CN109613092B - 一种同时检测特定dna总量和单碱基突变量的生物传感器及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测特定DNA总量和单碱基突变量的生物传感器及其检测方法。将设计有6对碱基互补的巯基修饰的抓捕链cDNA与亚甲基蓝修饰的信标‑抓捕链pcDNA预先杂交，得到底端为双螺旋、顶端为两条未配对长链作为抓捕臂的“锚式”alDNA，将之组装至金电极表面并封闭电极表面未组装alDNA的空余位点，得到生物传感器界面；传感器首先捕获特定序列DNA的总量，后再经特异性酶连‑化学变性，可得特定单碱基突变DNA的含量。本发明构建方法简单，检测灵敏度高，可实现同时定量检测特定DNA总量及其突变DNA含量的目的，且反应条件温和、传感体系稳定高效，对比临床上基因测序的昂贵繁琐，具有很大的实际意义和发展潜力，有利于推广使用。

Description

一种同时检测特定DNA总量和单碱基突变量的生物传感器及 其检测方法
技术领域
本发明涉及一种同时检测特定DNA总量和单碱基突变量的生物传感器及其检测方法，属于生物传感技术领域。
背景技术
单碱基突变是指DNA链上某一碱基发生变异，其可导致下游蛋白质功能异常，从而引发一系列疾病，甚至癌症。突变的DNA可能存在于细胞内或游离于血液、组织液、唾液等体液中。受外界及遗传等因素影响，基因突变普遍存在于人类的一生之中，因此针对单碱基突变的检测一直是研究热点。
目前常用的针对基因突变的检测手段主要有二代测序(NGS)、Sanger测序、数字PCR等，可准确鉴别基因组，虽然灵敏度高，但操作复杂、耗时长且检测成本高昂。生物传感器方面，荧光、紫外、SPR、比色法等检测方法多与分子信标、酶等反应原理联用，极大降低了检测成本和等待时间，但仍然存在检测限高、灵敏度低、重现性差、实际样干扰多等缺点。其中，电化学方法以其原理简单、即时检测、成本低廉等优点表现突出，且电极检测受溶液浑浊程度影响低，在实际样的检测中优势明显。因此，设计一种模型可变、构建稳定、操作简单、成本低廉的以功能化DNA为模型的生物传感器，通过电化学检测直接获得一个或多个突变信息被提上日程。
本发明提供了一种检测单碱基突变DNA的锚式生物传感器，仅需一次构建，便可先后有效定量特定序列的野生型、突变型DNA总量(t-DNA)与其中突变型DNA(M-DNA)含量。本发明中构建的“锚式”DNA(alDNA)凭借其特有的底端为少量螺旋双链、上部两条未配对长单链为抓捕臂的结构，实现了对人造样和实际样中含量极低的目标DNA的高效捕获，同时赋予传感器体系较强的电信号变化，较传统传感器具有检测限低、灵敏度高、简单快速、成本低廉等优势。本发明的检测方法中新颖地利用了甲酰胺可抢先配对碱基的原理，同时通过加盐调控溶液离子强度以影响DNA双链稳定性，有效促进DNA在显著低于原有热变性温度的环境下实现变性解旋，替代了外置热源高温加热的传统方法，使反应全程条件温和而高效。
发明内容
本发明旨在提供一种同时检测DNA总量和单碱基突变比例及突变量的生物传感器及其检测方法。本发明的生物传感器可通过修改少量DNA序列设计以用于任意单碱基突变DNA的检测，而且具有检测限低、灵敏度高、简单快速、成本低廉等优势，同时反应条件温和，大大提升可操作性。
一种同时检测特定DNA总量和单碱基突变量的生物传感器，包括由以下方式制备得到的传感器界面：
将有5～7对碱基互补的抓捕链cDNA与修饰有信标分子的信标-抓捕链pcDNA杂交，得到一端为双螺旋、另一端为两条未配对长单链作为抓捕臂的“锚式”alDNA；将alDNA的双螺旋一端组装至电极表面，后封闭电极表面的空余位点以防止非特异性吸附，得到传感器界面。
进一步的，所述cDNA长28～30bp，能够与待测DNA形成长20bp以上的连续互补配对，其5’端修饰有巯基或氨基；pcDNA长21～23bp，能够与待测DNA形成长16bp以上的连续互补配对，其5’端修饰有磷酸基团，3’端修饰有电化学信号分子，电化学信号分子包括：亚甲基蓝、二茂铁或Cy5。
优选的方案，所述alDNA的合成，是取等体积等浓度的cDNA与pcDNA混合，使最终浓度均为1μM，溶剂为34mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液。
优选的方案，所述碱基互补配对杂交反应条件为37℃下水浴2h。
进一步的，将alDNA滴加至电极(含金电极、粗糙化金电极或电沉积有金纳米颗粒的玻碳电极)表面，静置，使alDNA通过其末端的巯基或氨基经Au-S或Au-C共价键组装至电极表面。
金电极在连接DNA之前要经以下预处理过程，优选的方案，所述金电极是指将抛光后的裸金电极置于0.5M硫酸中用循环伏安法扫描活化，设置电压范围0.2～1.6V，先后在扫速50mV/s、10mV/s下扫描多圈至循环伏安曲线稳定。
进一步的，将alDNA滴加至电极表面，静置14h或过夜，然后将电极表面浸入6-巯基己醇(MCH)溶液以封闭电极表面的空余位点以防止非特异性吸附物质干扰。
优选的方案，将电极浸入1mM MCH乙醇溶液，室温下反应2h，以封闭电极表面的空余位点以防止非特异性吸附，得到传感器界面。
进一步的，还包括：利用DNA连接酶进行DNA链接反应的试剂和DNA化学变性反应所需的试剂。
进一步的，DNA连接反应的试剂组成为：30mM Tris-HCl，4mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，0.005％BSA，0.2mM NAD和0.5～2U/μL E.coli DNA连接酶。
进一步的，DNA变性反应所需试剂组成为：50％甲酰胺，10mM氯化钠或氯化钾，1mMEDTA，10mM Tris(pH 7.0)。
优选的方案，所述cDNA长29bp，5’端修饰有六碳链连巯基；pcDNA长21bp，5’端修饰有磷酸基团，3’端修饰有亚甲基蓝信号分子；cDNA与pcDNA仅在一侧有6对连续碱基互补。
进一步的，
所述cDNA碱基序列为：5’-TTTTCAACTAGGCACTCTTGCCTACGCCA-3’(SEQ ID NO.1)。
所述pcDNA碱基序列为：5'-TCAGCTCCAACTACCAGTTGA-3'，(SEQ ID NO.2)；
优选的方案，所述cDNA碱基序列为：
5’-(SH C6)TTTTCAACTAGGCACTCTTGCCTACGCCA-3’；
所述pcDNA碱基序列为：
5'-P-TCAGCTCCAACTACCAGTTGA-MB-3'。
所述的生物传感器的使用方法：
将含待测特定序列的目标DNA溶液滴于电极表面与传感器体系进行杂交，此时检测电化学信号，可获得特定DNA的量对应的电流值。
优选的方案，所述的生物传感器及其检测方法，将含目标序列的DNA溶液滴于传感器界面，使之与传感器杂交反应，然后二次水冲洗电极并吹干，检测电化学信号，获得含目标序列的野生型W-DNA和突变型M-DNA之和的t-DNA总量。
如果要进一步获得特定单碱基突变DNA的含量，则继续向电极表面滴加DNA连接酶溶液，使捕获有M-DNA的传感体系中原cDNA的3’端与pcDNA的5’端发生特异性链接反应，而捕获有W-DNA的传感体系则不发生反应；再将电极表面浸入DNA变性反应溶液中定温水浴，通过DNA变性解旋使未直接连接在电极表面的所有DNA脱离传感体系，此时检测电化学信号，W-DNA体系无明显信号，可获得突变型M-DNA量对应的电流值。
进一步的，所述的生物传感器的使用方法，所述链接反应条件为38～40℃、0.5～1h。所述DNA变性反应条件为40～42℃、30～45min。
进一步的，所述的生物传感器的使用方法，为方波伏安法或循环伏安法，检测条件为：以10mM pH 7.4的PBS缓冲液为电解质溶液，以金电极或粗糙化金电极或电沉积有金纳米颗粒的玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt丝电极为对电极，电压扫描范围为-0.4～0V，频为10Hz，振幅为25mV。
本发明中的电化学生物传感器，优选抓捕链cDNA由六碳连巯基修饰，巯基用于连接金电极。优选信标链pcDNA由亚甲基蓝修饰，亚甲基蓝的作用是作为电化学信号分子，于PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)中进行方波伏安法扫描在-0.27V左右存在一个明显的氧化峰，以此峰高对应的最大电流响应值作为本实验的定量信号。记传感器初始信号为I0，alDNA，第一步对目标序列t-DNA总量的检测信号为I1，t-DNA，第二步对M-DNA含量的检测信号记为I2，M-DNA，分别以该步检测信号与初始信号的比值为纵坐标，该步目标物浓度的对数为横坐标，构建标准曲线。
本发明中生物传感器的构建基于DNA分子杂交原理，其反应及检测原理基于锚式结构碱基配对优势效应、序列特异性酶连反应和甲酰胺-盐溶液促进DNA变性作用，实现了仅通过一次传感器构建对含特定序列的DNA总量及其单碱基突变DNA含量的定量检测。
pcDNA和cDNA率先杂交形成一种一端为少量双螺旋、另一端为两条未配对长单链作为抓捕臂的“锚式”alDNA结构；当待测DNA被alDNA捕获后，cDNA和pcDNA均与一半待测DNA杂交，原有的alDNA结构底部的少量双螺旋被打开，待测DNA下半段与cDNA互补，上半段与pcDNA互补，三链共同形成具有一定刚性的长段双螺旋结构；pcDNA的5端’和cDNA的3’端之间存在一个缺口，该缺口处相邻碱基的配对情况取决于待测DNA对应位置的碱基类型，加入DNA连接酶后，野生型待测DNA由于缺口处碱基错配而无法发生碳链连接，突变型待测DNA则由于缺口处相邻碱基均为完美配对而发生碳链链接；经DNA变性处理与溶剂冲洗后，所有双链间氢键断裂，原捕获有野生型待测DNA的体系中仅剩无电化学信号的cDNA依然通过Au-S或Au-C共价键保留在电极表面，而原捕获有突变型待测DNA的体系则由于cDNA与pcDNA已连接成一条链保留下了原pcDNA末端的电化学信号分子。
相对现有技术，本发明的技术优点在于：
(1)本发明的生物传感器alDNA的“锚式”结构，其上端两条暴露了多个未配对碱基的长单链相较于传统的例如发夹型结构，空间位阻更小，利于抓捕游离在溶剂中的低浓度的目标DNA，同时其底端的较短的仅6对碱基对的双螺旋结构兼具了一定的初始结构稳定性而又易于后续整体结构的改变，奠定了本发明检测方法的原理基础，实现了对待测样中浓低度目标DNA的有力捕获，传感器与目标物的结合优势明显，有效提升了检测灵敏度，拥有较低的检测限和较宽的检测范围。
(2)本发明的生物传感器的结构简单，仅采用特殊设计的DNA，试剂成本低廉，构建稳定性佳，从投放目标待测物DNA到检测结果仅需3.5小时，简单快速，且仅需一次构建，后续可分步操作得到两类有效信息，同时本发明仅需更改少量碱基设计便可实现对各类单碱基突变DNA的检测，有效提升了实际待测样本的检测效率。
(3)本发明的生物传感器及其检测方法涉及双链DNA的热变性，其中低离子强度环境不利于DNA维持双螺旋结构，甲酰胺的加入可抢先配对碱基，二者协同作用，有效降低了双链DNA的热稳定性，得到优良的解旋效果，克服了传统解旋手段需要外加高温热源的缺点，保护了实验电极的可持续使用性，使全套实验条件温和高效。
(4)本发明的生物传感器的检测方法是电化学方波伏安法，本传感器由于其特殊结构具有一个较强的初始信号，取后两步检测信号与初始信号之比来定量，进一步缩小了由于电化学检测的系统误差、人为误差和重现性误差，使检测数据可靠性更高。
(5)本发明的生物传感器及其检测方法创新性地探究了单碱基突变量及其突变比例，仅一次构建可分别得到目标序列DNA总量及其突变量，对比现有的单信息输出传感器体系，优势明显，同时，本实验中浓度梯度的设置也建立于实际样本中检测对象的真实浓度范围，确保了本传感器及其检测方法可用于实际待测样检测，这是以往同类型发明所未探究的。
(6)本发明生物传感器的使用方法，能够适用于多种非医学诊断目的的DNA碱基突变的研究。
附图说明
图1为本发明中传感器构建及检测原理示意图；
A为alDNA锚式传感器的构建原理示意图，B为针对含目标序列的DNA总量的检测原理示意图，C为分别针对含目标碱基的突变型DNA、野生型DNA的检测原理示意图。
图2为本发明中传感器检测方法的可行性探究；
A为传感界面构建后分别投放野生型及突变型DNA的方波伏安响应电流图，B为传感界面构建后分别投放空白样、野生型及突变型DNA的方波伏安响应电流图。
图3为本发明中传感器构建及检测过程的界面电化学阻抗表征图；
A为捕获有突变型DNA的传感器的各步界面阻抗值，B为捕获有野生型DNA的传感器的各步界面阻抗值。
图4为本发明中传感器检测中变性溶液组分与变性时间的条件优化；
A为甲酰胺浓度，B为氯化钠浓度，C为变性反应时间。
图5为本发明中传感器检测含有目标序列的DNA总量及其单碱基突变DNA含量的浓度-信号线性关系。
A为检测含目标序列的DNA总量；B为检测含目标序列特定单碱基突变DNA的含量。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。本发明以KRAS基因G12D突变为例，说明论证本发明方法的可行性，但并不限于该基因或该突变检测，而是可通过变更DNA序列设计以适用于多种DNA单碱基突变的检测方法。
本发明的所用药品和试剂无特殊说明均直接通过购买得到，如西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司、宝日医生物技术(北京)有限公司、生工生物工程(上海)股份有限公司等。
实施例1
(1)金电极的预处理
将金电极用粒径为50μm的α-Al2O3抛光粉在电极布上打磨抛光约5min至表面光滑，用二次水冲洗干净电极表面。将电极置于5mM铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中用循环伏安法扫描1圈，电压范围为0.2～1.6V，扫速为50mV/s，若显示氧化还原峰峰位置差小于90mV则电极抛光完成；将电极置于0.5M硫酸溶液中用循环伏安法扫描，电压范围为0.2～1.6V，先以扫速50mV/s扫描50圈，再以扫速10mV/s扫描10圈，至循环伏安曲线稳定不变则电极表面活化完成。将电极用二次水冲洗，氮气吹干待用。
(2)alDNA的制备与传感界面的构建
cDNA序列为：5’-(SH C6)TTTTCAACTAGGCACTCTTGCCTACGCCA-3’；
pcDNA序列为：5'-P-TCAGCTCCAACTACCAGTTGA-MB-3'。
分别配制10μM cDNA和10μM pcDNA溶液，溶剂为34mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液。取等量的cDNA及pcDNA溶液混合得到终浓度各为1μM的混合溶液，混匀后置于37℃水浴2h，得到alDNA溶液。将一定量alDNA溶液滴加至金电极表面，室温下避光静置14h。配制1mM 6-巯基己醇的乙醇溶液，浸入电极，室温下静置1h。将电极用乙醇与二次水冲洗，氮气吹干，得到MCH/alDNA/Au传感界面。将电极置于PBS缓冲溶液中用方波伏安法扫描，以Ag/AgCl电极为参比电极，Pt丝电极为对电极，电压范围-0.4～0V，频率10Hz，振幅25mV，记录此时的响应电流信号大小，记为I0，alDNA。
(3)检测样品中含KRAS G12D突变及其野生型基因的DNA(t-DNA)的总量
t-DNA中突变型M-DNA长40bp，碱基序列为：
5'-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCT-3'(SEQ ID NO.3)。
t-DNA中野生型W-DNA长40bp，碱基序列为：
5'-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCT-3'(SEQ ID NO.4)。
分别滴加12μL的不同浓度(100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM)的M-DNA和W-DNA至MCH/alDNA/Au传感界面，37℃下避光反应1h，后用二次水冲洗电极再氮气吹干，得到t-DNA/MCH/alDNA/Au体系。
将电极置于PBS中用方波伏安法扫描，以Ag/AgCl电极为参比电极，Pt丝电极为对电极，电压范围-0.4～0V，频率10Hz，振幅25mV，记录此时的响应电流信号大小，记为I1，t-DNA。取I1，t-DNA与初始信号I0，alDNA之比，记为NI1，t-DNA。以DNA浓度的对数为横坐标，NI1，t-DNA为纵坐标，建立标准曲线。
(4)检测样品中含KRAS G12D突变型基因的DNA(M-DNA)的含量
接(3)步(或可跳过(3)步的电化学检测)，配制2U/μL的E.coli DNA连接酶溶液，滴加12μL至t-DNA/MCH/alDNA/Au体系，室温下反应1h，后用二次水冲洗电极再氮气吹干，将电极浸没于甲酰胺-氯化钠溶液(50％甲酰胺，10mM NaCl，1mM EDTA，10mM Tris(pH 7.0))中，于40℃下水浴30min，后用二次水冲洗电极再氮气吹干。
将电极置于PBS中用方波伏安法扫描，以Ag/AgCl(3M KCl)电极为参比电极，Pt丝电极为对电极，电压范围-0.4～0V，频率10Hz，振幅25mV，记录此时的响应电流信号大小，记为I2，M-DNA。取I2，M-DNA与初始信号I0，alDNA之比，记为NI2，M-DNA。以DNA浓度的对数为横坐标，NI2，M-DNA为纵坐标，建立标准曲线。
从图1可以看出，A图为alDNA锚式传感器的构建原理示意图，B图为针对含目标序列的DNA总量的检测原理示意图，C图为分别针对含目标碱基的突变型DNA、野生型DNA的检测原理示意图。
从图2可以看出，A图为传感界面构建后分别投放野生型及突变型DNA的方波伏安响应电流图，B图为传感界面构建后分别投放空白样、野生型及突变型DNA的方波伏安响应电流图。说明本发明传感器及其两步检测方法均可行。
从图3可以看出，A图为捕获有突变型DNA的传感器的各步界面阻抗值，B图为捕获有野生型DNA的传感器的各步界面阻抗值。每一步反应所对应的界面阻抗大小反映了界面在该状态时所装载的DNA链的数量和密度：a曲线为裸金电极，此时电极表面光滑，阻抗极小；b曲线为往电极表面组装alDNA后，阻抗明显增大，说明传感器成功组装；c曲线为往传感体系中投放目标DNA后，阻抗进一步加大，说明传感器成功捕获了目标DNA；d曲线为经酶连-变性反应后，未连接在金电极表面的DNA脱离传感器，阻抗明显减小，但捕获有突变型DNA的体系仍保留一定阻抗值，而捕获有野生型DNA的体系阻抗明显小于突变型。说明本实验的反应及检测原理是可行的。
从图4可以看出，A图说明当变性反应溶液中甲酰胺为50％时DNA双链的解旋效果最佳；B图说明当氯化钠浓度为10mM时DNA双链的解旋效果最佳；C图说明当变性反应的时间在30分钟及以上时DNA双链的解旋效果最佳。
从图5可以看出，A图为检测含目标序列的DNA总量时，标准化信号大小与DNA浓度的对数成反比(NI1,t-DNA＝-6.3128lgct-DNA+4.4619)；B图为检测含目标序列特定单碱基突变DNA的含量时，标准化信号大小与DNA浓度的对数成正比(NI2,M-DNA＝5.7213lgcM-DNA+87.9224(R＝0.9850))。
从表1可以看出，此传感器在实际样本中的检测不同浓度的含目标序列DNA的回收率接近100％，相对标准偏差较小，说明该检测干扰较小，可运用于实际样品的检测。
从表2可以看出，此传感器在实际样本中的检测不同浓度的含目标单碱基突变DNA的回收率接近100％，相对标准偏差较小，说明该检测干扰较小，可运用于实际样品的检测。
表1稀释10倍正常人血清中t-DNA回收率的测定
Figure BDA0001913564270000101
表2稀释10倍正常人血清中M-DNA回收率的测定
Figure BDA0001913564270000102
序列表
<110> 中南大学
<120> 一种同时检测特定DNA总量和单碱基突变量的生物传感器及其检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ttttcaacta ggcactcttg cctacgcca 29
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
tcagctccaa ctaccagttg a 21
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
cttgtggtag ttggagctga tggcgtaggc aagagtgcct 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
cttgtggtag ttggagctgg tggcgtaggc aagagtgcct 40

Claims (8)

1.一种同时检测DNA总量及其单碱基突变量的生物传感器，其特征在于，包括由以下方式制备得到的传感器界面：
将有5~7对碱基互补的抓捕链cDNA与修饰有信标分子的信标-抓捕链pcDNA杂交，得到一端为互补双螺旋、另一端为两条未配对长单链作为抓捕臂的“锚式”alDNA；将alDNA的双螺旋一端组装至电极表面，后封闭电极表面的空余位点以防止非特异性吸附，得到传感器界面；
所述cDNA长28~ 30bp，能够与待测DNA形成长20 bp以上的连续互补配对，其5’端修饰有巯基或氨基；pcDNA长21 ~ 23 bp，能够与待测DNA形成长16 bp以上的连续互补配对，其5’端修饰有磷酸基团，3’端修饰有电化学信号分子，电化学信号分子包括：亚甲基蓝、二茂铁或Cy5；
还包括：利用DNA连接酶进行DNA连接反应的试剂和DNA变性反应所需的试剂。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，将alDNA滴加至含金电极、粗糙化金电极或电沉积有金纳米颗粒的玻碳电极表面，静置，使alDNA通过其末端的巯基或氨基经Au-S或Au-C共价键组装至电极表面。
3.根据权利要求2所述的生物传感器，其特征在于，将alDNA滴加至电极表面，静置14 h或过夜，然后将电极表面浸入6-巯基己醇溶液以封闭电极表面的空余位点以防止非特异性吸附物质干扰。
4.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，DNA连接反应的试剂组成为：30 mMTris-HCl，4 mM MgCl2，10 mM (NH4)2SO4，0.005% BSA，0.2 mM NAD和0.5 ~ 2 U/μL E. coli DNA连接酶。
5.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，DNA变性反应所需试剂组成为：50 %甲酰胺，10 mM 氯化钠或氯化钾，1 mM EDTA，10 mM pH 7.0的Tris。
6.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述cDNA碱基序列为：5’-TTTTCAACTAGGCACTCTTGCCTACGCCA-3’；所述pcDNA碱基序列为：5’-TCAGCTCCAACTACCAGTTGA-3’。
7.权利要求1-6任一项所述的生物传感器的检测方法，其特征在于，
将含待测序列的目标DNA溶液滴于电极表面与传感器体系进行杂交，此时检测电化学信号，可获得包括野生型W-DNA和突变型M-DNA之和的DNA总量对应的电流值；
突变型M-DNA含量的检测，继续向电极表面滴加DNA连接酶溶液，使捕获有M-DNA的传感体系中原cDNA的3’端与pcDNA的5’端发生特异性链接反应，而捕获有W-DNA的传感体系则不发生反应；再将电极表面浸入DNA变性反应溶液中定温水浴，通过DNA变性解旋使未直接连接在电极表面的所有DNA脱离传感体系，此时检测电化学信号，W-DNA体系无明显信号，可获得突变型M-DNA量对应的电流值。
8.根据权利要求7所述的生物传感器的检测方法，其特征在于，所述链接反应条件为38~ 40℃、0.5 ~ 1 h；所述DNA变性反应条件为40 ~ 42℃、30 ~ 45 min。
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