CN108169221A - 一种检测土霉素的生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测土霉素的生物传感器，包括修饰底物探针（S1）的纳米金，土霉素完全抗原；所述S1的序列如SEQ No.1所示，其5’端修饰巯基（‑SH）。利用该生物传感器采用标准曲线法可以测定溶液中土霉素的含量。本发明的生物传感器特异性高、灵敏度好，性能稳定，重复性好；反应条件温和，反应速度快；检测方法操作简便、检测周期短。

Description

一种检测土霉素的生物传感器
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测土霉素的生物传感器。
背景技术
四环素类抗生素是广谱抗生素，已被广泛应用在农业的运作和人类医学中，用于治疗传染性疾病。它们在低浓度中效果非常明显，并且在较短时间内就可以完全从体内代谢出来。然而，过度使用四环素可能引起食品安全问题，比如过敏反应和细菌抗药性的增加。此外人体内四环素的残留，会破坏肝脏和肾脏，威胁人类安全，此外还会引发环境问题。
土霉素（Oxytetracycline，OTC）作为重要的兽用四环素类抗生素，主要是干扰和抑制蛋白质的合成，从而产生杀灭微生物的作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体，猪附红细胞体等均有抑制作用。畜禽生产中，对猪肺炎菌、葡萄球菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、多杀性巴氏菌、嗜血杆菌、支原体、衣原体、立克次氏体（附红细胞体）等细菌有很好的抑制作用。另对猪的边虫病、钩端螺旋病、猪肺疫、气炭肿、喘气病、猪痢疾、猪牛的子宫内膜炎和乳房炎。雏禽的白痢、大肠杆菌、弧菌感染、脐炎、肠炎；水产弧菌病、鳞病、鳗鱼鳍病等也有很好的防治作用。然而，四环素的广泛使用会增加食品中土霉素残留风险，需要对食品中四环素进行定性、定量检测。
目前报道的土霉素的检测方法包括微生物检测法、色谱法、荧光法、毛细管电泳、色谱质谱联用技术等，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，已经难以适应土霉素检测的方便、快捷、灵敏度等方面的要求。因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测土霉素的残留。
发明内容
为了解决以上现有技术中检测土霉素的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于竞争关系的纳米金比色法检测土霉素的生物传感器。
本发明还提供一种上述生物传感器检测土霉素的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测土霉素的生物传感器，包括修饰底物探针（S1）的纳米金，土霉素完全抗原；所述S1的序列如SEQ No.1所示，其5’端修饰巯基（-SH）。
可选地，纳米金的制备可以采用金氯酸还原的方法制备获得；还原剂可选用常用还原剂，如柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷或硼氢化钠；优选地，纳米金采用金氯酸经柠檬酸钠还原获得。
一种利用上述检测土霉素的生物传感器检测土霉素的方法，包括以下步骤：
（1）土霉素完全抗原分别与系列浓度土霉素标准溶液或待测液混合，37℃恒温孵育；
（2）将修饰S1的纳米金加入上述步骤（1）的溶液中，37℃恒温孵育；
（3）用紫外可见分光光度计测定各混合溶液的吸光值；作系列浓度的土霉素标准溶液浓度的常用对数对吸光值的标准曲线，计算回归方程，根据待测液的吸光值，计算得其中土霉素的浓度。
所述土霉素完全抗原的终浓度为0.0001-10mg/mL，优选为0.001-1 mg/mL。
所述步骤（2）的反应时间为30-60min，优选为30min。
所属步骤（3）的检测波长为520nm。
本生物传感器的原理：
S1是土霉素的核酸适配体，其5’端修饰-SH，通过Au-S共价键修饰于纳米金表面。当溶液中存在土霉素的时候，S1可与目标物结合，使得金纳米粒子聚沉，从而产生颜色的变化：土霉素完全抗原能够与土霉素的核酸适配体链结合，当只加入土霉素完全抗原时，纳米金发生团聚，此时颜色变成无色。土霉素完全抗原更容易与土霉素结合，所以在土霉素完全抗原与经过修饰过的纳米金的竞争中，能够与土霉素核酸适配体链结合的土霉素完全抗原的数量减小，纳米金团聚的数量降低，此时溶液的颜色为紫红色。因此，通过测量纳米金溶液的吸光度来定量检测土霉素。
本发明具有以下优点：
本发明的生物传感器特异性高、灵敏度好，性能稳定，重复性好；反应条件温和，反应速度快；检测方法操作简便、检测周期短、易携带；适用于食品安全及水体中土霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为本生物传感器的工作原理示意图；
图2为不同浓度的完全抗原对检测土霉素的影响；
图3为不同反应时间对检测土霉素的影响；
图4为系列土霉素溶液的紫外吸收光谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
PBS缓冲液含Na2HPO4 (10 mM)，NaH2PO4 (10 mM)，NaCl (140 mM)，KCl (1 mM)，MgCl2 (1 mM)，CaCl2 (1 mM)，pH值为7.4。
取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L NaOH溶液15.2mL，用水稀释至250mL，配制为20mM的PB缓冲液，pH为6.5。
配置的各缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将缓冲液或水分装在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口，在高压灭菌锅中120 ℃的温度下灭菌20min。
DNA序列如下：5’-SH- CGA CGC ACA GTC GCT GGT GCG TAC CTG GTT GCC GTTGTG T-3’。
实施例1 金纳米的制备。
（1）向三口烧瓶中加入200mL超纯水；
（2）取500uL浓度为0.04g/mL的HAuCl4于离心管中，加200mL超纯水，搅拌加热至沸，搅拌速度450rpm；
（3）在搅拌的条件下，取3ml浓度为1%的柠檬酸三钠溶液快速加入步骤（2）的溶液中，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，至于4℃保存备用。
根据530nm处吸光值，上述溶液中金纳米颗粒的浓度约为0.3nM。
实施例2 金纳米的修饰。
（1）取实施例1中1 mL纳米金溶液于离心管中，离心10 min至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至3 nM；
（2）将上述溶液移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口，室温放置30 min后，加入150 μL浓度为30 μM的S1，混合均匀后，4 ℃下放置24 h；
（3）上述溶液中，分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡后无菌水反复冲洗）搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液，取出磁子，4 ℃放置48 h；
（4）将上述溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液；再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次，最后加入1 mL灭菌水配制为溶液。
实施例3 不同浓度的完全抗原对检测土霉素的影响。
（1）将2μL不同浓度的土霉素完全抗原（OTC-BSA，终浓度为0.0001 mg/mL，0.001mg/mL，0.01mg/mL，0.1mg/mL，1 mg/mL，10 mg/mL）和2μL土霉素溶液（1×10-3 mg/L）加入离心管中，震荡30s，在水浴锅中37摄氏度水浴0.5小时。
（2）将混合好的溶液从水浴锅中取出，再加入20μL修饰S1的纳米金溶液，放入37℃的水浴锅中反应30min。
（3）30min后，从水浴锅中取出混合溶液；用紫外可见分光光度计测定混合溶液520nm的吸光值。
以OTC-BSA浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，作图2，从图中可以看出，检测到的紫外吸收峰值随着完全抗原的浓度在0.0001g/mL- 0.01mg/mL区间内增大而增大，当浓度超过0.01mg mL-1后，吸收峰值趋于稳定。
实施例4 不同反应时间对检测土霉素的影响。
（1）将2μL OTC-BSA溶液（终浓度为0.1g/mL）和2μL土霉素溶液（1×10-3 mg/L）加入离心管中，震荡30s，在37摄氏度的水浴锅水浴30分钟。
（2）将混合好的溶液从水浴锅中取出，再加入标记好的纳米金溶液（20μL），放入37℃的水浴锅中反应，时间分别为（10min，20min，30min，40min，50min，60min）。
（3）反应完成后，从水浴锅中取出混合溶液；观察颜色变化，并且用紫外可见分光光度计测定混合溶液520nm的吸光值。
以反应时间为横坐标，以吸光度值为纵坐标，作图3。从图中可以看出，检测到的紫外吸收峰值随着反应时间在10min-30min区间内增大而减小，当反应时间超过30min后，吸收峰值趋于稳定。
实施例5 对土霉素的检测。
（1）将2μL OTC-BSA（终浓度为0.1g/mL）和系列浓度的土霉素标准溶液（1×10-3mg/L）加入离心管中，震荡30s，在37摄氏度的水浴锅水浴30分钟。
（2）将混合好的溶液从水浴锅中取出，再加入20μL修饰S1的纳米金溶液，放入37℃的水浴锅中反应30min。
（3）30min后，从水浴锅中取出混合溶液；观察颜色变化，用紫外可见分光光度计测定各混合溶液520nm的吸光值。
根据系列浓度的土霉素标准溶液520nm的吸光值，如图4所示，计算回归方程为A=15.4095-4.2350×logC，其中A是紫外吸收值，C是OTC的浓度，相关系数为0.9957；待测液的吸光值为0.385，计算得其土霉素浓度为2×10-6 mg/L。在2×10-6 mg/L的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于2×10-6 mg/L时，紫外吸收峰值与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的吸收峰值的最低点因此可得到该方法的检测下限为2×10-6mg/L。
<110> 济南大学
<120> 一种检测土霉素的生物传感器
<130> 20171212
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1
<400> 1
cgacgcacag tcgctggtgc gtacctggtt gccgttgtgt 40

Claims (5)

1.一种检测土霉素的生物传感器，其特征在于，包括修饰底物探针的纳米金，土霉素完全抗原；所述底物探针的序列如SEQ No.1所示，其5’端修饰巯基。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，纳米金的制备可以采用金氯酸还原的方法制备获得。
3.一种利用如权利要求1所述的生物传感器检测土霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）土霉素完全抗原分别与系列浓度土霉素标准溶液或待测液混合，37℃恒温孵育；
（2）将修饰底物探针的纳米金加入上述步骤（1）的溶液中，37℃恒温孵育；
（3）用紫外可见分光光度计测定各混合溶液的吸光值；作系列浓度的土霉素标准溶液浓度的常用对数对吸光值的标准曲线，计算回归方程，根据待测液的吸光值，计算得其中土霉素的浓度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，土霉素完全抗原的终浓度为0.0001-10mg/mL。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）的反应时间为30-60min。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110763673A (zh) * 2018-07-25 2020-02-07 首都师范大学 一种基于纳米金-dna的比色适体传感器及应用该传感器检测土霉素的方法
CN113831912A (zh) * 2021-10-20 2021-12-24 广东石油化工学院 一种基于自身荧光增强的土霉素比率荧光探针及制备与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103616423A (zh) * 2013-12-02 2014-03-05 济南大学 一种检测土霉素的竞争型适配体传感器的制备方法及应用
CN104634754A (zh) * 2015-01-30 2015-05-20 新疆农垦科学院 一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法
CN104777206A (zh) * 2015-01-28 2015-07-15 济南大学 一种检测土霉素的适体电极及其制备方法
CN105259231A (zh) * 2015-02-28 2016-01-20 济南大学 用于土霉素检测的电化学适体电极及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103616423A (zh) * 2013-12-02 2014-03-05 济南大学 一种检测土霉素的竞争型适配体传感器的制备方法及应用
CN104777206A (zh) * 2015-01-28 2015-07-15 济南大学 一种检测土霉素的适体电极及其制备方法
CN104634754A (zh) * 2015-01-30 2015-05-20 新疆农垦科学院 一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法
CN105259231A (zh) * 2015-02-28 2016-01-20 济南大学 用于土霉素检测的电化学适体电极及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YEON SEOK KIM ET AL.: "A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110763673A (zh) * 2018-07-25 2020-02-07 首都师范大学 一种基于纳米金-dna的比色适体传感器及应用该传感器检测土霉素的方法
CN113831912A (zh) * 2021-10-20 2021-12-24 广东石油化工学院 一种基于自身荧光增强的土霉素比率荧光探针及制备与应用

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