CN104749233A

CN104749233A - 一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚a传感器及方法

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Publication number: CN104749233A
Application number: CN201510149951.XA
Authority: CN
Inventors: 朱烨; 闫妍; 周楚青; 闫旭鹏
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2035-03-31
Also published as: CN104749233B

Abstract

本发明公开了一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚A传感器及方法，对双酚A(BPA)进行了高灵敏度、高选择性地直接电化学检测。将金银合金薄膜置于浓硝酸中腐蚀掉其中的银，得到NPG膜。用NPG修饰玻碳电极，然后再修饰上BPA的适配体，制得传感器。NPG对BPA的氧化还原反应表现出优异的电化学催化活性，从而确保了传感器的高灵敏度。固定在NPG上的适配体大大提升了该传感器的选择性。被适配体捕获的BPA在0.35V/0.28V处(相对于银/氯化银电极)显示出氧化还原峰。本实验对重要的实验参数进行了优化。该检测方法的线性检测范围为0.1nM到100nM，检测限为0.056±0.004nM。值得一提的是，该传感器已被成功应用于人血清样本中BPA的检测。

Description

一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚A传感器及方法

技术领域

本发明属于电化学检测领域，特别涉及一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚A传感器及方法。

背景技术

双酚A(BPA)是聚碳酸酯聚合物和环氧树脂的合成过程中的一种重要的有机单体，其广泛存在于食品储存和包装材料中，包括婴幼儿奶瓶、饮用水瓶、餐具和食品罐头的内部涂层等。随着BPA在食品及环境领域的广泛应用与渗入[1]，人们对BPA的危害性产生了顾虑[2][3]。实际上，BPA是一种有害的内分泌干扰物质，因其结构与激素相类似，它可以冒充雌激素并且干涉雌激素与雌激素受体间的正常结合[3]，从而导致人体内分泌系统紊乱，尤其是对婴幼儿和孕妇会产生明显的危害[4]。最新的研究调查显示，BPA与肥胖症、神经中毒、甚至是癌症的病发都有潜在的关联[5][6]。因此，人体液中BPA的检测对于控制其对人体的危害有非常重要的意义。但是，生物样本中基体效应的干扰加大了BPA的检测难度。当下急需开发出一种快速的、简便的、高灵敏度、高选择性、稳定的检测方法来检测人体液中痕量的BPA。

当前BPA的检测方法有很多，但是大多数都是基于色谱技术[7]，比如液相色谱法[8]、高效液相色谱法[9]、液相色谱-质谱联用法[10]和气相色谱-质谱联用法[11]。近几年，一些其他的检测方法陆续被应用于BPA的检测，如酶联免疫吸附分析法(ELISA)[12]、分子印迹技术[13]、比色法[14]和电化学传感器[15]等等。在这些已被报道的方法中，电化学传感器因其装置低廉、操作简便、检测迅捷、操作成本低、灵敏度高、稳定性强、适合于真实样品的检测等诸多优势激发了广泛的研究兴趣[16]。由于BPA的电化学活性来源于它的酚羟基，直接的电化学检测成为了可能。为了加强检测信号，具有电化学催化性能的纳米材料常被用于催化BPA的氧化还原反应，如纳米金颗粒[17]、量子点[18]、碳纳米管[19]和石墨烯[15][20][21]。但是，许多其他酚类物质的反应也会被上述的纳米材料所催化，从而干扰了BPA的检测。为了提高检测的选择性，一些生物分子被用来作为识别元件，包括抗体[22]、适配体[23]、肽链[24]和雌激素受体[25]。Ragavan等人指出BPA的检测迫切需要的是一种灵敏度高、选择性好的简便的传感器[16]。因此，寻找一种兼具高效的电催化作用和优异的生物兼容性的纳米材料是发展BPA检测方法的关键。

脱合金法制备纳米多孔金(NPG)自2004年被报道以来获得了广泛的关注[26]。NPG是一种双向连续的多孔结构，纳米孔和金骨架完全联通，有一定的机械强度，化学性质稳定、导电性出众、生物兼容性良好。它所具备的高效的催化性质和光学性质已被广泛地应用于多个研究领域[27][28]。另外，它还对小分子物质展现出了优异的电催化性质[29][30]。但是，将具有优异的电催化作用的NPG和特异性生物分子识别元件相结合，用于设计高灵敏度和高选择性的电化学传感器实现BPA的检测，到目前为止从未被报道。基于NPG的诸多优势，其在电化学传感器领域具有非常大的应用潜力和价值。

发明内容

针对上述问题，我们开发了一种基于适配体修饰纳米多孔金NPG的生物传感器，对双酚A(BPA)进行直接电化学检测。NPG用脱合金法制得，并用于修饰玻碳电极(GCE)。然后，再用对BPA有特异性识别作用的适配体(aptamer)修饰NPG/GCE，传感器的制备工作便完成。我们用扫描电镜法(SEM)和X射线光电子光谱法(XPS)对该传感器的制备过程进行了表征，并用循环伏安法(CV)对BPA在NPG/GCE上的电化学行为进行了研究。本实验还对一些重要的实验参数进行了优化，包括适配体浓度、反应时间、pH和温度。这一新型的传感器对于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中和实际样品中的BPA浓度的检测结果通过差分脉冲伏安法(DPV)获得。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚A传感器，包括对电极、参比电极和工作电极，所述的工作电极为表面修饰了双酚A适配体/纳米多孔金的玻碳电极，制备方法如下：

1)将玻碳电极GCE用氧化铝粉末在麂皮革上研磨至镜面抛光度，超声洗涤后，再分别用超纯水和乙醇浸洗；

2)将脱合金法制得的纳米多孔金NPG平铺到GCE表面，得到的NPG/GCE；

3)将活化后的BPA适配体滴至NPG/GCE上，静置10-12h，使适配体通过S-Au键固定在NPG上，即得aptamer/NPG/GCE传感器探针。

优选的是，所述的对电极为铂电极，所述的参比电极为银/氯化银电极。

本发明还提供了一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚A传感器的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

2)将脱合金法制得的，得到的NPG/GCE；

3)将BPA适配体滴至NPG/GCE上，静置过夜，即得aptamer/NPG/GCE传感器探针，并用TE缓冲液洗涤后置于4℃的冰箱内储存待用。

优选的是，步骤2)中，所述将NPG平铺到GCE表面的具体方法是:用玻碳电极将漂浮在水上的NPG膜捞起，使NPG膜吸附到玻碳电极表面。

优选的是，步骤3)中，所述BPA适配体的滴加量为4～8μL。

一种应用上述的传感器检测双酚A浓度的方法，包括以下步骤：将生物传感器浸入待测样品中，根据相应电流值与双酚A浓度的定量关系，确定待测样品中双酚A的浓度。

本发明的有益效果：

1.在该工作中，我们开发了一种基于NPG纳米材料的适配体传感器，用于BPA的直接电化学检测。该电极的检测限低至0.056±0.004nM BPA，低于绝大多数已报道的电化学检测方法。该传感器还对BPA显示出了出色的选择性和长期的稳定性。另外，该传感器已经成功应用于人血清样本中BPA的检测，这意味着其在临床诊断领域有着值得瞩目的应用前景。

2.本发明制备过程简单、成本低，制备的检测结果稳定性高，重现性和检测精度高。

附图说明

图1.(a)NPG/GCE,(b)GCE,(c)金盘电极在含有200μM BPA的PBS溶液中的CV扫描图，(d)NPG/GCE在PBS溶液中的CV扫描图；内置图为NPG/GCE在含有50μM BPA的PBS溶液中的多圈CV扫描图。

图2.NPG的SEM表征图像(A和C)，aptamer/NPG的SEM表征图像(B和D)；(E)NPG/GCE和aptamer/NPG/GCE的XPS表征光谱图；(F)(a)aptamer/NPG/GCE和(b)BPA/aptamer/NPG/GCE在PBS溶液中的CV扫描图。

图3.(A)在0.1M PBS溶液中，BPA/aptamer/NPG/GCE在不同扫速下的CV图，(B)峰电流与扫速的线性拟合图。

图4.(A)aptamer/NPG/GCE传感器对不同浓度的BPA溶液的DPV检测结果((a)0,(b)0.1,(c)1.0,(d)10.0,(e)20.0,(f)50.0,(g)100.0,(h)150.0nM)；(B)aptamer/NPG/GCE传感器检测不同浓度BPA得到的标准曲线。

图5.aptamer/NPG/GCE传感器对不同分析物的DPV扫描结果图。

图6.基于纳米多孔金的适配体传感器的制备流程及BPA直接电化学检测原理

具体实施方式

以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选择。实施例1

1、实验部分

2.1化学试剂与材料

BPA购于阿拉丁试剂有限公司(中国，上海)。一种可以对BPA实现特异性识别的5-巯基化BPA适配体(5'–CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCGCAT CAC GGG TTC GCA CCA–3')[31]由Invitrogen生物科技有限公司(中国，北京)合成制得。人血清样品从健康的志愿者体内采集。PBS由0.01M的磷酸氢二钠、0.01M的磷酸二氢钠和0.9％氯化钠溶液配制而成。TE缓冲液(pH 8.0)由10mM tris(三羟甲基)氨基甲烷和1mM乙二胺四乙酸制得，被用于稀释适配体。金银合金膜(100nm厚；金银质量比50:50)购于常熟贵金属公司。所有的其他化学试剂都是分析纯级别，使用前未经进一步纯化。电阻率为18.25MΩ.cm的超纯水被用来配置所有的水溶液。

2.2实验仪器与装置

电化学实验装置与一个三电极系统相连接，包括一个被修饰的GCE工作电极(电极表面积为0.07cm²)，一个银/氯化银参比电极和一个铂丝对电极。CV和DPV扫描图像由CHI 660E电化学工作站(中国上海，辰华)获得。NPG的表面形态信息来源于日立S-4800超高分辨率(UHR)场发射(FE)扫描电子显微镜。XPS实验采用了赛默飞世尔科技ESCALAB 250XPS分光计。

2.3纳米多孔金的制备

NPG由脱合金法制得[26]。简而言之，将金银合金薄膜在浓硝酸溶液中腐蚀后，由于银被腐蚀掉，薄膜由银白色转变成了金色。

2.4aptamer/NPG/GCE探针的制备

aptamer/NPG/GCE探针的制备见方案图1。首先，GCE用氧化铝粉末(颗粒大小分别为0.3μm和0.05μm)在麂皮革上研磨至镜面抛光度，接着超声洗涤以除去电极表面的氧化铝颗粒和其他的杂质，然后再分别用超纯水和乙醇浸洗。这时，将已准备好的NPG(8mm*8mm)通过物理吸附在作用平铺到GCE表面，沿GCE的面积将多余的NPG用纸巾擦掉，得到的NPG/GCE。BPA的适配体在固定之前先要对其进行活化，具体做法为：取100μL适配体(5.0μM)与10μL二硫苏糖醇(0.5mM)充分振荡混合，活化15分钟，然后用100μL乙酸乙酯对未反应的二硫苏糖醇及其它副产物进行萃取分离，萃取三次。取3μL活化后的BPA适配体(5.0μM)滴至NPG/GCE上并静置一夜，使适配体通过S-Au键固定在NPG上，没有被固定的适配体通过用TE缓冲溶液洗涤除去。最后，将5μL巯基丙酸(1mM)滴至电极表面并静置30分钟，以对NPG上未固定适配体的位点进行封闭，用TE缓冲液洗涤后，即得aptamer/NPG/GCE传感器探针，将其置于4℃的冰箱内储存待用。

方案图1.处

方案图1.基于纳米多孔金的适配体传感器的制备流程及BPA直接电化学检测原理

2.5aptamer/NPG/GCE探针用于BPA的检测

为了检测BPA，组装好的aptamer/NPG/GCE传感器探针需浸于含有BPA的PBS溶液中30分钟。检测前，该探针需再用PBS溶液洗涤，再用置于PBS溶液中的三电极系统进行检测。CV和DPV扫描图像可以显示出被捕获的BPA在NPG催化作用下的氧化还原反应。

2、结果与分析

3.1NPG对于BPA的催化性能

图1.处

在组装aptamer/NPG/GCE之前，我们先用NPG/GCE作为工作电极研究了NPG对于BPA的催化作用。在含有200μM BPA的PBS溶液中得到的CV图在0.43V处显示出一个氧化峰(图1.中的曲线a)，这与之前用其他电极得到的BPA的氧化峰位置相一致[32][33]。相对地，在不含BPA的PBS溶液中，CV扫描结果没有出现任何峰(图1.中的曲线d)，这说明获得的氧化峰确实是BPA的峰。为了进一步证实NPG的电催化效果，我们分别用裸GCE和金盘电极进行了对照实验。在含有200μM BPA的PBS溶液中，用GCE和金盘电极进行CV扫描，结果都在0.5V附近得到了BPA的氧化峰(图1.中的曲线b和c)。明显地，用NPG/GCE扫描得到的BPA的氧化峰过电势较低，峰电流大小分别达到了GCE电极的23倍和金盘电极的9倍。这些证实了NPG对BPA有良好的电催化作用。根据这一实验结果，适配体修饰纳米多孔金的传感器用于检测BPA能够大大提高检测灵敏度。

用NPG/GCE在含有50μM BPA的PBS溶液中进行连续扫描，CV扫描结果显示随着扫描圈数的增加，氧化峰电流值在逐步减小(图1.内置图)，这与之前报道中的描述相吻合[32]。产生这一现象的原因是由于溶液中的BPA在NPG表面发生了电聚合，占据了催化活性位点，从而减弱了NPG对BPA的电催化性能。但是，值得一提的是，在用aptamer/NPG/GCE探针检测BPA的过程中，这一现象并未出现，这一点将会在接下来的3.2部分中进一步阐述。3.2aptamer/NPG/BPA探针的表征

图2.处

我们用SEM对组装好的aptamer/NPG/GCE传感器探针进行了表征。结果显示，NPG的孔径在20nm左右，这与金骨架部分的尺寸基本相同(见图2.A)。在高分辨率图像中，可以清楚地观察到NPG的骨架表面是很干净的(见图2.C)。在修饰上适配体之后，骨架部分变粗，孔径看起来变小了(见图2.B)。高分辨率图像中还可以看出在NPG的骨架表面上覆盖上了一层薄膜(见图2.D)。

为了进一步证实适配体固定到了电极表面，我们用XPS对组装好的传感器探针进行了测试。在对NPG/GCE和aptamer/NPG/GCE的XPS检测谱图中，位于284.6eV处的C1s峰作为了基准(见图2.E)。284.6eV处的C1s峰对应的是C-C和C-H键，另外常见的532.1eV处的O1s峰出现在了所有检测表面中。两个Au4f峰分别位于86.2eV和83.6eV处，出现在了所有检测表面中。相较于NPG/GCE检测谱图，aptamer/NPG/GCE的图谱中多出现了位于131.9eV处的P2p峰以及400.0eV处的N1s峰，前者对应着磷酸盐，其是适配体中一种关键的结构物质[34]；后者对应于DNA碱基中的C-N键。XPS测试结果进一步证实我们成功地制备了aptamer/NPG/GCE传感器探针。

我们在三电极体系中对由aptamer/NPG/GCE传感器探针捕获的BPA的电化学性质进行了研究。在空白试验中，在不含BPA的PBS溶液中，aptamer/NPG/GCE探针扫描结果没有显示出氧化还原峰(图2.F中的曲线a)。接着，将aptamer/NPG/GCE探针浸于含50μM BPA的PBS溶液中，使适配体捕捉溶液中的BPA。再用PBS溶液洗掉表面未固定的BPA，将获得的BPA/aptamer/NPG/GCE置于PBS溶液中进行检测。得到的曲线b(图2.F中)显示了一对位于0.35/0.28V左右的氧化还原峰，它对应着探针上适配体捕获的BPA的氧化还原反应。另外，在PBS溶液中，BPA/aptamer/NPG/GCE在不用扫速下得到的CV图的峰电流值与扫速的关系可见图3.。BPA的氧化还原电流随着扫速的增大而增大，阳极电流和阴极电流值都与扫速成正比关系，这说明了适配体很好地将BPA固定在了电极的表面。以上实验结果都证实了适配体可以成功地识别并捕获BPA。有趣的是，被捕获的BPA的电化学性质与体相溶液中溶解的BPA有所不同，因为后者只有氧化峰出现(见图1)。而且，对适配体探针捕获的BPA进行多圈CV扫描的结果显示峰电流的大小并未发生变化(见图2.F中的曲线b)，而溶液中的BPA的氧化峰电流值是随着扫描圈数的增加而逐步减小的(见图1.)。该现象的出现可归结于以下两种原因：第一，适配体对BPA的捕获缩短了BPA和NPG之间的距离，从而使NPG对BPA氧化还原反应的催化作用更加容易进行。第二，每个BPA分子都是被一个适配体分子捕获的，这可以阻止BPA在电极表面发生不可逆的聚合，而溶液中的BPA由于可自由运动会出现这种聚合现象。

图3.处

3.3实验条件的优化

为了使开发出的传感器实现最优的工作状态，一些实验参数需要进行优化，包括适配体的浓度、反应时间、pH和检测温度。为了研究适配体浓度的影响，我们在NPG/GCE表面固定不同浓度(0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,8.0,10.0,12.0μM)的适配体。得到的aptamer/NPG/GCE探针被浸于含有50μM BPA的PBS溶液中。接着，通过DPV扫描结果来观察不同浓度的适配体对传感器性能的影响。结果显示在低浓度范围内，响应电流随着适配体浓度的增大明显增大。但是，当适配体浓度超过5.0μM后，响应电流不再有明显的增大。这是因为电极表面用于固定适配体的活性位点已经达到了饱和。因此，在制备该电极的过程中，适配体的最佳浓度为5.0μM。

为了研究适配体探针与BPA的反应时间对检测结果的影响，aptamer/NPG/GCE探针分别在含有50μM BPA的PBS溶液中浸没不同时间(0-35分钟)，再用DPV测试捕获到的BPA，便可获得传感器的响应电流和反应时间的关系。结果显示响应电流在反应3min以后出现，然后随着反应时间的增加逐渐增大。但是在30min后由于能捕获BPA的适配体位点趋于饱和，峰电流不再出现明显的增大。因此，aptamer/NPG/GCE与BPA溶液最佳的反应时间应为30min。

接下来，为了研究测试溶液的pH对传感器响应电流的影响，我们将捕获了BPA的探针置于不同pH(5.5到8.0)的PBS溶液中进行DPV扫描。在pH为5.5到7.5的范围内，电流值随着pH值的增大而增大，当pH值大于7.5后，电流值随着pH值的增大而减小。最大响应电流出现在pH为7,5的实验条件下，因此本实验的所有工作都是在pH为7.5的PBS溶液中进行的。

另外，检测温度(15到50℃)对反应电流的影响也被考虑到。当检测温度从15℃上升到40℃的过程中，峰电流显著增大。但是一旦温度超过40℃，峰电流值急剧下降。这一显著的下降应该是由于NPG结构内部的热效应导致的。考虑到NPG的稳定性，30℃被选作最佳检测温度。

3.4BPA的检测

图4.处

在优化的实验条件下，aptamer/NPG/GCE探针被用来检测PBS溶液中不同浓度的BPA(0-150.0nM)。DPV扫描结果如图4.A所示，峰电流值随着BPA浓度的增大而逐渐增大。相对应的标准曲线在0.1nM到100nM BPA浓度范围内显示了非常好的线性关系(见图4.B)。该线性关系可以用方程Ip(μA)＝(0.047±0.007)+(0.017±0.00036)[BPA](nM)表示，其相关系数为0.998。该传感器的灵敏度为0.017±0.00036μA/nM。基于五组空白实验数据的标准偏差(置信水平为95％，k＝3,n＝5)，可计算出检测限为0.056±0.004nM BPA。该传感器的线性范围和检测限与之前报道的电化学BPA传感器进行了比较。我们发现该传感器的检测限低于之前大多数的检测方法。而且值得一提的是，和用纳米金颗粒修饰的电化学传感器相比较[35][17]，该传感器的检测限降低了接近100倍。这一结果归功于NPG双向连续的纳米结构，大大提高了传感器的电传导性。

3.5选择性，重复性和稳定性

图5.处

图5.aptamer/NPG/GCE传感器对不同分析物的DPV扫描结果图。

为了研究该传感器的选择性，我们选取了一些与BPA的结构、官能团相似的化合物进行实验，例如苯酚、对苯二酚、4,4'-二羟基联苯和双酚B。aptamer/NPG/GCE探针分别用来检测100nM上述的化合物和10nM BPA。图5.显示了DPV扫描结果，对于苯酚、对苯二酚、4,4'-二羟基联苯和双酚B来说，该传感器并未出现明显的氧化还原峰。但是，该传感器检测10nM BPA时出现了非常明显的氧化峰。该传感器的出色的选择性来自于适配体能可靠地特异性识别BPA。

为了考究该传感器探针检测的重复性，同一批制得的五支探针被用来检测10nM BPA溶液。这批传感器的检测结果的相对标准差(RSD)为6.2％，显示了良好的检测重复性。

通过先后对同一浓度BPA溶液的检测来评估该传感器探针的工作稳定性。首先，在相同条件下制得一批aptamer/NPG/GCE传感器探针。接着，用其中的三支探针来检测10nM BPA溶液，其检测平均值作为参考基准。其余的电极储存于4℃条件下，每隔十天取三支来检测同一浓度的BPA。历经两个月，所得检测结果并没有随时间不同发生明显变化，这显示了该探针的稳定性是令人满意的。

3.6实际样品的分析

表1.对注入定量BPA的稀释五倍的人体血清样本的检测结果

最后，我们对该aptamer/NPG/GCE传感器探针在分析领域的实用性进行了研究。在之前大部分的报道中，自来水和塑料用品常被作为检测BPA的实际样本。人血清中BPA的检测对于控制BPA在人体内的危害具有重要意义，但是相关分析研究却很少。该实际样品分析中，将收集到的人血清样本在10000rpm速度下离心作用5分钟，并将所得的上层清液用PBS溶液稀释5倍。接着，将标准BPA溶液加入到已稀释的血清样本中，使得加入的BPA的最终浓度分别为0.5,1.0,5.0,10,和50nM。然后，用aptamer/NPG/GCE探针检测上述溶液，DPV检测结果已列入表1.中。加入的BPA的回收率在99.2％和106％之间，RSD小于5％。这些结果都有力地显示出该适配体传感器在BPA的临床检测中的巨大潜力。

3、小结

在该工作中，我们开发了一种基于NPG纳米材料的适配体传感器，用于BPA的直接电化学检测。该电极的检测限低至0.056±0.004nM BPA，低于绝大多数已报道的电化学检测方法。该传感器还对BPA显示出了出色的选择性和长期的稳定性。另外，该传感器已经成功应用于人血清样本中BPA的检测，这意味着其在临床诊断领域有着值得瞩目的应用前景。

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上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚A传感器，包括对电极、参比电极和工作电极，其特征在于：所述的工作电极为表面修饰了双酚A适配体/纳米多孔金的玻碳电极，制备方法如下：

2.根据权利要求1所述的双酚A传感器，其特征在于：所述的对电极为铂电极，所述的参比电极为银/氯化银电极。

3.一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚A传感器的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

2)将脱合金法制得的NPG平铺到GCE表面，得到的NPG/GCE；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述将NPG通过物理吸附作用平铺到GCE表面。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述活化后的BPA适配体的滴加量为0.1～12μL。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述BPA适配体的活化方法为取100μL、5.0μM适配体与10μL、0.5mM二硫苏糖醇充分振荡混合，活化15分钟，然后用100μL乙酸乙酯对未反应的二硫苏糖醇及其它副产物进行萃取分离，萃取三次，即得。

7.一种应用权利要求1或2所述的双酚A传感器检测双酚A浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：将生物传感器浸入待测样品中，根据相应电流值与双酚A浓度的定量关系，确定待测样品中双酚A的浓度。