CN113278026A

CN113278026A - 一种具有抗肿瘤活性的苦木素类新化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113278026A
Application number: CN202110595626.1A
Authority: CN
Inventors: 赵明; 杨承斌; 陶伟伟
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2021-05-29
Filing date: 2021-05-29
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2041-05-29
Also published as: CN113278026B

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的苦木素类新化合物及其制备方法和用途，属于医药领域。本发明中将鸦胆子干燥成熟果实的80%乙醇提取物经大孔树脂脱色素，再由正向硅胶柱划段，以石油醚‑乙酸乙酯（体积比85:15，75:25，55:45，35:65），二氯甲烷‑甲醇(体积比95:5，0:100)依次进行梯度洗脱；将得到的分离组分再进行MCI柱层析以甲醇‑水（0%~100%）、聚酰胺柱层析以甲醇‑水（30%）洗脱划段；再经过凝胶和高效液相HPLC分离纯化；最后通过高分辨质谱和NMR等技术鉴定其化学结构。本发明化合物可用于制备抗胰腺癌药物或作为抗胰腺癌药物开发的先导化合物。

Description

一种具有抗肿瘤活性的苦木素类新化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域；具体涉及一种具有抗肿瘤活性的苦木素类新化合物及其制备方法和应用。

背景技术

胰腺癌是一组主要起源于胰腺导管上皮及腺泡细胞的恶性肿瘤，恶性程度极高，起病隐匿，早期诊断较为困难，而且进展十分迅速，是预后最差的恶性肿瘤之一。该病患者免疫力低下、手术切除率不足20％、放化疗疗效十分有限，至今5年生存率仍保持在8％左右。然而，传统的治疗手段(放/化疗、手术等)会引起一系列的毒副作用。因此，探寻低毒高效的新型抗癌药物一直是医药研究的重点方向。天然产物作为药物使用已有数千年的历史，其资源丰富，种类繁多，是寻找新型抗癌药物的重要来源。

中药鸦胆子(拉丁名)是苦木科鸦胆子属植物鸦胆子Brucea javanica(L.)Merr.的干燥成熟果实。苦寒，有小毒，归大肠、肝经。主要分布在亚洲、印尼、澳洲的热带和亚热带，在中国主要分布在广东和广西。其清热、燥湿、杀虫、解毒等功效广泛用于治疗痢疾、久泻、疟疾、痔疮、疔毒和赘疣等常见疾病。最早记载出自《本草纲目拾遗》：“鸦胆子，出闽、广，药肆中皆有之。形如梧子，其仁多油，生食令人吐，作霜，捶去油，入药佳”。鸦胆子具有多种药理活性，目前在临床上被广泛应用于肺癌、前列腺癌和胃肠癌的治疗。前期研究表明，鸦胆子中主要含苦木素类、生物碱类、黄酮类、苯丙素类、蒽醌类、脂肪酸类等化合物，其中苦木素类是其主要生物活性成分。研究发现，鸦胆子苦木素类成分体内外抗胰腺癌作用确切(裸鼠皮下移植肿瘤模型，0.75mg/kg/day，给药第四天抑瘤率达80％)，有效剂量下安全，可能是有价值的先导物。

鸦胆子中苦木素主要为C19和C20骨架类型，本发明首次从中分离得到C22骨架类型化合物。

发明内容

本发明的目的是对鸦胆子活性成分进行深入研究，从植物鸦胆子的干燥成熟果实中分离得到的一个C22碳骨架苦木素类新化合物，并命名为Sergeolide A，本发明筛选出了该提供了C22碳骨架苦木素类化合物的制备方法。

本发明通过实验发现，该C22碳骨架苦木素类新化合物Sergeolide A具有一定的抑制胰腺癌细胞增殖活性，该化合物可用于制备抗胰腺癌药物或作为抗胰腺癌药物开发的先导化合物。

本发明提供的新化合物命名为Sergeolide A，结构式为：

本发明中C22碳骨架苦木素类新化合物Sergeolide A的制备方法是按下述步骤进行的：

本发明所述的一种具有抗肿瘤活性的苦木素类新化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将干燥鸦胆子果实粉碎，加入乙醇，搅匀，回流提取，过滤，合并滤液，减压回收乙醇并挥至无醇味得浸膏；

步骤2：将浸膏用适量的蒸馏水混旋，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。

步骤3：取乙酸乙酯部位上预处理过的大孔树脂柱，并用80％乙醇洗脱，收集合并洗脱液，减压回收乙醇，得大孔树脂洗脱物，备用；

步骤4：取步骤3大孔树脂洗脱物，经正相硅胶柱色谱分离，依次用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱和二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，通过薄层色谱检测，相似成分进行合并，得到6个组分Fr.1～Fr.6；

步骤5：取步骤4的Fr.3组分，经MCI中压制备色谱分离纯化，采用甲醇-水体系梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4～5个柱体积，薄层色谱检测合并相同流分，得到6个组分Fr.3-1～Fr.3-6；将Fr.3-5组分经聚酰胺柱色谱分离纯化，采用甲醇等度洗脱；再将甲醇洗脱液经Spheladex LH-20柱色谱分离，采用甲醇等度洗脱，收集前半段馏分；最后通过C18高压制备色谱反复洗脱得新化合物。

作为更加有限方案，本发明制备方法包括以下步骤：

步骤1：将干燥鸦胆子果实粉碎，加入8倍量体积80％乙醇，搅匀，反复回流提取3次，每次3h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇并挥至无醇味得浸膏。

步骤3：取乙酸乙酯部位进行预处理过的大孔树脂吸附，并用80％乙醇洗脱，收集合并洗脱液，减压回收乙醇，备用；

步骤4：取步骤3洗脱液，经正相硅胶柱色谱分离，依次用石油醚-乙酸乙酯(85:15，75:25，55:45，35:65)，二氯甲烷-甲醇(95:5，0:100)梯度洗脱，通过薄层色谱检测，10％硫酸-乙醇显色观察成分相似情况，相似成分进行合并，得到6个组分Fr.1～Fr.6。

步骤5：将Fr.3(石油醚-乙酸乙酯55:45洗脱组分)经MCI中压制备色谱，甲醇-水(0％，20％，40％，60％，80％，100％)体系梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4～5个柱体积，薄层色谱检测合并相同流分，得到6个组分Fr.3-1～Fr.3-6。将Fr.3-5(40％、60％和80％甲醇洗脱组分)经聚酰胺柱色谱，30％甲醇等度洗脱；再将洗脱液经Spheladex LH-20柱色谱，甲醇等度洗脱，收集前半段馏分；最后通过C18高压制备色谱反复洗脱得新化合物。

活性实验采用对Mia PaCa-2胰腺癌细胞进行增殖抑制实验，选择临床用药吉西他滨作为阳性对照药物，MTT法测试了新化合物对Mia PaCa-2胰腺癌细胞的IC50(半数抑制浓度)最终证明上述新化合物Sergeolide A具有良好的抗胰腺癌作用。上述新化合物在制备抗胰腺癌药物方面的用途。

有益效果：

本发明首次从中药鸦胆子Brucea javanica(L.)Merr.中发现一个C22碳骨架苦木素类新化合物Sergeolide A，并提供了该化合物的提取分离技术，结构鉴定方法和抗胰腺癌细胞增殖方面的用途。

附图说明

图1本发明新化合物的UV图(CH₃OH)。

图2本发明新化合物的HR-ESI-MS图。

图3本发明新化合物的¹H NMR图(CD₃OD-d₄)。

图4本发明新化合物的¹³C NMR图(CD₃OD-d₄)。

图5本发明新化合物的DEPT图(CD₃OD-d₄)。

图6本发明新化合物的¹H-¹H COSY图(CD₃OD-d₄)。

图7本发明新化合物的HSQC图(CD₃OD-d₄)。

图8本发明新化合物的HMBC图(CD3OD-d₄)。

图9本发明新化合物的NOESY图(CD3OD-d₄)。

图10本发明新化合物的1H-1H COSY和HMBC关键信号相关图。

具体实施方式

实施例1

本发明中C22碳骨架苦木素类新化合物Sergeolide A制备方法是按照下述步骤进行的：

步骤1：将20kg干燥鸦胆子果实粉碎，加入体积浓度80％乙醇160L，搅匀，105℃反复回流提取3次，每次3h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇并挥至无醇味得浸膏3.1kg。

步骤2：将步骤1的浸膏用10L蒸馏水溶解分散，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得到石油醚部位525g、乙酸乙酯部位221g、正丁醇部位730g和水部位1200g。

步骤3：取步骤2的乙酸乙酯部位上预处理过的AB-8大孔树脂吸附(0.3-1.2mm，北京索莱宝科技有限公司)。将乙酸乙酯部位浸膏用400mL甲醇溶解，采用湿法上样，大孔树脂柱体积约为3L，全部上样后使其吸附12h，最后用80％乙醇洗脱4-5个柱体积，收集合并洗脱液，减压回收乙醇，备用；

步骤4：取步骤3洗脱液，经正相硅胶(200-300目，青岛海洋化工厂)柱色谱分离，依次用石油醚-乙酸乙酯(体积比85:15，75:25，55:45，35:65)和二氯甲烷-甲醇(体积比95:5，0:100)梯度洗脱，通过薄层色谱检测，10％硫酸-乙醇显色观察成分相似情况，相似成分进行合并，得到6个组分Fr.1～Fr.6。

步骤5：将39.5g Fr.3(即石油醚-乙酸乙酯55:45洗脱组分)经MCI(75-150μm，日本三菱化学)中压制备色谱，甲醇-水(0％，20％，40％，60％，80％，100％)体系梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4～5个柱体积，薄层色谱检测合并相同流分，得到6个组分Fr.3-1～Fr.3-6。将Fr.3-5(40％、60％和80％甲醇洗脱组分2.4g)经聚酰胺柱色谱，30％甲醇等度洗脱4-5个柱体积，收集合并洗脱液，减压回收甲醇，备用；

步骤6：将步骤5洗脱液经Spheladex LH-20(27-163μm，美国GE公司)柱色谱，甲醇等度洗脱，收集前半段馏分(约为8-10h收集的馏分)；最后通过C18高压制备色谱(日本岛津LC-20AR，SPD-20A紫外可见光检测器，检测波长254nm，XBridge BEH C18 OBDTM PrepColumn,

3.5μm,10mm×250mm,1/pkg)，55％甲醇等度反复洗脱得该化合物(SERGEOLIDEA)。

本发明进行的TLC检识的条件：

条件1：紫外灯(254nm)荧光；

条件2：紫外灯(365nm)荧光；

条件3：10％硫酸乙醇，烤板机105℃，2min加热显色。

本发明进行的结构鉴定的技术：高分辨质谱(Waters Synapt G2-Si QTOF)、¹HNMR、¹³C NMR和二维核磁谱(Bruker 500MHz)等。

化合物Sergeolide A为白色粉末，[α]²⁰D 50(c 0.1，MeOH)，能溶于甲醇、乙醇、乙腈等，不溶于水。UV最大吸收λ_max 223，278nm。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 545.2018[M+H⁺]，推测分子式为C₂₈H₃₂O₁₁。

¹H-NMR(500MHz，CD₃OD-d₄)谱显示有4个甲基质子信号：δ_ppm 1.33(3H，d，J＝6.6Hz，H-18)，1.55(3H，s，H-19)，2.15(3H，s，H-4’)，1.94(3H，s，H-5’)；1个甲氧基质子信号：δ_ppm3.72(3H，s，H-OMe)；3个烯质子信号：δ_ppm6.34(1H，s，H-1)，5.66(1H，s，H-2’)，6.00(1H，s，H-7’)。

¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD-d₄)谱及DEPT谱显示有28个碳信号，其中包括4个甲基碳信号：δ_ppm15.8(C-18)，18.6(C-19)，20.5(C-4’)，27.5(C-5’)；1个甲氧基碳信号：δ_ppm53.1(C-OMe)；2个sp³杂化亚甲基碳信号(包括1个与氧相连的亚甲基碳)：δ_ppm30.0(C-6)，74.5(C-20)；8个sp³杂化次甲基碳信号(包括4个与氧相连的次甲基碳)：δ_ppm31.3(C-4)，46.6(C-5)，84.6(C-7)，40.6(C-9)，73.0(C-11)，76.6(C-12)，50.6(C-14)，68.3(C-15)；3个sp²杂化次甲基碳信号：δ_ppm 119.1(C-1)，115.9(C-2’)，112.3(C-7’)；3个sp³杂化季碳信号(包括1个与氧相连的季碳)：δ_ppm47.2(C-8)，41.5(C-10)，82.9(C-13)，3个sp²杂化季碳信号：δ_ppm150.9(C-2)，162.0(C-3’)，160.6(C-3’)；4个羰基碳信号：δ_ppm169.8(C-16)，172.0(C-21)，166.5(C-1’)，172.0(C-6’)。

¹H-¹H COSY谱显示H-18/H-4/H-5/H-6α之间存在相关。HMBC谱显示H-1和C-2，C-3，C-5相关，H-1和C-5相关，表明了A环的结构；H-11和C-8，C-12，C-13相关，表明了C环的结构以及C-11，C-12上存在的两个羟基结构；H-18和C-3，C-4，C-5相关，H-19和C-1，C-5，C-10相关，表明了C-18，C-19两个甲基的连接位置；H-4’，H-5’同时和C-2’，C-3’相关，表明了侧链的连接方式；H-7’和C-2，C-6’相关，表明了五元内酯环的结构及连接方式。

化合物的空间构型由NOESY谱确定，NOESY谱显示H-18/H-5/H-9，H-11/H-6α之间存在相关，表明H-5，H-9，H-11，C-18甲基为α构型；还显示H-19/H-4/H-20α/H-6β/H-7/H-12，H-14/H-20β之间存在相关，表明H-4，H-7，H-12，H-14，C-19甲基为β构型。

结合上述信息，确定化合物结构为：

表1本发明的分离该化合物的核磁数据：

¹H(500MHz)and ¹³C(125MHz)in CD₃OD-d₄

a:not detectable

实施例2：

本发明化合物SERGEOLIDE A的抗胰腺癌活性研究是按照下述步骤进行的：

1.肿瘤细胞培养

将Mia PaCa-2胰腺癌细胞株(中国科学院细胞库)，以含10％胎牛血清的DMEM培养液(美国Gibco公司)，在37℃，5％CO₂条件下培养。进行传代培养时，先取出一盘Mia PaCa-2胰腺癌细胞，去培养液，加入3mL PBS，清洗两遍。加入1mL胰酶消化，2min后加入1mL培养液终止消化，常温离心，5min，1000r/min。去上清，加1mL含10％胎牛血清的DMEM培养液，重悬得细胞悬液。

2.实验药物的配制

称取适量化合物SERGEOLIDE A溶解于DMSO中，使母液终浓度为50mM，4℃冰箱储存。

实验之前，将母液用DMEM培养基稀释，使药物浓度为50μM，并且保证DMSO的最终浓度低于0.1％。

加入不同体积的DMEM培养基将化合物SERGEOLIDE A稀释成不同浓度。同时用含有0.1％DMSO的DMEM培养基作为阴性对照。

3.药物对肿瘤细胞株的毒性

将肿瘤细胞用培养基悬浮，以6×10³的细胞密度接种96孔板(100μL/孔)，37℃，5％CO₂条件下培养24h。在肿瘤细胞株的对数生长期，加入不同浓度的SERGEOLIDE A，37℃，5％CO₂条件下培养24h。

4.MTT法检测细胞活力

待药物与肿瘤细胞作用24h后，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)无菌培养箱中孵育3h。完全吸弃上清液，每孔加入150μL的DMSO，在摇床上反应30min，使蓝紫色的甲瓒结晶溶解。使用酶标仪在570nm波长下测定OD值。利用GraphPad Prism 8软件计算化合物的IC₅₀(半数抑制浓度)，以吉西他滨作为阳性对照。

表2化合物SERGEOLIDE A对Mia PaCa-2胰腺癌细胞的抑制作用(IC₅₀值)

名称	IC<sub>50</sub>(μM)
		化合物SERGEOLIDE A	0.229
吉西他滨	＞100

实验结论：本发明中的一个C22碳骨架苦木素类新化合物Sergeolide A对于MiaPaCa-2胰腺癌细胞具有明显的抑制作用，体外生物活性强于阳性药吉西他滨400倍以上，具有开发成抗胰腺癌新药的潜力。

Claims

1.一种具有抗肿瘤活性的苦木素类新化合物，其特征在于，它的结构为：

2.权利要求1所述的一种具有抗肿瘤活性的苦木素类新化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤5：取步骤4的Fr.3组分，经MCI中压制备色谱分离纯化，采用甲醇-水体系梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4～5个柱体积，薄层色谱检测合并相同流分，得到7个组分Fr.3-1～Fr.3-7；将Fr.3-5组分经聚酰胺柱色谱分离纯化，采用甲醇等度洗脱；再将甲醇洗脱液经Spheladex LH-20柱色谱分离，采用甲醇等度洗脱，收集前半段馏分；最后通过C18高压制备色谱反复洗脱得新化合物。

3.根据权利要求2所述的一种具有抗肿瘤活性的苦木素类新化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将干燥鸦胆子果实粉碎，加入药材8倍量体积量的80％乙醇，搅匀，回流提取3次，每次3h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，并挥至无醇味得浸膏；

步骤4：取步骤3大孔树脂洗脱物，经正相硅胶柱色谱分离，依次用体积比为85:15，75:25，55:45，35:65的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱和体积比为95:5，0:100的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，通过薄层色谱检测，10％硫酸-乙醇显色观察成分相似情况，相似成分进行合并，得到6个组分Fr.1～Fr.6；

步骤5：取步骤4的Fr.3组分，即体积比为55:45的石油醚-乙酸乙酯洗脱组分，经MCI中压制备色谱分离纯化，依次采用水和20％、40％、60％、80％、100％甲醇溶液梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4～5个柱体积，薄层色谱检测合并相同流分，得到6个组分Fr.3-1～Fr.6；将Fr.3-5组分，即40％、60％、80％体积浓度的甲醇洗脱组分，经聚酰胺柱色谱分离纯化，采用体积浓度30％甲醇等度洗脱；再将30％甲醇洗脱液经Spheladex LH-20柱色谱分离，采用甲醇等度洗脱，收集前半段馏分；最后通过C18高压制备色谱反复洗脱得新化合物。

4.根据权利要求2或3所述的一种具有抗肿瘤活性的苦木素类新化合物的制备方法，其特征在于，C18高压制备色谱条件为：日本岛津LC-20AR，SPD-20A紫外可见光检测器，检测波长254nm，XBridge BEH C₁₈ OBDTM Prep Column,

3.5μm,10mm×250mm,1/pkg，55％甲醇等度反洗脱。

5.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的苦木素类新化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的具有抗肿瘤活性的苦木素类新化合物在制备抗胰腺癌药物中的应用。