CN107389942B - 一种基于纳米金标记的重金属镉可视化检测方法 - Google Patents

一种基于纳米金标记的重金属镉可视化检测方法 Download PDF

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Abstract

一种基于纳米金标记的重金属镉可视化检测方法，其特征在于：用柠檬酸钠还原法制得纳米金颗粒(粒径15nm左右)，再分别将巯基化镉离子适配体、巯基化镉离子适配体互补寡核苷酸单链与金纳米颗粒连接形成两种探针，将这两种探针与待测物按一定比例混匀，加热后孵育1小时后，再加入盐溶液，反应4～5分钟。靶标的加入会破坏DNA对金纳米颗粒的保护作用，随着靶标浓度的增大，纳米金颗粒在高盐环境下会发生聚集，溶液的颜色由红色变为紫色(或蓝紫色)，导致吸收峰变宽并红移至620nm左右，此时在400～800nm进行UV‑vis扫描，即可实现对待测物中镉离子的检测。本发明用于水体中重金属镉检测，具有灵敏度高、快速简便的优点，检测限可达0.1ng/mL。

Description

一种基于纳米金标记的重金属镉可视化检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于纳米金标记的重金属镉可视化检测方法。
背景技术
镉(Cd)元素是一种生物蓄积性强、毒性持久、具有“三致”作用的剧毒元素，摄入过量的镉对生物体的危害极其严重，会导致肾脏、肝脏、肺部、骨骼、生殖器官的损伤，对免疫系统、心血管系统等具有毒性效应，进而引发多种疾病。镉移动性强，难以生物降解，极易通过食物链进入人体，引起人体机能衰退，长期接触会引起癌症。目前，我国镉污染形势严峻，镉污染事件频发，严重影响了居民的正常生活和身体健康。做好食品中镉的分析检测工作，对保护人体健康具有重要意义。
镉的传统检测方法目前是应用于国际法的主要检测方法，但存在成本高、样品处理繁琐、效率低、不适合现场和在线检测等缺点。镉的快速检测方法主要有生物化学传感器法、免疫分析法、酶分析法、试纸法等。这些方法各有优缺点，一些方法在测量精确度、选择性和稳定性等方面仍需进一步提高，一定程度上限制了其推广和应用。
金纳米颗粒作为一种制备简单、便于吸附生物分子的纳米材料，由于其具有独特的光学、化学、电化学及催化性能，已经被广泛应用于生物学和化学传感器的研究中。近年来，应用纳米金及纳米金的团聚对靶物质进行可视化检测的报道越来越多，这些物质主要包括一些食源性致病菌、毒素、金属离子、农药残留、食品非法添加剂等。但是，到目前为止，纳米金用于重金属镉检测的相关研究报道仍是很少。
适配体是一段具有三维空间结构的单链DNA或RNA，它可以与靶标发生特异性结合。因此，在构建检测方法时，适配体可以被用作一种优良的分子识别元件。首先，适配体是在体外设计和筛选的，因此，原则上，任何靶标都可以有它对应的适配体；其次，适配体在信号传导和化学修饰方面具有更加优良的特性。
本发明用镉离子适配体和镉离子适配体互补寡核苷酸单链与金纳米颗粒连接形成两种适配体探针，利用纳米金团聚产生的由红到蓝的颜色变化实现对镉离子的可视化检测。该方法操作简便、灵敏度高、检测时间较短，可用于检测水体中的镉含量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高的基于纳米金标记的重金属镉可视化检测方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
用柠檬酸钠还原法制得纳米金颗粒(粒径15nm左右)，再分别将巯基化镉离子适配体、巯基化镉离子适配体互补寡核苷酸单链与金纳米颗粒连接形成两种探针，将这两种探针与待测物按一定比例混匀，加热后孵育1小时后，再加入盐溶液，反应4～5分钟。靶标的加入会破坏DNA对金纳米颗粒的保护作用，随着靶标浓度的增大，纳米金颗粒在高盐环境下会发生聚集，溶液的颜色由红色变为紫色(或蓝紫色)，导致吸收峰变宽并红移至620nm左右，此时在400～800nm进行UV-vis扫描，即可实现对待测物中镉离子的检测。
具体地，所述的镉离子适配体序列(DNA1)为5’SH-ACC GAC CGT GCT GGA CTC TGGACT GTT GTG GTA TTA TTT TTG GTT GTG CAG TAT GAG CGA GCG TTG CG-3’，所述的镉离子适配体互补寡核苷酸单链序列(DNA2)为5’SH-CGC AAC GCT CGC TCA TAC TGC ACA ACCAAA-3’。
具体地，所述的纳米金的制备方法包括依次如下进行的如下步骤：
(1)用王水对容器进行浸泡，然后用超纯水对所述的浸泡后的容器进行清洗并烘干；
(2)在所述的烘干后的容器中按体积比为(15～20):1加入所述的超纯水和0.2～0.3％(w/v)氯金酸溶液，搅拌均匀后加热至沸腾，并在沸腾状态下保持5～10分钟，然后加入0.8～1.2％(w/v)的柠檬酸三钠溶液(含0.02～0.05％柠檬酸)，继续在沸腾状态下保持10～15分钟，其中所述的柠檬酸三钠溶液与所述的氯金酸溶液的体积比为(0.8～1):1；
(3)停止加热，继续搅拌12～18分钟，冷却至10～40℃，即得所述的纳米金。
具体地，所述的镉离子适配体探针制备方法包括依次进行的如下步骤：
(1)将所述的纳米金在3～5℃，13000～15000r/min离心30～40分钟后，弃去3/4上清液，混匀，得纳米金浓缩液；
(2)将浓度为10-5mol/L的DNA1与1mmol/L TCEP混合静置30～40分钟，加入到上述纳米金浓缩液中，在35～40℃下摇床孵育20～30小时，形成纳米金-DNA1溶液，其中，所述的DNA1、TCEP、纳米金浓缩液的体积比为1:1:(22～25)；
(3)将10％(w/v)十二烷基磺酸钠(SDS)溶液加入到所述的纳米金-DNA1溶液中，然后再分多次加入0.3～0.8mol/L的NaCl，使所述的NaCl的终浓度达到0.05～0.15mol/L，每次加入所述的NaCl后，超声处理8～12秒；
(4)将经步骤(3)处理后的纳米金-DNA1溶液在35～40℃陈化10～15小时；
(5)将经步骤(4)陈化后的纳米金-DNA1溶液在20～25℃，13000～15000r/min离心30～40分钟后，弃去上清液，再用去离子水溶液溶解沉淀，如此重复离心多次，以去除未连接到纳米金上的DNA，即得所述的镉离子适配体探针。
具体地，所述的镉离子适配体互补寡核苷酸单链探针的制备方法包括依次进行的如下步骤：
(1)将所述的纳米金在3～5℃，13000～15000r/min离心30～40分钟后，弃去3/4上清液，混匀，得纳米金浓缩液；
(2)将浓度为10-5mol/L的DNA2与1mmol/L TCEP混合静置30～40分钟，加入到上述纳米金浓缩液中，在35～40℃下摇床孵育20～30小时，形成纳米金-DNA2溶液，其中，所述的DNA2、TCEP、纳米金浓缩液的体积比为1:1:(22～25)；
(3)将10％(w/v)十二烷基磺酸钠(SDS)溶液加入到所述的纳米金-DNA2溶液中，然后再分多次加入0.3～0.8mol/L的NaCl，使所述的NaCl的终浓度达到0.05～0.15mol/L，每次加入所述的NaCl后，超声处理8～12秒；
(4)将经步骤(3)处理后的纳米金-DNA2溶液在35～40℃陈化10～15小时；
(5)将经步骤(4)陈化后的纳米金-DNA2溶液在20～25℃，13000～15000r/min离心30～40分钟后，弃去上清液，再用去离子水溶液溶解沉淀，如此重复离心多次，以去除未连接到纳米金上的DNA，即得所述的镉离子适配体互补寡核苷酸单链探针。
具体地，所述的镉离子适配体探针、镉离子适配体互补寡核苷酸单链探针、待测溶液的体积比为1:2:1。
检测原理：DNA1与DNA2是部分互补配对的，当分别将这两个DNA片段核酸适配体共价偶联到纳米金表面时，分散的纳米金会交联到一起，使纳米金颗粒间保持一定的动态距离并且稳定存在，此时液体呈红色。当检测体系中出现镉离子时，镉离子可与镉离子适配体结合，使得互补双链解开，交联的金纳米颗粒断开。此时，向该体系中加入高浓度盐(如NaCl),没有交联在一起的金纳米颗粒会因金颗粒表面的双电层被破坏而发生聚集，聚集态金纳米颗粒的吸收峰变宽并红移至620nm左右，液体的颜色由红色变为紫色(或蓝紫色)，而已经交联在一起的金颗粒仍可以保持稳定的红色，从而达到检测的目的。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明对镉离子的检测限为0.1ng/mL，在0.1～1000ng/mL范围内线性良好(R2＝0.9944)，因此，本发明中的检测方法灵敏度高；并且发明中的镉离子适配体探针和镉离子适配体互补寡核苷酸单链探针易于制备，因此，本发明操作简单，且成本较低。
附图说明
图1是基于纳米金标记的重金属镉可视化检测方法的原理图
图2是纳米金的透射电镜图；
图3是纳米金的紫外-可见吸收图谱；
图4是检测镉离子的标准曲线，其中，横坐标的单位为lg(ng/mL)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。
实施例1
1、合成巯基化镉离子适配体与巯基化镉离子适配体互补寡核苷酸单链(购自上海生工生物工程股份有限公司)
巯基化镉离子适配体序列：5’SH-ACC GAC CGT GCT GGA CTC TGG ACT GTT GTGGTA TTA TTT TTG GTT GTG CAG TAT GAG CGA GCG TTG CG-3’；
巯基化镉离子适配体互补寡核苷酸单链序列：5’SH-CGC AAC GCT CGC TCA TACTGC ACA ACC AAA-3’；
2、制备纳米金
1)用王水(体积比为3:1的浓盐酸和浓硝酸)浸泡相关容器，再用超纯水清洗，烘干；
2)在容器中加入50mL超纯水(电阻率≥18.2MΩ)和2.5mL 0.2％氯金酸溶液，用转子搅拌均匀，煮沸10min，加入2mL 1％的柠檬酸三钠溶液(含0.03％柠檬酸)，溶液立即变为深蓝黑色，继续煮沸10min；
3)停止加热，持续搅拌15min，在室温下冷却，得到了酒红色的纳米金溶液，并通过透射电子显微镜以及紫外-可吸收图谱对所制备的纳米金进行表征，表征图谱参见图2和图3。
3、制备镉离子适配体探针
取1840mL纳米金置于2mL离心管中，4℃12000r/min离心30min，弃去1380mL的上清液，混匀待用。取20μL浓度为10-5mol/L的镉离子适配体与20μL浓度为1mmol/L的TCEP混匀静置30min，然后加入到前面已经浓缩好的纳米金溶液中，37℃摇床孵育12h。加入20μL 10％SDS溶液，于37℃温度下陈化12h，陈化过程中逐次加入0.5mol/L的NaCl溶液，使NaCl终浓度达到0.1mol/L，每次加入NaCl溶液后，超声处理10s左右。陈化结束后，25℃12000r/min离心30min，弃去上清，再用超纯水(电阻率≥18.2MΩ)溶解沉淀，如此重复两次，以去除未连接到纳米金上的DNA，保存在4℃条件下备用。
4、镉离子适配体互补寡核苷酸单链探针的制备方法和镉离子适配体探针的制备方法相同。
5、镉离子的检测
分别取50μL制备好的镉离子适配体探针和100μL镉离子适配体互补寡核苷酸单链探针，置于离心管中，混匀，再加入50μL不同浓度的镉离子溶液(超纯水溶)，混匀，95℃处理10min，然后放置于37℃环境中孵育50min，然后加入NaCl溶液至终浓度为0.1mol/L，观察颜色变化并在400～800nm进行UV-vis扫描，根据A620/A520的值和镉离子浓度的对数值绘制出镉离子浓度的标准曲线，参见图4。
实施例2
像自来水样品中分别添加浓度为50、200、500ng/mL的重金属镉，采用基于纳米金标记的重金属镉可视化检测方法测定实际样本中的重金属镉的添加回收率，结果如表1：
表1重金属隔水样品的测定
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
序列表
〈110〉 江南大学
〈120〉 一种基于纳米金标记的重金属镉可视化检测方法
〈130〉
〈160〉 1
〈170〉 PatentIn version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 68
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 1
accgaccgtgctggactctggactgttgtggtattatttttggttgtgcagtatgagcgagcgttgcg 68
〈210〉 2
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 2
cgcaacgctcgctcatactgcacaaccaaa 30

Claims (2)

1.一种基于纳米金标记的重金属镉可视化检测方法，其特征在于：用柠檬酸钠还原法制得纳米金颗粒，颗粒粒径15nm左右；随后取巯基化镉离子适配体和巯基化镉离子适配体互补寡核苷酸单链分别与1mmol/L TCEP混合静置30～40分钟，再与纳米金混合在35～40℃下摇床孵育10～15小时，其中所述的巯基化镉离子适配体DNA1序列为5’SH-ACC GAC CGTGCT GGA CTC TGG ACT GTT GTG GTA TTA TTT TTG GTT GTG CAG TAT GAG CGA GCG TTGCG-3’，巯基化镉离子适配体互补寡核苷酸单链DNA2序列为5’SH-CGC AAC GCT CGC TCATAC TGC ACA ACC AAA-3’；然后再将混合液在35～40℃下陈化10～15小时，并在这个过程中分多次加入NaCl，使NaCl的终浓度达到0.1mol/L；随后将这两种探针与待测物按一定比例混匀，所述的镉离子适配体探针、镉离子适配体互补寡核苷酸单链探针、待测溶液的体积比为1:2:1，然后将混合溶液混匀，95℃下加热10min，然后放置于37℃环境中孵育50min，加入NaCl溶液至终浓度为0.1mol/L，反应5分钟；靶标的加入会破坏DNA对金纳米颗粒的保护作用，随着靶标浓度的增大，纳米金颗粒在高盐环境下会发生聚集，溶液的颜色由红色变为紫色或蓝紫色，导致吸收峰变宽并红移至620nm左右；观察颜色变化并在400～800nm进行UV-vis扫描，根据A620/A520的比值和镉离子浓度的对数值绘制出镉离子浓度的标准曲线；随后，实际检测过程中通过测得最终检测液的A620/A520的比值，根据标曲即可换算得到镉离子浓度值。
2.如权利要求1所述的可视化检测方法，其特征在于：制备纳米金时，所采用的试剂为0.2～0.3％(w/v)氯金酸溶液与0.8～1.2％(w/v)的柠檬酸三钠溶液，其中所述的柠檬酸三钠溶液含有0.02～0.05％柠檬酸；制得纳米金后，离心浓缩3～4倍待用。
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