KR20090017434A - 자성-표면증강 라만산란 입자, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 바이오센서 - Google Patents

자성-표면증강 라만산란 입자, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 바이오센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자성-표면증강 라만산란 입자(M-SERS dots) 및 이의 제조방법, 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다. 구체적으로는 입자 응집체 및 상기 입자 응집체 주변을 둘러싸는 실리카 껍질을 포함하는 자성-표면증강 라만산란 입자로서, 상기 입자 응집체는 자성물질을 포함하는 자성 중심입자; 상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자; 및 상기 은나노 입자 주변에 고정된 표지물질을 포함하는 입자가 1개 이상 응집되어 형성된 것인 자성-표면증강 라만산란 입자, 및 이의 제조방법에 관한 것이며, 상기 자성-표면증강 라만산란 입자; 상기 자성-표면증강 라만산란 입자 표면에 도입된 작용기; 및 상기 작용기에 부착된 리셉터를 포함하는 바이오센서, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바이오센서는 자성물질과 은나노 입자를 포함한 자성-표면증강 라만산란 입자를 이용함으로써, 핫스팟의 유도가 효율적으로 이루어지고, 상기 바이오센서에 결합된 물질의 검출이 용이하다는 장점을 가진다. 또한, 본 발명에 따른 바이오센서는 라벨 프리이거나 라벨의 개수에 특별한 제한이 없고 무독성인 특성을 가져, 특히 바이오물질의 검출이 중요한 의학 및 약학 등의 분야에 다양하게 이용될 수 있다.
자성-표면증강 라만산란 입자, 바이오센서, 은나노 입자, 자성입자, 핫스팟

Description

자성-표면증강 라만산란 입자, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 바이오센서{MAGNETIC ACTIVE SURFACE ENHANCED RAMAN SCATTERING NANO PARTICLE, METHOD FOR PRODUCTION THEREOF, AND BIOSENSOR USING THE SAME}
본 발명은 자성-표면증강 라만산란 입자, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다. 특히 본 발명은 자성물질과 은나노 입자를 포함하여, 핫스팟(hot spot)의 유도가 효율적으로 이루어지고, 상기 바이오센서에 결합된 물질의 검출이 용이하다는 장점을 가지며, 라벨 프리이거나 라벨의 개수에 특별한 제한이 없고 무독성인 특성을 가지는 자성-표면증강 라만산란 입자에 관한 것이다.
생체 분석 과학 및 바이오 엔지니어링에 있어서의 진보에 따라 제노믹스 및 프로테오믹스에서의 최근의 연구는 보다 많은 시퀀스 데이터를 생산한다. 따라서, 많은 수의 생체 분자들 및 그것들의 리간드를 동시에 신속하게 스크리닝할 수 있는 새로운 기술들에 대한 수요가 있다.
이에 처음에는 방사성 동위원소를 이용한 물질 분석 방법이 개발되었다. 그 러나 이 방법은 인체에 해로운 방사선을 방출한다는 점 및 반감기가 길어 오랜 기간 저장된다는 문제가 있었다.
이후, 형광계 나노 물질이 개발되어 생물학적 응용에 있어 가장 넓게 이용되었다. 그러나, 형광계 나노 물질의 이용 방법은 포토블리칭(photobleaching), 넓은 방출 프로파일을 가지는 좁은 여기 영역, 다중 시험에 있어서 피크의 오버랩 및 표지물질의 수에 제한이 있다는 등의 문제가 있었다.
이에 최근에는 양자점을 이용한 방법이 개발되어 사용되었다. 그러나 이 역시 제조과정 중에 카드뮴 등의 사용으로 독성이 있고 표면 개질 시에 양자점의 고유의 색을 잃어버리는 문제가 발생하고 표지물질의 수가 제한된다는 등의 문제점이 있었다.
이에 포토블리칭이 없고, 라벨 프리이거나 많은 종류의 표지물질이 존재하여 표지개수에 제한이 없으며, 독성이 낮거나 없고, 물질의 효율적인 검출을 가능케 하는 입자의 개발이 요구된다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 자성-표면증강 라만산란 입자, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 입자 응집체 및 상기 입자 응집체 주변을 둘러싸는 실리카 껍질을 포함하는 자성-표면증강 라만산란 입자로서, 상기 입자 응집체는 자성물질을 포함하는 자성 중심입자; 상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자; 및 상기 은나노 입자 주변에 고정된 표지물질을 포함하는 입자가 1개 이상 응집되어 형성된 것인 자성-표면증강 라만산란 입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 자성물질을 포함하는 자성 중심입자 표면에 은나노 입자를 도입하는 단계; 상기 은나노 입자 주변에 표지물질을 고정하는 단계; 상기 자성 중심입자, 상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자, 및 상기 은나노 입자 주변에 고정된 표지물질을 포함하는 입자를 1개 이상 응집시켜 입자 응집체를 제공하는 단계; 및 상기 입자 응집체 주변에 실리카 껍질을 형성하는 단계를 포함하는 자성-표면증강 라만산란 입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 자성-표면증강 라만산란 입자; 상기 자성-표면증강 라만산란 입자 표면에 도입된 작용기; 및 상기 작용기에 부착된 리셉터를 포함하는 바이오센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 바이오센서를 이용하는 것을 특징으로 하는, 상기 바이오센서의 리셉터와 결합하거나 반응하는 표적 바이오물질의 검출방법으로서, 상기 검출은 라만산란, 자기장, 또는 라만산란 및 자기장을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 자성-표면증강 라만산란 입자 및 은나노 자성입자는 핫스팟의 효율적인 형성이 가능하므로 라만 분석이 용이하며, 라벨 프리이거나 많은 종류의 표지물질이 존재하여 표지물질에 제한이 없어, 물질의 검출이 중요한 의학 및 약학 등의 분야에 광범위하게 이용될 수 있다. 또한, 상기 자성-표면증강 라만산란 입자 및 은나노 자성입자는 포토블리칭이 없고, 독성이 낮거나 없어, 물질의 효율적인 검출을 가능케 하는 효과를 가진다.
상술한 목적, 특징들 및 장점은 첨부된 도면과 관련한 다음의 설명을 통하여 보다 분명해 질 것이다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다.
정의
본 발명에 이용되는 용어의 정의는 다음과 같다.
본 발명에 있어서, "자성 중심입자"는 자성물질을 포함하는 입자를 의미한다.
본 발명에 있어서, "자성-표면증강 라만산란 입자(M-SERS dots)"는 입자 응집체 및 상기 입자 응집체 주변을 둘러싸는 실리카 껍질을 포함하는 입자를 의미한다. 여기서, 상기 입자 응집체는 자성물질을 포함하는 자성 중심입자; 상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자; 및 상기 은나노 입자 주변에 고정된 표지물질을 포함하는 입자가 1개 이상 응집되어 형성된 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, "은나노 자성입자(Ag-M dots)"는 자성물질을 포함하는 자성 중심입자; 및 상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자를 포함하는 입자가 1개 이상 응집되어 이루어진 입자를 의미한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 입자 응집체 및 상기 입자 응집체 주변을 둘러싸는 실리카 껍질을 포함하는 자성-표면증강 라만산란 입자로서, 상기 입자 응집체는 자성물질을 포함하는 자성 중심입자; 상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자; 및 상기 은나노 입자 주변에 고정된 표지물질을 포함하는 입자가 1개 이상 응집되어 형성된 것인 자성-표면증강 라만산란 입자를 제공한다.
자성 중심입자는 자성물질을 포함하는 입자이며, 상기 자성물질은 자기적 성질을 가지는 물질이다. 자성 중심입자는 본 발명에 따른 바이오센서에 자기적 성질을 부여하여 핫스팟의 유도 및 표적 바이오물질의 검출을 용이하게 한다. 상기 자성물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, MM'2O4, MxOy(M 또는 M'=Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, Cr, 0<x≤3, 0<y≤5) 등이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 자성 중심입자는 자성물질이 선택적으로 실리카 코팅된 입자로서, 자성물질 및 상기 자성물질을 둘러싸는 실리카 코팅을 포함하는 입자일 수 있다. 자성물질이 실리카 코팅되어 이루어진 자성 중심입자의 경우, 크기가 20 ㎚ 내지 300 ㎚인 것이 바람직하며, 40 ㎚ 내지 80 ㎚인 것이 보다 바람직하나, 이에 제 한되는 것은 아니다. 상기 중심입자의 크기가 20 ㎚ 미만이면 라만 표면증강 효과가 작아질 수 있고, 300 ㎚를 초과하면 생물학적 응용시 제약을 받을 수 있다.
상기 실리카 코팅은 자성물질을 상기 자성 중심입자 내부에 고정하며, 이후 자성-표면증강 라만산란 입자를 형성하는 과정에서 상기 자성물질을 보호하고, 자성 중심입자의 표면 개질을 용이하게 하며, 자성 중심입자의 크기를 조절할 수 있도록 하는 역할을 한다. 상기의 역할을 수행함과 동시에 자성-표면증강 라만산란 입자에 있어서 상기 자성물질의 자기적 성질이 충분히 발휘될 수 있도록 하기 위해서는, 상기 실리카 코팅의 두께가 100 ㎚이하인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 자성 중심입자 표면에 도입되는 은나노 입자는 라만산란 분광법의 이용을 용이하게 한다. 상기 밀집된 은나노 입자 간에는 핫스팟 또는 나노정션(nano junction)이라고 불리는 접점이 존재하게 되는데, 이 위치에서는 증강된 라만산란(surface enhanced Raman scattering) 현상이 더욱 강하게 발생하게 된다. 즉, 이러한 밀집된 은나노 입자는 라만 분광법을 기반으로 하는 본 발명의 나노-표지 입자의 응용을 보다 용이하게 해 줄 수 있다는 이점이 있다. 도입되는 은나노 입자의 크기는 100 ㎚이하인 것이 바람직하며, 8 ㎚ 내지 20 ㎚인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 은나노 입자의 크기가 100 ㎚를 초과하면 라만산란에 대한 신호 증강이 작아질 수 있다. 또한, 상기 은나노 입자의 크기가 10 ㎚이하인 경우에도 라만산란에 대한 신호 증강이 작아질 수 있지만, 자기장에 의해 핫스팟을 유도하면 적용이 가능하다.
은나노 입자가 도입된 자성 중심입자에 표지물질을 도입하기 이전에, 극성고분자의 도입이 이루어질 수 있다. 이와 같이 도입된 극성고분자는 이후 실리카 껍질의 형성을 용이하게 하는 역할을 수행할 수 있다.
상기 표지물질은 은나노 입자와 결합력이 있는 화학물질인 것이 바람직하며, 간단한 구조를 가지면서도 뚜렷한 지문 영역에서 라만 스펙트럼을 보여줄 수 있다. 이 때문에 상기 표지물질은 본 발명에 따른 자성-표면증강 라만산란 입자를 포함하는 바이오센서를 이용한 표적 바이오물질의 검출을 용이하게 한다.
본 발명에서 이용될 수 있는 표지 물질은 4-머켑토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머켑토 피리미딘(2-MPY), 2-머켑토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF) 및 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람 직하나, 은나노 입자와 결합력이 있는 화학물질이면 제한되지 않고 이용될 수 있다. 본 발명은 상기와 같이 라만 표지물질의 개수가 많고 이들의 임의의 조합도 가능하므로, 표지물질의 개수에 제한이 없는 것과 마찬가지의 효과가 있다. 상기에서 "은나노 입자와 결합력이 있는 화학물질"은 말단에 티올기(-SH), 아민기(-NH2), 시아나이드기(-CN), 이소시아나이드기(-CNO), 이소티오시아나이드기(-CNS), 다이설파이드기(-SS-) 또는 아자이드기(-N3)가 존재하는 화학물질을 의미하며, 이와 같이 말단에 티올기, 아민기, 시아나이드기, 이소시아나이드기, 이소티오시아나이드기, 다이설파이드기 또는 아자이드기가 있는 화학물질은 은나노 입자와 강한 친화력이 있으므로, 본 발명에 바람직하게 이용될 수 있다.
상기 자성-표면증강 라만산란 입자 또는 은나노 자성입자 형성 중의 응집은 은나노 입자의 도입으로 자성 중심입자의 실리카 코팅 표면의 정전기적 반발력이 작아지고, 이로 인해 입자들 간의 반발력이 약해져 이루어지는 현상이다.
본 발명에 따른 자성-표면증강 라만산란 입자는 상기 입자 응집체 주변을 둘러싸는 실리카 껍질을 포함한다. 상기 실리카 껍질은 자성-표면증강 라만산란 입자의 표면 개질을 용이하게 하며, 자성-표면증강 라만산란 입자의 크기를 조절할 수 있도록 하는 역할을 수행한다. 상기 실리카 껍질은 두께가 5 ㎚ 내지 10 ㎚인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 실리카 껍질의 두께가 5 ㎚ 미만으로 너무 얇게 되면 표지물질이 코팅된 은나노 입자를 외부 환경으로부터 보호하기 어렵고, 10 ㎚를 초과하게 되면 세포나 조직 등에의 생물학적 응용시 제약이 될 수 있다.
본 발명에 따른 자성-표면증강 라만산란 입자의 크기는 적용되는 조건에 따라 제한없이 다양하게 변화될 수 있다. 본 발명에 따른 자성-표면증강 라만산란 입자는 크기가 36 ㎚ 내지 8 ㎛인 것이 바람직하며, 50 ㎚ 내지 800 ㎚인 것이 보다 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 자성-표면증강 라만산란 입자의 크기가 36 ㎚ 미만이면 표면 개질이 어렵고, 라만산란에 대한 신호 증강이 낮아질 수 있으며, 8 ㎛를 초과하면 세포와의 결합 효율이 낮아질 수 있다.
또한, 본 발명은 자성물질을 포함하는 자성 중심입자 표면에 은나노 입자를 도입하는 단계; 상기 은나노 입자 주변에 표지물질을 고정하는 단계; 상기 자성 중심입자, 상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자, 및 상기 은나노 입자 주변에 고정된 표지물질을 포함하는 입자를 1개 이상 응집시켜 입자 응집체를 제공하는 단계; 및 상기 입자 응집체 주변에 실리카 껍질을 형성하는 단계를 포함하는 자성-표면증강 라만산란 입자의 제조방법을 제공한다. 자성물질, 자성 중심입자, 은나노 입자, 표지물질, 입자 응집체 및 실리카 껍질 등에 관한 내용은 상술한 바와 같다.
자성물질이 실리카 코팅되어 이루어진 자성 중심입자의 경우, 상기 자성물질에의 실리카 코팅은 실리카 전구 물질을 이용하는 방법, 또는 마이크로 에멀젼법 등 공지의 방법에 따라 이루어질 수 있다.
상기 자성 중심입자 표면에 은나노 입자를 도입하는 단계는 공지의 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 자성 중심입자에 3-머켑토프로필트리에톡시실란을 첨가하여 상기 자성 중심입자 표면에 티올기(-SH)를 도입한 이후, 은나노 입자를 가하는 방법과 같은 공지의 방법이 이용될 수 있다.
상기 은나노 입자 주변에 표지물질을 고정하는 단계는 공지의 임의의 방법에 따라 이루어질 수 있다. 고정되는 표지물질의 종류 및 상기 표지물질의 고정을 용이하게 하는 작용기에 대하여는 상술한 바와 같다.
상기 자성 중심입자, 상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자, 및 상기 은나노 입자 주변에 고정된 표지물질을 포함하는 입자를 1개 이상 응집시켜 입자 응집체를 제공하는 단계는 상기 자성 중심입자의 실리카 코팅 표면의 (-) 전하 반발력이 은나노 입자의 도입으로 많은 부분 상쇄되고, 이로 인해 상기 입자들 간의 반발력이 약해져 이루어질 수 있다.
상기 입자 응집체 주변에 실리카 껍질을 형성하는 단계는 테트라에틸 오르소실리케이트 또는 테트라메틸 오르소실리케이트 등과 같은 실리카 전구 물질을 이용하여 공지된 방법에 따라 이루어질 수 있다.
한편, 본 발명은 자성-표면증강 라만산란 입자; 상기 자성-표면증강 라만산란 입자 표면에 도입된 작용기; 및 상기 작용기에 부착된 리셉터를 포함하는 바이오센서를 제공한다. 자성-표면증강 라만산란 입자에 대하여는 상술한 바와 같다.
상기 자성-표면증강 라만산란 입자 표면에 도입될 수 있는 작용기는 바이오센서에 일반적으로 이용될 수 있는 작용기로서, 아민기, 티올기, 카르복시기 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 작용기는 표적물질이 결합되는 리셉터와 본 발명에 따른 자성-표면증강 라만산란 입자를 연결해주는 역할을 한다. 이와 같은 작용기가 존재함으로써 다양한 리셉터를 작용기에 부착시킬 수 있으며, 이에 의해 결과적으로 본 발명에 따른 바이오센서가 다양한 표적물질을 검출할 수 있게 된다.
또한 상기 작용기에 부착되는 리셉터 역시 바이오센서에 일반적으로 이용될 수 있는 리셉터로서, 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 지질, 코펙터, 탄수화물, 또는 항체 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 각 리셉터는 그에 상응하는 특정 표적물질과 결합 또는 반응이 가능하며, 이후 리셉터를 통해 특정 표적물질과 결합 또는 반응이 이루어진 바이오센서를 자기장, 라만산란, 또는 자기장 및 라만산란을 이용하여 확인할 수 있다. 이로써 본 발명에 따른 바이오센서는 다양한 표적물질을 선택적으로 검출하는 것을 가능케 한다.
또한, 본 발명은 자성-표면증강 라만산란 입자 표면에 작용기를 도입하는 단계; 및 상기 작용기에 리셉터를 부착시키는 단계를 포함하는 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
상기 자성-표면증강 라만산란 입자 표면에 작용기를 도입하는 단계 및 상기 작용기에 상응하는 리셉터의 부착방법은 공지의 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 등록특허 제10-0525764호는 아미노알킬옥시실란 등을 이용하여 작용기로 아민기를 도입하는 방법을 개시하고 있고, 등록특허 제20-0525764호 및 제10-0549051호 등은 티올기의 도입방법 및 상기 티올기에 상응하는 리셉터의 부착방법을, 등록 특허 제10-0580642호 등은 카르복시기의 도입방법 및 상기 카르복시기에 상응하는 리셉터의 부착방법을 개시하고 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 바이오센서를 이용하는 것을 특징으로 하는, 상기 바이오센서의 리셉터와 결합하거나 반응하는 표적 바이오물질의 검출방법으로서, 상기 검출은 라만산란, 자기장, 또는 라만산란 및 자기장을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 표적 바이오 물질은 바이오센서의 리셉터와 반응하거나 결합하여 검출되는 표적 역할을 할 수 있는 물질로서, 바람직하게는 효소, 단백질, 핵산, 올리고당, 펩티드, 아미노산, 탄수화물, 지질, 세포, 암세포, 암줄기세포, 항원, 압타머 또는 기타 생체유래의 생물분자이며, 더욱 바람직하게는 질병에 관련된 단백질이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 암세포는 유방암세포, 폐암세포 및 백혈병세포 중 어느 하나임이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검출은 본 발명에 따른 자성-표면증강 라만산란 입자의 특성인 핫스팟에 의한 라만산란 효과 및 자성물질에 기인한 자기적 성질을 이용하여 이루어진다. 상기 라만산란 효과는 표지물질의 라만산란을 탐지하여 표적 바이오물질의 검출을 가능케 한다. 이 경우 공초점 라만 시스템(confocal Raman system, LabRam 300, JY-Horiba, Edison, NJ, USA)으로 라만 분석을 수행하여 분석함으로써 상기 표적 바이오물질을 검출할 수 있다. 또한, 자기적 성질은 상기 자성-표면증강 라만산란 입자를 이용한 바이오센서와 결합하거나 반응한 표적물질의 자기장에 의한 검출을 용이하게 한다. 상기 표적물질의 검출을 용이하게 하기 위해서는 자기장의 세기가 100 내지 7000가우스임이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 자성 중심입자가 자성물질을 포함함으로써 상기 자성-표면증강 라만산란 입자들은 자기장에 의한 응집이 가능하므로, 상기 자성-표면증강 라만산란 입자는 기존의 표면증강 라만산란 나노입자(SERS dots) 보다 더 우수한 신호증폭효과(핫스팟의 효과 및 응집효과)를 나타낸다. 또한 이와 같은 효과에 따라 자기장에 의해 응집시킨 자성-표면증강 라만산란 입자는 응집하지 않은 분산된 형태의 자성-표면증강 라만산란 입자에 비해 1000배 이상 라만신호를 증폭시킬 수 있기 때문에 매우 효율적인 표적물질 검출방법을 제공할 수 있다. 따라서, 이는 라만 분광법을 기반으로 하는 본 발명의 나노-표지 입자의 응용을 보다 용이하게 해 줄 수 있다는 이점이 있다.
한편, 본 발명은 자성물질을 포함하는 자성 중심입자; 및 상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자를 포함하는 입자가 1개 이상 응집되어 이루어진 은나노 자성입자를 제공한다. 자성 중심입자, 은나노 입자, 응집에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 자성물질을 포함하는 자성 중심입자 표면에 은나노 입자를 도입하는 단계; 및 상기 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자를 1개 이상 응집시키는 단계를 포함하는 은나노 자성입자의 제조방법을 제공한다. 자성 중심입자 표면에 은나노 입자를 도입하는 단계에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
상기 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자의 응집 단계는 상기 자성 중심입 자의 실리카 코팅 표면의 (-) 전하 반발력이 은나노 입자의 도입으로 감소되며, 이로 인해 상기 입자들 간의 반발력이 약해지기 때문에 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 은나노 자성입자를 이용하는 것을 특징으로 하는, 상기 은나노 자성입자 중의 은나노 입자와 결합할 수 있는 물질의 검출방법으로서, 상기 검출은 라만산란, 자기장, 또는 라만산란 및 자기장을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출방법을 제공한다. 은나노 자성입자에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
상기 본 발명에 따른 은나노 자성입자는 은나노 입자의 도입단계에서 상기 자성 중심입자의 실리카 코팅 표면의 반발력이 상쇄되기 때문에, 외부 자기장에 의해서 덩어리질 수 있으므로, 은나노 입자와 결합할 수 있는 물질의 라벨 프리 검출방법에 이용될 수 있다. 상기 은나노 입자와 결합할 수 있는 물질의 검출을 용이하게 하기 위해서는 외부 자기장의 세기가 100 내지 7000가우스임이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명에 따른 은나노 자성입자를 이용한 검출방법에 의해 검출되는 은나노 입자와 결합할 수 있는 물질은 상술한 은나노 입자와 결합력이 있는 화합물이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 은나노 입자와 결합할 수 있는 물질과 은나노 입자의 결합은 화학결합임이 바람직하고, 일련의 공유결합 내지 배위결합임이 보다 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 은나노 입자와 결합할 수 있는 물질은 메틸 파라티온(methyl parathion), 페놀 또는 아데닌일 수 있다. 상기 메틸 파라티온은 티온 그룹의 황 원자에 비공유 전자쌍을 가지고, 페놀은 히드록시기의 산소 원자에 비공유 전자쌍을 가지며, 아데닌은 아지드기(azide, N3)의 질소 원자에 비공유 전자쌍을 가지는데, 금속 입자, 예를 들면 은나노 입자가 상기 비공유 전자쌍들과 화학결합을 형성할 수 있으며, 이 결합은 C-C결합력 보다는 약하지만 화학적으로 상당히 강한 결합이다. 상기 은나노 입자를 통한 이와 같은 결합에 의해 메틸 파라티온, 페놀 또는 아데닌이 본 발명에 따른 은나노 자성입자와 결합하여 자기조립단층을 형성한다. 이로써, 본 발명에 따른 은나노 자성입자를 이용하면 상기 메틸 파라티온, 페놀 또는 아데닌이 낮은 농도로 존재하는 경우에도 라벨 프리 분석에 의해 검출할 수 있다. 이 역시 핫스팟에 의한 라만산란 효과 및 자성물질에 기인한 자기적 성질을 이용한 것이다.
실시예
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 일 실시예를 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 자성-표면증강 라만산란 입자의 제조
1-1. 자성 중심입자의 제조
먼저, 철 클로라이드(FeCl3·6H2O) 10.8 g 및 소디움 올레이트 36.5 g을 에탄올 80 ㎖, 증류수 60 ㎖ 및 헥산 140 ㎖의 혼합액에 녹인 후, 온도를 70℃로 높여 4시간 동안 반응시켜 철-올레이트 복합체를 얻었다. 반응 후 윗 층인 유기층에 철-올레이트 복합체가 녹아있는데, 이것을 증류수로 3회 세척한 후 헥산으로 세척하고, 건조하였다. 이렇게 준비한 철-올레이트 복합체 36 g 및 올레인산(oleic acid) 5.7 g을 200 g의 1-에이코센(1-eicosene)에 녹인 후, 서서히 온도를 320℃까지 올렸다. 이후 상온으로 식힌 다음 에탄올 500 ㎖를 넣어 반응물을 침전시켰다(Nature materials , 2004, 3, 891). 이 물질을 다시 마이크로에멀젼법에 의해 실리카 코팅하였다. 상기 철-올레이트 복합체의 직경은 18 ㎚였고, 상기 실리카 코팅의 두께는 16 ㎚였다. 이로써 자성 중심입자를 얻었다.
1-2. 자성 중심입자 표면에 은나노 입자의 도입
상기 실시예 1-1에서 제조된 자성 중심입자 1 ㎖(유도결합플라즈마(Inductively Coupled Plasma, ICP) 분석으로 정량한 상기 자성 중심입자 중의 자성 물질의 함량은 2.2 ㎎/㎖임)를 에탄올 1 ㎖에 분산시킨 후, 1%(v/v) 3-머켑토프로필트리메톡시실란 ((3-mercaptopropyl)trimethoxy silane, MPTS) 10 ㎕ 및 25% 암모니아수(NH4OH( aq )) 10 ㎕를 첨가하고 25℃에서 12시간 동안 교반하여, 상기 자성 중심입자 표면에 티올기를 도입하였다. 상기 티올기가 도입된 자성 중심입자 주변에 표면증강 라만산란을 잘 일으킬 수 있는 은나노 입자를 도입하기 위하여, 상기 자성 중심입자를 에탄올로 세척하고, 이후 상기 자성 중심입자를 AgNO3 0.92 mg이 녹아있는 에틸렌글리콜 1 ㎖에 분산시킨 후 50℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이후 에탄올로 5회 세척하여 정제하였고, 마지막 세척시에는 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자를 침전시킨 후 에탄올 100 ㎕만 남겨두고 여액을 버렸다. 이후 교반하여 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자가 에탄올에 잘 분산되도록 하였다. 이로써 자성 중심입자 표면에 은나노 입자를 도입하였다. 상기 방법은 폴리올 방법의 일종이다.
1-3-1. 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자 주변에 표지물질의 고정
상기 실시예 1-2에서 제조된 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자에 라만산란 효과를 부여하기 위해, 라만 표지물질인 벤젠티올을 고정하였다. 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자 50 ㎎에 표지물질로 2 mM 벤젠티올 1 ㎖를 첨가하여 25℃에서 30분 동안 교반하여, 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자 주변에 라만 표지물질로서 벤젠티올을 고정하였다. 이후 에탄올로 3회 세척하여 은나노 입자가 도입되고 상기 은나노 입자 주변에 고정된 벤젠티올을 포함하는 자성 중심입자를 얻었다.
1-3-2. 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자 주변에 극성고분자의 도입 및 표지물질의 고정
상기 실시예 1-2에서 제조된 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자에 이후의 실리카 껍질의 형성을 용이하게 하기 위해 극성고분자로 폴리비닐피롤리돈을 도입하고, 또한 라만산란 효과를 부여하기 위해, 라만 표지물질인 벤젠티올을 고정하였다. 먼저 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자 50 ㎎에 0.5% 폴리비닐피롤리돈 수용액 30 ㎖를 투입하여 25℃에서 25시간 동안 반응시켰다. 증류수와 에탄올로 각각 1회씩 세척한 후, 표지물질로 2 mM 벤젠티올 1 ㎖를 첨가하여 25℃에서 30분 동안 교반하고, 에탄올로 3회 세척하였다. 이로써 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자 주변에 극성고분자를 도입하고 표지물질을 고정하였다.
1-4. 입자 응집체의 제조
상기 실시예 1-3-1 또는 실시예 1-3-2에서 제조된 자성 중심입자, 은나노 입자 및 벤젠티올을 포함하는 입자를 방치하여 응집시킴으로써 핫스팟이 유도된 입자 응집체를 제조하였다. 응집 원리는 상술한 바와 같다.
1-5. 입자 응집체 주변에 실리카 껍질의 형성
상기 실시예 1-4에서 제조된 입자 응집체 주변에 실리카 껍질을 형성시키기 위해, 상기 입자 응집체를 15 ㎖의 수용액에 분산시킨 후 0.025%(v/v) 소디움 실리케이트 수용액 1.83 ㎖를 넣고, 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 얻어진 입자 응집체를 물과 에탄올로 각각 3회씩 세척하였다. 이로써 자성-표면증강 라만산란 입자를 얻었다.
[ 실시예 2] 바이오센서의 제조
2-1. 자성-표면증강 라만산란 입자 표면에 작용기인 아민기의 도입
실시예 1에서 제조된 자성-표면증강 라만산란 입자 표면에 생체친화성 및 기능성을 지닌 작용기를 도입하기 위하여, 상기 자성-표면증강 라만산란 입자 0.1 ㎖ (ICP 분석으로 정량한 상기 자성-표면증강 라만산란 입자 중의 자성 물질의 함량은 22 ㎎/㎖임)를 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTS) 용액(에탄올 중의 5부피%) 1 ㎖에 가하였고, 이후 암모늄 히드록사이드 10 ㎕를 가하였다. 수득된 분산액을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이후 에탄올로 세척하고 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 200 ㎕에 재분산시켜 아민기로 표면개질된 자성-표면증강 라만산란 입자의 분산액을 얻었다.
2-2-1. 리셉터로서 항체 HER2 의 부착
실시예 2-1에서 제조된 아민기로 표면개질된 자성-표면증강 라만산란 입자의 분산액 1 ㎖ (ICP 분석으로 정량한 상기 아민기로 표면개질된 자성-표면증강 라만산란 입자의 분산액 중의 자성 물질의 함량은 2.2 ㎎/㎖임)에 Fmoc-NH-TEG-COOH 10 μmol을 가하고, (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 및 N,N-디이소프로필 에틸아민(DIEA)을 각각 12 μmol 가하였다. 수득된 혼합물을 25℃에서 6시간 동안 교반하였다. DMF로 세척한 후에, 피페리딘(DMF 중의 20부피%) 500 ㎕로 40분 동안 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 수득된 DMF에 분산된 자성-표면증강 라만산란 입자 의 분산액 1 ㎖(ICP 분석으로 정량한 상기 DMF에 분산된 자성-표면증강 라만산란 입자 분산액 중의 자성 물질의 함량은 2.2 ㎎/㎖임)에 숙신산 무수물(succinic anhydride) 및 DIEA을 각각 20 μmol씩 넣고, 6시간 동안 상온에서 교반하여 카르복시산 작용기를 도입하였다. 이후 카르복시산으로 표면개질된 자성-표면증강 라만산란입자를 DMF로 3차례 세척하고, 다시 1 ㎖ DMF에 분산시킨 후 N-히드록시숙신이미드(NHS) 20 μmol, DIC 및 DIEA 각 30 μmol씩을 넣고 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 이렇게 자성-표면증강 라만산란 입자에 부착된 카르복시기를 활성화시킨 후, PBS 완충 용액 1 ㎖에 분산시켰다. 이 분산액에 항체 HER2(SantaCruz Biotechnology, USA) 10 ㎍을 가하고, 수득된 혼합물(ICP 분석으로 정량한 상기 수득된 혼합물 중의 자성 물질의 함량은 0.58 ㎎/㎖임)을 4℃에서 밤새 또는 25℃에서 2시간 동안 교반한 후, 수득된 항체 HER2가 부착된 자성-표면증강 라만산란 입자를 원심분리하고 Tween 20(0.1중량%)을 포함하는 PBS 용액으로 세척하였다. 이후 소혈청 알부민(bovine serum albumin)(PBS 용액 중의 1중량%)으로 25℃에서 30분 동안 처리한 후, Tween 20(0.1중량%)을 포함하는 PBS 용액으로 여러번 세척함으로써, 자성-표면증강 라만산란 입자에 리셉터로서 항체 HER2를 부착시킨 바이오센서를 제조하였다.
2-2-2. 상기 아민 작용기에 리셉터로서 항체 CD10 의 부착
상기 실시예 2-2-1과 유사한 방법으로, 자성-표면증강 라만산란 입자에 리셉터로 항체 CD10를 부착시켜 바이오센서를 제조하였다.
[ 실시예 3] 바이오센서의 암세포 검출 실험
상기 실시예 2에서 제조된 바이오센서들을 이용하여 암세포 검출 실험을 수행하였다.
3-1. 유방암 세포( SKBR3 )의 검출
먼저, 실시예 1과 같은 방법으로 표지물질로 2-나프탈렌티올이 도입된 자성-표면증강 라만산란 입자를 준비하였다. 이후 실시예 2-2-1과 같은 방법으로 자성-표면증강 라만산란 입자에 유방암 세포의 항원에 특이적인 리셉터로서 항체 HER2를 도입하여 바이오센서를 제조하였고, 상기 바이오센서를 유방암 세포(SKBR3)와 함께 4℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이후 4000가우스의 막대 자석 또는 3000가우스의 둥근 형태의 자석으로 세포를 끌었을 때 수 초만에 끌려오는 것을 확인할 수 있었으며, 이후 공초점 라만 시스템(confocal Raman system, LabRam 300, JY-Horiba, Edison, NJ, USA)으로 라만 분석을 수행하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바에 따르면, 상기 바이오센서와 결합한 세포들은 자석에 끌림과 동시에 2-나프탈렌티올의 라만 신호가 발생하였음을 확인할 수 있었다.
3-2. 백혈병 세포 SP2 /O( floating leukemia cells )의 검출
먼저, 실시예 1과 같은 방법으로 표지물질로 4-머켑토 톨루엔이 도입된 자성-표면증강 라만산란 입자를 준비하였다. 이후 실시예 2-2-1 또는 실시예 2-2-2와 같은 방법으로 자성-표면증강 라만산란 입자에 백혈병 세포의 항원에 특이적인 리셉터로서 항체 HER2 또는 항체 CD10를 도입하여 바이오센서를 제조하였고, 상기 바 이오센서를 백혈병 세포와 함께 4℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이후 4000가우스의 막대 자석으로 세포를 끌었을 때 수 초만에 끌려오는 것을 확인할 수 있었으며, 이후 공초점 라만 시스템(confocal Raman system, LabRam 300, JY-Horiba, Edison, NJ, USA)으로 라만 분석을 수행하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바에 따르면, 상기 바이오센서와 결합한 세포들은 자석에 끌림과 동시에 4-머켑토 톨루엔의 라만 신호가 발생하였음을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 4] 바이오센서의 무독성 실험
상기 실시예 1 및 2와 같은 방법으로 0.144 mg/㎖, 0.288 mg/㎖, 0.575 mg/㎖, 1.15 mg/㎖ 및 2.3 mg/㎖ 농도의 바이오센서들을 제조하였다. 이후 상기 바이오센서를 폐암세포(A549)와 함께 배양하여, 세포 생육력(Cell viability)에 대한 실험을 수행하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바에 따르면, 본 발명에 따른 바이오센서는 독성이 거의 없어 생체 적합성이 있음을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 5] 은나노 자성입자( Ag -M dots )의 제조
실시예 1-1 및 1-2와 동일한 방법으로, 자성 중심입자를 제조하고, 상기 자성 중심입자 표면에 은나노 입자를 도입하였다. 상기 표면에 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자를 방치하여 응집시킴으로써 은나노 자성입자를 제조하였다. 응집 원리는 상술한 바와 같다. 이와 같이 제조된 은나노 자성입자는 은나노 입자의 도입 단계에서 상기 자성 중심입자의 실리카 코팅 표면의 반발력이 상쇄되었기 때문에, 외부 자기장에 의해서 덩어리질 수 있으므로, 이후 은나노 입자와 결합할 수 있는 물질의 라벨 프리 검출방법에 이용될 수 있다.
[ 실시예 6] 자기장에 의한 은나노 자성입자( Ag -M dots )의 조절 및 핫스팟 분석 실험
상기 실시예 5에서 제조된 은나노 자성입자 이동의 자석에 의한 조절가능성을 확인하기 위하여, 모세관(capillary)을 이용한 실험을 수행하였다. 먼저 실시예 1-1 및 1-2와 동일한 방법에 의해, 표면에 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자를 제조하였다. 상기 표면에 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자를 방치하여 응집시킴으로써 은나노 자성입자를 제조하였다. 상기 은나노 자성입자를 길이 10 ㎝ 및 직경 0.5 ㎜ 모세관에 넣었다. 이후 4000가우스의 자석을 이용하여 상기 은나노 자성입자군을 형성하고, 형성된 은나노 자성입자군을 이동시킨 후, 다시 초음파 처리(sonication)를 하여 이를 분산시키는 실험을 수행하였으며, 이들 각각에 대하여 라만 분석을 수행하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바에 따르면, 자기장에 의해 은나노 자성입자군의 형성을 유도하여 핫스팟을 유도시킬 수 있으며, 동시에 은나노 자성입자의 이동을 자기장에 의해 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 7] 은나노 자성입자를 이용한 핫스팟 분석 실험
7-1. 메틸 파라티온 분석
실시예 5에서 제조된 은나노 자성입자를 이용해 농약성분인 메틸 파라티온을 검출하였고, 이로써 본 발명이 특정물질의 라벨 프리 분석을 가능케 함을 보여 주었다.
상기 은나노 자성입자를 1 ㎖의 수용액에 분산시킨 후 그 수용액 100 ㎕를 분취하여, 1 ppm, 0.1 ppm, 0.01 ppm의 메틸 파라티온이 녹아있는 1 ㎖ 수용액에 넣었다. 이것을 25℃에서 1시간 동안 교반한 후, 물로 5회 세척하였다. 이후 슬라이드 글라스에 메틸 파라티온이 화학결합에 의해 자기조립단층을 이루고 있는 은나노 자성입자를 한 방울 떨어뜨린 후 4000가우스의 막대자석을 이용하여 덩어리진 은나노 자성입자를 얻었다. 이렇게 제조된 핫스팟이 유도된 덩어리진 은나노 자성입자를 라만으로 측정하였고, 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 1 ppm 메틸 파라티온을 이용한 경우 라만 신호가 잘 나타났다. 또한, 0.001 ppm 메틸 파라티온을 이용한 경우의 라만 신호도 측정할 수 있을 만큼 본 발명의 은나노 자성입자는 라만산란 분석에 민감하였다. 즉, 본 발명에 따른 은나노 자성입자는 매우 낮은 농도의 물질까지도 분석 가능함을 보여 주었다.
7-2. 페놀 분석
실시예 5에서 제조된 은나노 자성입자를 이용해 유해물질이자 라만으로 분석이 용이하지 않다고 알려진 페놀을 분석하였다.
상기 은나노 자성입자를 1 ㎖의 수용액에 분산시킨 후 그 수용액 100 ㎕를 분취하여, 1 mM의 페놀 1 ㎖를 넣고, 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이후 슬라이드 글라스에 1 mM의 페놀이 함유된 은나노 자성입자를 한 방울 떨어뜨린 후 4000가우스의 자석을 이용하여 덩어리진 은나노 자성입자를 얻었다. 이렇게 만들어진 핫스팟이 유도된 덩어리진 은나노 자성입자를 라만으로 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 은과 결합할 수 있는 티올기나 아민기와 같은 작용기가 없는 페놀을 본 발명의 은나노 자성입자를 이용하여 분석함으로써, 본 발명이 티올기나 아민기가 없는 물질의 분석에까지 이용될 수 있음을 보여주었다. 즉, 본 발명에 따른 표면증강 라만산란 자성 나노 입자의 넓은 범위에서의 응용 가능성 및 라벨 프리 분석 가능성을 확인하였다.
7-3. 아데닌 분석
실시예 5에서 제조된 은나노 자성입자를 이용해 생체물질인 아데닌을 검출하였고, 이로써 본 발명이 특정물질의 라벨 프리 분석을 가능케 함을 보여 주었다.
상기 은나노 자성입자를 1 ㎖의 수용액에 분산시킨 후 그 수용액 100 ㎕를 분취하여, 1 pM ~ 1 μM의 아데닌이 녹아있는 1 ㎖ 수용액에 넣었다. 이것을 25℃에서 1시간 동안 교반한 후, 물로 5회 세척하였다. 이후 슬라이드 글라스에, 표면에 아데닌이 화학결합에 의해 자기조립단층을 이루고 있는 은나노 자성입자를 한 방울 떨어뜨린 후 4000가우스의 막대자석을 이용하여 덩어리진 은나노 자성입자를 얻었다. 이렇게 제조된 핫스팟이 유도된 덩어리진 은나노 자성입자를 라만으로 측정하였고, 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 1 pM 아데닌을 이용한 경우 라만 신호가 잘 나타났다. 즉, 본 발명에 따른 은나노 자성입자는 매우 낮은 농도의 물질까지도 분석 가능함을 보여 주었다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 은나노 자성입자, 자성-표면증강 라만산란 입자 및 바이오센서의 구조와 제조 과정의 개략도 및 TEM 이미지:
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 은나노 자성입자, 자성-표면증강 라만산란 입자 및 바이오센서의 합성 과정의 개략도;
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 자성물질 중 18 ㎚ 마그네타이트의 TEM 이미지;
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 자성 중심입자의 TEM 이미지;
도 1d는 본 발명의 일 실시예에 따른 은나노 자성입자의 TEM 이미지;
도 1e는 도 1d의 입자를 티올기로 개질된 실리콘 웨이퍼 위에 떨어뜨린 경우의 은나노 자성입자의 FE-SEM 이미지;
도 1f는 본 발명의 일 실시예에 따른 자성-표면증강 라만산란 입자의 HR-TEM 이미지.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서를 이용한 표적 바이오물질의 검출 과정의 개략도:
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서가 암세포의 항원과 결합하는 반응의 개략도;
도 2b는 인간 유방암세포(SKBR3)의 항원과 결합한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서(표지물질로 2-나프탈렌티올, 리셉터로 항체 HER2 이용)의 광학 현미경 이미지, 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal Laser Scanning Microscopy; CLSM) 이미지, 및 상기 암세포의 항원과 결합한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서의 라만 데이터;
도 2c는 외부 자기장에 의한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서와 결합한 유방암세포(SKBR3) 검출 과정의 광학 현미경 이미지.
도 3은 백혈병세포(SP2/O)의 항원과 결합한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서(표지물질로 4-머켑토 톨루엔, 리셉터로 항체 CD10 이용)의 광학 현미경 이미지, 공초점 레이저 주사 현미경 이미지, 및 상기 암세포의 항원과 결합한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서의 라만 데이터.
도 4는 다양한 셀라인에서 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서의 잠재적인 세포독성(cytotoxicity)에 대한 세포 생육력(cell viability)을 나타낸 그래프.
도 5는 모세관에서 실험한 본 발명에 따른 은나노 자성입자의 자기장에 의한 컨트롤에 대한 도면:
도 5a는 자기장에 의해 은나노 자성입자군의 형성 및 형성된 은나노 자성입자군의 자기장에 의한 이동에 관한 도면;
도 5b는 모세관에서의 실험 결과로서 위부터 차례로 (ⅰ) 분산된 은나노 자성입자, (ⅱ) 자기장에 의해 형성된 은나노 자성입자군, (ⅲ) 초음파 처리에 의해 재분산된 은나노 자성입자, (ⅳ) 자기장에 의해 재형성된 은나노 자성입자군을 나타내는 도면;
도 5c는 은나노 자성입자의 라만 데이터에 관한 그래프로서, (ⅰ) 및 (ⅱ) 자기장에 의해 형성된 은나노 자성입자군의 표면증강 라만산란 피크(b.(ⅱ),(ⅳ)), (ⅲ) 분산된 은나노 자성입자의 피크(b.(ⅰ),(ⅲ)).
도 6은 농약성분인 메틸 파라티온을 본 발명에 따른 은나노 자성입자를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 표면증강 라만산란 이미지.
도 7는 페놀을 본 발명에 따른 은나노 자성입자를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 표면증강 라만산란 이미지.
도 8은 아데닌을 본 발명에 따른 은나노 자성입자를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 표면증강 라만산란 이미지:
도 8a는 아데닌 10 pM 농도인 경우의 표면증강 라만산란 이미지;
도 8b는 아데닌 1 pM 농도인 경우의 표면증강 라만산란 이미지.
도 9는 본 발명에 따른 다양한 라만 표지물질이 도입된 자성-표면증강 라만산란 입자의 라만피크를 나타낸 그래프.

Claims (20)

  1. 입자 응집체 및 상기 입자 응집체 주변을 둘러싸는 실리카 껍질을 포함하는 자성-표면증강 라만산란 입자로서,
    상기 입자 응집체는
    자성물질을 포함하는 자성 중심입자;
    상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자; 및
    상기 은나노 입자 주변에 고정된 표지물질을 포함하는 입자가 1개 이상 응집되어 형성된 것인
    자성-표면증강 라만산란 입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자성 중심입자는 자성물질 및 상기 자성물질을 둘러싸는 실리카 코팅을 포함하는 입자인
    자성-표면증강 라만산란 입자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 자성물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, MM'2O4 및 MxOy(M 또는 M'=Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, Cr, 0<x≤3, 0<y≤5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인
    자성-표면증강 라만산란 입자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 표지물질은 은나노 입자와 결합력이 있는 화학물질인
    자성-표면증강 라만산란 입자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 표지물질은 4-머켑토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머켑토 피리미딘(2-MPY), 2-머켑토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토- 5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF) 및 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인
    자성-표면증강 라만산란 입자.
  6. 자성물질을 포함하는 자성 중심입자 표면에 은나노 입자를 도입하는 단계;
    상기 은나노 입자 주변에 표지물질을 고정하는 단계;
    상기 자성 중심입자, 상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자, 및 상기 은나노 입자 주변에 고정된 표지물질을 포함하는 입자를 1개 이상 응집시켜 입자 응집체를 제공하는 단계; 및
    상기 입자 응집체 주변에 실리카 껍질을 형성하는 단계를 포함하는 자성-표면증강 라만산란 입자의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 자성 중심입자는 자성물질 및 상기 자성물질을 둘러싸는 실리카 코팅을 포함하는 입자인
    자성-표면증강 라만산란 입자의 제조방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 따른 자성-표면증강 라만산란 입자;
    상기 자성-표면증강 라만산란 입자 표면에 도입된 작용기; 및
    상기 작용기에 부착된 리셉터를 포함하는 바이오센서.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 작용기는 아민기, 카르복시기 및 티올기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인
    바이오센서.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 지질, 코펙터, 탄수화물 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인
    바이오센서.
  11. 제1항 또는 제2항에 따른 자성-표면증강 라만산란 입자 표면에 작용기를 도입하는 단계; 및
    상기 작용기에 리셉터를 부착시키는 단계를 포함하는 바이오센서의 제조방법.
  12. 제8항에 따른 바이오센서를 이용하는 것을 특징으로 하는, 상기 바이오센서의 리셉터와 결합하거나 반응하는 표적 바이오물질의 검출방법으로서,
    상기 검출은 라만산란, 자기장, 또는 라만산란 및 자기장을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 표적 바이오물질은 효소, 단백질, 핵산, 올리고당, 펩티드, 아미노산, 세포, 암세포, 암줄기세포, 항원 및 압타머로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인
    검출방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 암세포는 유방암세포, 폐암세포 및 백혈병세포 중 어느 하나인
    검출방법.
  15. 자성물질을 포함하는 자성 중심입자; 및
    상기 자성 중심입자 표면에 도입된 은나노 입자를 포함하는 입자가 1개 이상 응집되어 이루어진
    은나노 자성입자.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 자성 중심입자는 자성물질 및 상기 자성물질을 둘러싸는 실리카 코팅을 포함하는 입자인
    은나노 자성입자.
  17. 자성물질을 포함하는 자성 중심입자 표면에 은나노 입자를 도입하는 단계; 및
    상기 은나노 입자가 도입된 자성 중심입자를 1개 이상 응집시키는 단계를 포 함하는 은나노 자성입자의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 자성 중심입자는 자성물질 및 상기 자성물질을 둘러싸는 실리카 코팅을 포함하는 입자인
    은나노 자성입자의 제조방법.
  19. 제15항 또는 제16항에 따른 은나노 자성입자를 이용하는 것을 특징으로 하는, 상기 은나노 자성입자 중의 은나노 입자와 결합할 수 있는 물질의 검출방법으로서,
    상기 검출은 라만산란, 자기장, 또는 라만산란 및 자기장을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 은나노 입자와 결합할 수 있는 물질은 메틸 파라티온, 페놀 및 아데닌 중 어느 하나인
    검출방법.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010114297A3 (en) * 2009-03-31 2011-01-20 Se Jin Park Microsphere having hot spots and method for identifying chemicals through surface enhanced raman scattering using the same
KR101350722B1 (ko) * 2012-01-09 2014-01-16 한국세라믹기술원 효소 모방 자성나노촉매의 합성방법 및 그에 의하여 합성된 효소 모방 자성나노촉매
CN104209537A (zh) * 2014-08-26 2014-12-17 浙江大学 一种聚邻苯二胺-纳米金属复合颗粒及制备方法
KR101669954B1 (ko) * 2014-10-01 2016-10-27 강원대학교산학협력단 금 나노입자가 도입된 펩타이드 나노자기조립체의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 금 나노입자가 도입된 펩타이드 나노자기조립체
US9551025B2 (en) 2012-10-30 2017-01-24 Samsung Electronics Co., Ltd. Nucleic acid structure complex including nucleic acids, Raman-active molecules, and metal particles, method of preparing the same, and method of detecting target material by using the nucleic acid structure complex
CN109557067A (zh) * 2017-09-26 2019-04-02 中国科学院烟台海岸带研究所 一种核—卫星结构金纳米颗粒及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100733085B1 (ko) 2005-07-29 2007-06-28 재단법인서울대학교산학협력재단 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자 및 이의 제조방법
KR100650522B1 (ko) 2005-09-15 2006-11-27 재단법인서울대학교산학협력재단 표면증강 라만 산란법에 의해 표지된 마이크로 비드와유전전기영동력을 이용한 새로운 초고속 검색 방법

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010114297A3 (en) * 2009-03-31 2011-01-20 Se Jin Park Microsphere having hot spots and method for identifying chemicals through surface enhanced raman scattering using the same
KR101350722B1 (ko) * 2012-01-09 2014-01-16 한국세라믹기술원 효소 모방 자성나노촉매의 합성방법 및 그에 의하여 합성된 효소 모방 자성나노촉매
US9551025B2 (en) 2012-10-30 2017-01-24 Samsung Electronics Co., Ltd. Nucleic acid structure complex including nucleic acids, Raman-active molecules, and metal particles, method of preparing the same, and method of detecting target material by using the nucleic acid structure complex
CN104209537A (zh) * 2014-08-26 2014-12-17 浙江大学 一种聚邻苯二胺-纳米金属复合颗粒及制备方法
CN104209537B (zh) * 2014-08-26 2016-07-06 浙江大学 一种聚邻苯二胺-纳米金属复合颗粒及制备方法
KR101669954B1 (ko) * 2014-10-01 2016-10-27 강원대학교산학협력단 금 나노입자가 도입된 펩타이드 나노자기조립체의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 금 나노입자가 도입된 펩타이드 나노자기조립체
CN109557067A (zh) * 2017-09-26 2019-04-02 中国科学院烟台海岸带研究所 一种核—卫星结构金纳米颗粒及其制备方法
CN109557067B (zh) * 2017-09-26 2021-07-20 中国科学院烟台海岸带研究所 一种核—卫星结构金纳米颗粒及其制备方法

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