CN112457261B - 铁皮石斛叶生物碱的制备方法及其应用 - Google Patents

铁皮石斛叶生物碱的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供铁皮石斛叶生物碱的制备方法与其在铁皮石斛叶的质量控制中的应用。本发明的制备方法包括将铁皮石斛叶经乙醇提取的粗提物，通过石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇萃取，然后将二氯甲烷萃取部位经硅胶、凝胶柱层析，以及高效液相色谱制备，得到川芎哚、β‑咔啉、1‑羟甲基‑β‑咔啉、1‑(β‑咔啉‑1‑基)‑3,4,5‑三羟基‑1‑戊酮和4‑(6‑甲基吡嗪‑2‑基)‑1,2,3‑丁三醇。本发明填补了铁皮石斛叶生物碱研究方面的空白，本发明的方法首次从铁皮石斛叶中分离、鉴定出咔啉类生物碱和吡嗪类生物碱。方法简单实用，操作性强，溶剂使用环保。并可以利用这五个生物碱作为标准品，评判铁皮石斛叶质量。

Description

铁皮石斛叶生物碱的制备方法及其应用
技术领域：
本发明属于医药和食品技术领域，尤其涉及铁皮石斛叶生物碱成分的制备与其在铁皮石斛叶质量控制中的应用。
背景技术：
据2020版《中华人民共和国药典》记载，兰科植物铁皮石斛Dendrobiumofficinale Kimura et Migo的干燥茎，具有益胃生津、滋阴清热的功能；用于治疗热病津伤、口干烦渴、胃阴不足、食少干呕、病后虚热不退、阴虚火旺、骨蒸劳热、目暗不明、筋骨痿软等病症。铁皮石斛叶，则被作为地方特色食品在利用，如浙江省卫生健康委员会于2020年6月11日发布了浙江省食品安全地方标准《干制铁皮石斛叶》(DB33/3012-2020)(https://mp.weixin.qq.com/s/-qzRMnAjPF4t1j6Nocuaxg)；贵州省卫生健康委员会于2020年7月17日发布了《铁皮石斛叶(干叶)》食品安全地方标准(http://www.gzhfpc.gov.cn/xwzx_500663/zwyw/202007/t20200724_61712723.html)。
铁皮石斛叶主要含有多糖、黄酮、联苄、甾体等类型化学成分[文献1,张春花；徐巧林；曾雷；王颂；罗青文；陈颖乐.铁皮石斛叶的化学成分研究.林业与环境科学,2020,36(3),30-34.文献2,唐靖雯；卢礼平；王欢；梁斌；潘梅.铁皮石斛叶的研究进展.中国民族民间医药,2020,29(7),63-67.文献3,任刚；陈优婷；叶金宝；钟国跃；肖川云；邓文赞；陈云龙.铁皮石斛叶的化学成分研究.中草药,2020,51(14),3637-3644.文献4,Ren,G.；Deng,W.-Z.；Xie,Y.-F.；Wu,C.-H.；Li,W.-Y.；Xiao,C.-Y.；Chen,Y.-L.Bibenzyl derivatives fromleaves of Dendrobium officinale.Natural Product Communications,2020,15(2),1-5]。
到目前为止，尚没有系统地研究铁皮石斛叶生物碱类成分的报道，这对于铁皮石斛叶的质量控制，以及提升铁皮石斛叶质量标准来说，是一个缺陷。
发明内容：
针对铁皮石斛叶研究上存在的空白，发明人系统地研究了铁皮石斛叶中的生物碱类成分，首次从铁皮石斛叶中分离、鉴定出咔啉类生物碱和吡嗪类生物碱。本发明旨在提供铁皮石斛叶生物碱的制备方法及其在铁皮石斛叶质量控制中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
铁皮石斛叶生物碱的制备方法，该方法包括将铁皮石斛叶经90～95％乙醇提取，回收溶剂，得到粗提物，粗提物分别通过石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇萃取，分别得石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇萃取部位，二氯甲烷萃取部位经硅胶柱层析用石油醚-丙酮，二氯甲烷-甲醇，以及甲醇洗脱，得到Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F和Fr.G等七个部分，其中Fr.B经反相硅胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，得到Fr.B1、Fr.B2、Fr.B3、Fr.B4和Fr.B5等五个部分；Fr.B2经凝胶柱层析用甲醇洗脱，用半制备高效液相色谱纯化得到川芎哚和β-咔啉；Fr.C经反相硅胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，再用半制备高效液相色谱纯化后得到1-羟甲基-β-咔啉；Fr.D经反相硅胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，再用半制备高效液相色谱纯化得到1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮；Fr.E经反相硅胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，经LH-20凝胶柱层析用甲醇洗脱，再用半制备高效液相色谱纯化后得到4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇。
铁皮石斛叶生物碱的制备方法，该方法包括下述步骤：
将铁皮石斛叶用90～95％乙醇提取，回收溶剂，得到粗提物，粗提物加入水水制备成混悬液，加入石油醚萃取，重复8次；萃取后的水相用6M盐酸调节pH值为2～3，用乙酸乙酯萃取，重复5次；萃取后的水相用50％氢氧化钠水溶液调节pH值为9～10，用二氯甲烷萃取，重复5次；萃取后的水相用6M盐酸调节pH值至7左右，用正丁醇萃取，重复5次，回收溶剂后，分别得到石油醚萃取部位，乙酸乙酯萃取部位，二氯甲烷萃取总生物碱部位，以及正丁醇萃取部位；
二氯甲烷萃取部位经硅胶柱层析用石油醚-丙酮(5:1，3:1，1:1)，二氯甲烷-甲醇(1:1)，以及甲醇洗脱，得到Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F和Fr.G等七个部分；
Fr.B(石油醚-丙酮5:1洗脱部分)经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水(30:70→100:0)梯度洗脱，得到Fr.B1、Fr.B2、Fr.B3、Fr.B4和Fr.B5等五个部分；
Fr.B2(30～50％甲醇洗脱部分)经LH-20凝胶柱层析用甲醇洗脱，用半制备高效液相色谱纯化得到川芎哚和β-咔啉；
Fr.C(石油醚-丙酮3:1洗脱部分)经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水(10:90→100:0)梯度洗脱，得到Fr.C1、Fr.C2、Fr.C3、Fr.C4、Fr.C5和Fr.C6等六个部分，Fr.C3(20～30％甲醇洗脱部分)用半制备高效液相色谱纯化后得到1-羟甲基-β-咔啉；
Fr.D(石油醚-丙酮1:1洗脱部分)经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水(5:95→100:0)梯度洗脱，得到Fr.D1、Fr.D2、Fr.D3、Fr.D4、Fr.D5和Fr.D6等六个部分。Fr.D4(30～40％甲醇洗脱部分)用半制备高效液相色谱纯化得到1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮；
Fr.E(石油醚-丙酮1:1洗脱部分)经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水(5:95→100:0)梯度洗脱，得到Fr.E1、Fr.E2、Fr.E3、Fr.E4、Fr.E5、Fr.E6和Fr.E7等七个部分，Fr.E1(5％甲醇洗脱部分)经LH-20凝胶柱层析用甲醇洗脱，再用半制备高效液相色谱纯化后得到4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇。
如所述的铁皮石斛叶生物碱的制备方法，其特征在于所述的半制备高效液相色谱使用的仪器是安捷伦1260Infinity II液相色谱仪。
如所述的铁皮石斛叶生物碱的制备方法，其中制备川芎哚和β-咔啉所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱，大小为9.4×250mm，洗脱剂为甲醇-水(比例60:40)，流速2mL/min，保留时间分别为25.600min和21.260min。
如所述的铁皮石斛叶生物碱的制备方法，其中制备1-羟甲基-β-咔啉所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱，大小为9.4×250mm，洗脱剂为乙腈-水(30:70)，流速2mL/min，保留时间为17.070min。
如所述的铁皮石斛叶生物碱的制备方法，其中制备1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱，色谱柱大小为9.4×250mm，洗脱剂为甲醇-水(55:45)，流速2mL/min，保留时间为14.513min。
如所述的铁皮石斛叶生物碱的制备方法，其中制备4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-AQ柱，色谱柱大小为4.6×250mm，洗脱剂为甲醇-水(5:95)，流速1mL/min，保留时间为38.411min。
如所述的铁皮石斛叶生物碱的制备方法，其中所述的铁皮石斛叶生物碱为咔啉类生物碱和吡嗪类生物碱。
本发明同时还提供了铁皮石斛叶生物碱在铁皮石斛叶质量控制中的应用。取川芎哚(perlolyrine)、β-咔啉(β-carboline)、1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮[1-(β-carbolin-1-yl)-3,4,5-trihydroxy-1-pentanone]、1-羟甲基-β-咔啉(1-hydroxymethyl-β-carboline)和4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇[4-(6-methylpyrazin-2-yl)butane-1,2,3-triol]各1～5mg，用甲醇、乙腈和(或)水1～1000mL稀释后，作为标准品，采用高效液相色谱外标法，测定铁皮石斛叶中这五个生物碱的含量，根据含量变化，评判铁皮石斛叶质量。
本发明另外提供了铁皮石斛叶的二氯甲烷萃取总生物碱部位，该部位是由下述方法制备而得的：将铁皮石斛叶用90～95％乙醇提取，回收溶剂，得到粗提物，粗提物加入水水制备成混悬液，萃取后的水相用50％氢氧化钠水溶液调节pH值为9～10，用二氯甲烷萃取，重复5次，回收溶剂后，得到二氯甲烷萃取总生物碱部位；进一步将二氯甲烷萃取总生物碱部位经硅胶、凝胶柱层析，以及高效液相色谱制备，得到萃取物中的标记物生物碱川芎哚、β-咔啉、1-羟甲基-β-咔啉、1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮和4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇，该五种生物碱在二氯甲烷萃取总生物碱部位物中的含量不低于0.5％。
此外，提供了铁皮石斛叶二氯甲烷萃取总生物碱部位在铁皮石斛叶质量控制中的应用，所述的质量控制采用：取二氯甲烷萃取总生物碱部位中的标志物川芎哚、β-咔啉、1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮、1-羟甲基-β-咔啉和4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇各1～5mg，用甲醇、乙腈和(或)水1～1000mL稀释后，作为标准品，采用高效液相色谱外标法，测定铁皮石斛叶中这五个生物碱的含量，根据含量变化，评判铁皮石斛叶质量。
与现有相关技术相比，本发明具备如下的优益性：
1.本发明填补了铁皮石斛叶生物碱研究方面的空白，本发明的方法首次从铁皮石斛叶中分离、鉴定出咔啉类生物碱和吡嗪类生物碱。
2.本发明的方法简单实用，操作性强，常规植物化学实验室所具备的材料和仪器即可满足制备方法的需求。
3.本发明的方法使用的溶剂环保。例如，本发明采用二氯甲烷萃取生物碱，和通常使用氯仿萃取的方法相比，二氯甲烷毒性比氯仿低。
附图说明：
图1为本发明铁皮石斛叶生物碱成分的化学结构式。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
铁皮石斛叶的二氯甲烷萃取总生物碱部位以及铁皮石斛叶中生物碱成分川芎哚(perlolyrine)、β-咔啉(β-carboline)、1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮[1-(β-carbolin-1-yl)-3,4,5-trihydroxy-1-pentanone]、1-羟甲基-β-咔啉(1-hydroxymethyl-β-carboline)和4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇[4-(6-methylpyrazin-2-yl)butane-1,2,3-triol]的提取、分离：
铁皮石斛叶9.0kg，90～95％乙醇提取，回收溶剂，得到粗提物(浸膏)2.3kg。粗提物加入1L水制备成混悬液，加入3L石油醚萃取，重复8次；萃取后的水相用6M盐酸调节pH值为2～3，用3L乙酸乙酯萃取，重复5次；萃取后的水相用50％氢氧化钠水溶液调节pH值为9～10，用2L二氯甲烷萃取，重复5次；萃取后的水相用6M盐酸调节pH值至7左右，用2L正丁醇萃取，重复5次。回收溶剂后，分别得到石油醚萃取部位520.0g，乙酸乙酯萃取部位156.0g，二氯甲烷萃取部位(铁皮石斛叶的二氯甲烷萃取总生物碱部位)5.9g，以及正丁醇萃取部位85.6g。
二氯甲烷萃取部位经硅胶柱层析用石油醚-丙酮(5:1，3:1，1:1)，二氯甲烷-甲醇(1:1)，以及甲醇洗脱，得到Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F和Fr.G等七个部分。
(1)Fr.B(石油醚-丙酮5:1洗脱部分，815.5mg)经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水(30:70→100:0)梯度洗脱，得到Fr.B1、Fr.B2、Fr.B3、Fr.B4和Fr.B5等五个部分。
(2)Fr.B2(30～50％甲醇洗脱部分)经LH-20凝胶柱层析用甲醇洗脱，用半制备高效液相色谱纯化得到川芎哚(perlolyrine，23.4mg)和β-咔啉(β-carboline，3.8mg)。
(3)Fr.C(石油醚-丙酮3:1洗脱部分，502.9mg)经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水(10:90→100:0)梯度洗脱，得到Fr.C1、Fr.C2、Fr.C3、Fr.C4、Fr.C5和Fr.C6等六个部分。Fr.C3(20～30％甲醇洗脱部分)用半制备高效液相色谱纯化后得到1-羟甲基-β-咔啉(1-hydroxymethyl-β-carboline，1.9mg)。
(4)Fr.D(石油醚-丙酮1:1洗脱部分，223.3mg)经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水(5:95→100:0)梯度洗脱，得到Fr.D1、Fr.D2、Fr.D3、Fr.D4、Fr.D5和Fr.D6等六个部分。Fr.D4(30～40％甲醇洗脱部分)用半制备高效液相色谱纯化得到1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮[1-(β-carbolin-1-yl)-3,4,5-trihydroxy-1-pentanone，15.4mg]。
(5)Fr.E(石油醚-丙酮1:1洗脱部分，1.1g)经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水(5:95→100:0)梯度洗脱，得到Fr.E1、Fr.E2、Fr.E3、Fr.E4、Fr.E5、Fr.E6和Fr.E7等七个部分。Fr.E1(5％甲醇洗脱部分)经LH-20凝胶柱层析用甲醇洗脱，再用半制备高效液相色谱纯化后得到4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇[4-(6-methylpyrazin-2-yl)butane-1,2,3-triol，2.2mg]。
上面所述的半制备高效液相色谱使用的仪器是安捷伦1260Infinity II液相色谱仪。
制备川芎哚和β-咔啉所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱，大小为9.4×250mm，洗脱剂为甲醇-水(比例60:40)，流速2mL/min，保留时间分别为25.600min和21.260min。
制备1-羟甲基-β-咔啉所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱，大小为9.4×250mm，洗脱剂为乙腈-水(30:70)，流速2mL/min，保留时间为17.070min。
制备1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱，色谱柱大小为9.4×250mm，洗脱剂为甲醇-水(55:45)，流速2mL/min，保留时间为14.513min。
制备4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-AQ柱，色谱柱大小为4.6×250mm，洗脱剂为甲醇-水(5:95)，流速1mL/min，保留时间为38.411min。
实施例2：
铁皮石斛叶生物碱成分的波谱数据。
川芎哚(perlolyrine)，浅黄色针状晶体(甲醇)，分子式C16H12N2O2，CAS登记号29700-20-7。1H NMR(pyridine-d5,500MHz)δ:12.06(1H,s,NH),8.67(1H,d,J＝5.1Hz,H-3),8.26(1H,d,J＝8.0Hz,H-5),8.03(1H,d,J＝5.1Hz,H-4),7.57(1H,overlapped,H-8),7.51(1H,m,H-7),7.31(1H,m,H-6),7.19(1H,overlapped,H-2′),6.67(1H,br d,J＝3.3Hz,H-3′),4.70(2H,s,H-5′)。13C NMR(pyridine-d5,126MHz)δ:157.7(C,C-1′),154.2(C,C-4′),141.9(C,C-8a),138.9(CH,C-3),134.5(C,C-1),131.8(C,C-9a),130.4(C,C-4a),128.5(CH,C-7),121.8(CH,C-5),121.7(C,C-4b),120.0(CH,C-6),113.7(CH,C-4),112.6(CH,C-8),110.1(CH,C-2′),109.4(CH,C-3′),57.0(CH2,C-5′)。ESIMS m/z 287[M+Na]+,551[2M+Na]+。其核磁共振波谱数据跟文献[Dassonneville,B.；Witulski,B.；Detert,H.[2+2+2]Cycloadditions of alkynylynamides–A total synthesis of perlolyrine and thefirst total synthesis of“isoperlolyrine”.European Journal of OrganicChemistry,2011,2011(15),2836-2844]中的数据一致。
β-咔啉(β-carboline)，白色固体，分子式C11H8N2，CAS登记号244-63-3。1H NMR(MeOH-d4,600MHz)δ:8.80(1H,s,H-1),8.29(1H,d,J＝5.1Hz,H-3),8.19(1H,br d,J＝8.1Hz,H-5),8.10(1H,d,J＝5.1Hz,H-4),7.57(2H,m,H-7,H-8),7.27(1H,m,H-6)。13C NMR(MeOH-d4,151MHz,)δ:142.8(C,C-8a),138.4(CH,C-3),137.8(C,C-9a),134.1(CH,C-1),130.5(C,C-4a),129.8(CH,C-7),122.7(CH,C-5),122.2(C,C-4b),120.9(CH,C-6),116.1(CH,C-4),112.8(CH,C-8)。ESIMS m/z 169[M+H]+。其核磁共振波谱数据跟文献[杨泊涛；刘录；张敉；刘亚平；李宝才；秦徐杰.景东山橙根中生物碱成分研究.天然产物研究与开发,2016,28(6),868-873,954]中的数据一致。
1-羟甲基-β-咔啉(1-hydroxymethyl-β-carboline)，浅黄色固体，分子式C12H10N2O，CAS登记号17337-22-3。1H NMR(pyridine-d5,600MHz)δ:12.43(1H,s,NH),8.60(1H,d,J＝5.2Hz,H-3),8.29(1H,d,J＝8.0Hz,H-5),8.06(1H,d,J＝5.2Hz,H-4),7.72(1H,d,J＝8.0Hz,H-8),7.58(1H,m,H-7),7.33(1H,m,H-6),5.54(2H,s,H2-1′)。13C NMR(pyridine-d5,151MHz)δ:146.6(C,C-1),142.2(C,C-8a),138.4(CH,C-3),135.3(C-9a),129.7(C,C-4a),128.9(CH,C-7),122.5(CH,C-5),122.4(C,C-4b),120.2(CH,C-6),114.5(CH,C-4),112.9(CH,C-8),65.6(CH2,C-1′)。ESIMS m/z 199[M+H]+,221[M+Na]+,419[2M+Na]+。该化合物的结构得到二维核磁共振波谱的确认。其核磁共振波谱数据跟文献[Szabó,T.；Hazai,V.；Volk,B.；Simig,G.；Milen,M.First total synthesis of theβ-carbolinealkaloids trigonostemine A,trigonostemine B and a new synthesis ofpityriacitrin and hyrtiosulawesine.Tetrahedron Letters,2019,60(22),1471-1475]中用DMSO-d6测试的数据接近。
1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮[1-(β-carbolin-1-yl)-3,4,5-trihydroxy-1-pentanone]，浅黄色片状结晶(甲醇)，分子式C16H16N2O4，CAS登记号180995-40-8。[α]25 D–14(c 0.3,MeOH)。1H NMR(MeOH-d4,500MHz)δ:8.46(1H,d,J＝5.0Hz,H-3),8.29(1H,d,J＝5.0Hz,H-4),8.21(1H,brd,J＝7.9Hz,H-5),7.70(1H,brd,J＝8.2Hz,H-8),7.59(1H,m,H-7),7.31(1H,m,H-6),4.35(1H,m,H-3′),3.83(1H,m,H-5′a),3.60-3.69(4H,m,H2-2′,H-4′,H-5′b)。13C NMR(MeOH-d4,126MHz)δ:203.6(C,C-1′),143.4(C,C-8a),138.5(CH,C-3),137.3(C,C-1),136.3(C,C-9a),133.3(C,C-4a),130.3(CH,C-7),122.7(CH,C-5),121.6(C,C-4b),121.6(CH,C-6),120.1(CH,C-4),113.4(CH,C-8),76.2(CH,C-4′),70.3(CH,C-3′),64.7(CH2,C-5′),43.1(CH2,C-2′)。ESIMS m/z 323[M+Na]+,623[2M+Na]+。其核磁共振波谱数据跟文献[Aimi,N.；Kitajima,M.；Oya,N.；Nitta,W.；Takayama,H.；Sakai,S.-i.；Kostenyuk,I.；Gleba,Y.；Endreb,S.；
Figure BDA0002832591130000071
J.Isolation of alkaloids fromcultured hybrid cells of Rauwolfia serpentina×Rhazya stricta.Chemical andPharmaceutical Bulletin,1996,44(8),1637-1639]中的数据一致。
4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇[4-(6-methylpyrazin-2-yl)butane-1,2,3-triol]，白色固体，分子式C9H14N2O3，CAS登记号1016610-63-1。1H NMR(MeOH-d4,600MHz)δ:8.35(1H,s,H-3′),8.34(1H,s,H-5′),3.95(1H,m,H-3),3.77(1H,dd,J＝11.3,3.8Hz,H-1a),3.62(1H,dd,J＝11.3,6.4Hz,H-1b),3.54(1H,m,H-2),3.18(1H,dd,J＝14.0,3.0Hz,H-4a),2.87(1H,dd,J＝14.0,9.5Hz,H-4b),2.54(3H,s,6′-Me)。13C NMR(MeOH-d4,151MHz)δ:156.2(C,C-2′),154.7(C,C-6′),143.4(CH,C-3′),142.7(CH,C-5′),76.2(CH,C-2),73.0(CH,C-3),64.6(CH2,C-1),39.7(CH2,C-4),21.3(CH3,6′-Me)。ESIMS m/z 221[M+Na]+。该化合物的结构得到二维核磁共振波谱的确认。其核磁共振波谱数据跟文献[李占林；李丹毅；李铣；李宁；孟大利.文冠果果壳中一个新生物碱.药学学报,2006,41(12),1197-1200]中用DMSO-d6测试的数据接近。
实施例3：
取川芎哚(perlolyrine)、β-咔啉(β-carboline)、1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮[1-(β-carbolin-1-yl)-3,4,5-trihydroxy-1-pentanone]、1-羟甲基-β-咔啉(1-hydroxymethyl-β-carboline)和(或)4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇[4-(6-methylpyrazin-2-yl)butane-1,2,3-triol]各1～5mg，用甲醇、乙腈和(或)水1～1000mL稀释后，作为标准品，采用高效液相色谱外标法，测定铁皮石斛叶中这五个生物碱的含量，根据含量变化，评判铁皮石斛叶质量。

Claims (7)

1.铁皮石斛叶生物碱的制备方法，该方法包括将铁皮石斛叶经90~95%乙醇提取，回收溶剂，得到粗提物，粗提物分别通过石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇萃取，分别得石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇萃取部位，其中二氯甲烷萃取部位经硅胶柱层析用石油醚-丙酮，二氯甲烷-甲醇，以及甲醇洗脱，得到Fr. A、Fr. B、Fr. C、Fr. D、Fr. E、Fr. F和Fr.G七个部分，其中Fr. B经反相硅胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，得到Fr. B1、Fr. B2、Fr. B3、Fr. B4和Fr. B5五个部分；Fr. B2经凝胶柱层析用甲醇洗脱，用半制备高效液相色谱纯化得到川芎哚和β-咔啉；Fr. C经反相硅胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，再用半制备高效液相色谱纯化后得到1-羟甲基-β-咔啉；Fr. D经反相硅胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，再用半制备高效液相色谱纯化得到1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮；Fr. E经反相硅胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，经LH-20凝胶柱层析用甲醇洗脱，再用半制备高效液相色谱纯化后得到4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇。
2.铁皮石斛叶生物碱的制备方法，该方法包括下述步骤：
将铁皮石斛叶用90~95%乙醇提取，回收溶剂，得到粗提物，粗提物加入水水制备成混悬液，加入石油醚萃取，重复8次；萃取后的水相用6 M盐酸调节pH值为2~3，用乙酸乙酯萃取，重复5次；萃取后的水相用50%氢氧化钠水溶液调节pH值为9~10，用二氯甲烷萃取，重复5次；萃取后的水相用6 M盐酸调节pH值至7左右，用正丁醇萃取，重复5次，回收溶剂后，分别得到石油醚萃取部位，乙酸乙酯萃取部位，二氯甲烷萃取总生物碱部位，以及正丁醇萃取部位；
二氯甲烷萃取部位经硅胶柱层析用石油醚-丙酮（5:1，3:1，1:1），二氯甲烷-甲醇（1:1），以及甲醇洗脱，得到Fr. A、Fr. B、Fr. C、Fr. D、Fr. E、Fr. F和Fr. G七个部分；
Fr. B（石油醚-丙酮5:1洗脱部分）经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水（30:70→100:0）梯度洗脱，得到Fr. B1、Fr. B2、Fr. B3、Fr. B4和Fr. B5五个部分；
Fr. B2（30~50%甲醇洗脱部分）经LH-20凝胶柱层析用甲醇洗脱，用半制备高效液相色谱纯化得到川芎哚和β-咔啉；
Fr. C（石油醚-丙酮3:1洗脱部分）经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水（10:90→100:0）梯度洗脱，得到Fr. C1、Fr. C2、Fr. C3、Fr. C4、Fr. C5和Fr. C6等六个部分，Fr. C3（20~30%甲醇洗脱部分）用半制备高效液相色谱纯化后得到1-羟甲基-β-咔啉；
Fr. D（石油醚-丙酮1:1洗脱部分）经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水（5:95→100:0）梯度洗脱，得到Fr. D1、Fr. D2、Fr. D3、Fr. D4、Fr. D5和Fr. D6六个部分；其中Fr. D4（30~40%甲醇洗脱部分）用半制备高效液相色谱纯化得到1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮；
Fr. E（石油醚-丙酮1:1洗脱部分）经C18反相硅胶柱层析，甲醇-水（5:95→100:0）梯度洗脱，得到Fr. E1、Fr. E2、Fr. E3、Fr. E4、Fr. E5、Fr. E6和Fr. E7七个部分，Fr. E1（5%甲醇洗脱部分）经LH-20凝胶柱层析用甲醇洗脱，再用半制备高效液相色谱纯化后得到4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇。
3.如权利要求1或2所述的铁皮石斛叶生物碱的制备方法，其特征在于所述的半制备高效液相色谱使用的仪器是安捷伦1260 Infinity II液相色谱仪。
4.如权利要求1或2所述的铁皮石斛叶生物碱的制备方法，其特征在于所述的制备川芎哚和β-咔啉所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱，大小为9.4 × 250 mm，洗脱剂为甲醇-水（比例60:40），流速2 mL/min，保留时间分别为25.600 min和21.260 min。
5.如权利要求1或2所述的铁皮石斛叶生物碱的制备方法，其特征在于所述的制备1-羟甲基-β-咔啉所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱，大小为9.4 × 250 mm，洗脱剂为乙腈-水（30:70），流速2 mL/min，保留时间为17.070 min。
6.如权利要求1或2所述的铁皮石斛叶生物碱的制备方法，其特征在于所述的制备1-(β-咔啉-1-基)-3,4,5-三羟基-1-戊酮所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱，色谱柱大小为9.4 × 250 mm，洗脱剂为甲醇-水（55:45），流速2 mL/min，保留时间为14.513 min。
7.如权利要求1或2所述的铁皮石斛叶生物碱的制备方法，其特征在于所述的制备4-(6-甲基吡嗪-2-基)-1,2,3-丁三醇所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-AQ柱，色谱柱大小为4.6 × 250 mm，洗脱剂为甲醇-水（5:95），流速1 mL/min，保留时间为38.411 min。
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