滤纸孔径小于等于5um。
10.根据权利要求1所述的一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法，其特征在于，所述烟酰胺单核苷酸标准品的梯度溶液的浓度分别为1μg/ml、2 μg/ml、5μg/ml、10 μg/ml、40 μg/ml、100μg/ml、200μg/ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111652719.XA CN115015360A (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111652719.XA CN115015360A (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115015360A true CN115015360A (zh) | 2022-09-06 |
Family
ID=83064480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111652719.XA Pending CN115015360A (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115015360A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105866270A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-08-17 | 中山百灵生物技术有限公司 | 一种β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法 |
| CN110559224A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-12-13 | 广东丸美生物技术股份有限公司 | 一种西兰花提取物及制备方法和用途 |
| CN110922494A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-03-27 | 福州福德恩生物科技有限公司 | 一种猴头菇多糖提取分离方法 |
| JP2021038213A (ja) * | 2019-08-30 | 2021-03-11 | 広東丸美生物技術股▲フン▼有限公司 | アボカド抽出物及びその調製方法並びに老化防止化粧品における使用 |
| CN112870979A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-06-01 | 内蒙古金达威药业有限公司 | 一种特种膜及其制备方法和应用以及β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法 |
| CN113189185A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-07-30 | 辽宁省农业科学院 | 金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法 |
-
2021
- 2021-12-31 CN CN202111652719.XA patent/CN115015360A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105866270A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-08-17 | 中山百灵生物技术有限公司 | 一种β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法 |
| CN110559224A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-12-13 | 广东丸美生物技术股份有限公司 | 一种西兰花提取物及制备方法和用途 |
| JP2021038213A (ja) * | 2019-08-30 | 2021-03-11 | 広東丸美生物技術股▲フン▼有限公司 | アボカド抽出物及びその調製方法並びに老化防止化粧品における使用 |
| CN110922494A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-03-27 | 福州福德恩生物科技有限公司 | 一种猴头菇多糖提取分离方法 |
| CN112870979A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-06-01 | 内蒙古金达威药业有限公司 | 一种特种膜及其制备方法和应用以及β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法 |
| CN113189185A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-07-30 | 辽宁省农业科学院 | 金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 马晓颖;肖军;杨涛;吕立涛;宋艳雨;: "高效毛细管电泳法测定桑黄菌丝体提取物中腺苷含量的研究", 园艺与种苗, no. 05 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ma et al. | Extraction of carbamate pesticides in fruit samples by graphene reinforced hollow fibre liquid microextraction followed by high performance liquid chromatographic detection | |
| Poole et al. | Green sample-preparation methods using room-temperature ionic liquids for the chromatographic analysis of organic compounds | |
| Zheng et al. | Supercritical carbon dioxide explosion as a pretreatment for cellulose hydrolysis | |
| Hou et al. | Bis (trifluoromethanesulfonyl) imide-based ionic liquids grafted on graphene oxide-coated solid-phase microextraction fiber for extraction and enrichment of polycyclic aromatic hydrocarbons in potatoes and phthalate esters in food-wrap | |
| Li et al. | Separation and purification of chlorogenic acid by molecularly imprinted polymer monolithic stationary phase | |
| CN109444282B (zh) | 液相色谱测定大庆油田石油磺酸盐样品中活性物含量的方法 | |
| Zhang et al. | Ethanol/salt aqueous two-phase system based ultrasonically assisted extraction of polysaccharides from Lilium davidiivar. unicolor Salisb: Physicochemical characterization and antiglycation properties | |
| Wang et al. | Method development for the analysis of phthalate esters in tea beverages by ionic liquid hollow fibre liquid-phase microextraction and liquid chromatographic detection | |
| CN109283280B (zh) | 一种从水果、蔬菜中快速提取净化苯甲酰脲类农药残留的方法 | |
| CN105467026A (zh) | 一种土壤及沉积物中全氟化合物的检测方法 | |
| Sun et al. | Graphene reinforced hollow fiber liquid-phase microextraction for the determination of phthalates in water, juice and milk samples by HPLC | |
| WO2016155347A1 (zh) | 测定大气颗粒物中酞酸酯的系统及方法 | |
| Fan et al. | A ionic liquid for dispersive liquid-liquid microextraction of phenols | |
| CN109613158B (zh) | 基于超高效合相色谱同时检测双酚a和邻苯二甲酸酯类物质的方法 | |
| CN114213486A (zh) | 一种西兰花中烟酰胺单核苷酸的提取纯化方法 | |
| Guo et al. | Temperature-controlled ionic liquid dispersive liquid phase microextraction combined with ultra-high-pressure liquid chromatography for the rapid determination of triclosan, triclocarban and methyl-triclosan in aqueous samples | |
| CN115015360A (zh) | 一种测定烟酰胺单核苷酸含量的方法 | |
| Wang et al. | A separation and quantification method of levoglucosan in biomass pyrolysis | |
| CN107255680B (zh) | 同时快速检测土壤中多种有机磷酸酯阻燃剂方法 | |
| Liu et al. | Novel polymer monolith microextraction using a poly-(methyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate) monolith and its application to the determination of polychlorinated biphenyls in water samples | |
| CN103123345A (zh) | 一种快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法 | |
| UETA et al. | Super absorbent polymer for water removing process followed by a needle-type extraction to the effective collection of methanol in water samples | |
| Zhang et al. | Extraction and separation of triazine herbicides in soybean by ionic liquid foam-based solvent flotation and high performance liquid chromatography determination | |
| CN112505190B (zh) | 一种土壤中丙烯酸的检测方法 | |
| CN105181830B (zh) | 一种gc‑ms/ms测定水果和蔬菜中二溴氯丙烷残留的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |