CN109765279B - 基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器及其制备方法和应用,所述制备方法包括:在GCE电极上滴加GO溶液,之后在PBS溶液中进行电沉积,即得RGO/GCE电极;将APBA溶液、HCl溶液和NaF溶液混合,得到混合液A,将上述RGO/GCE电极在混合液A中进行循环伏安扫描,即得PAPBA/RGO/GCE电极;在PAPBA/RGO/GCE电极上滴加BSA溶液,得到BSA/PAPBA/RGO/GCE电极;将PBS溶液、NADH和FcBA溶液混合得到混合液B,将BSA/PAPBA/RGO/GCE置于混合液B中反应得到三明治类型电化学传感器。解决了传统的NADH的检测灵敏度低、检测方法少和选择性差等问题。
Description
技术领域
本发明涉及传感器检测领域,具体地,涉及一种基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器及其制备方法和应用。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),是一种参与代谢过程的重要辅酶,广泛存在于生物体的细胞中。它可以刺激细胞中神经递质如多巴胺、去甲肾上腺激素和血清素的产生,同时可为免疫系统提供能量并且对DNA系统具有修复作用,因此,发展用于NADH检测的传感器已经成为近年来研究的热点,由于NADH在电极表面氧化需要较高的过电位,使得其在常规固体电极上的氧化高度不可逆,并且NADH容易在电极表面聚集,阻碍了电子转移,限制了分析的灵敏度。因此,设计具有高灵敏度和选择性的NADH电化学传感器具有重要意义。
为了弥补以上研究的不足,本发明旨在设计一种通过NADH的两对邻二羟基,其中一对邻二羟基与二茂铁硼酸中的硼酸基团先在溶液中结合,另一对邻二羟基与之前修饰有氨基苯硼酸的电极结合,构建APBA-NADH-FcBA的三明治夹心结构,利用NADH和FcBA的双信号加和表征NADH的浓度,来提高检测NADH的灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器及其制备方法和应用,解决了传统的NADH的检测灵敏度低、检测方法少和选择性差等问题。
为了实现上述目的,本发明提供了一种基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器的制备方法,所述制备方法包括:
(1)RGO/GCE的制备:在GCE电极上滴加GO溶液,之后在PBS溶液中进行电沉积,即得RGO/GCE电极;
(2)PAPBA/RGO/GCE的制备:将APBA溶液、HCl溶液和NaF溶液混合,得到混合液A,将上述RGO/GCE电极在混合液A中进行循环伏安扫描,即得PAPBA/RGO/GCE电极;
(3)在PAPBA/RGO/GCE电极上滴加BSA溶液,得到BSA/PAPBA/RGO/GCE电极;
(4)将PBS溶液、NADH和FcBA溶液混合得到混合液B,将BSA/PAPBA/RGO/GCE置于混合液B中反应得到三明治类型电化学传感器。
本发明还提供了一种基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器,所述三明治类型电化学传感器由上述的制备方法制得。
本发明还提供了上述的三明治类型电化学传感器在NADH检测中的应用。
根据上述技术方案,本发明提供了一种基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器及其制备方法和应用,本发明通过NADH的两对邻二羟基,其中一对邻二羟基与二茂铁硼酸中的硼酸基团先在溶液中结合,另一对邻二羟基与之前修饰有氨基苯硼酸的电极结合,构建了APBA-NADH-FcBA的三明治夹心结构;利用NADH和FcBA的双信号加和表征NADH的浓度,其中FcBA的信号强弱取决于NADH的浓度,结果显示随着NADH浓度的增加,NADH的峰电流在增加,同时FcBA的峰电流也在增加,这样就提高了传感器的灵敏度,还能选择性检测NADH,该传感器具备抗干扰能力强,灵敏度高且制备简单、成本低、性能稳定等一系列优点。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本发明,但并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是本发明提供的三明治类型电化学传感器的制备流程图;
图2是本发明中GO/GCE的电镜扫描图;
图3是本发明中RGO/GCE的电镜扫描图;
图4是本发明中PAPBA/RGO/GCE的1μm电镜扫描图;
图5是本发明中PAPBA/RGO/GCE的2μm电镜扫描图;
图6-图10为PAPBA/RGO/GCE的X射线能谱图;
图11为BSA/PAPBA/RGO/GCE传感器检测不同浓度NADH的循环伏安曲线;
图12为不同溶液的紫外可见吸收光谱图;
图13聚合圈数、聚合速率、检测液的pH、NADH和FcBA结合的时间对传感器的性能产生的影响图;
图14为传感器对于NADH的选择性检测结果图;
图15为BSA/APBA/RGO/GCE定量检测能力图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
本发明提供了一种基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器的制备方法,所述制备方法包括:
(1)RGO/GCE的制备:在GCE电极上滴加GO溶液,之后在PBS溶液中进行电沉积,即得RGO/GCE电极;
(2)PAPBA/RGO/GCE的制备:将APBA溶液、HCl溶液和NaF溶液混合,得到混合液A,将上述RGO/GCE电极在混合液A中进行循环伏安扫描,即得PAPBA/RGO/GCE电极;
(3)在PAPBA/RGO/GCE电极上滴加BSA溶液,得到BSA/PAPBA/RGO/GCE电极;
(4)将PBS溶液、NADH和FcBA溶液混合得到混合液B,将BSA/PAPBA/RGO/GCE置于混合液B中反应得到三明治类型电化学传感器。
在本发明的一种优选的实施方式中,为了进一步增加电化学传感器的检测灵敏度和选择性,在步骤(1)中,GO溶液的滴加量为8-12μL,GO溶液的浓度为0.8-1.2mg/mL;和/或
PBS溶液的pH为6.8-7.2。
在本发明的一种优选的实施方式中,为了进一步增加电化学传感器的检测灵敏度和选择性,在步骤(1)中,电沉积的条件包括:电位范围为-1.4V~-1.3V,时间为715-725s。
在本发明的一种优选的实施方式中,为了进一步增加电化学传感器的检测灵敏度和选择性,在步骤(2)中,APBA溶液的浓度为9-11mmol/L,HCl溶液的浓度为0.9-1.1mol/L,NaF溶液的浓度为4-6mmol/L。
在本发明的一种优选的实施方式中,为了进一步增加电化学传感器的检测灵敏度和选择性,在步骤(2)中,循环伏安扫描的条件包括:电位范围为-0.5V~0.7V,扫描速度为0.09-0.11V/s。
在本发明的一种优选的实施方式中,为了进一步增加电化学传感器的检测灵敏度和选择性,在步骤(3)中,BSA溶液的用量为8-12μL,其体积浓度为4-6%;
PAPBA/RGO/GCE电极上滴加BSA溶液后需放置28-32min。
在本发明的一种优选的实施方式中,为了进一步增加电化学传感器的检测灵敏度和选择性,在步骤(4)中,FcBA溶液的浓度为0.9-1.1mmol/L;PBS溶液的pH为7.3-7.5。
在本发明的一种优选的实施方式中,为了进一步增加电化学传感器的检测灵敏度和选择性,在步骤(4)中,电聚合APBA圈数范围:8~12圈;和/或
NADH和FcBA溶液结合时间范围:15~35min。
在本发明的一种优选的实施方式中,GCE电极在使用前用Al2O3在麂皮纸上打磨至镜面,用蒸馏水冲洗干净超声,然后在0.9-1.1mmol/L Fe(CN)6 3-/4-溶液中表征,直到得到稳定的电流响应。
本发明还提供了一种基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器,所述三明治类型电化学传感器由上述的制备方法制得。
本发明还提供了上述的三明治类型电化学传感器在NADH检测中的应用。
以下通过具体实施例进行说明。以下实施例和检测例中,仪器:CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司);三电极系统,以饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝电极(Pt)为对电极,以裸或修饰玻碳电极(GCE)电极为工作电极;扫描电镜(SEM,Hitachi S-4800,10KV),雷磁酸度计(PHS-3C,上海仪电科学仪器股份有限公司)。
试剂:氧化石墨烯(GO,先丰纳米),3-氨基苯硼酸(3-Aminobenzeneboronic acid,APBA,上海柏卡化学),烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NADH,Aladdin),1,1’-二硼酸二茂铁(1,1’-Ferrocenediboronic Acid,FcBA,TCI),葡萄糖(glucose,Glu,Aladdin),抗坏血酸(ascorbic acid,AA,Aladdin),尿酸(Uric acid,UA,Aladdin),谷氨酸(Glutamate,Glu,Aladdin),多巴胺(Dopamine,DA,Aladdin),肾上腺素(Epinephrine,EP,Aladdin)。实验室用水为二次蒸馏水。
实施例1
(1)RGO/GCE的制备:在GCE电极上滴加8μL GO溶液(浓度为0.8mg/mL),之后在PBS溶液(pH为6.8)中进行电沉积(电位范围为-1.4VV,时间为715s),即得RGO/GCE电极;
(2)PAPBA/RGO/GCE的制备:将APBA溶液、HCl溶液和NaF溶液混合,得到混合液A(APBA溶液的浓度为9mmol/L,HCl溶液的浓度为0.9mol/L,NaF溶液的浓度为4mmol/L),将上述RGO/GCE电极在混合液A中进行循环伏安扫描(电位范围为-0.3V~0.5V,扫描速度为0.09V/s),即得PAPBA/RGO/GCE电极;
(3)在PAPBA/RGO/GCE电极上滴加8μL BSA溶液(体积浓度为4%),得到BSA/PAPBA/RGO/GCE电极;
(4)将PBS溶液、NADH和FcBA溶液混合得到混合液B(其中,FcBA溶液的浓度为0.9mmol/L,PBS溶液的pH为7.3),将BSA/PAPBA/RGO/GCE置于混合液B中反应得到三明治类型电化学传感器,其中,电聚合APBA圈数范围:8圈;NADH和FcBA溶液结合时间范围:15min。
实施例2
(1)RGO/GCE的制备:在GCE电极上滴加10μL GO溶液(浓度为1mg/mL),之后在PBS溶液(pH为7)中进行电沉积(电位范围为-1.4V,时间为720s),即得RGO/GCE电极;
(2)PAPBA/RGO/GCE的制备:将APBA溶液、HCl溶液和NaF溶液混合,得到混合液A(其中,APBA溶液的浓度为10mmol/L,HCl溶液的浓度为1mol/L,NaF溶液的浓度为5mmol/L),将上述RGO/GCE电极在混合液A中进行循环伏安扫描(电位范围为-0.4V~0.6V,扫描速度为0.1V/s),即得PAPBA/RGO/GCE电极;
(3)在PAPBA/RGO/GCE电极上滴加10μL BSA溶液(体积浓度为5%),得到BSA/PAPBA/RGO/GCE电极;
(4)将PBS溶液、NADH和FcBA溶液混合得到混合液B(其中FcBA溶液的浓度为1mmol/L,PBS溶液的pH为7.4),将BSA/PAPBA/RGO/GCE置于混合液B中反应得到三明治类型电化学传感器,其中,电聚合APBA圈数范围:10圈;NADH和FcBA溶液结合时间范围:25min。
实施例3
(1)RGO/GCE的制备:在GCE电极上滴加8-12μL GO溶液(浓度为1.2mg/mL),之后在PBS溶液(pH为7.2)中进行电沉积(电位范围为-1.3V,时间为725s),即得RGO/GCE电极;
(2)PAPBA/RGO/GCE的制备:将APBA溶液、HCl溶液和NaF溶液混合,得到混合液A(APBA溶液的浓度为11mmol/L,HCl溶液的浓度为1.1mol/L,NaF溶液的浓度为6mmol/L),将上述RGO/GCE电极在混合液A中进行循环伏安扫描(电位范围为-0.5V~0.7V,扫描速度为0.11V/s),即得PAPBA/RGO/GCE电极;
(3)在PAPBA/RGO/GCE电极上滴加12μL BSA溶液(体积浓度为6%),得到BSA/PAPBA/RGO/GCE电极;
(4)将PBS溶液、NADH和FcBA溶液混合得到混合液B(其中FcBA溶液的浓度为1.1mmol/L,PBS溶液的pH为7.5),将BSA/PAPBA/RGO/GCE置于混合液B中反应得到三明治类型电化学传感器,其中,电聚合APBA圈数范围:12圈;NADH和FcBA溶液结合时间范围:35min。
检测例
采用循环伏安发(CV)和差示脉冲伏安法(DPV)在PBS溶液中(0.1mol/L,pH 7.4)中表征传感器的电化学性质;多巴胺(DA),肾上腺素(EP),抗坏血酸(AA),葡萄糖(Glu),尿酸(UA),谷氨酸(Glu acid)作为结构类似物和共存物来考察传感器的选择性。其中,图2为GO/GCE的电镜扫描图,图3为RGO/GCE的电镜扫描图;图4和图5为PAPBA/RGO/GCE的电镜扫描图。图2表示的是聚集的褶皱的石墨烯层,石墨烯层具有很大的表面积,加速电子传递,提高了电极的灵敏度,此外由于石墨烯水溶性差,所以比较稳定;图3表示RGO/GCE,表面呈片状,图4和图5表示PAPBA/RGO/GCE,相比于RGO/GCE,表面颜色更加暗淡,这是因为修饰了PAPBA,该膜导电性差,阻碍电子束穿透,证明聚APBA成功聚合到RGO/GCE表面。图6-图10表示PAPBA/RGO/GCE的EDS图,由图可以看出PAPBA中C,B,N,O等元素均匀分布在电极表面,这也说明PAPBA膜成功修饰到电极表面。
图11表示BSA/PAPBA/RGO/GCE三明治型电化学传感器检测不同浓度NADH的循环伏安曲线。三明治传感器检测含有不同浓度的NADH(0,3.0×10-4,5.0×10-4,7.0×10-4,1.0×10-3M;分别对应图11中a、b、c、d、e曲线)和一定浓度的FcBA(1.0×10-3M)的PBS溶液(pH7.4),在E=0.6V左右是NADH的氧化峰,E=0.1V左右是FcBA的氧化峰,随着NADH浓度的增加,NADH的氧化峰在增大,同时FcBA的氧化峰也在增大。图11中a曲线表示,当溶液中没有NADH时,此时没有产生FcBA的氧化峰,这说明NADH在其中起了一个重要的连接作用,没有NADH,就无法将FcBA连接到APBA上,无法产生电信号。
图12表示为不同溶液的紫外可见吸收光谱图,分别是APBA,FcBA,NADH,FcBA-NADH,APBA-NADH等溶液,NADH在λ=338nm处有很强的特征吸收峰,APBA无吸收峰,当NADH和APBA混合时,在λ=334nm处有特征吸收,吸收峰发生蓝移,说明NADH和FcBA之间发生了相互作用,FcBA也无特征吸收,当NADH和FcBA混合时,同样在λ=334nm处有一个特征吸收峰,说明NADH和FcBA之间也发生了相互作用。
为了使三明治电化学传感器结合NADH的性能最佳,本工作分别对氨基苯硼酸聚合圈数,聚合速率,检测液的pH,NADH和FcBA结合的时间等影响因素进行了优化实验;以加入NADH后,产生NADH的电流信号和FcBA的电流信号的加和(ΔiFcBA+ΔiNADH)作为判断依据。
图13中的A、B中聚合圈数和聚合速率分别影响膜的厚度和致密程度。聚合圈数过多,聚合膜则太厚,增大传质阻力。聚合膜圈数太少,膜不能完全覆盖电极表面,也就使硼酸基不能完全覆盖电极表面。聚合速率过快会造成膜过于疏松、稳定性差,速率过慢则导致膜过于致密,不利于传质。
APBA和NADH的结合情况很大程度上取决于检测液的pH,在不同pH条件下,ΔiFcBA+ΔiNADH的电流响应信号如图13中C所示,随着pH从7.0到7.4,ΔiFcBA+ΔiNADH的电流响应信号显著增加,在pH 7.4时响应电流最大,这和之前报道的碱性条件更利于形成硼酸酯的描述一致,因为在碱性条件下,苯硼酸及其衍生物的硼酸基团为四面体结构,更利于与顺式邻二羟基发生共价结合形成五元或六元环状硼酸酯化合物。
NADH和FcBA的结合时间的长短会影响两者结合的多少,从而影响FcBA电信号的大小。图13D中可以看出随着时间增大,ΔiFcBA+ΔiNADH的电信号增强,这是因为随着时间增长,NADH结合的FcBA越多,结合到电极上的NADH和FcBA也就越多,电信号也就越强,由图可知在结合时间为25min时两者结合最多,产生的电信号最强;当结合时间超过25min时,过量的FcBA可能会发生部分聚集,将NADH包覆,影响NADH与电极接触。
选择多巴胺(DA),肾上腺素(EP),抗坏血酸(AA),葡萄糖(Glu),尿酸(UA),谷氨酸(Glu acid)作为结构类似物和共存物来考察传感器的选择性。在含有1.0×10-5mol/LNADH溶液中加入等浓度的DA、EP、100倍AA、Glu、UA、Glu acid进行检测。电流比(|ΔiNADH|+|ΔiFcBA|)i/(|ΔiNADH|+|ΔiFcBA|)中(|ΔiNADH|+|ΔiFcBA|)i表示加入1.0×10-5mol/L NADH和干扰物时产生的NADH电流响应与FcBA电流响应的加和,(|ΔiNADH|+|ΔiFcBA|)表示只加入NADH后产生的NADH的电流响应与FcBA电流响应的加和。结果如图14所示,不管是没有邻二羟基,含有一对邻二羟基,含两对邻二羟基的干扰物,均对NADH的检测影响很小,可见该传感器对于NADH的选择性检测结果良好。
为了探究BSA/APBA/RGO/GCE具有定量检测能力,本工作采用DPV考察了该传感器对NADH和FcBA的电流响应信号的加和与NADH浓度之间的关系,如图15所示,随着NADH浓度的增加,其氧化峰电流在增大,同时FcBA的氧化峰电流也在增大,两者的氧化峰电流加和与NADH浓度在5.0×10-8~1.0×10-5mol/L的浓度范围内成线性关系(图15中B),回归方程为|ΔiNADH|+|ΔiFcBA|(μA)=1.29204cNADH(μmol/L)+3.62078(R=0.99157)(内插图)。检出限为(LOD)2.554×10-8mol/L。为了比较,分别进行了以NADH的氧化电流和FcBA的氧化电流作为输出信号,进行线性处理,单独的NADH的氧化电流与NADH浓度在5.0×10-8~1.0×10-5mol/L浓度范围内回归方程为ΔiNADH(μA)=0.25657cNADH(μmol/L)+0.69811(R=0.95171)(浅灰色线)。单独FcBA的氧化电流与NADH浓度在5.0×10-8~1.0×10-5mol/L浓度范围内回归方程为ΔiFcBA(μA)=1.03615cNADH(μmol/L)+2.92241(R=0.9748)(黑色线)。由上可知,以|ΔiNADH|+|ΔiFcBA|作为信号输出,在5.0×10-8~1.0×10-5mol/L浓度范围内具有更高的灵敏度,更好的相关性。
传感器的从重现性考察如下:用5根不同的电极通过同样的方法制备出传感器来检测相同浓度的NADH,记录|ΔiNADH|+|ΔiFcBA|的加和,其标准偏差为3.39%。
传感器的稳定性考察如下:将制备好的传感器检测1.0×10-5mol/LNADH,采用DPV记录初始的|ΔiNADH|+|ΔiFcBA|,再以同样的条件制备电极,放置两周后,再检测同浓度的NADH,得到|ΔiNADH|+|ΔiFcBA|电流值是初始值的88%,结果表明该传感器具有良好的重现性和稳定性。
为了评估该传感器的实际应用价值,从芜湖皖南医学院第一附属医院取了5个不同人的血清作为实际样品。将取得的实际样品进行离心处理,取上清液进行测试。该实验通过标准加入法来检验血清中的NADH浓度,如表1所示,该方法具有较高的回收率,回收率为96.0%~108.8%,RSD在1.8%~4.6%,表明该传感器可以作为一个有效可靠的传感界面进行NADH实际样品的测定。
表1
综上所述,本工作基于三明治夹心结构构建双信号电化学传感器用于灵敏检测NADH,利用NADH和FcBA的信号加和作为输出信号,相比于单独以NADH的信号作为输出信号或单独以FcBA作为输出信号,该传感器均表现出较高的的灵敏度。同时,该传感器具有良好的抗干扰能力。本发明制备的三明治类型的双信号电化学传感器还可应用于其他有电活性或非电活性的含两对邻二羟基的物质。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
(1)RGO/GCE的制备:在GCE电极上滴加GO溶液,之后在PBS溶液中进行电沉积,即得RGO/GCE电极;
(2)PAPBA/RGO/GCE的制备:将APBA溶液、HCl溶液和NaF溶液混合,得到混合液A,将上述RGO/GCE电极在混合液A中进行循环伏安扫描,即得PAPBA/RGO/GCE电极;
(3)在PAPBA/RGO/GCE电极上滴加BSA溶液,得到BSA/PAPBA/RGO/GCE电极;
(4)将PBS溶液、NADH和FcBA溶液混合得到混合液B,将BSA/PAPBA/RGO/GCE置于混合液B中反应得到三明治类型电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其中,在步骤(1)中,GO溶液的滴加量为8-12μL,GO溶液的浓度为0.8-1.2mg/mL;和/或
PBS溶液的pH为6.8-7.2。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其中,在步骤(1)中,电沉积的条件包括:电位范围为-1.4V~-1.3V,时间为715-725s。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其中,在步骤(2)中,APBA溶液的浓度为9-11mmol/L,HCl溶液的浓度为0.9-1.1mol/L,NaF溶液的浓度为4-6mmol/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其中,在步骤(2)中,循环伏安扫描的条件包括:电位范围为-0.5V~0.7V,扫描速度为0.09-0.11V/s。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其中,在步骤(3)中,BSA溶液的用量为8-12μL,其体积浓度为4-6%;
PAPBA/RGO/GCE电极上滴加BSA溶液后需放置28-32min。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其中,在步骤(4)中,FcBA溶液的浓度为0.9-1.1mmol/L;PBS溶液的pH为7.3-7.5;电聚合APBA圈数范围:8~12圈;和/或
NADH和FcBA溶液结合时间范围:15~35min。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其中,GCE电极在使用前用Al2O3在麂皮纸上打磨至镜面,用二次蒸馏水冲洗干净超声,然后在0.9-1.1mmol/L Fe(CN)6 3-/4-溶液中表征,直到得到稳定的电流响应。
9.一种基于硼酸亲和构建的三明治类型电化学传感器,其特征在于,所述三明治类型电化学传感器由权利要求1-8中任意一项所述的制备方法制得。
10.根据权利要求9所述的三明治类型电化学传感器在NADH检测中的应用。
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