KR101130551B1 - 동시다중 유전자 증폭용 키트 및 이를 이용한 스트렙토코커스 미티스 속균의 동정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 연쇄상구균의 검출을 위한 유전자 증폭 반응용 프라이머쌍, 이를 포함하는 유전자증폭용 키트 및 이를 이용한 연쇄상구균의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 증폭 반응용 프라이머쌍을 이용하면 병리학적으로 상이하지만 유전학적으로 유사하여 배양법에 기초한 분류 방법을 통해서는 분별하기가 매우 어려운 연쇄상구균인 폐렴구균 (S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)를 간편하고 경제적인 방법으로 분별 및 검출할 수 있다.
연쇄상구균, 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis), 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 프라이머쌍(primer pair), 유전자증폭 키트, PCR 검출 방법

Description

동시다중 유전자 증폭용 키트 및 이를 이용한 스트렙토코커스 미티스 속균의 동정방법{Multiplex PCR Kit and Method for Detecting and Identifying Streptococcus mitis Using the Same}
본 발명은 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) 중 하나 이상의 연쇄상구균의 검출을 위한 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 프라이머쌍, 이를 포함하는 유전자증폭 키트 및 이를 이용하여 연쇄상구균을 PCR 검출하는 방법에 관한 것이다.
연쇄상구균(Streptococcus)은 사람의 구강과 호흡기도에 존재하는 이질적인 그람양성세균 군으로, 주요 병원성균인 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 파이오젠스(Streptococcus pyogenes) 및 화농성연쇄상구균(Streptococcus agalactiae)를 포함한 48 종으로 구성된다(Facklam et al., Clin Microbiol Rev, 15:613-630, 2002). 일반적으로 연쇄상구균은 16S rDNA 염기서열에 의하여 `화농성(pyogenic)', `미티스(mitis)', `살리베리우스(salivarius)', ` 보비스(bovis)', `뮤탄스(mutans)' 및 `안지노서스(anginosus)'군 등 총 6 개의 군으로 분류되고(Kawamura et al., Int J Syst Bacteriol, 45:406-408, 1995), 혈청학적 특성에 기준하여서는 A-H, K-M 및 O-V (Lancefield et al., J Exp Med, 145:490-499, 1977)로 분류되며, 적혈구에 대한 용혈성 (alpha, beta 및 gamma) 및 생화학적 성상에 의해서 서로 분별된다 (Coykendall, Clin Microbiol Rev, 2:315-328, 1989; Whiley et al., Oral Microbiol Immunol, 13:195-216, 1998). 상기'미티스(mitis)'군 균에 속하는 균들은 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 오라리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 상기우스(Streptococcus sangius) 및 스트렙토코커스 파라상기우스(Streptococcus parasangius)등이 있다.
폐렴구균(S. pneumoniae)은 사람의 구강에 존재하는 상주균으로 건강한 사람의 40-60％가 보균자인데, 보균자의 대다수는 병독성이 약한 종류의 균을 지니고 있고 보균상태도 영구적이 아니라 산발적이며 간헐적인 것이 특징이다. 이러한 폐렴구균은 호흡기를 통하거나 맥관 계통에 의해서 확산되며, 신체의 다른 부위로 이동하여 폐렴, 이하선염, 결막염, 복막염, 중이염, 심내막염 및 패혈증 등을 일으키며(Suzuki et al., J Clin Microbiol, 43: 4528-4534, 2005), 미국에서는 연간 500,000건의 폐렴감염환자의 원인체로, 40,000명의 사망을 초래한다(Williams et al., Ann Intern Med, 108: 616-625, 1988).
스트렙토코커스 미티스(S. mitis)는 구강, 피부, 위장, 여성의 생식기 등에 존재하는 정상 무리군으로 낮은 병원성을 가지는 것이 일반적이다. 그러나 이 균은 심내막염과 폐혈증 뇌막염등을 일으키는 아급성 균이다(Kutlu et al., Int J Infect Dis. 12:e107-9, 2008).
스트랩토코커스 오라리스(S. oralis)는 무균 상태의 신생아나 구강상태가 청결한 성인의 구강에 빠르게 자리 잡는다. 그리고 구강의 정상 무리균들이 형성하기 위한 글루칸을 합성하여 구강에 변화를 주거나 충치형성을 초래한다(Frandsen et al, Oral Microbiol Immunol. 6:129-133, 1991).
병원성 연쇄구균의 동정은 배양법에 기초한 일련의 생리 화학적 검사와 혈청학적 시험으로 수행되어 왔다(Freney et al., J Clin Microbiol, 30:2657-2661, 1992). 그러나 종(species) 수준에서의 동정은 균이 늦게 성장하는 특성으로 인하여 생리 화학적 검사에 7 일 정도의 기간이 소요되며, 검사 결과도 분자 진화적 계통도에 근거한 유전학적 결과와 일치하지 않는 경우가 있었다(Whiley et al., Oral Microbiol Immunol, 13:195-216, 1998; Heath, Paediatr Respir Rev, 1:4-7, 2000).
폐렴구균의 동정에는 4가지 특성, 즉 집락 형태, 옵토친(optochin) 감수성 시험, 담즙 용해성 및 캡슐 다당류 항체에 대한 응집반응 등의 방법이 이용되어 왔으나, 많은 환자 분리주들이 한 종류 이상의 표준 검사방법에 대해 비정형 반응을 나타내고, 스트렙토코커스 미티스와 스트렙토코커스 오라리스 등 다른 알파 용혈성 연쇄구균들도 이러한 시험에서 유사한 결과를 보여 정확한 동정에 어려움이 있었다(Finland et al., J Clin Microbiol, 5:154-166, 1997; Kontiainen et al., Eur J Clin Microbiol, 6:422-424, 1987; Mundy et al., Microbiol Infect Dis, 109:55-61, 1998; Munoz et al., Diagn Microbiol, 13:63-66, 1990).
최근, 이러한 동정의 어려움을 극복하고자 DNA 분석에 근거한 많은 방법들이 연쇄구균의 동정과 검출을 위하여 개발되었다. 예를 들면, 폐렴구균(Davis et al., J Clin Microbiol, 29: 2193-2196, 1991; Pozzi et al., J Clin Microbiol, 27: 370-372, 1989), 스트렙토코커스 파이오젠스, 화농성연쇄상구균 및 스트렙토코커스 보비스(S. bovis) (Whitehead et al., J Clin Microbiol, 31: 2387-2391, 1993)에 대한 특이 프로브를 이용한 하이브리다이제이션 방법이 개발되었으나 실험방법이 복잡하고 시간이 많이 소요되며 특이성이 문제가 있었다. 따라서 현재에는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)에 기초한 방법들이 널리 이용되고 있다 (Salo et al., J Infect Dis, 171:479-482,1995).
Salo 등은 pneumolysin 유전자(ply) (Salo et al., J Infect Dis, 171:479-482,1995), Gillespie 등은 autolysin 유전자(lytA) (Gillespie et al., J Clin Microbiol, 32:1308-1311, 1994)를 이용하여 프라이머들을 제작하고, 중합효소연쇄반응을 개발하여 폐렴구균과 유사 연쇄상구균들을 대상으로 시험한 결과 특이성을 보고한 바 있었다. 또한 ply 유전자와 lytA 유전자를 바탕으로 pneumococcal surface antigen A (psaA)(Morrison et al., J Clin Microbiol, 38:424-437, 2000), superoxide dismutase(sodA) (Kawamura et al., Mirobiology, 145:2605-2613, 1999)와 penicillin binding protein(pbp2b) (O'Neill et al., J Clin Microbiol, 37:157-160, 1999)을 이용한 폐렴구균 검출법이 개발 되었다. 또한 일 본에서도 Suzuki 등(Suzuki et al., J Clin Microbiol. 43:4528-4534, 2005)은 subtractive hybridization 기술을 이용하여 폐렴구균을 검출해내는 프라이머 (Spn9802, Spn9828)를 개발였고, 스웨덴에서도 폐렴구군을 비롯한 여러 구강 연쇄구균들을 대상으로 시험한 결과 기존의 보고된 lytA와 ply 프라이머들과 Spn9802 프라이머가 특이성이 높다는 등의 보고가 이어지고 있다(Abdeldaim et al., Microbiol Infect Dis. 60:143-150, 2008; Suzuki et al., J Med Microbiol. 55:709-714, 2006).
이렇듯 폐렴구균의 동정방법에 관한 연구는 세계적인 관심 속에서 지속적인 연구가 진행 되고 있으나, 스트렙토코커스 미티스(S. mitis)와 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 동정방법에 대해서는 여전히 진행되지 않고 있는 실정이다. 따라서, 상술한 문제점을 극복하면서 신속하고 효과적인 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 동정방법이 여전히 요구되고 있다.
한편, Yamamoto 와 Harayama는 다양한 미생물의 gyrB 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 만들었다(Yamamoto et al., Appl. Env. Microbiol. 61: 1104-1109, 1995). gyrB는 16S rDNA보다 진화가 빠르기 때문에 유전적으로 유사한 균주들을 구별하는데 효과적이기 때문이다(Yamamoto et al., Int J Syst Bacteriol. 46: 506-511,1996, Yamamoto et al., Int J Syst Bacteriol. 48: 813-819,1998). 또한 gyrB 유전자를 기초로 한 구별법은 DNA-DNA 혼성화를 통한 구별법을 비교하였을 때 미생물을 분리 하는데 효과적인 방법으로 알려져 있다. 그러나, 현재까지 gyrB 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR) 방법에 의해 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)를 동정하는 방법은 개발되어 있지 않다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 연쇄상구균(Streptococcus)의 미티스(mitis)군에 속하는 균으로서 대표적인 구강 병원균인 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)를 특이적으로 검출 및 동정할 수 있는 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과 gyrB 유전자에서 미티스(mitis)군의 균들 사이에 핵산의 염기서열의 다양한 변이가 존재함을 발견하였고, 이러한 사실에 근거하여 gyrB 유전자를 표적으로 하는 유전자 증폭 반응용 프라이머쌍을 디자인하여 실험한 결과, 미티스(mitis)군 균 중의 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)만을 특이적으로 검출 및 분별할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발 명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) 검출을 위한 유전자 증폭반응용 프라이머쌍을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머쌍을 이용하여 상기 연쇄상구균을 검출하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머쌍을 포함하는 상기 연쇄상구균의 검출용 유전자 증폭키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 전방향 (forward) 프라이머 및 (ⅱ) 서열목록 제 2 서열, 제 3 서열 또는 제 4 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 역방향(reverse) 프라이머를 갖는 프라이머쌍 또는 상기 프라이머쌍의 조합으로서, 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)중 하나 이상의 검출을 위한 유전자증폭 반응용 프라이머쌍 또는 이의 조합을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 하는 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)중 어느 하나 이상의 연쇄상구균을 검출하는 방법을 제공한다: (a) 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) (i) 상기 추출된 시료 DNA, (ⅱ) 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 전방향 (forward) 프라이머, 및 (ⅱ) 서열목록 제 2 서열, 제 3 서열 또는 제 4 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 역방향(reverse) 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍 또는 상기 프라이머쌍의 조합을 포함하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)액을 제조하는 단계; 및 (c) 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.
본 발명자들은 연쇄상구균(Streptococcus)의 미티스(mitis)군에 속하는 균으로서 대표적인 구강 병원균인 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)를 특이적으로 검출 및 동정할 수 있는 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과 gyrB 유전자에서 미티스(mitis)군의 균들 사이에 핵산의 염기서열의 다양한 변이가 존재함을 발견하였고, 이러한 사실에 근거하여 gyrB 유전자를 표적으로 하는 유전자 증폭 반응용 프라이머쌍을 디자인하여 실험한 결과, 미티스(mitis)군 균 중의 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)만을 특이적으로 검출 및 분별할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서 사용된 용어 "gyrB 유전자"는 ATP-의존적 방식으로 DNA의 두 가닥을 자르고 이 자른 틈새로 온전한 DAN 가닥을 통과시키는 기작을 촉매하는 세균에서의 DNA topoisomerase II 구성 서브유닛(subunit) A 및 B 중 서브유닛 B를 코딩하는 유전자를 의미한다.
본 발명의 프라이머쌍은 연쇄상구균중에서 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 "gyrB 유전자"의 핵산 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머쌍이다.
본 발명의 프라이머쌍을 사용한 유전자증폭반응에 의해 연쇄상구균의 미티스(mitis)군 균 중에서 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)만을 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 프라이머쌍은 유전자증폭반응에 의해 생성되는 산물(product)이 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 균종에 따라 각각 그 크기가 상이하도록 디자인되므로 유전자 증폭반응 산물의 크기 분석에 의해 상기 균주를 분별하는 것이 가능하다.
본 발명의 프라이머쌍의 조합은 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)를 동시에 검출 및 분별이 가능한 멀티플렉스(multiplex) 유전자 증폭반응에 사용될 수 있다.
연쇄상구균의 미티스(mitis)군 균 중의 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)를 검출하기 위하여 본 발명의 프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 균의 gyrB 유전자의 유무를 조사한다. 이 경우 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커 스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 gDNA(genomic DNA) 또는 mRNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 gyrB 유전자를 특이적으로 증폭한다.
폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) 세포로부터 gDNA의 분리는, 예컨대, 페놀-클로로포름 추출 방법으로 얻을 수 있다 (Neumann B, et al., Rapid isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria., Trends Genet. 8:332-333(1992)).
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow)" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다.
바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
유전자 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 명세서에 기술된 용어"증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다) (미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에서 증폭 반응에 이용되는 프라이머는 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 gDNA 또는 cDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
본 명세서에서 용어 "전방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
본 발명의 프라이머쌍은 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 gyrB 유전자를 특이적으로 증폭하도록 제작된다. 구체적으로, 본 발명의 프라이머쌍이 타깃으로 하는 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 유전자 및 프라이머의 뉴클레오타이드 서열이 아래 표에 정리되어 있다.
서열 명칭 정방향 프라이머
(Forward primer)		 역방향 프라이머
(Reverse primer) 		이용서열
L1
(서열목록 제1서열)		 GGCTTAGAGGCTGTTCGT gyrB 유전자
R3
(서열목록 제2서열)		 TCACTTCCCACTTTAACCC gyrB 유전자
R4
(서열목록 제3서열)		 AGTTTGTTCTAGCCCCTCA gyrB 유전자
R5
(서열목록 제4서열)		 ATCTCACCGTCTGTATAGA gyrB 유전자
본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 증폭된 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 gyrB 유전자는 적합한 방법으로 분석된다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 증폭된 gyrB 유전자의 존재 유무, 즉 상기 폐렴구균, 스트렙토코커스 미티스 및 스트렙토코커스 오라리스의 존재 유무를 분석한다.
본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 증폭된 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 gyrB 유전자의 증폭산물은 상기 균주들에 따라 각기 다른 크기(size)를 갖도록 디자인되므로, gyrB 유전자의 증폭산물의 크기 분석을 통해 상기 세가지 균주를 각각 분별할 수 있다(도 1 참조).
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 전방향 (forward) 프라이머 및 (ⅱ) 서열목록 제 2 서열, 제 3 서열 또는 제 4 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 역방향(reverse) 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍 또는 상기 프라이머쌍의 조합을 포함하는 (S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) 중 어느 하나 이상의 연쇄상구균의 검출을 위한 유전자 증폭 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 키트는 (c) dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP); (d) DNA 중합효소; 및 (e) 완충(buffer)용액을 더욱 포함한다.
본 발명의 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 연쇄상구균의 검출용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명은 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 연쇄상구균 검출을 위한 유전자 증폭 반응용 프라이머쌍, 이를 포함하는 유전자증폭 키트 및 이를 이용한 연쇄상구균의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 증폭 반응용 프라이머쌍을 이용하면 병리학적으로 상이하지만 유전학적으로 유사하여 배양법에 기초한 분류 방법을 통해서는 분별하기가 매우 어려운 연쇄상구균인 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)를 간편하고 경제적인 방법으로 분별 및 검출할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1 : 미티스(mitis)군 균 중 폐렴구균( S. pneumoniae ), 스트렙토코커스 미티 스 ( S. mitis ) 및 스트렙토코커스 오라리스 ( S. oralis ) 균 특이적 gyr B 유전자 검출 프라이머의 제작
미티스(mitis) 군의 특이적 유전자 검출을 위하여 gyrB 유전자 서열을 기초로 oligo6 프로그램을 이용하여 프라이머를 설계하였다(표 1). 도 1에 나타낸 바와 같이'미티스 (mitis)' 군의 특이적 부분을 정하였고 프라이머를 완성하였다. 설계된 프라이머는 (주)제노텍(Taejon, Korea)에 의뢰하여 200pM 스케일(scale)로 합성하고 PAGE로 정제하였다. 합성한 프라이머는 10μM 농도로 희석하고 -20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
서열 명칭 정방향 프라이머
(Forward primer)		 역방향 프라이머
(Reverse primer)
L1 (서열목록 제1서열) GGCTTAGAGGCTGTTCGT
R3 (서열목록 제2서열) TCACTTCCCACTTTAACCC
R4 (서열목록 제3서열) AGTTTGTTCTAGCCCCTCA
R5 (서열목록 제4서열) ATCTCACCGTCTGTATAGA
실시예 2 : 폐렴구균( S. pneumoniae ), 스트렙토코커스 미티스 ( S. mitis ) 및 스트렙토코커스 오라리스 ( S. oralis )균의 gyrB 유전자 증폭
합성된 프라이머가 '미티스(mitis)'군의 폐렴구균((S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)에서의 gyrB 유전자를 증폭할 수 있는 지와 증폭된 산물의 크기로부터 상기 세가지 균주를 각각 분별할 수 있는 지를 확인하기 위해, 상기 합성한 전방향 프라이머와 역방향 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다.
우선, 분리 정제한 '미티스(mitis)' 군의 DNA 1 ㎕ (10 ng)에 반응액 (10 X Taq buffer 2 ㎕, 2.5 mM dNTPs 1 ㎕, D.W. 13.7 ㎕, 프라이머는 각각 1 ㎕씩 (L1 : R3 : R4 : R5 = 20uM : 20uM : 1uM : 2uM), Taq 중합효소 0.3 ㎕ (Intron, Seoul, Korea)를 각 19 ㎕씩 가한 다음 94℃ 5분 1회, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 40초 간의 반응을 30회 반복하고, 72℃에서 10분간 반응시켜 증폭하였다. PCR 증폭산물은 1％ LE 아가로즈 겔(FMC)에서 전기영동하고 증폭 유무 및 크기를 관찰하였다.
도 2에 나타낸 실험결과에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 프라이머들이 '미티스(mitis)'군의 gyrB 유전자 각각을 특이적으로 증폭시킨다는 것을 확인하였다. 또한, 증폭된 산물의 크기의 차이로부터 세가지 균인 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)를 가각 분별할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3 : 미티스 ( mitis ) 균 중에서 폐렴구균( S. pneumoniae ), 스트렙토코커스 미티스 ( S. mitis ) 및 스트렙토코커스 오라리스 ( S. oralis ) 균 특이적 gyrB 유전자 증폭
합성된 프라이머가'미티스 (mitis)'군 중에서 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) 균의 gyrB 유전자만을 특이적으로 증폭하는지 확인하기 위해, 보유중인 미티스(mitis) 군 및 유사군의 총 128의 균을 대상으로 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 3 서열 및 제 4 서열로 이루어지는 프라이머의 조합을 이용하여, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다.
우선, 표 2에 개시된 128종의'미티스(mitis)' 군의 균주들로부터 DNA를 정제한 후, DNA 1㎕ (10ng)에 반응액 (10X Taq buffer 2㎕, 2.5 mM dNTPs 1㎕, D.W. 13.7㎕, 프라이머는 각각1㎕씩(L1 : R3 : R4 : R5 = 20uM : 20uM : 1uM : 2uM), Taq 중합효소 0.3㎕(Intron, Seoul, Korea)를 각 19 ㎕씩 가한 다음, 94℃ 5분 1회, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 40초간의 반응을 30회 반복하고, 72℃에서 10분간 반응하여 증폭하였다. PCR 산물은 1％ LE 아가로즈 겔(FMC)에서 전기영동하고 증폭 유무 및 크기를 관찰하였다.
Figure 112009064122592-pat00013
Figure 112009064122592-pat00014

Figure 112009064122592-pat00015

Figure 112009064122592-pat00016
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도 3a 내지 도 3c의 실험결과에 나타난 바와 같이, 상기 프라이머들이 '미티스(mitis)' 군의 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) 균의 gyrB 유전자를 특이적으로 증폭시키고 다른 연쇄상구균(Streptococcus) 속을 비롯하여 다른 유사균종의 유전자는 증폭시키지 않는 것을 알 수 있었다. 또한, 증폭산물의 크기 분석을 통해 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) 균을 분별할 수 있었다.
실시예 4 : 중합효소연쇄반응을 이용한 구강검체시료로부터 미티스(mitis)군 균의 검출
폐렴구균은 사람의 구강에 존재하는 상주균으로 건강한 사람의 40-60％가 보균자이므로, 일반인 47 명을 대상으로 시료를 채취하고 Ausubel 등의 방법(1994)에 준하여 지놈 DNA (Genomic DNA, gDNA)를 분리하였다. 분리한 지놈 DNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하고, 타겟 gyrB 유전자의 증폭유무와 증폭된 PCR 생성물의 크기를 관찰하였다.
도 4의 실험결과에 나타낸 바와 같이, 서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 3 서열 및 제 4 서열로 이루어지는 프라이머의 조합을 이용하면 구강검체 시료로부터 추출한 DNA를 이용한 PCR 증폭반응에 의해 미티스군에 포함되는 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) 균의 존재 및 이들 균주를 각각 분별하여 확인할 수 있었다. 도 5에는 도 4의 실험결과를 도표로 정리하여 나타내었으며, 이 도 5의 결과로부터 각각의 시료가 '미티스(mitis)'군의 세가지 균 중에서 어떠한 균을 보유하고 있는지를 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 gyrB 유전자와 이를 특이적으로 증폭하는 프라이머 전방향프라이머 L1, 역방향프라이머 R3, R4, 및 R5의 구성을 모식적으로 보여주는 도면이다.
도 2는 본 발명의 프라이머쌍을 사용하여 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 gyrB 유전자의 일부분을 PCR 증폭한 산물을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 검출대상인 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)을 포함하는 다양한 연쇄상구균에 대해 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 gyrB 유전자의 일부분을 증폭하여 본 결과를 보여준다. 도 3a 내지 도 3b의 결과는 본 발명의 프라이머쌍은 미티스(mitis) 군 중의 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)만을 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 제시한다.
도 4는 실제 47명의 사람으로부터 구강 시료를 채취하여 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 검출 분석을 행한 결과를 보여준다.
도 5는 상기 도 4의 PCR 검출 분석의 결과를 도표로 정리한 것이다. 상기 도 4 및 도 5의 결과로부터 본 발명의 프라이머쌍은 사람의 구강 시료중의 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리 스(S. oralis)만을 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
<110> Cung-Ang University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Multiplex PCR Kit and Method for Detecting and Identifying Streptococcus mitis Using the Same <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Streptococcus mitis <400> 1 ggcttagagg ctgttcgt 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Streptococcus mitis <400> 2 tcacttccca ctttaaccc 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Streptococcus mitis <400> 3 agtttgttct agcccctca 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Streptococcus mitis <400> 4 atctcaccgt ctgtataga 19

Claims (5)

  1. (ⅰ) 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 전방향 (forward) 프라이머 및 (ⅱ) 서열목록 제 2 서열, 제 3 서열 및 제 4 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 역방향(reverse) 프라이머를 갖는 프라이머쌍으로서, 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 연쇄상구균의 분별 검출을 위한 유전자증폭 반응용 프라이머쌍.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자증폭 반응은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), 복구연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 중 어느 하나의 반응인 것을 특징으로 하는 유전자증폭 반응용 프라이머쌍.
  3. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 연쇄상구균을 분별 검출하는 방법:
    (a) 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) (i) 상기 추출된 시료 DNA, (ⅱ) 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 전방향 (forward) 프라이머, 및 (ⅱ) 서열목록 제 2 서열, 제 3 서열 및 제 4 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 역방향(reverse) 프라이머를 갖는 프라이머쌍을 포함하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)액을 제조하는 단계; 및
    (c) 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.
  4. (ⅰ) 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 전방향 (forward) 프라이머 및 (ⅱ) 서열목록 제 2 서열, 제 3 서열 및 제 4 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 역방향(reverse) 프라이머를 갖는 프라이머쌍을 포함하는 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)의 연쇄상 구균의 분별 검출을 위한 유전자 증폭 키트.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 키트는 (c) dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP); (d) DNA 중합효소; 및 (e) 완충(buffer)용액을 더욱 포함하는 유전자 증폭 키트.
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