CN111157596A - 同时检测pat和ota的电化学传感器、制备及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了同时检测PAT和OTA的电化学传感器、制备及检测方法,该电化学传感器包括工作电极、参比电极和对电极,工作电极表面依次涂覆有AuNPs‑BP纳米复合材料层和识别待测物的识别敏感层;AuNPs‑BP纳米复合材料层涂覆在工作电极表面,识别敏感层涂覆在AuNPs‑BP纳米复合材料层的表面;识别敏感层包含PAT适体链、PAT互补链、OTA适体链和OTA互补链。本发明的电化学传感器可以同时检测PAT和OTA,利用同一个电化学传感平台实现了两个目标物的检测,且检出浓度低。
Description
技术领域
本发明属于食品安全快速检测技术领域,具体涉及一种同时检测PAT和OTA的电化学传感器、制备及检测方法。
背景技术
近年来,由食品中的微生物病原体和生物毒素引起的食源性疾病对数百万人的健康构成了严重威胁,许多国家的食源性疾病达到创纪录的水平。对人和动物来说,受污染的食物会导致食物中毒,严重的情况下会导致死亡。因此,由食源性致病菌及其产生的生物毒素引起的食品安全问题已成为国内外关注的焦点,并且及其具有挑战性。
展青霉素(PAT)是由至少60种青霉属、曲霉属和丝衣霉属真菌产生的一种毒性次生代谢产物。它主要存在于人们日常生活中食用的水果、蔬菜和坚果中,如苹果、桃子、西红柿、杏仁、榛子等,特别是在烂苹果和苹果汁中,它的含量较高。因此,人们很容易受到这种有毒物质的影响,引起抽搐、呼吸困难、肺充血等不良反应。目前在中国和欧盟等国家对展青霉素在相关产品的最高含量进行了明确的限定。
同样地,赭曲霉素A(OTA)也是由曲霉、青霉等多种真菌产生的次生代谢产物。它广泛存在于小麦、豆类、牛奶、鸡蛋、葡萄酒以及人类和动物食用的大多数其他食品中。它也出现在固体水果和果汁中,如苹果和桔子。OTA具有肝毒性、致癌性、肾毒性等有害因素,可对人和动物机体造成不同程度的损害。因此,为了避免人类和动物因过度食用OTA而受到伤害,欧盟委员会已经规定不同食物中OTA的最高限量。
目前,PAT和OTA分析中出现了越来越多的方法,包括高效液相色谱法、荧光分析法、比色法和电化学方法等。高效液相色谱、荧光分析等技术需要昂贵的设备和复杂的操作,比色法操作相对简单但灵敏度又太低,电化学方法因其具有低成本、操作简单、灵敏度高等优点而被广泛研究。但是目前都是使用电化学方法对单一的PAT或者OTA的检测。
发明内容
针对现有技术的缺陷和不足,本发明提供了一种同时检测PAT和OTA的电化学传感器及制备方法,解决现有的检测方法中不能实现对PAT和OTA同时检测的问题。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案予以实现:
同时检测PAT和OTA的电化学传感器,包括工作电极、参比电极和对电极,所述的工作电极表面依次涂覆有AuNPs-BP纳米复合材料层和识别待测物的识别敏感层;所述的AuNPs-BP纳米复合材料层涂覆在工作电极表面,识别敏感层涂覆在AuNPs-BP纳米复合材料层的表面;
所述的识别敏感层包含PAT适体链、PAT互补链、OTA适体链和OTA互补链;
所述的AuNPs-BP纳米复合材料通过如下方法制备得到:
将0.5~5mg/mL的黑鳞分散液与0.05~0.2mM的纳米金溶液按照体积比为3:1混合,室温下反应1~2h,得到AuNPs-BP纳米复合材料。
具体的,将氯金酸溶液加热至150℃后加入柠檬酸钠,氯金酸与柠檬酸钠的摩尔浓度比为1:1,反应25min,得到纳米金溶液。
具体的,所述的工作电极为玻碳电极、金电极或石墨电极。
本发明还公开了上述电化学传感器的工作电极的制备方法,该制备方法包括以下步骤:
步骤1,将权利要求1至3任一项得到的AuNPs-BP纳米复合材料滴涂在工作电极上,室温干燥后得到AuNPs-BP/GCE电极;
步骤2,将第一混合液滴涂到AuNPs-BP/GCE电极表面,室温下孵育2~14h,然后再在表面涂覆6-巯基-1-己醇,室温下反应0.2~2h;
第一混合液包括PAT适体链、OTA互补链、Tris-HCl和TCEP;
步骤3,将第二混合液滴涂到步骤2得到的电极表面,室温下孵育0.2~3h,得到工作电极;
第二混合液包括PAT互补链、OTA适体链和Tris-HCl。
优选的,所述的第一混合液的浓度为0.5μM;第一混合液中PAT适体链为10μM、OTA互补链为10μM、Tris-HCl为0.1M、TCEP为1mM。
优选的,所述的第二混合液的浓度为0.5μM;第二混合液中PAT互补链为10μM、OTA适体链为10μM、Tris-HCl为0.1M。
进一步的,所述的工作电极在滴涂AuNPs-BP纳米复合材料前经过预处理,预处理过程为:使用氧化铝浆对工作电极进行抛光,再用乙醇和超纯水混合液超声清洗多次,最后用超纯水超声清洗多次。
本发明还公开了一种同时检测PAT和OTA的方法,该方法包括:
步骤1,将权利要求1~3任一项所述的电化学传感器作为三电极体系,通过差分脉冲伏安法分别得到PAT浓度与电流的标准曲线以及OTA浓度与电流的标准曲线;
步骤2,根据步骤1得到的标准曲线,对待检测样品中的PAT和OTA定量检测。
具体的,所述的PAT浓度与电流之间的标准曲线关系为:
△IPAT=0.00926lgCPAT+0.07317或△IPAT=0.00568lgCPAT+0.07385;
所述的OTA浓度与电流之间的标准曲线关系为:
△IOTA=-0.03631lgCOTA-0.38450或△IOTA=-0.02702lgCOTA-0.3933。
其中,CPAT表示PAT的浓度,单位为pg·mL-1;△IPAT表示PAT的电流变化值,单位为μA;COTA表示OTA的浓度,单位为pg·mL-1;△IOTA表示OTA的电流变化值,单位为μA。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明的电化学传感器可以同时检测PAT和OTA,利用同一个电化学传感平台实现了两个目标物的检测。且检出浓度低,通过实验发现,PAT和OTA标准品同时检出的线性范围是0.01fg/mL~10.0ng/mL,最低检出限可达到3.3×10–3fg/mL。
(2)使用本发明的电化学传感器,利用差分脉冲伏安法即可实现检测,具体方便快速、操作简单、成本低廉的优点。
附图说明
图1是本发明同时测定PAT和OTA的原理示意图。
图2是本发明实施例1中同时测定PAT和OTA的标准曲线图,其中,图A表示电化学传感器同时对不同浓度的PAT和OTA的DPV响应,图B表示0.01fg/mL~10.0pg/mL浓度范围内的PAT与DPV电流变化关系图,图C表示1.0pg/mL~10.0ng/mL浓度范围内的PAT与DPV电流变化关系图,D表示0.01fg/mL~10.0pg/mL浓度范围内的OTA与DPV电流变化关系图,图E表示1.0pg/mL~10.0ng/mL浓度范围内的OTA与DPV电流变化关系图。
图3是本发明实施例1中不同放置时间下苹果汁中PAT和OTA的电流变化结果图。
以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。
具体实施方式
本发明公开的同时检测PAT和OTA的电化学传感器,包括工作电极、参比电极和对电极,其中,工作电极表面涂覆有AuNPs-BP纳米复合材料层和识别待测物的识别敏感层;AuNPs-BP纳米复合材料层涂覆在工作电极表面,识别敏感层涂覆在AuNPs-BP纳米复合材料层的表面;
识别敏感层中包含PAT适体链、PAT互补链、OTA适体链和OTA互补链。PAT适体链、PAT互补链、OTA适体链和OTA互补链同时存在于识别敏感层,并且PAT适体链和PAT互补链、OTA适体链和OTA互补链两两通过碱基互补配对进行结合。
本发明的AuNPs-BP纳米复合材料通过如下方法制备得到:
将0.5~5mg/mL的黑鳞分散液与0.05~0.2mM的纳米金溶液按照体积比为3:1混合,室温下反应1~2h,得到AuNPs-BP纳米复合材料。
其中,本发明的工作电极为玻碳电极、金电极或石墨电极;本发明所采用的黑鳞分散液为市购。纳米金溶液通过以下方法制备:将氯金酸溶液加热至150℃后加入柠檬酸钠,氯金酸与柠檬酸钠的摩尔浓度比为1:1,反应25min,得到纳米金溶液。
如图1所示为本发明的检测原理示意图。利用适配体与目标物特异性结合的能力大于与其杂交的互补DNA链这一原理实现了PAT和OTA方便、快捷的检测,其中PAT适体链和OTA适体链被分别修饰了电信号分子亚甲基蓝(MB)和二茂铁(Fc),在电解液中加入目标物标准品后,由于PAT适体链和OTA适体链上的MB和Fc与电极表面之间的距离发生了改变,电子转移的速度也随之会改变,所以电流发生变化。由于电流变化量与标准品浓度的对数之间存在着一定的线性关系,从而实现了苹果汁中PAT和OTA的检测。
本发明的同时检测PAT和赭曲霉素A的电化学传感器的工作电极的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,使用氧化铝浆对工作电极进行抛光,再用乙醇和超纯水混合液超声清洗多次,最后用超纯水超声清洗多次;
步骤2,将本发明制备得到的AuNPs-BP纳米复合材料滴涂在处理后的工作电极上,室温干燥后得到AuNPs-BP/GCE电极;
步骤3,将第一混合液滴涂到AuNPs-BP/GCE电极表面,室温下孵育2~14h,然后用Tris-HCl冲洗后,然后再在表面涂覆6-巯基-1-己醇,室温下反应0.2~2h,用于封闭AuNPs-BP/GCE表面未覆盖的活性位点,防止其他电活性物质在AuNPs-BP/GCE表面发生反应。
其中,第一混合液包括PAT适体链、OTA互补链、Tris-HCl和TCEP,Tris-HCl的pH=7.42;PAT适体链溶液浓度为10μM,OTA互补链溶液浓度为10μM,Tris-HCl为0.1M,TCEP为1mM。
步骤4,将第二混合液滴涂到步骤3得到的电极表面,此时第二混合液中的PAT互补链、OTA适体链会与第一混合液中的PAT适体链、OTA互补链通过碱基互补配对进行杂交,形成稳定的双链结构,室温下孵育0.2~3h,用Tris-HCl冲洗后,室温下晾干,得到电化学传感器。
其中,第二混合液包括PAT互补链、OTA适体链和Tris-HCl缓冲液,Tris-HCl的pH=7.42。PAT互补链溶液浓度为10μM,OTA适体链溶液浓度为10μM,Tris-HCl为0.1M。
本发明下述实施例中的PAT适体链溶液、OTA互补链溶液、PAT互补链溶液和OTA适体链溶液购买于上海生工生物工程有限公司。
本发明中第一混合液浓度优选0.5μM,第二混合液浓度优选0.5μM。
采用本发明制备的电化学传感器用于同时食品中PAT和OTA时,首先需要采用差分脉冲伏安法(DPV)建立PAT和OTA电流变化值与浓度之间的标准曲线,具体方法为:向Tris-HCl电解液中同时加入一定浓度的PAT标准品和OTA标准品,PAT标准品和OTA标准品均为市购,磁力搅拌混匀后静置;采用差分脉冲伏安法(DPV)依次对不同浓度的PAT标准品和OTA标准品进行检测,得到PAT浓度与电流的标准曲线以及OTA浓度与电流的标准曲线;根据得到的标准曲线,对待检测样品中的PAT和OTA定量检测。
以下给出本发明的具体实施例,需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例中,凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1
制备同时检测PAT和OTA的电化学传感器的工作电极:
步骤1,使用氧化铝浆对玻碳电极进行抛光,再用乙醇和超纯水混合液超声清洗多次,最后用超纯水超声清洗多次;
步骤2,将市购的BP分散液(0.2mg/mL)离心浓缩至2.0mg/mL,放入冰箱(温度4℃)备用;
将350μL浓度为10mM的氯金酸(HAuCl4)添加到24.65mL超纯水中得到均匀的混合液;将混合液在加热板上加热至近150℃;然后加入2.5mL浓度为10mM的柠檬酸钠,反应约25分钟,得到纳米金溶液;
将2.0mg/mL的BP分散液与0.13mM的纳米金溶液按体积比为3:1混合,反应1h,得到AuNPs-BP纳米复合材料。
步骤3,将步骤2得到的AuNPs-BP纳米复合材料滴涂在步骤1得到的玻碳电极上,室温干燥后得到AuNPs-BP/GCE电极;
步骤4,将10μM PAT适体链、10μM OTA互补链、0.1M Tris-HCl(pH=7.42)和1mMTCEP混合配置第一混合液。将10μL浓度为0.5μM的第一混合液滴涂到AuNPs-BP/GCE电极表面,室温下孵育12h,然后用Tris-HCl冲洗后,然后再在表面涂覆6-巯基-1-己醇覆盖电极,室温下反应1h,以封闭AuNPs-BP/GCE表面未覆盖的活性位点。
步骤5,将10μM PAT互补链、10μM OTA适体链、0.1M Tris-HCl(pH=7.42)混合配置第二混合液。将10μL浓度为0.5μM的第二混合液滴涂到步骤4得到的电极表面,然后在室温下孵育2h。最后用0.1M Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.42)清洗后并在室温下晾干,得到工作电极。
将制备的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系,即本实施例的电化学传感器。
将本实施例制备的电化学传感器用于同时检测苹果汁中的PAT和OTA,具体检测方法为:
将实施例得到的电化学传感器作为三电极体系,通过差分脉冲伏安法分别得到PAT浓度与电流的标准曲线以及OTA浓度与电流的标准曲线;如图2所示,可以看出,PAT与DPV电流变化值成良好的线性关系,OTA与DPV电流变化值成良好的线性关系,本实施例得到的PAT浓度与电流之间的标准曲线关系为:
△IPAT=0.00926lgCPAT+0.07317或△IPAT=0.00568lgCPAT+0.07385;
OTA浓度与电流之间的标准曲线关系为:
△IOTA=-0.03631lgCOTA-0.38450或△IOTA=-0.02702lgCOTA-0.3933。
其中,CPAT表示PAT的浓度,单位为pg·mL-1;△IPAT表示PAT的电流变化值,单位为μA;COTA表示OTA的浓度,单位为pg·mL-1;△IOTA表示OTA的电流变化值,单位为μA。
对苹果汁中的PAT和OTA进行测定:
从当地水果市场购买新鲜苹果和部分腐烂的苹果。首先,将苹果切片放入榨汁机中捣碎,然后将糊状物离心,保留上清液。其次,新鲜苹果的上层清液使用0.45μm的滤膜过滤后用于测试,部分腐烂苹果的上层清液过滤后需要进一步处理。最后,用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH=7.42)将部分腐烂苹果的过滤溶液稀释至原溶液的1/10。需要注意的是,用于检测的苹果汁是现榨的,放置不同时间的新鲜苹果汁保存在冰箱中(T=4℃)。
对新鲜苹果汁和部分腐烂的苹果汁中的PAT和OTA进行检测,检测的结果(电流的变化值)与上述标准曲线进行比对,从而得到实际样品中PAT和OTA的含量。其结果如表1所示。从表1中可以得出新鲜苹果的果汁中不含有PAT和OTA,而被稀释的部分腐烂苹果的果汁中则含有浓度为2.754pg/mL的PAT和4.231pg/mL的OTA,也就是说原部分腐烂苹果的果汁中含有浓度为27.54pg/mL的PAT和42.31pg/mL的OTA,虽然没有达到中国和欧盟标准对苹果汁中PAT规定的下限(OTA没有明确的规定),但是还是会对人和动物体造成一定程度的伤害,这也提醒人们尽量避免吃部分腐烂的苹果。
表1同时检测新鲜苹果汁和部分腐烂苹果汁中的PAT和OTA
对放置时间不同的新鲜苹果汁中的PAT和OTA进行检测。如图3所示为放置时间不同下的新鲜苹果汁中的PAT和OTA的含量变化(含量变化以电流变化值呈现)结果,从图中可以看出将新鲜的苹果汁在冰箱内放置2h,没有测得PAT和OTA,但当放置时间超过2h时,随着时间的延长,PAT和OTA的含量逐渐增加,当放置时间在8-10h范围内时,PAT的增长速度最快,在12-14h范围内,OTA的增长速度达到最大。这说明部分真菌可在4℃下存活并产生一定量的毒素,提醒人们果汁应现榨现喝,不宜在冰箱内长时间储存。
Claims (9)
1.同时检测PAT和OTA的电化学传感器,包括工作电极、参比电极和对电极,其特征在于,所述的工作电极表面依次涂覆有AuNPs-BP纳米复合材料层和识别待测物的识别敏感层;所述的AuNPs-BP纳米复合材料层涂覆在工作电极表面,识别敏感层涂覆在AuNPs-BP纳米复合材料层的表面;
所述的识别敏感层包含PAT适体链、PAT互补链、OTA适体链和OTA互补链;
所述的AuNPs-BP纳米复合材料通过如下方法制备得到:
将0.5~5mg/mL的黑鳞分散液与0.05~0.2mM的纳米金溶液按照体积比为3:1混合,室温下反应1~2h,得到AuNPs-BP纳米复合材料。
2.如权利要求1所述的同时检测PAT和OTA的电化学传感器,其特征在于,将氯金酸溶液加热至150℃后加入柠檬酸钠,氯金酸与柠檬酸钠的摩尔浓度比为1:1,反应25min,得到纳米金溶液。
3.如权利要求1所述的同时检测PAT和OTA的电化学传感器,其特征在于,所述的工作电极为玻碳电极、金电极或石墨电极。
4.权利要求1至3任一项所述的电化学传感器的工作电极的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1,将权利要求1至3任一项得到的AuNPs-BP纳米复合材料滴涂在工作电极上,室温干燥后得到AuNPs-BP/GCE电极;
步骤2,将第一混合液滴涂到AuNPs-BP/GCE电极表面,室温下孵育2~14h,然后再在表面涂覆6-巯基-1-己醇,室温下反应0.2~2h;
第一混合液包括PAT适体链、OTA互补链、Tris-HCl和TCEP;
步骤3,将第二混合液滴涂到步骤2得到的电极表面,室温下孵育0.2~3h,得到工作电极;
第二混合液包括PAT互补链、OTA适体链和Tris-HCl。
5.如权利要求4所述的电化学传感器的工作电极的制备方法,其特征在于,所述的第一混合液的浓度为0.5μM;第一混合液中PAT适体链为10μM、OTA互补链为10μM、Tris-HCl为0.1M、TCEP为1mM。
6.如权利要求4所述的电化学传感器的工作电极的制备方法,其特征在于,所述的第二混合液的浓度为0.5μM;第二混合液中PAT互补链为10μM、OTA适体链为10μM、Tris-HCl为0.1M。
7.如权利要求4所述的电化学传感器的工作电极的制备方法,其特征在于,所述的工作电极在滴涂AuNPs-BP纳米复合材料前经过预处理,预处理过程为:使用氧化铝浆对工作电极进行抛光,再用乙醇和超纯水混合液超声清洗多次,最后用超纯水超声清洗多次。
8.一种同时检测PAT和OTA的方法,其特征在于,该方法包括:
步骤1,将权利要求1~3任一项所述的电化学传感器作为三电极体系,通过差分脉冲伏安法分别得到PAT浓度与电流的标准曲线以及OTA浓度与电流的标准曲线;
步骤2,根据步骤1得到的标准曲线,对待检测样品中的PAT和OTA定量检测。
9.如权利要求8所述的同时检测PAT和OTA的方法,其特征在于,所述的PAT浓度与电流之间的标准曲线关系为:
△IPAT=0.00926lgCPAT+0.07317或△IPAT=0.00568lgCPAT+0.07385;
所述的OTA浓度与电流之间的标准曲线关系为:
△IOTA=-0.03631lgCOTA-0.38450或△IOTA=-0.02702lgCOTA-0.3933。
其中,CPAT表示PAT的浓度,单位为pg·mL-1;△IPAT表示PAT的电流变化值,单位为μA;COTA表示OTA的浓度,单位为pg·mL-1;△IOTA表示OTA的电流变化值,单位为μA。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN113252658A (zh) * | 2021-06-28 | 2021-08-13 | 中国农业大学 | 一种基于金纳米识别适配体冗余碱基的方法 |
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