KR101251603B1 - 클로로계 실란을 이용하여 시스테인계 단백질 ｇ가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자의 제조방법 및 그 자성나노입자 - Google Patents

클로로계 실란을 이용하여 시스테인계 단백질 ｇ가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자의 제조방법 및 그 자성나노입자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 시스테인계 단백질 G가 고정화된 자성실리카 나노입자를 제조하는 것으로서, 보다 상세하게는 항체에 결합하는 부위가 증가하는 시스테인계 단백질 G 다합체의 사용을 통해서 면역 검출의 감도를 향상시키는 시스테인계 단백질 G 다합체가 높은 효율로 고정화 된 자성실리카 나노입자를 간단한 one-step으로 제조하는 방법에 관한 것이 개시된다.

Description

클로로계 실란을 이용하여 시스테인계 단백질 Ｇ가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자의 제조방법 및 그 자성나노입자{Method for manufacturing the functional silica magnetic nano-paticle immobilized the cystene protein G and the functional silica magnetic nano-paticle is manufactured thereby}
본 발명은 단백질 G가 고정화 된 실리카 자성나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 실리카 코팅된 자성나노입자(Fe3O4@SiO2)의 표면에 클로로(chloro) 실란을 도입하여 제조되는 기능성 실리카 자성나노입자(Cl-Fe3O4@SiO2)의 표면에 시스테인계단백질 G를 고정화시키는 방법에 관한 것이다.
항원-항체 반응을 이용한 면역센서, 진단키트 등의 응용 분야에서 대부분은 항체는 다양한 무기성(inorganic) 고체 물질 표면에 고정화된 형태로 사용된다. 항체의 고유한 결합 특성 및 활성을 손상시키지 않으면서 항체의 활성 부위가 표면에 잘 노출될 수 있도록 다양한 고체기판에 항체를 단분자막 형태 및 배향성을 조절하면서 고정화시키는 기술은 칩이나 센서의 검출 감도와 직접적으로 연결되므로 매우 중요하다. 특히 항체에서 항원에 대한 결합 부위는 Fab 영역에 존재하기 때문에 항체의 Fab 영역을 외부로 노출시키도록 항체를 고정화시키는 것은 항체의 성능과 감도를 높이는데 매우 중요하며 Fab 영역이 노출되지 않은 항체는 항체의 고정화에도 불구하고 그 기능을 상실하게 되어 고정화 양과 상관없이 센서 및 검출에는 아무런 효과가 없다. 결국 항체의 고정화시 고정화양만이 중요한 것이 아니라 배향성이 확보된 고정화가 중요한 요소가 되는 것이다.
또 다른 고려할 요소는, 항체의 단분자막으로부터 항원-항체 반응을 감도 높게 측정하기 위해서는 항원-항체간의 결합 반응이 입체제한(steric hindrance)을 최소로 하는 조건에서 높은 수준으로 이루어져야 한다. 입체 제한은 주로 고체 표면에 고정화된 항체분자의 밀도에 의해 발생하며 밀도가 높은 경우 항원 결합 효율이 심각하게 떨어지게 된다. 따라서 고체 표면에서 항체 분자의 밀도를 조절하는 기술이나 혹은 항체 분자의 고정화 밀도가 항원-항체 결합반응에 미치는 효과를 최소화할 수 있는 새로운 단분자막 제조기술이 개발되어야한다. 최근에 이런 기술을 개발하고자 하는 연구가 많이 진행되고 있지만 성과는 아직 미비하고 초보적인 수준에 그치고 있다.
기존 연구를 살펴보면 단순 흡착을 이용한 항체의 고정화에서 배향성을 조절하는 방법으로 이동하고 있으며 그 기본은 항체의 Fc 영역에 많이 존재하는 아미노그룹을 이용하여 고체표면에 알데하이드 혹은 카르복실 그룹을 이용하여 고정화하는 방법이다. 이 방법의 경우 항체의 고정화양은 많아지지만 상기에서 명시한 입체제한이 나타나며 배향성에서 있어서 특정 tag나 리간드를 사용하는 것보다는 배향성에 대한 효율이 크지 않은 단점이 있다. 통상적으로 많이 사용되는 다른 방법은 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 결합을 이용하는 것으로 스트렙타비딘은 저분자 비타민인 비오틴 4개와 결합할 수 있는 입체구조를 갖고 있으며 비오틴의 아민기는 항체의 고정영역(Fc)에 위치한 탄수화물 부분을 산화시켜 부착시킬 수 있으므로, 고체물질 표면에 고정화된 스트렙타비딘과 항체에 부착된 비오틴이 결합되어 배향성 고정화를 할 수 있다. 하지만 스트렙타비딘 및 비오틴은 비교적고가의 시료라서 대량 생산 및 상업화에 단점으로 작용한다.
한편 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 단백질A (protein A)와 단백질G (protein G)를 이용하여 항체의 배향성을 확보하는 방법도 소개되고 있다. 항체와 특이적으로 결합하는 미생물 유래 항체결합단백질(단백질A, 단백질G, 단백질A/G, 또는 단백질L)을 이용한 항체고정화 기술은 항원-항체 반응에 참여하지 않는 항체의 특정부위에 강하게 결합하여 해당 항체를 고체기판에 고정함으로써 항원의 접근성을 용이하게 한다(Danczyk R et al., Biotechnol Bioeng 84:215-223, 2003). 상기 단백질들과 항체와의 결합에는 화학적 수식이 필요하지 않으므로 항체의 고유기능을 해치지 않는 장점이 있다. 그러나 항체결합 단백질을 고체기판에 고정하는 과정에서 단백질의 배향성 조절이 어려워 항체의 고정 효율을 최적화하는데 문제가 되어 왔다.
최근에 발표된 방법은 골드결합단백질을 코딩하는 유전자와 프로테인에 이와 지 (protein A, G)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터로 형질전환된 미생물에 의해서 발현된 재조합 융합단백질을 고체상에 고정하여 항체의 배향성을 확보하는 방법이 소개되었다 (대한민국 특허 등록번호 10-0965480).
기존의 단백질 G를 자성나노입자의 표면에 고정화하기 위한 방법으로 cross-linking 시약인 sulfo succinimidyl 4-(N-maleimi-domethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC)를 사용하였지만 이는 반응이 복잡하며 고가의 시약이 사용되어 생산 단가를 올리게 되는 문제점이 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 면역검출에서 고민감도 검출을 위한 민감도 향상을 위한 것으로, 항체의 배향성 확보를 통한 민감도 향상뿐만 아니라 구조적 배열을 통한 입체제한 극복을 동시에 해결하기 위하여 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 시스테인계단백질 G가 고효율로 고정화되는 자성실리카 나노입자를 one-step, 저비용으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 시스테인계단백질 G가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자는 중심핵(core)으로 나노자성체 산화물을 사용하고 나노자성체 산화물의 표면을 실리카로 코팅 처리 후 다시 클로로계 실란으로 실리카 표면처리를 하는 것으로, 상기 클로로계 실란이 치환된 실리카 코팅 자성나노입자의 클로로기에 시스테인계단백질 G를 결합시켜 고정화되어 있는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 나노자성체는 자철광(magnetite; Fe3O4), 헤마타이트(hematite; α-Fe2O3), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe2O3), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 자성나노입자는 30 ~ 200㎚의 크기를 가지는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 단백질 G 다합체는 말단에 시스테인 기능기가 태크된 삼중(tri-)의 단백질G 다합체인 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 클로로계 실란은 ((chloromethyl)phenylethyl -trimethoxysilane), chloromethylphenethyltris(trimethylsiloxy)silane, (p-Chloromethyl)phenyltrimethoxysilane, chloromethyltriethoxysilane, chloromethyltrimethoxysilane, chloromethyltrimethylsilane, chloromethyltris(trimethylsiloxy)silane, chlorophenyltriethoxysilane, p-Chlorophenyltriethoxysilane, p-Chlorophenyltrimethylsilane, 3-Chloropropyltriethoxysilane, 3-Chloropropyltrimethoxysilane, 3-Chloropropyltrimethylsilane, 3-Chloropropyltris(trimethylsiloxy) -silane, chlorosilane, 2-(4-Chlorosulfonylphenyl)ethyltrimethoxy -silane, (dichloromethyl)trimethylsilane, triethylchlorosilane, trimethylchlorosilane, 2-(Trimethylsilyl)ethoxymethyl chloride, tris -(trimethylsiloxy)chlorosilane, vinyldiphenylchlorosilane, trivinyl -chlorosilane으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서는 중심핵(core)으로 나노자성체 산화물에 실리카 코팅된 자성 실리카 나노입자를 준비하고, 상기 실리카 코팅된 나노입자의 표면에 클로로계 실란을 치환시키고, 상기 클로로기가 치환된 실리카 코팅 자성나노입자의 클로로기에 시스테인계 단백질 G를 결합시켜 고정화키는 과정을 포함하여 되는 것을 특징으로 하는 시스테인계 단백질 G가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자의 제조방법을 제공한다.
상기 클로로계 실란은 ((Chloromethyl)phenylethyltrimethoxy silane); ((chloromethyl)phenylethyl -trimethoxysilane); chloromethylphenethyltris(trimethylsiloxy)silane; (p-Chloromethyl)phenyltrimethoxysilane; chloromethyltriethoxysilane; chloromethyltrimethoxysilane; chloromethyltrimethylsilane; chloromethyl tris(trimethylsiloxy)silane; chlorophenyltriethoxysilane; p-Chlorophenyltriethoxysilane; p-Chlorophenyltrimethylsilane; 3-Chloropropyltriethoxysilane; 3-Chloropropyltrimethoxysilane; 3-Chloropropyltrimethylsilane; 3-Chloropropyltris(trimethylsiloxy)-silane; chlorosilane; 2-(4-Chlorosulfonylphenyl)ethyltrimethoxy-silane; (dichloromethyl)trimethylsilane; triethylchlorosilane; trimethylchlorosilane; 2-(Trimethylsilyl)ethoxymethyl chloride; tris -(trimethylsiloxy)chlorosilane; vinyldiphenylchlorosilane; trivinyl-chlorosilane으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 나노자성체는 자철광(magnetite; Fe3O4), 헤마타이트(hematite; α-Fe2O3), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe2O3), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 한다.
상기 단백질 G 다합체는 말단에 시스테인 기능기가 태크된 삼중(tri-)의 단백질G 다합체인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 제공되는 클로로계 실란처리된 자성나노입자에 고정된 시스테인계 단백질 G는 항체의 배향성을 확보하면서 동시에 입체제한을 극복할 수 있는 방법으로 면역검출에 있어서 가장 중요한 민감도를 향상시킬 수 있다. 즉, 기존 단백질 G의 경우 많은 단백질 G를 표면에 결합시킨다고 해도 입체적인 제한 때문에 대부분의 단백질 G가 항체고정화에 사용되지 못하고 도리어 입체제한 때문에 민감도를 떨어뜨리는 결과를 낳게 되지만 클로로계 실란처리된 자성나노입자에 고정된 시스테인계 단백질 G를 사용하면 입체적인 제한을 극복하면서 2차원 배열이 아닌 3차원 배열을 통한 항체 고정화로 민감도를 현저히 증가시킬 수 있는 효과를 가진다.
또한 제조 공정이 one-step으로 간단하며 cross-linking 시약을 사용하지 않으므로 제조 단가를 낮출 수 있게 된다.
도 1은 본 발명에 일실시예에 따라, 클로로계 실란이 발현된 실리카코팅 자성나노입자의 제작 과정을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라, 클로로계 실란이 발현된 실리카코팅 자성나노입자에 시스테인 단백질 G를 고정화 시키는 과정을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 실리카코팅 자성나노입자의 표면에 클로로계 실란을 치환 처리한 전후의 FT-IR 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 시스테인계 단백질 G의 각 농도에 따른 결합효율에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 시스테인계 단백질 G의 결합에 대한 SDS-폴리아크릴 아미노겔 전기영동분석 결과를 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
첨부 도면 도 1은 본 발명의 일실시예에 따라, 클로로계 실란이 발현된 실리카코팅 자성나노입자의 제작 과정을 도시한 것이다, 도 2는 본 발명의 일실시예에 따라, 클로로계 실란이 발현된 실리카코팅 자성나노입자에 시스테인계 단백질 G를 고정화시키는 일련의 과정을 도시한 것이며, 도 3을 본 발명에 따른 실리카코팅 자성입자의 표면에 클로로계 실란을 치환 처리한 전후의 FT-IR 스펙트라를 나타낸 것이며, 도 4는 본 발명에 따른 시스테인계 단백질 G의 각 농도에 따른 결합 효율에 대한 결과를 나타낸 것이며, 도 5는 본 발명에 따른 시스테인계 단백질 G의 결합에 대한 SDS-폴리아크릴 아미노겔 전기영동분석 결과를 도시한 것이다.
본 발명은 항체의 Fc 영역에 친화성을 갖는 단백질 G로 구성된 다합체를 제공하며 상기 시스테인계 단백질 G는 유전자 재조합 기술을 통해 단백질 G 코딩 유전자를 적절한 발현 벡터에 클로닝하여 발현 벡터를 제작하며, 이때 단백질 G 삼중체는 단백질 Gdp 대한 코딩 유전자를 3회 반복 연결한 발현 벡터를 제작하여, 상기 발현 벡터를 이용하여 적절한 미생물을 형질전환시키고, 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 단백질 G 삼중체를 생산한 후 세포 외벽을 파괴하고 컬럼을 통해 합성된 단백질 G 삼중체를 분리한다. 이때 단백질 G 의 하단에 시스테인잔기가 부착되도록 발현시키게 된다.
본 발명에 사용되는 실리카 코팅 자성나노입자는 첨부도면 도 1에 도시된 바와 같이 자성나노입자의 표면에 실리카를 코팅시켜 제조된다.
클로로 실란으로 치환된 실리카코팅 자성나노입자를 분산시킨 후 시스테인계 단백질 G와 혼합하여 반응시킨 후 영구자석을 통해 분리하여 세척한다. 이를 통해 시스테인계 단백질 G가 고정화된 실리카코팅 자성나노입자를 제작하게 된다.
본 발명에서는 중심핵(core)으로 자성체 철 산화물을 사용하고, 자성체 철 산화물에 실리카 코팅하고, 표면에 클로로계 실란이 도출되어 치환되고, 상기 치환된 클로로계 실란에 시스테인계 단백질 G를 고정화 시키는 방법을 제공한다.
상기 나노자성체는 자성에 반응하는 물질이면 어느 것을 사용하여도 좋으나, 바람직하게는 자철광(magnetite; Fe3O4 , 헤마타이트(hematite; α-Fe2O3), 마게마이트(maghemite; γ-Fe2O3), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군에서 선택된 1종을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 자성나노입자는 30 ~ 200nm 의 크기를 가지는 것을 사용하는 것이 좋다.
상기 시스테인계 단백질 G는 말단에 시스테인기가 결합되어 있고, 삼중(tri-)의 단백질 G 다합체인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 첨부도면 도 2에 예시된 바와 같이 상기 개시된 시스테인계 단백질 G가 고정화된 실리카 코팅된 자성나노입자는 첨부 도면 도 1에 도시된 바와 같은 자성체 나노입자의 표면에 실리카 코팅처리된 자성나노입자의 표면에 클로로기 실란을 치환시키는 단계와 클로로기 실란이 표면에 부착된 실리카코팅 자성나노입자에 상기 시스테인 단백질 G를 고정화시키는 단계로 이루어진 과정에 의해 시스테인 단백질 G가 자성실리카 나노입자에 고정 결합된다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하기로 한다. 단, 하기의 실험예로 본 발명이 한정되는 것이 아니며, 이상의 상술한 바와 같이 적의 선택된 구성들에 따라 다양한 형태로 변형 가능한 것은 자명한 것이다.
실시예 1: 클로로 실란이 치환된 실리카 코팅 자성나노입자(Cl-Fe3O4@SiO2)의 제작
실시예 1-1: 실리카층의 코팅
침전법으로 얻은 자철광을 이용하여 실리카 코팅된 자성나노입자를 제작하기 위하여 계면활성제인 Igepal CO-520 0.22g을 사이클로헥산 4.5mL에 녹인 용액을 준비하고, magnetite와 olieic acid를 사이클로헥산 용액에 넣고 1시간가량 초음파 처리를 하여 분산시킨 후 기 준비된 Igepal이 들어있는 사이클로헥산 용액에 넣고 교반시킨다. 이때 수산화암모늄, TEOS(Tetraethyl orthosilicate)를 넣고 추가적으로 20시간을 더 교반시킨 후 메탄올을 넣어서 세척하여 최종적으로 실리카 코팅 자성나노입자를 얻게 된다.
실시예 1-2: 실리카 코팅 자성나노입자(Fe3O4@SiO2)에 기능기 합성
실리카 코팅된 자성나노입자를 Toluene에 분산시키고 1시간가량 초음파 처리를 하여 분산시킨 후 실온에서 2시간가량 교반을 시킨다. 교반 후 ((Chloromethyl)phenylethyl-trimethoxysilane)을 넣고 질소 분위기에서 100℃로 8시간 reflux 시킨다. 이후 Toluene으로 세척을 하여 최종적으로 염소그룹이 치환된 실리카 코팅 자성나노입자(이하, "Cl-Fe3O4@SiO2라 약칭함)얻게 된다. 염소그룹이 치환된 실리카 코팅 자성나노입자의 특성을 확인하기 위해 FT-IR(도 3) 분석을 하였다.
실시예 2: Cl-Fe3O4@SiO2에 시스테인-태그된 단백질 G 다합체(cysteine-tagged multimer protein G)의 합성 및 정제 (도 2 참조)
5mg의 Cl-Fe3O4@SiO2에 (주) 중겸에서 받은 시스테인계 단백질 G의 농도를 각각 100, 125, 150, 175, 200, 300㎍/㎖가 되도록 추가하여 0.1% 트윈20을 최종농도로 하여 10mM PBS버퍼로 재현탁한다. 각 시료를 교반하고, 1시간 동안 로터리쉐이킹하여 인큐베이트한다. 상기 재현탁을 한 다음, 10분간 자성을 띠게 한 후, 자석을 이용하여 시스테인계 단백질 G가 고정된 Cl-Fe3O4@SiO2 입자를 정제하고, 정제한 후에 1.5㎖ 10mM PBS버퍼(pH 7.4)로 3회 세척한다.
이상의 과정에서 첨부도면 도 2에 도시된 바와 같이 시스테인계 단백질 G가 자성 나노입자에 고정된다. 각각의 농도별 시스테인계 단백질 G가 Cl-Fe3O4@SiO2 입자에 고정화된 효율을 확인하기 위해 BCA test를 진행하였다. 도 4는 시스테인계 단백질 G의 각 농도에 따른 결합효율에 대한 결과를 나타낸 것이다. 도 5는 5mg의 Cl-Fe3O4@SiO2 입자에 시스테인계 단백질 G 의 농도가 100, 300㎍/㎖일 때 시스테인 단백질 G가 Cl-Fe3O4@SiO2 입자에 고정화된 후 고정화되지 않고 씻겨서 나온 상층액을 측정한 SDS-PAGE 분석결과이다.
이상의 결과로 본 발명에서는 기존의 단백질 G를 고정화하기 위한 기능성 입자를 만들기 위한 방법보다 간단하고 경제적으로 시스테인계 단백질 G를 고정화하기 위한 기능성 자성나노입자 Cl-Fe3O4@SiO2를 제조 하였고, 제조된 Cl-Fe3O4@SiO2 입자의 시스테인계 단백질 G의 고정화가 뛰어남을 확인 하였고, 5mg의 Cl-Fe3O4@SiO2 입자를 사용하였을 때 시스테인계 단백질 G의 농도가 100㎍/㎖일 때 포화상태가 됨을 확인하였다.

Claims (9)

  1. 중심핵(core)으로 자철광(magnetite; Fe3O4), 헤마타이트(hematite; α-Fe2O3), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe2O3), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군에서 선택된 1종인 나노자성체 산화물인 실리카 코팅된 자성 실리카 나노입자의 표면에 클로로계 실란을 치환시키고,
    상기 클로로계 실란이 치환된 실리카 코팅 자성나노입자의 클로로기에 말단에 시스테인 기능기가 태크된 삼중(tri-)의 단백질G 다합체인 시스테인계 단백질 G를 결합시켜 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 시스테인계 단백질 G가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성나노입자는 30 ~ 200㎚의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 시스테인계 단백질 G가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 클로로계 실란은 ((Chloromethyl) phenylethyl-trimethoxy silane); ((chloromethyl) phenylethyl-trimethoxysilane); chloromethylphenethyltris (trimethylsiloxy) silane; (p-Chloromethyl) phenyltrimethoxysilane; chloromethyltriethoxysilane; chloromethyltrimethoxysilane; chloromethyltrimethylsilane; chloromethyltris(trimethylsiloxy)silane; chlorophenyltriethoxysilane; p-Chlorophenyltriethoxysilane; p-Chlorophenyltrimethylsilane; 3-Chloropropyltriethoxysilane; 3-Chloropropyltrimethoxysilane; 3-Chloropropyltrimethylsilane; 3-Chloropropyltris(trimethylsiloxy)-silane; chlorosilane; 2-(4-Chlorosulfonylphenyl) ethyltrimethoxy-silane; (dichloromethyl) trimethylsilane; triethylchlorosilane; trimethylchlorosilane; 2-(Trimethylsilyl) ethoxymethyl chloride; tris -(trimethylsiloxy) chlorosilane; vinyldiphenylchlorosilane; trivinyl -chlorosilane으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시스테인계 단백질 G가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자.
  6. 중심핵(core)으로 자철광(magnetite; Fe3O4), 헤마타이트(hematite; α-Fe2O3), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe2O3), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군에서 선택된 1종인 나노자성체 산화물인 실리카 코팅된 자성 실리카 나노입자를 준비하고, 상기 실리카 코팅된 나노입자의 표면에 클로로계 실란을 치환시키고,
    상기 클로로계 실란으로 치환된 실리카코팅 자성나노입자를 분산시킨 후,
    상기 클로로계 실란을 치환시켜된 실리카 코팅 자성나노입자의 클로로기에 말단에 시스테인 기능기가 태크된 삼중(tri-)의 단백질G 다합체인 시스테인계 단백질 G와 혼합하여 반응시킨 후, 상기 시스테인계 단백질 G와 결합시켜 고정화켜 영구자석을 통해 분리하여 세척하는 과정을 포함하여 되는 것을 특징으로 하는 시스테인계 단백질 G가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 클로로계 실란은 ((Chloromethyl)phenylethyl-trimethoxy silane); ((chloromethyl)phenylethyl-trimethoxysilane); chloromethylphenethyltris(trimethylsiloxy)silane; (p-Chloromethyl)phenyltrimethoxysilane; chloromethyltriethoxysilane; chloromethyltrimethoxysilane; chloromethyltrimethylsilane; chloromethyltris(trimethylsiloxy)silane; chlorophenyltriethoxysilane; p-Chlorophenyltriethoxysilane; p-Chlorophenyltrimethylsilane; 3-Chloropropyltriethoxysilane; 3-Chloropropyltrimethoxysilane; 3-Chloropropyltrimethylsilane; 3-Chloropropyltris(trimethylsiloxy)-silane; chlorosilane; 2-(4-Chlorosulfonylphenyl)ethyltrimethoxy-silane; (dichloromethyl)trimethylsilane; triethylchlorosilane; trimethylchlorosilane; 2-(Trimethylsilyl)ethoxymethyl chloride; tris -(trimethylsiloxy)chlorosilane; vinyldiphenylchlorosilane; trivinyl -chlorosilane으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시스테인계 단백질 G가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자의 제조방법.
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KR100927886B1 (ko) * 2007-06-18 2009-11-23 한국생명공학연구원 단백질 ｇ-올리고 뉴클레오타이드 결합체

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