CN107556346B - 一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物及其制备方法和应用。一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物，包括Lathyrane类型二萜laurifolioside A、2‑epi‑laurifolioside A、Lathyrane类型二萜laurifolioside B、2‑epi‑laurifolioside B四种物质及其药学上可接受的载体。本发明抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物的应用，作为药物活性成分用于制备抗乙型肝炎病毒药物和乙型肝炎病毒药物。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
据有关统计显示，全世界大约有3亿多人为慢性乙肝病毒(HBV)携带者，我国约占半数。乙肝病毒感染已成为全球性的影响人类健康的主要疾病之一，由于HBV感染可以导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，因此成为影响人类寿命的九大疾病之一。由于慢性HBV感染者较非携带者发生肝癌的相对危险率为217，因此在全世界每年大约有200万人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我国是乙型肝炎的高发区，每年约有25万人死于与乙肝相关的慢性肝病(肝硬化与肝癌)。上述疾病给人民健康和国民经济带来巨大损失。因此，寻求高效低毒的抗HBV药物已成为刻不容缓的问题。
黄芫花为瑞香科荛花属植物河朔荛花(Wikstroemia chamaedaphne Meissn)的花蕾，花小，黄色，数朵排成顶生伞形聚伞花序，带数个再集合成圆锥花序，花蕾粉末为黄绿色，主产于山西新绛。黄芫花性温味辛，有小毒，在山西、甘肃等省用黄芫花入药主治泻下逐水，通便，用于水肿胀满，痰饮积聚，咳逆喘满，急、慢性传染性肝炎，精神分裂症，癫痫等。临床研究表明，黄芫花叶子水提物有明显镇静作用，河朔荛花能使兴奋性病人安静，抑郁性病人情绪活跃，忧虑性病人有所缓解。我国传统用药中，河朔荛花作为抗早孕药物使用可使孕酮水平、血清绒毛膜促性腺激素水平降低，效果与前列腺素、米非司酮相当。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物，包括Lathyrane类型二萜laurifolioside A(1)、2-epi-laurifolioside A(2)、Lathyrane类型二萜laurifoliosideB(3)、2-epi-laurifolioside B(4)四种物质及其药学上可接受的载体，其中Lathyrane类型二萜laurifolioside A(1)、2-epi-laurifolioside A(2)、Lathyrane类型二萜laurifolioside B(3)、2-epi-laurifolioside B(4)四种物质的结构式为：
本发明抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取黄芫花花蕾，干燥，用10倍量的甲醇或者乙醇回流提取两次，每次3h，滤过，合并提取液，减压浓缩得到浸膏；
(2)取步骤(1)的浸膏，加入3-5倍量水，依次用石油醚，乙酸乙酯萃取3次，萃取液回收溶剂，减压浓缩得各萃取物；
(3)取乙酸乙酯萃取物经正相硅胶柱色谱，用1:1—1:2的石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，按照洗脱时间依次得到3个组分A1、A2和A3；
(4)组分A3经硅胶柱色谱分离，采用5:1—1:9乙酸乙酯：甲醇洗脱，按照洗脱时间依次得到A31-A33三个组分A31、A32和A33；
(5)组分A33经Sephadex LH-20柱色谱分离，按照洗脱时间依次得到3个组分A331、A332和A333，组分A332组分经半制备高效液相色谱分离用45％甲醇—55％水得到Lathyrane类型二萜laurifolioside B和2-epi-laurifolioside B；
(6)组分A333经过多次Sephadex LH-20柱色谱分离，纯甲醇进行洗脱，再经半制备高效液相色谱用40％甲醇—60％水分离得到化合物Lathyrane类型二萜laurifolioside A和2-epi-laurifolioside A。
本发明抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物的应用，作为药物活性成分用于制备抗乙型肝炎病毒药物和乙型肝炎病毒药物。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或以药学上可接受的载体或赋形剂以及药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1—99％，优选为0.5—90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。苔黑酚-1-氧-β-D-葡萄糖吡喃苷、苔黑酚及其衍生物的组合物采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型、如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行抗乙肝病毒的治疗。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面将用实施例进一步详细说明本发明，但不以此实施例来限定本发明。
实施例1
一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物，包括Lathyrane类型二萜laurifolioside A(1)、2-epi-laurifolioside A(2)、Lathyrane类型二萜laurifoliosideB(3)、2-epi-laurifolioside B(4)四种物质及其药学上可接受的载体，其中Lathyrane类型二萜laurifolioside A(1)、2-epi-laurifolioside A(2)、Lathyrane类型二萜laurifolioside B(3)、2-epi-laurifolioside B(4)四种物质的结构式为：
Lathyrane类型二萜laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、Lathyrane类型二萜laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B四种物质的制备方法及表征如下：
(1)取黄芫花花蕾，干燥，用10倍量的甲醇或者乙醇回流提取两次，每次3h，滤过，合并提取液，减压浓缩得到浸膏；
(2)取步骤(1)的浸膏，加入3-5倍量水，依次用石油醚，乙酸乙酯萃取3次，萃取液回收溶剂，减压浓缩得各萃取物；
(3)取乙酸乙酯萃取物经正相硅胶柱色谱，用1:1—1:2的石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，按照洗脱时间依次得到3个组分A1、A2和A3；
(4)组分A3经硅胶柱色谱分离，采用5:1—1:9乙酸乙酯：甲醇洗脱，按照洗脱时间依次得到A31-A33三个组分A31、A32和A33；
(5)组分A33经Sephadex LH-20柱色谱分离，按照洗脱时间依次得到3个组分A331、A332和A333，组分A332组分经半制备高效液相色谱分离用45％甲醇—55％水依次得到Lathyrane类型二萜laurifolioside B和2-epi-laurifolioside B；
(6)组分A333经过多次Sephadex LH-20柱色谱分离，纯甲醇进行洗脱，再经半制备高效液相色谱用40％甲醇—60％水分离依次得到化合物Lathyrane类型二萜laurifolioside A和2-epi-laurifolioside A。
化合物laurifolioside A：淡黄色无定形粉末，5％浓硫酸-乙醇显棕色，[α]D 20+14.4(c＝0.17,MeOH)，IR(KBr)νmax：3485,2985,2950,1651,1460,1365,1255,1180,754,684cm-1，HR-ESI-MSm/z515.2246[M+Na]+(计算值为515.2256)；1H和13C NMR数据，见下表2和3。
化合物2-epi-laurifolioside A：淡黄色无定形粉末，5％浓硫酸-乙醇显棕色，[α]D 20+17.6(c＝0.10,MeOH)，IR(KBr)νmax：3485,2985,2950,1651,1460,1365,1255,1180,754,684cm-1；HR-ESI-MS m/z515.2246[M+Na]+(计算值为515.2256)，1H和13C NMR数据，见下表2和3。
化合物laurifolioside B：淡黄色色无定形粉末，5％浓硫酸-乙醇显棕色，[α]D 20+26.5(c＝0.19,MeOH)，IR(KBr)νmax：3485,2985,2950,1651,1365,1180,684cm-1；HR-ESI-MSm/z517.2195[M+Na]+(计算值为517.2166)，1H和13C NMR数据，见下表2和3。
化合物2-epi-laurifolioside B：淡黄色无定形粉末，5％浓硫酸-乙醇显棕色，[α]D 20+28.3(c＝0.24,MeOH)，IR(KBr)νmax：3485,2985,2950,1651,1365,1180,684cm-1；HR-ESI-MSm/z517.2195[M+Na]+(计算值为517.2166)，1H和13C NMR数据，见下表1和2。
表1，化合物laurifoliosides A-D的1H-NMR数据(600MHz)
表2，化合物laurifoliosides A-D的13C-NMR数据(150MHz)
实施例2
laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B对HBsAg，HBeAg分泌和对HepG2.2.15细胞的药物毒性实验。
化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B的细胞毒性测定：
HepG2.2.15细胞经消化，制备成2×105/mL的细胞悬液，以100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，经48小时培养后，加入倍比稀释的不同浓度样品液，继续培养9天(每3天换液一次)，用MTT法检测细胞存活率，确定样品对细胞生长的影响，计算TC50，并确定细胞活性≥90％的样品浓度用于进一步检测抗HBV活性。
MTT法检测步骤:细胞经实验培养后，弃去培养板中培养液，在每孔培养孔中加入新培养液95μL和5mg/mL的MTT溶液5μL，摇匀，置37℃培养3-4小时，可见孔内有蓝紫色结晶形成，小心吸去板内的溶液，加入DMSO100μL/孔，震荡，使结晶充分溶解，在酶标仪上测定光吸收值，测定波长为490nm。
化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B抑制HBsAg和HBeAg分泌活性的测定：
HepG2.2.15细胞经消化，制备成2×105/mL的细胞悬液，以100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，培养48小时后，加入系列浓度的样品液(细胞活性≥90％时的样品浓度)，同时设不加样品的空白对照，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液，采用上海实业科华生物技术公司的HBsAg和HBeAg ELISA诊断试剂盒，按试剂盒说明书进行操作，检测HepG2.2.15细胞上清中的HBsAg和HBeAg水平，计算样品对HBV抗原的抑制率并对抑制率≥50％的样品计算IC50和治疗指数(TI＝TC50/IC50)。阳性对照为拉米呋啶(3TC)。
结果，实验结果见表3.
表3，化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B在HepG2.2.15细胞对HBV抑制活性和细胞毒性
结论：化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B能有效抑制HBV-DNA的产生，抑制率在2.3％到30.％之间，阳性对照药拉米呋啶的抑制率为34.8％。
实施例3
按实施例1的方法先制得化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B，用少量的DMSO溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例4
按实施例1的方法先制得化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B，用少量的DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例5
将实施例1所分离得到的化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B，分别按其与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
实施例6
按实施例1的方法先制得化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B，分别按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例7
按实施例1的方法先制得化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B，分别按常规口服液制法制成口服液。
实施例8
按实施例1的方法先制得化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
实施例9
按实施例1的方法先制得化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
实施例10
按实施例1的方法先制得化合物laurifolioside A、2-epi-laurifolioside A、laurifolioside B、2-epi-laurifolioside B，分别按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
Claims (5)
1.一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物，其特征是包括Lathyrane类型二萜laurifolioside A(1)、2-epi-laurifolioside A(2)、Lathyrane类型二萜laurifoliosideB(3)、2-epi-laurifolioside B(4)四种物质及其药学上可接受的载体，其中Lathyrane类型二萜laurifolioside A(1)、2-epi-laurifolioside A(2)、Lathyrane类型二萜laurifolioside B(3)、2-epi-laurifolioside B(4)四种物质的结构式为：
2.权利要求1所述的一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)取黄芫花花蕾，干燥，用10倍量的甲醇或者乙醇回流提取两次，每次3h，滤过，合并提取液，减压浓缩得到浸膏；
(2)取步骤(1)的浸膏，加入3-5倍量水，依次用石油醚，乙酸乙酯萃取3次，萃取液回收溶剂，减压浓缩得各萃取物；
(3)取乙酸乙酯萃取物经正相硅胶柱色谱，用1:1—1:2的石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，按照洗脱时间依次得到3个组分A1、A2和A3；
(4)组分A3经硅胶柱色谱分离，采用5:1—1:9乙酸乙酯：甲醇洗脱，按照洗脱时间依次得到A31-A33三个组分A31、A32和A33；
(5)组分A33经Sephadex LH-20柱色谱分离，按照洗脱时间依次得到3个组分A331、A332和A333，组分A332组分经半制备高效液相色谱分离用45％甲醇—55％水依次得到Lathyrane类型二萜laurifolioside B和2-epi-laurifolioside B；
(6)组分A333经过多次Sephadex LH-20柱色谱分离，纯甲醇进行洗脱，再经半制备高效液相色谱用40％甲醇—60％水分离依次得到化合物Lathyrane类型二萜laurifolioside A和2-epi-laurifolioside A。
3.权利要求1所述一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物的应用，其特征是作为药物活性成分用于制备抗乙型肝炎病毒药物和乙型肝炎病毒药物。
4.根据权利要求3所述一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物的应用，其特征是抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物作为药物活性成分的重量百分含量为0.1-99％。
5.根据权利要求3所述一种抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物的应用，其特征是抗乙型肝炎病毒Lathyrane型二萜类化合物作为药物活性成分的重量百分含量为0.5-90％。
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