KR20180117405A - 단백질 a가 배향 고정된 실리카 자성나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 정제방법 - Google Patents

단백질 a가 배향 고정된 실리카 자성나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 정제방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180117405A
KR20180117405A KR1020170050476A KR20170050476A KR20180117405A KR 20180117405 A KR20180117405 A KR 20180117405A KR 1020170050476 A KR1020170050476 A KR 1020170050476A KR 20170050476 A KR20170050476 A KR 20170050476A KR 20180117405 A KR20180117405 A KR 20180117405A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
immobilized
magnetic nanoparticle
silica
antibody
Prior art date
Application number
KR1020170050476A
Other languages
English (en)
Inventor
김성현
장정호
Original Assignee
한국세라믹기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국세라믹기술원 filed Critical 한국세라믹기술원
Priority to KR1020170050476A priority Critical patent/KR20180117405A/ko
Publication of KR20180117405A publication Critical patent/KR20180117405A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09C—TREATMENT OF INORGANIC MATERIALS, OTHER THAN FIBROUS FILLERS, TO ENHANCE THEIR PIGMENTING OR FILLING PROPERTIES ; PREPARATION OF CARBON BLACK  ; PREPARATION OF INORGANIC MATERIALS WHICH ARE NO SINGLE CHEMICAL COMPOUNDS AND WHICH ARE MAINLY USED AS PIGMENTS OR FILLERS
    • C09C1/00—Treatment of specific inorganic materials other than fibrous fillers; Preparation of carbon black
    • C09C1/22—Compounds of iron
    • C09C1/24—Oxides of iron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09C—TREATMENT OF INORGANIC MATERIALS, OTHER THAN FIBROUS FILLERS, TO ENHANCE THEIR PIGMENTING OR FILLING PROPERTIES ; PREPARATION OF CARBON BLACK  ; PREPARATION OF INORGANIC MATERIALS WHICH ARE NO SINGLE CHEMICAL COMPOUNDS AND WHICH ARE MAINLY USED AS PIGMENTS OR FILLERS
    • C09C3/00—Treatment in general of inorganic materials, other than fibrous fillers, to enhance their pigmenting or filling properties
    • C09C3/06—Treatment with inorganic compounds
    • C09C3/063—Coating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/60—Particles characterised by their size
    • C01P2004/64—Nanometer sized, i.e. from 1-100 nanometer

Abstract

본 발명은 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자, 이의 제조 방법 및 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자를 이용한 항체 분리 정제방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자는 실리카 코팅된 자성나노입자에 시스테인을 갖는 유전적으로 변형된 단백질 A를 일정방향으로 배향 고정시킴으로써, 단백질 A의 활성을 유지하면서 실리카 자성나노입자에 고정되는 단백질 A의 고정화 양이 크게 증가되어, 상기 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자를 이용하여 항체를 분리 정제시 항체의 초고속 및 고순도 분리정제가 가능한 효과를 나타낸다.

Description

단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 정제방법{SILICA MAGNETIC NANOPARTICLE IMMOBILIZED WITH PROTEIN A, MANUFACTURING METHOD OF THE SAME AND ISOLATING AND PURIFYING ANTIBODY USING THE SILICA MAGNETIC NANOPARTICLE IMMOBILIZED WITH PROTEIN A}
본 발명은 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자, 이의 제조 방법 및 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자를 이용한 항체 분리 정제방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자는 실리카 코팅된 자성나노입자에 시스테인을 갖는 유전적으로 변형된 단백질 A를 일정방향으로 배향 고정시킴으로써, 단백질 A의 활성을 유지하면서 실리카 자성나노입자에 고정되는 단백질 A의 고정화 양이 크게 증가되어, 상기 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자를 이용하여 항체를 분리 정제시 항체의 초고속 및 고순도 분리정제가 가능한 효과를 나타낸다.
항체는 FDA가 승인한 많은 항체 기반의 약제와 200개 이상의 항체 약품이 임상 개발 중에 있는 생물 약제 중에서 가장 중요한 분자이다. 이러한 항체를 정제하는데 있어서, 단백질 A 기반의 크로마토그래피는 높은 선택성과 견고성으로 인해 가장 중요한 기준이 되고 있다. 그 이유는 바로 단백질 A는 항원 결합 능력을 방해하지 않고 항체의 결합 부위를 특이적으로 인식하는 능력을 가지고 있기 때문이다.
시중에 나와있는 상용 단백질 A 기반의 크로마토그래피는 단일 단계에서는 최대 95%의 고순도의 항체를 분리하는 것이 가능하다. 그러나, 항체와의 낮은 결합 능력, 느린 정제 과정뿐만 아니라, 고가의 단백질 A-비드 활용에 대한 어려움이 따른다. 특히 대량의 세포 배양에 있는 상층액은 순차적인 정제 사이클이 요구되므로 공정 시간과 정화 비용이 크게 증가하게 된다. 결과적으로, 이러한 문제를 극복하기 위해, 새로운 정제 방법이 주목받고 있다.
산화철 자성 입자는 바이오 센서, MRI 에이전트, 약물 전달 캐리어 및 정제 공정을 위한 재료와 같은 많은 응용 분야에서 매력적인 소재이다. 특히, 자기 분리는 단백질 기반의 컬럼 수지에 비해 일반적으로 2 ㎛의 작은 입자로 인해 빠른 처리와 높은 결합 능력을 제공한다.
현재, 마이크로미터 크기의 단백질 A가 배향 고정된 자성 나노입자는 이미 상업적으로 이용 가능하며 효소 및 항체와 같은 생물학적 분자 분리에 대해 우수한 성능을 보였다. 그러나, 이러한 자기 분리는 아직 산업 분야에서 이용하기에 충분하지 않은 문제가 있다.
주요 원인은 항체 결합 능력이다. 가장 보편적인 제품인 Dynalbead 社에서 판매하는 Dynalbead®protein A는 균일한 2.8 ㎛의 고상 자성 나노입자로 단백질 A의 고정화 정도는 항체 결합 용량 1 mg 당 8 ㎍ 정도로 낮으며, 이에 따라 항체 정제 용량(capacity)이 낮다. 종래 상용 단백질 A는 표면에 리신(L-Lysine) 잔기를 포함하며, 리신 잔기는 자성입자의 에폭시기와 반응하여 단백질 A의 기능적 활성을 감소시키는 비배향성(비방향성) 고정화 반응이 진행되는 문제점이 있었다. 또한 단백질 A를 고정화할 때 고가의 cross-linking 시약인 sulfo succinimidyl 4-(N-maleimi-domethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC)를 사용하여 반응도 복잡하고 무작위로 단백질 A가 고정화되어서 활성이 떨어져서 생산 단가를 올리게 되는 문제점이 있다. 이와 같이 낮은 결합 용량에도 불구하고 높은 비용이 들고 결과적으로 대규모 산업으로의 응용이 제한되었다.
따라서, 높은 결합 능력 및 항체 정제 능력이 우수하고, 비용적인 측면을 고려할 때, 단백질 A의 고정화 양을 최대화함으로써, 항체 정제 용량 및 정제 효율을 개선시키는 자성나노입자를 개발하는 것이 바람직하다.
본 발명은 시스테인을 포함하는 단백질 A를 실리카 자성나노입자에 배향 고정시켜 단백질 A의 고정화 양이 크게 개선된 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 또한, 상기 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자를 이용한 항체의 분리 및 정제시, 고용량의 항체를 초고속 및 고순도로 분리 정제하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법은
a) 중심핵(core)으로 50 nm 이하의 나노자성체 산화물을 포함하는 실리카 코팅된 자성나노입자를 준비하는 단계;
b) 상기 실리카 코팅된 자성나노입자는 클로로계 실란으로 치환하여 표면 처리하는 단계;
c) C 말단에 시스테인(cystein)을 포함하는 단백질 A를 준비하는 단계;
d) 상기 자성나노입자에 상기 C 말단에 시스테인을 포함하는 단백질 A를 고정화시키는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법에 있어서, 상기 d) 상기 자성나노입자에 상기 C 말단에 시스테인을 포함하는 단백질 A를 고정화시키는 단계에서는 상기 자성나노입자에 상기 시스테인의 티올기(SH)가 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법에 있어서, 상기 d) 상기 자성나노입자에 상기 C 말단에 시스테인을 포함하는 단백질 A를 고정화시키는 단계는 리신(lysine)의 반응성은 비활성화 시키고 시스테인(cystein)의 반응성은 활성화시키는 pH 5 내지 6 에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "자성나노입자"는 강자성을 띠는 입자로서 일반적으로 수 나노미터에서 수백 나노미터의 크기를 갖는 입자를 의미한다.
본 발명의 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법에 있어서, 상기 실리카 코팅된 자성나노입자는 50 nm 이하의 입자 크기로 형성됨으로써 단백질 A를 고정시킬 수 있는 표면적이 증대되며, 더욱 바람직하게는 20 nm 이하인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법에 있어서, 상기 나노자성체는 자성 금속 또는 자성금속 산화물일 수 있다. 예를 들면, 자성 금속은 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 희토류 원소(La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), 화폐금속 원소(Cu, Ag, Au), 아연족 원소(Zn, Cd, Hg), 알루미늄족원소(Al, Ga, In, Tl), 알칼리토금속 원소(Ca, Sr, Ba, Ra) 또는 백금족 원소(Pt, Pd)를 포함할 수 있다. 상기 자성금속 산화물(magnetic metal material)은 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 희토류 원소(La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), 화폐금속 원소(Cu, Ag, Au), 아연족 원소(Zn, Cd, Hg), 알루미늄족 원소(Al, Ga, In, Tl), 알칼리토금속 원소(Ca, Sr, Ba, Ra) 또는 백금족 원소(Pt, Pd)에의 산화물 또는 이들의 합금의 산화물일 수 있다. 바람직하기는, 상기 나노자성체는 자철광(magnetite; Fe3O4), 헤마타이트(hematite; α-Fe2O3), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe2O3), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법에 있어서, 상기 클로로계 실란은 ((chloromethyl)phenylethyltrimethoxysilane), chloromethylphenethyltris(trimethylsiloxy)silane, (p-Chloromethyl)phenyltrimethoxysilane,chloromethyltriethoxysilane, chloromethyltrimethoxysilane, chloromethyltrimethylsilane, chloromethyltris(trimethylsiloxy)silane, chlorophenyltriethoxysilane, p-Chlorophenyltriethoxysilane, p-Chlorophenyltrimethylsilane, 3-Chloropropyltriethoxysilane, 3-Chloropropyltrimethoxysilane, 3-Chloropropyltrimethylsilane, 3-Chloropropyltris (trimethylsiloxy)-silane, chlorosilane, 2-(4-Chlorosulfonylphenyl)ethyltrimethoxy silane, (dichloromethyl)trimethylsilane, triethylchlorosilane, trimethylchlorosilane, 2-(Trimethylsilyl)ethoxymethyl chloride, tris-(trimethylsiloxy)chlorosilane, vinyldiphenylchlorosilane, trivinyl-chlorosilane으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자를 이용한 항체 분리 및 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자를 이용한 항체의 분리정제방법은 상기 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자에 항체를 결합시키는 단계; 및 영구자석을 이용하여 상기 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자에 결합된 항체를 분리하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자를 이용한 항체의 분리정제방법에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG4, 마우스 IgG2a, IgG2b, IgG3, 래트 IgIgG2c, 소(Bovine) IgG2, 개(Dog) IgG, Goat IgG1, IgG2, 원숭이(Monkey) IgG, 토끼(Rabbit) IgG 및 양(Sheep) IgG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의한 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자는 실리카 코팅된 자성나노입자에 시스테인을 갖는 유전적으로 변형된 단백질 A를 일정방향으로 배향 고정시킴으로써, 단백질 A의 활성을 유지하면서 실리카 자성나노입자에 고정되는 단백질 A의 고정화 양이 크게 증가되어, 본 발명에 의한 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자를 이용하여 항체를 분리 정제시 항체의 초고속 및 고순도 분리정제가 가능한 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 실리카 코팅 자성나노입자의 크기를 나타내는 것으로, 도 1(a)는 투과전자현미경(TEM) 분석 사진이고, 도 1(b)는 동적 광 산란 기기(DLS) 분석 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 실리카 코팅 자성나노입자의 클로로실란 처리 정도를 나타내는 열중량분석(TGA) 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 클로로실란 처리된 실리카 코팅 자성나노입자의 자화력(magnetizing force) 분석 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 시스테인을 갖는 단백질A 를 발현 및 정제하여 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의하여 실리카 코팅 자성나노입자에 단백질 A의 고정화 과정을 나타내는 모식도이다.
도 5(a)는 종래 상용화되고 있는 단백질 A의 고정화 과정을 나타내는 것으로, 상용 단백질 A는 표면에 리신(L-Lysine) 잔기를 포함하며, 리신 잔기는 자성입자의 에폭시기와 반응하여 단백질 A의 기능적 활성을 감소시키는 비배향성(비방향성) 고정화 반응이 진행된다.
도 5(b)는 본 발명의 일 실시예에 의하여 유전적으로 변형된 단백질 A의 고정화 과정을 나타내는 것으로, 변형된 단백질 A는 표면에 시스테인(Cystein) 잔기를 포함하며, 이 때 시스테인 잔기는 클로로실란이 치환된 자성나노입자와 반응하여 단백질 A의 정상적인 기능적 활성을 유지하는 배향성(방향성) 고정화 반응이 진행된다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의하여 자성나노입자의 양에 따른 단백질 A의 고정화 양을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의하여 pH 조건에 따른 단백질 A의 고정화 양을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의하여 종래 상용화되고 있는 단백질 A의 미배향 고정화 양 대비 실시예 3에 따라 단백질 A의 배향 고정화 양을 나타내는 BCA 단백질 정량 분석 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의하여 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자를 이용하여 항체의 결합/분리 과정을 통한 항체 정제 과정을 나타내는 개략도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의하여 종래 상용화되고 있는 단백질 A가 미배향 고정된 자성입자의 항체 정제 용량 대비 실시예 3에 따라 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자의 항체 정제 용량을 나타내는 BCA 단백질 정량 분석 및 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의하여 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자를 이용하여 항체 정제를 3회 반복 사용시 항체 정제 효율을 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과이다.
본 발명을 첨부된 도면을 참고하여 이하 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 클로로실란이 치환된 실리카 코팅 자성나노입자(CTMS-MNPs@SiO 2 )의 제조
실시예 1-1: 실리카 코팅 자성나노입자( MNPs : Fe 3 O 4 @SiO 2 )의 제조
2 M의 FeCl2와 1 M의 FeCl3 용액을 각각 80 mL와 320 mL를 만들어 혼합한 후 교반하면서 0.7 M NH4OH 용액 4 L를 한 방울씩 떨어뜨려 용액의 색깔이 검정색으로 변하게 한 후, 원심분리를 통해 생성물을 물과 에탄올로 세척한 다음 건조시켜 Fe3O4 자성나노입자를 얻었다.
합성한 Fe3O4 자성나노입자 표면에 Silica를 코팅하기 위하여 Fe3O4 자성나노입자를 100 ml cyclohexane에 넣고 3.3 ml oleic acid를 첨가하여, 초음파 분산기(ultrasonification)로 30분 이상 분산시킨 후, Igepal CO-520, cyclohexane, NH4OH 및 TEOS (tetraethyl orthosilicate)를 첨가하여 20 시간 교반한 후, methanol을 이용한 세척 과정을 통해 실리카로 코팅된 코어-쉘 형태의 실리카 코팅 자성나노입자를 제조하였다.
< 실험예 1> 입도 분석
상기 실시예 1-1에서 제조된 실리카 코팅 자성나노입자의 크기를 TEM과 DLS를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 1에 도시하였다.
도 1 에서 보는 바와 같이, TEM 분석을 통하여 자성나노입자는 20 nm 정도의 구형의 균일한 입자 크기를 가지고 있는 것으로 확인되며, DLS 입도분석 결과, 평균 입경은 약 18.4 nm 인 것을 알 수 있다.
실시예 1-2: 실리카 코팅 자성나노입자에 기능기 합성(CTMS-MNPs@SiO 2 )
상기 실시예 1-1에서 제조된 실리카 코팅 자성나노입자를 Toluene에 넣고 약 1시간 동안 초음파 처리하여 분산시킨 후 실온에서 2시간 동안 교반시켰다.
교반이 종료되면 CTMS ((Chloromethyl)phenylethyl-trimethoxysilane)을 넣고, 질소 분위기에서 100 ℃로 8 시간 reflux시켰다. 이후 Toluene으로 세척하여 최종적으로 염소그룹이 치환된 실리카 코팅 자성나노입자 (이하, " CTMS-MNPs@SiO2 "라 약칭함)를 제조하였다.
< 실험예 2> 열중량분석 ( TGA )
상기 실시예 1-2에서 제조된 실리카 코팅 자성나노입자의 클로로실란의 결합을 확인하기 위하여, 열중량분석(TGA)을 실시하였고 그 결과를 도 2에 도시하였다.
도 2에서 보는 바와 같이, 상기 CTMS-MNPs@SiO2 입자는 열중량의 변화를 통하여 표면에 염소그룹이 15% 정도 결합되었음을 확인할 수 있다.
< 실험예 3> 자화력 (magnetizing force) 분석
상기 실시예 1-2에서 제조된 CTMS-MNPs@SiO2 입자의 자화력을 분석하였고, 그 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 CTMS-MNPs@SiO2 입자는 약 37.91 emu/g의 자화력을 가지고 있음을 확인할 수 있다.
< 실시예 2> 시스테인을 포함하는 변형된 단백질 A( cystein -Protein A)의 제조
단백질 A의 c-terminal 부분에 cystein을 도입하기 위하여, 유전자 합성을 하여 pET28b vector에 클로닝하였다.
상기 클로닝한 단백질 시퀀스는 아래와 같다.
MNAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKA
DAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK
ADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKAD
NKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNK
FNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDSLEC
상기 vector를 BL21 E.coli에 transformation 한 후 IPTG를 이용하여 과발현시켰다. 그 다음 Ni-NTA beads를 이용하여 시스테인을 갖는 변형된 단백질 A (이하, " cys-Protein A"라 약칭함)를 정제하였다.
< 실험예 4> SDS- 폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석
상기 실시예 2에서 제조된 cys-Protein A 를 발현 및 정제하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 분석하여 도 4에 도시하였다.
도 4에서 보는 바와 같이, 약 40 kDa에서 Induction되었으며 Ni-NTA bead의 정제한 후 순도 95% 이상으로 정제되었음을 확인할 수 있다.
< 실시예 3> 자성나노입자에 단백질 A의 고정화
Cys-Protein A의 배향 고정화를 위해 상기 실시예에서 제조된 1 mg의 CTMS-MNPs@SiO2 에 Cys-Protein A 을 각 25, 50, 100, 200, 300 ㎍/㎕의 농도로 첨가하여 Cys-Protein A의 첨가량에 따른 고정화 반응을 수행하였다.
이 때 고정화 양에 영향을 미치는 최적의 pH 조건을 확인하기 위하여, pH 농도를 변화시키며 반응을 수행하고, pH 5 에서 9까지 50 mM Citrate buffer(pH5) 및 50 mM sodium phosphate buffer(pH6-9)를 이용하여 pH를 조절하였다.
상기 CTMS-MNPs@SiO2 에 첨가된 Cys-Protein A 를 50 mM PB (pH7.0)버퍼로 재현탁하였다. 재현탁된 각 시료를 교반하고, 5시간 동안 로터리쉐이킹하여 인큐베이트하였다. 상기 재현탁 시료에 자석을 이용하여 단백질 A가 고정된 CTMS-MNPs@SiO2 입자를 정제하고, 정제한 후에 1.0 ㎖ 50 mM PB 버퍼(pH 7.0)로 3회 세척하였다.
이상의 과정을 통해 도 5(b)에서 보는 바와 같이, CTMS-MNPs@SiO2 입자에 cys-Protein A가 고정된다.
< 실험예 5> 자성나노입자에 단백질 A의 최적의 고정화 양 분석
상기 실시예 3에 따라 CTMS-MNPs@SiO2 입자의 양 증가에 따른 cys-Protein A의 최적의 고정화 양을 분석하여 그 결과를 도 6에 도시하였다.
도 6에서 보는 바와 같이, cys-Protein A의 양이 200 ㎍/㎕ 이상이 되었을 때 saturation 되었으며 1 mg 자성나노입자당 최대 80 ug의 cys-Protein A가 고정화되었음을 확인할 수 있다.
< 실험예 6> 자성나노입자에 단백질 A의 최적의 고정화 pH 분석
cys-Protein A의 고정화 양에 영향을 미치는 최적의 pH 조건을 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 50 mM Citrate buffer (pH5), 50 mM sodium phosphate buffer (pH6), 50 mM sodium phosphate buffer (pH7), 50 mM sodium phosphate buffer (pH8), 50 mM sodium phosphate buffer (pH9) 를 이용하여 pH를 5 내지 9 범위에서 변화시키면서 CTMS-MNPs@SiO2 입자에 고정화된 cys-Protein A 의 양을 분석하였고, 그 결과를 도 7에 도시하였다.
도 7에서 보는 바와 같이, pH 농도가 높아질수록 cys-Protein A의 고정화 양은 감소하는 것을 알 수 있다.
또한, lysine의 반응은 비활성화 되고 cystein의 반응은 활성화되어 배향성이 우수하게 나타나는 최적의 pH는 5 내지 6인 것을 확인하였다.
< 실험예 7> 상용 단백질 A- 자성비드(Dynalbead@protein A)와 고정화 양 비교 분석
상기 실시예 3에 따라 cys-Protein A 가 배향 고정된 자성나노입자와 비교예로서 상용화되고 있는 Protein A가 미배향 고정된 자성입자(Dynalbead@protein A)의 고정화 양을 확인하기 위해 BCA 단백질 정량 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 8에 도시하였다.
도 8에서 보는 바와 같이, 상용화 되고 있는 Dynalbead@protein A 대비 본 발명에 의한 cys-Protein A 가 배향 고정된 자성나노입자의 경우, 11배 이상 고정화 양이 증가한 것을 확인할 수 있다.
< 실시예 4> 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자를 이용한 항체 정제
상기 실시예 3에 따라 제조된 cys-Protein A 가 배향 고정된 자성나노입자를 이용하여 항체를 정제하였고, 그 과정을 도 9에 도시하였다.
cys-Protein A 가 배향 고정된 자성나노입자 1 mg에 항체를 각 100, 200 ㎍/㎕의 농도로 첨가하여 50 mM PB (pH7.0)버퍼로 재현탁하였다. 각 재현탁액 시료를 교반하고, 1시간 동안 로터리쉐이킹하여 인큐베이트하였다. 상기 시료에 자석을 이용하여 cys-Protein A 가 배향 고정된 자성나노입자를 분리한 후 1.0 ㎖ 50 mM PB 버퍼(pH 7.0)로 3회 세척하였다.
상기 cys-Protein A 가 배향 고정된 자성나노입자로부터 항체를 분리하기 위하여 0.2 M glycine (pH 2.8)을 이용하여 분리한 후 자석을 이용하여 cys-Protein A 가 배향 고정된 자성나노입자를 제거하였다. 그 다음 1 M Tris-HCl (pH 9) 버퍼를 이용하여 항체를 중성화하였다.
< 실험예 8> 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자의 항체 정제 용량 분석
상기 실시예 4에서 cys-Protein A 가 배향 고정된 자성나노입자를 이용한 항체 정제 용량을 분석하기 위하여, BCA 단백질 정량 분석 및 SDS-PAGE 분석을 실시하였고 그 결과를 도 10에 도시하였다.
도 10에서 보는 바와 같이, 상기의 cys-Protein A 가 배향 고정된 자성나노입자 1 mg에 항체 100, 200, 400 ug 을 섞어서 항체 결합 정도를 확인한 결과, 상용화 되고 있는 Dynalbead@protein A 대비 본 발명에 의한 cys-Protein A 가 배향 고정된 자성입자의 경우, 약 7 배 이상의 항체 정제 용량이 증가한 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 9> 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자의 재사용 정제 효율 분석
상기 실시예 4에 따라 제조된 cys-Protein A 가 배향 고정된 자성나노입자를 이용한 항체 정제 과정을 3 회 반복시 항체 정제 효율을 분석하기 위하여 SDS-PAGE 분석을 실시하였고 그 결과를 도 11에 도시하였다.
도 11에서 보는 바와 같이, 상기의 cys-Protein A 가 배향 고정된 자성나노입자를 3회 반복 사용 후에도 약 80%의 항체와 결합 및 분리가 가능한 것 볼 수 있다. 이와 같은 결과를 통해 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자의 우수한 정제 효율을 확인할 수 있다.

Claims (8)

  1. a) 중심핵(core)으로 50 nm 이하의 나노자성체 산화물을 포함하는 실리카 코팅된 자성나노입자를 준비하는 단계;
    b) 상기 실리카 코팅된 자성나노입자는 클로로계 실란으로 표면 처리하는 단계;
    c) C 말단에 시스테인(cystein)을 포함하는 단백질 A를 준비하는 단계;
    d) 상기 자성나노입자에 상기 C 말단에 시스테인을 포함하는 단백질 A를 고정화시키는 단계; 를 포함하는
    단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성나노입자에 상기 C 말단에 시스테인을 포함하는 단백질 A를 고정화시키는 단계에서는 상기 자성나노입자에 상기 시스테인의 티올기(SH)가 결합되는 것을 특징으로 하는
    단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 상기 자성나노입자에 상기 C 말단에 시스테인을 포함하는 단백질 A를 고정화시키는 단계는 리신(lysine)의 반응성은 비활성화시키고 시스테인(cystein)의 반응성은 활성화시키는 pH 5 내지 6 에서 수행되는 것을 특징으로 하는
    단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노자성체는 자철광(magnetite; Fe3O4), 헤마타이트(hematite; α-Fe2O3), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe2O3), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 클로로계 실란은 ((chloromethyl)phenylethyltrimethoxysilane), chloromethylphenethyltris(trimethylsiloxy)silane, (p-Chloromethyl)phenyltrimethoxysilane,chloromethyltriethoxysilane, chloromethyltrimethoxysilane, chloromethyltrimethylsilane, chloromethyltris(trimethylsiloxy)silane, chlorophenyltriethoxysilane, p-Chlorophenyltriethoxysilane, p-Chlorophenyltrimethylsilane, 3-Chloropropyltriethoxysilane, 3-Chloropropyltrimethoxysilane, 3-Chloropropyltrimethylsilane, 3-Chloropropyltris (trimethylsiloxy)-silane, chlorosilane, 2-(4-Chlorosulfonylphenyl)ethyltrimethoxy silane, (dichloromethyl)trimethylsilane, triethylchlorosilane, trimethylchlorosilane, 2-(Trimethylsilyl)ethoxymethyl chloride, tris-(trimethylsiloxy)chlorosilane, vinyldiphenylchlorosilane, trivinyl-chlorosilane으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는
    단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자의 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 제조 방법에 의하여 제조된 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자.
  7. 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자에 항체를 결합시키는 단계; 및
    영구자석을 이용하여 상기 단백질 A가 배향 고정된 자성나노입자에 결합된 항체를 분리하는 단계; 를 포함하는
    제 6 항에 의한 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자를 이용한 항체의 분리정제방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG4, 마우스 IgG2a, IgG2b, IgG3, 래트 IgIgG2c, 소(Bovine) IgG2, 개(Dog) IgG, Goat IgG1, IgG2, 원숭이(Monkey) IgG, 토끼(Rabbit) IgG 및 양(Sheep) IgG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 A가 배향 고정된 실리카 자성나노입자를 이용한 항체의 분리정제방법.
KR1020170050476A 2017-04-19 2017-04-19 단백질 a가 배향 고정된 실리카 자성나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 정제방법 KR20180117405A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170050476A KR20180117405A (ko) 2017-04-19 2017-04-19 단백질 a가 배향 고정된 실리카 자성나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 정제방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170050476A KR20180117405A (ko) 2017-04-19 2017-04-19 단백질 a가 배향 고정된 실리카 자성나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 정제방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180117405A true KR20180117405A (ko) 2018-10-29

Family

ID=64101221

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170050476A KR20180117405A (ko) 2017-04-19 2017-04-19 단백질 a가 배향 고정된 실리카 자성나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 정제방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20180117405A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102291376B1 (ko) * 2020-07-02 2021-08-23 경희대학교 산학협력단 자성입자, 그 제조방법 및 그를 이용한 이산화티타늄의 분리방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102291376B1 (ko) * 2020-07-02 2021-08-23 경희대학교 산학협력단 자성입자, 그 제조방법 및 그를 이용한 이산화티타늄의 분리방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bordbar et al. Characterization of modified magnetite nanoparticles for albumin immobilization
Li et al. Biosynthesis of nanoparticles by microorganisms and their applications
Ma et al. Synthesis of magnetic silica nanospheres with metal ligands and application in affinity separation of proteins
US7868145B2 (en) Magnetic particles containing a copolymer core, magnetic layer and silicon layer
Cui et al. Synthesis of orientedly bioconjugated core/shell Fe3O4@ Au magnetic nanoparticles for cell separation
JP5678565B2 (ja) 磁性微粒子およびその製造方法
CN107614458B (zh) 稳定的纳米磁性颗粒分散体
JP6452704B2 (ja) 磁性粒子の製造
IE870658L (en) Coated chromium dioxide particles for use in immunoassay
Šulek et al. Immobilization of cholesterol oxidase to finely dispersed silica-coated maghemite nanoparticles based magnetic fluid
US6844426B2 (en) Magnetic carrier capable of binding with protein and purification method of protein utilizing the magnetic carrier
CN101521067B (zh) 一种核/壳型磁性微粒制品的制备方法和应用
EP3314616B1 (en) Entrapment of magnetic nanoparticles in a cross-linked protein matrix without affecting the functional properties of the protein
Wang et al. Synthesis of hierarchical nickel anchored on Fe 3 O 4@ SiO 2 and its successful utilization to remove the abundant proteins (BHb) in bovine blood
KR20060061494A (ko) 핵산(ｄｎａ/ｒｎａ) 분리정제용 기능성 실리카자성나노입자 및 그 제조방법
Li et al. Surface sieving coordinated IMAC material for purification of His-tagged proteins
KR20180117405A (ko) 단백질 a가 배향 고정된 실리카 자성나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 정제방법
KR101135054B1 (ko) 단백질 분리용 나노입자, 그 제조 방법 및 이를 이용한 단백질 분리 정제 방법
KR101077966B1 (ko) 펩티드 분리용 나노입자, 그 제조방법 및 이를 이용한 펩티드 분리방법
KR20090017434A (ko) 자성-표면증강 라만산란 입자, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 바이오센서
KR100762969B1 (ko) 기능성 실리카 코팅 자성 나노입자를 이용한 고효율의 핵산및 단백질의 선택적 분리정제 방법
CN101354938B (zh) 分离用磁性颗粒及其制备方法和应用
KR20170055171A (ko) 단백질 a가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자를 이용한 항체 분리 및 정제방법
JP3979949B2 (ja) タンパク質と結合し得る磁性担体およびそれを利用したタンパク質の精製方法
CN110531075A (zh) 基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application