CN111208177A - 一种基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建方法。在本发明中，鲁米诺Luminol作为发光体与牛血清蛋白包覆的金纳米粒子Au@BSA反应生成Luminol‑Au@BSA，然后与氧化铜纳米球结合生成Luminol‑Au@BSA‑CuO作为信号探针。氧化铜和纳米铂可以催化H₂O₂得到更多的O₂ ^•‑，从而极大增强了Luminol在低电位下的发光强度，实现了信号的双重放大。不同浓度的降钙素原PCT可结合不同量的二抗标记物Ab₂‑Luminol‑Au@BSA‑CuO，从而引起了传感器发光强度的变化，实现了PCT的定量检测。

Description

一种基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电 化学发光传感器的构建方法

技术领域

本发明设计了一种基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建方法，具体是以Luminol为发光体，CuO和PtNPs为信号增强剂，制备一种定量检测PCT的信号双放大型电化学发光传感器，属于电化学发光检测技术领域。

背景技术

PCT通常由甲状腺C细胞分泌，反映了全身炎症反应的活性。血浆中PCT的水平随着严重细菌和真菌感染，多器官功能衰竭和败血症的发生而升高。因此，PCT可以作为全身性炎症反应监测和诊断的重要指标。目前为止，只有很少的分析方法可用于PCT的定量检测，例如化学发光免疫分析，表面等离子体共振和荧光分析。因此，开发一种快速而高效的检测手段来实现PCT的定量检测变得至关重要。

电致化学发光ECL传感器作为一种ECL免疫修饰传感平台具有特异性更好，灵敏度更高等显著优势。ECL信号作为实时监测疾病标志物水平的特征信号，已被广泛应用于疾病标志物的分析检测。众所周知，Luminol作为一种传统的发光试剂，是研究最广泛的ECL发光体之一，具有低氧化电位、高发射率和稳定发光信号等诸多优势。然而，Luminol在低电位下不能产生强的ECL发射，而电位过高又会对传感器的生物活性产生影响。因此，我们需要寻找有效的增强剂来放大Luminol的发光信号，使其在低电位下依然具有强ECL发射。

CuO作为一种具有广泛用途的金属氧化物，具有很高的催化活性，可以降低催化分解温度、加快分解速率。其次，CuO对光、温度和湿度均具有很高的灵敏性，将其制成薄膜包覆在传感器的表面，可以极大地提高传感器的灵敏性和选择性。PtNPs作为一种过渡金属纳米粒子，化学性质稳定，具有优异的导电性和催化活性。因此，本发明采用CuO和PtNPs作为增强剂来实现H₂O₂的高效催化，从而极大地增强了Luminol的低电位发光，既保护了传感器的生物活性，又实现了信号的双重放大。

发明内容

本发明目的之一是制备催化性能优异的增强剂以实现Luminol在低电位下的强发光。

本发明目的之二是构建基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器。

本发明目的之三是利用构建的电化学发光传感器实现对PCT的高灵敏检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1. 将玻碳电极用Al₂O₃泥浆抛光至镜状表面，超纯水冲洗干净；将抛光好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，在-0.2 V的恒定电压下沉积一层AuNPs，沉积时间为40 s；将10 μL制备的PtNPs滴在沉积好的电极表面，室温保存至干燥；将修饰后的电极浸入50ng/mL的HGC溶液中1 h以结合一定量的HGC；将10 μL 5 μg/mL的Ab₁滴在电极表面，4 ^oC下孵化2 h；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴在电极表面，封闭Ab₁上非特异性活性位点；将6 μL不同浓度的PCT滴在电极表面，4 ^oC下孵化1 h；将10 µL 2-8 μg/mL的Ab₂-Luminol-Au@BSA-CuO滴在电极表面，4 ^oC下孵化2 h，即实现了基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建；如上所述传感器构建过程中，每一步都需将所得修饰后电极用超纯水轻轻冲洗，以去除未结合的生物分子；本发明采用Luminol作发光体，得到了稳定的发光信号；采用CuO和PtNPs作为增强剂，利用二者优异的催化活性催化H₂O₂生成更多的O₂ ^•-，极大地增强了Luminnol的发光信号；在裸电极上沉积一层AuNPs，促进了电子转移，增强了发光效率；HGC的引入实现了抗体的定向固定，既维持了构建传感器的生物活性，又提升了抗体的孵化效率，从而进一步提高了传感器的灵敏度；将Luminol-Au@BSA负载在CuO上作为二抗标记物，使传感器对目标物的浓度变化反应更加灵敏，从而实现对PCT的定量检测。

2. 将1 g CuSO₄•5H₂O溶于60 mL超纯水中，磁力搅拌至完全溶解，得到蓝色溶液；随后，加入6 g PVP，搅拌至完全溶解，溶液颜色变为蓝绿色，再依次加入6 g尿素和2 mLH₂O₂，继续搅拌1 h以充分反应；接下来，将上述溶液转移至高温高压反应釜中，120 ^oC下反应4 h，将反应所得墨绿色溶液离心，依次用水和乙醇洗涤，并将离心产物在60 ^oC下烘干；最后将制得前驱体在600 ^oC下煅烧2 h，即制得黑色的CuO粉末，并将其溶于超纯水中备用；本发明合成了CuO作增强剂来与H₂O₂反应生成大量的O₂ ^•-，进而有效放大了Luminol在低电位下的发光信号；CuO作为一种具有广泛用途的金属氧化物，具有很高的催化活性，可以降低催化分解温度、加快分解速率；同时，CuO对光、温度和湿度均具有很高的灵敏性，将其制成薄膜包覆在传感器的表面，可以极大地提高传感器的灵敏性和选择性；

将3 mL 10 mM的H₂PtCl₆溶液和0.5 mL 0.1 M的NaOH溶液搅拌混合；然后在搅拌下将0.5 mL 0.1 M的AA溶液缓慢添加到上述溶液中，再将混合物在60 ^oC下水浴加热30 min；最后将所得溶液离心洗涤，即制得PtNPs，并将其溶于超纯水中备用；本发明制备了PtNPs对H₂O₂进行高效催化，生成了更多的O₂ ^•-，进一步增强了Luminol的发光强度，实现了信号的双重放大；PtNPs是一种过渡金属纳米粒子，其化学性质稳定，具有优异的导电性和催化活性。

3. 首先，将1 mL质量分数为1 %的HAuCl₄分散于50 mL超纯水中；随后，在剧烈搅拌下加入2 mL质量分数为1 %的柠檬酸钠溶液，煮沸10 min，继续搅拌20 min后，将溶液冷却至室温；接下来，将500 mg BSA加入上述溶液，待完全溶解后继续加入40 mg NaBH₄，室温反应24 h；最后，将所得溶液离心洗涤，冷冻干燥，即成功制得BSA改性的AuNPs，并取3 mg制得的Au@BSA粉末溶于5 mL超纯水中备用；本发明制备了Au@BSA，用BSA对AuNPs进行包覆，实现了AuNPs的稳定和保护；此外，经过表面功能化的BSA可通过酰胺反应使CuO表面结合更多的发光体，从而增强了发光效率。

4. 取500 μL体积分数为12.5 %的GA加入Au@BSA溶液中，室温下震荡3 h得到GA修饰的Au@BSA，然后将1 mL 0.1 M的Luminol加入其中反应2 h得到Luminol-Au@BSA；将2 mL包含40 mM EDC和10 mM NHS的混合溶液加入上述溶液中，4 ^oC下反应2 h，得到羧基活化的Luminol-Au@BSA；随后，将CuO溶于甲苯中，加入1 mL APTES，超声处理1 h后，将所得混合溶液移至高温高压反应釜中，90 ^oC下反应24 h，离心洗涤，得到CuO-NH₂；接下来，将CuO-NH₂溶于羧基活化的Luminol-Au@BSA溶液中，反应2 h后，将所得溶液离心洗涤，得到Luminol-Au@BSA-CuO，并将其溶于PH为7.4的PBS中备用；最后，将500 μL 10 μg/mL的Ab₂加入上述溶液，4 ^oC下孵育12小时，即成功制得Ab₂-Luminol-Au@BSA-CuO；本发明将Luminol负载在CuO表面，合成了Luminol-Au@BSA-CuO作为信号探针，表面功能化的BSA可使CuO表面结合更多的发光体，提高了发光效率，将Ab₂ 固定在Luminol-Au@BSA-CuO上作为标记物，使传感器对PCT的浓度变化反应更加灵敏，实现了对PCT的定量检测。

5. 将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂电极作为对电极、构建传感器作为工作电极组成三电极体系；将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，然后将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为0-0.6 V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用10-100 mmol/L的H₂O₂溶液作为检测底液，利用三电极体系检测不同浓度PCT下的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线；所述H₂O₂溶液，pH为6.0-8.5，利用10-100 μL的H₂O₂溶于10 mL 0.1 M的PBS配制。

6. 在稀释的血清样品中加入不同浓度的PCT，采用标准加入法测定血清样品中PCT的相对标准偏差和回收率，所得血清样品中PCT的相对标准偏差为1.03-1.21 %，回收率为99.8-100.3 %，表明本发明可以用于实际样品检测，且结果准确可靠。

本发明的有益成果

1. 本发明成功制备了催化性能优异的CuO和PtNPs，其作为增强剂可催化H₂O₂生成更多的O₂ ^•-，从而显著增强了Luminol在低电位下的发光强度，满足了痕量分析的需求。

2. 本发明成功构建了基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器。

3. 本发明通过构建的电化学发光传感器实现了对PCT的定量检测，结果具有优异的稳定性，选择性和重现性，对PCT检测的线性范围是10 fg/mL-100 ng/mL，检测限为2.96fg/mL。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，本发明保护范围不仅局限于实施例，该领域专业人员对本发明技术方案所作的改变均属于本发明保护范围。

实施例1

将玻碳电极用Al₂O₃泥浆抛光至镜状表面，超纯水冲洗干净；将抛光好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，在-0.2 V的恒定电压下沉积一层AuNPs，沉积时间为40 s；将10μL制备的PtNPs滴在沉积好的电极表面，室温保存至干燥；将修饰后的电极浸入50 ng/mL的HGC溶液中1 h以结合一定量的HGC；将10 μL 5 μg/mL的Ab₁滴在电极表面，4 ^oC下孵化2 h；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴在电极表面，封闭Ab₁上非特异性活性位点；将6 μL不同浓度的PCT滴在电极表面，4 ^oC下孵化1 h；将10 µL 2 μg/mL的Ab₂-Luminol-Au@BSA-CuO滴在电极表面，4 ^oC下孵化2 h，即实现了基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建；如上所述传感器构建过程中，每一步都需将所得修饰后电极用超纯水轻轻冲洗，以去除未结合的生物分子。

实施例2

将玻碳电极用Al₂O₃泥浆抛光至镜状表面，超纯水冲洗干净；将抛光好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，在-0.2 V的恒定电压下沉积一层AuNPs，沉积时间为40 s；将10μL制备的PtNPs滴在沉积好的电极表面，室温保存至干燥；将修饰后的电极浸入50 ng/mL的HGC溶液中1 h以结合一定量的HGC；将10 μL 5 μg/mL的Ab₁滴在电极表面，4 ^oC下孵化2 h；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴在电极表面，封闭Ab₁上非特异性活性位点；将6 μL不同浓度的PCT滴在电极表面，4 ^oC下孵化1 h；将10 µL 5 μg/mL的Ab₂-Luminol-Au@BSA-CuO滴在电极表面，4 ^oC下孵化2 h，即实现了基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建；如上所述传感器构建过程中，每一步都需将所得修饰后电极用超纯水轻轻冲洗，以去除未结合的生物分子。

实施例3

将玻碳电极用Al₂O₃泥浆抛光至镜状表面，超纯水冲洗干净；将抛光好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，在-0.2 V的恒定电压下沉积一层AuNPs，沉积时间为40 s；将10μL制备的PtNPs滴在沉积好的电极表面，室温保存至干燥；将修饰后的电极浸入50 ng/mL的HGC溶液中1 h以结合一定量的HGC；将10 μL 5 μg/mL的Ab₁滴在电极表面，4 ^oC下孵化2 h；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴在电极表面，封闭Ab₁上非特异性活性位点；将6 μL不同浓度的PCT滴在电极表面，4 ^oC下孵化1 h；将10 µL 8 μg/mL的Ab₂-Luminol-Au@BSA-CuO滴在电极表面，4 ^oC下孵化2 h，即实现了基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建；如上所述传感器构建过程中，每一步都需将所得修饰后电极用超纯水轻轻冲洗，以去除未结合的生物分子。

实施例4

将1 g CuSO₄•5H₂O溶于60 mL超纯水中，磁力搅拌至完全溶解，得到蓝色溶液；随后，加入6 g PVP，搅拌至完全溶解，溶液颜色变为蓝绿色，再依次加入6 g尿素和2 mL H₂O₂，继续搅拌1 h以充分反应；接下来，将上述溶液转移至高温高压反应釜中，120 ^oC下反应4 h，将反应所得墨绿色溶液离心，依次用水和乙醇洗涤，并将离心产物在60 ^oC下烘干；最后将制得前驱体在600 ^oC下煅烧2 h，即制得黑色的CuO粉末，并将其溶于超纯水中备用；将3 mL10 mM的H₂PtCl₆溶液和0.5 mL 0.1 M的NaOH溶液搅拌混合；然后在搅拌下将0.5 mL 0.1 M的AA溶液缓慢添加到上述溶液中，再将混合物在60 ^oC下水浴加热30 min；最后将所得溶液离心洗涤，即制得PtNPs，并将其溶于超纯水中备用。

实施例5

首先，将1 mL质量分数为1 %的HAuCl₄分散于50 mL超纯水中；随后，在剧烈搅拌下加入2 mL质量分数为1 %的柠檬酸钠溶液，煮沸10 min，继续搅拌20 min后，将溶液冷却至室温；接下来，将500 mg BSA加入上述溶液，待完全溶解后继续加入40 mg NaBH₄，室温反应24 h；最后，将所得溶液离心洗涤，冷冻干燥，即成功制得BSA改性的AuNPs，并取3 mg制得的Au@BSA粉末溶于5 mL超纯水中备用。

实施例6

取500 μL体积分数为12.5 %的GA加入Au@BSA溶液中，室温下震荡3 h得到GA修饰的Au@BSA，然后将1 mL 0.1 M的Luminol加入其中反应2 h得到Luminol-Au@BSA；将2 mL包含40mM EDC和10 mM NHS的混合溶液加入上述溶液中，4 ^oC下反应2 h，得到羧基活化的Luminol-Au@BSA；随后，将CuO溶于甲苯中，加入1 mL APTES，超声处理1 h后，将所得混合溶液移至高温高压反应釜中，90 ^oC下反应24 h，离心洗涤，得到CuO-NH₂；接下来，将CuO-NH₂溶于羧基活化的Luminol-Au@BSA溶液中，反应2 h后，将所得溶液离心洗涤，得到Luminol-Au@BSA-CuO，并将其溶于PH为7.4的PBS中备用；最后，将500 μL 10 μg/mL的Ab₂加入上述溶液，4 ^oC下孵育12小时，即成功制得Ab₂-Luminol-Au@BSA-CuO。

实施例7

将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂电极作为对电极、构建传感器作为工作电极组成三电极体系；将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，然后将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为0-0.6 V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用10 mmol/L的H₂O₂溶液作为检测底液，利用三电极体系检测不同浓度PCT下的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线；所述H₂O₂溶液，pH为6.0，利用10 μL的H₂O₂溶于10 mL 0.1 M的PBS配制。

实施例8

将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂电极作为对电极、构建传感器作为工作电极组成三电极体系；将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，然后将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为0-0.6 V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用50 mmol/L的H₂O₂溶液作为检测底液，利用三电极体系检测不同浓度PCT下的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线；所述H₂O₂溶液，pH为7.4，利用50 μL的H₂O₂溶于10 mL 0.1 M的PBS配制。

实施例9

将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂电极作为对电极、构建传感器作为工作电极组成三电极体系；将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，然后将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为0-0.6 V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用100 mmol/L的H₂O₂溶液作为检测底液，利用三电极体系检测不同浓度PCT下的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线；所述H₂O₂溶液，pH为8.5，利用100 μL的H₂O₂溶于10 mL 0.1 M的PBS配制。

实施例10

在稀释的血清样品中加入不同浓度的PCT，采用标准加入法测定血清样品中PCT的相对标准偏差和回收率，所得血清样品中PCT的相对标准偏差为1.03-1.21 %，回收率为99.8-100.3 %，表明本发明可以用于实际样品检测，且结果准确可靠。

Claims (6)

1.一种基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建方法，其特征在于：

将玻碳电极用三氧化二铝Al₂O₃泥浆抛光至镜状表面，超纯水冲洗干净；将抛光好的电极浸入质量分数为1 %的氯金酸HAuCl₄溶液中，在-0.2 V的恒定电压下沉积一层金纳米粒子AuNPs，沉积时间为40 s；将10 μL制备的PtNPs滴在沉积好的电极表面，室温保存至干燥；将修饰后的电极浸入50 ng/mL的HGC溶液中1 h以结合一定量的HGC；将10 μL 5 μg/mL的一抗Ab₁滴在电极表面，4 ^oC下孵化2 h；将3 μL质量分数为1 %的牛血清白蛋白BSA滴在电极表面，封闭Ab₁上非特异性活性位点；将6 μL不同浓度的PCT滴在电极表面，4 ^oC下孵化1 h；将10 µL 2-8 μg/mL的Ab₂-Luminol-Au@BSA-CuO滴在电极表面，4 ^oC下孵化2 h，即实现了基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建；

如上所述传感器构建过程中，每一步都需将所得修饰后电极用超纯水轻轻冲洗，以去除未结合的生物分子。

2.一种基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建方法，关于CuO和PtNPs的制备，其特征在于，步骤如下：

将1 g五水合硫酸铜CuSO₄•5H₂O溶于60 mL超纯水中，磁力搅拌至完全溶解，得到蓝色溶液；随后，加入6 g聚乙烯吡咯烷酮PVP，搅拌至完全溶解，溶液颜色变为蓝绿色，再依次加入6 g尿素和2 mL H₂O₂，继续搅拌1 h以充分反应；接下来，将上述溶液转移至高温高压反应釜中，120 ^oC下反应4 h，将反应所得墨绿色溶液离心，依次用水和乙醇洗涤，并将离心产物在60 ^oC下烘干；最后将制得前驱体在600 ^oC下煅烧2 h，即制得黑色的CuO粉末，并将其溶于超纯水中备用；

将3 mL 10 mM的氯铂酸H₂PtCl₆溶液和0.5 mL 0.1 M的氢氧化钠NaOH溶液搅拌混合；然后在搅拌下将0.5 mL 0.1 M的抗坏血酸AA溶液缓慢添加到上述溶液中，再将混合物在60^oC下水浴加热30 min；最后将所得溶液离心洗涤，即制得PtNPs，并将其溶于超纯水中备用。

3.如权利要求1所述的一种基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建方法，所述Au@BSA的制备，其特征在于，步骤如下：

首先，将1 mL质量分数为1 %的HAuCl₄分散于50 mL超纯水中；随后，在剧烈搅拌下加入2mL质量分数为1 %的柠檬酸钠溶液，煮沸10 min，继续搅拌20 min后，将溶液冷却至室温；

接下来，将500 mg BSA加入上述溶液，待完全溶解后继续加入40 mg硼氢化钠NaBH₄，室温反应24 h；最后，将所得溶液离心洗涤，冷冻干燥，即成功制得BSA改性的AuNPs，并取3 mg制得的Au@BSA粉末溶于5 mL超纯水中备用。

4.如权利要求1所述的一种基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建方法，所述Ab₂-Luminol-Au@BSA-CuO的制备，其特征在于，步骤如下：

取500 μL体积分数为12.5 %的戊二醛GA加入Au@BSA溶液中，室温下震荡3 h得到GA修饰的Au@BSA，然后将1 mL 0.1 M的Luminol加入其中反应2 h得到Luminol-Au@BSA；将2 mL包含40 mM EDC和10 mM NHS的混合溶液加入上述溶液中，4 ^oC下反应2 h，得到羧基活化的Luminol-Au@BSA；随后，将CuO溶于甲苯中，加入1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，超声处理1 h后，将所得混合溶液移至高温高压反应釜中，90 ^oC下反应24 h，离心洗涤，得到CuO-NH₂；接下来，将CuO-NH₂溶于羧基活化的Luminol-Au@BSA溶液中，反应2 h后，将所得溶液离心洗涤，得到Luminol-Au@BSA-CuO，并将其溶于PH为7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS中备用；最后，将500 μL 10 μg/mL的Ab₂加入上述溶液，4 ^oC下孵育12小时，即成功制得Ab₂-Luminol-Au@BSA-CuO。

5.如权利要求1所述的一种基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建方法，所述PCT的检测，其特征在于：

将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂电极作为对电极、构建传感器作为工作电极组成三电极体系；将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，然后将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为0-0.6 V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用10-100 mmol/L的H₂O₂溶液作为检测底液，利用三电极体系检测不同浓度PCT下的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线；

所述H₂O₂溶液，pH为6.0-8.5，利用10-100 μL的H₂O₂溶于10 mL 0.1 M的PBS配制。

6.如权利要求1所述的一种基于氧化铜和纳米铂增强鲁米诺发光的信号双放大型电化学发光传感器的构建方法，在血清样本中对PCT的检测，其特征在于：

在稀释的血清样品中加入不同浓度的PCT，采用标准加入法测定血清样品中PCT的相对标准偏差和回收率，所得血清样品中PCT的相对标准偏差为1.03-1.21 %，回收率为99.8-100.3 %，表明本发明可以用于实际样品检测，且结果准确可靠。