KR101203132B1

KR101203132B1 - 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 폐렴구균의 정량 및 검출 방법

Info

Publication number: KR101203132B1
Application number: KR1020100055387A
Authority: KR
Inventors: 김원용; 박희국; 이희중
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-11
Filing date: 2010-06-11
Publication date: 2012-11-20
Also published as: KR20110135575A

Abstract

본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 폐렴구균(S. pneumoniae)을 검출하는 방법 및 이에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 폐렴구균(S. pneumoniae)에 특이적인 cpsA 유전자내의 염기서열을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브를 사용하여, 폐렴구균과 매우 유사하여 종래 방법으로 구별하여 검출하기가 어려운 S. pseudopneumoniae, 스트렙토코커스 미티스(S. mitis), 스트렙토코커스 오랄리스(S. oralis) viridans 그룹 연쇄상구균으로부터 폐렴구균을 매우 정확하게 구별하여 정량 및 검출할 수 있다.

Description

실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 폐렴구균의 정량 및 검출 방법{Method for Detection and Quantification of S. pneumoniae Using Real Time Polymerase Chain Reaction}

본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 폐렴구균(S. pneumoniae)을 정량하는 방법, 검출하는 방법 및 이에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것이다.

알파(α)-용혈연쇄상구균중에서 폐렴의 주요 원인균인 강력한 병원성 폐렴구균(S. pneumoniae), 중이염(otitis media)균, 폐혈증(septicemia)균 및 뇌수막염(meningitis)균은 구강 환경의 주요 군집을 구성하는 viridans 그룹 연쇄상구균(viridans group streptococci)과 함께 구강 환경내에서 자주 발견된다(Whatmore et al., 2000; Suzuki et al., 2005). 그러나, 폐렴구균(S. pneumoniae)는 S. pseudopneumoniae, 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오랄리스(S. oralis)와 같은 다른 viridans 그룹 연쇄상구균과 99％ 이상의 16S rRNA 유전자 동일성을 가지므로(Arbique et al., 2004; Suzuki et al., 2005), 폐렴구균(S. pneumoniae)를 정확하게 검출하는 것은 폐렴 질환을 진단하고 모니터링하는데 있어서 매우 중요하다(Mager et al., 2003). 폐렴구균(S. pneumoniae)를 검출하기 위한 PCR-기반 분석법은 폐렴 병원성 인자를 암호화하는 유전자들 예를 들어, 자가용해제(autolysin) (lytA) (McAvin et al., 2001), 뉴모리신(pneumolysin) (ply) (Corless et al., 2001), 폐렴 표면항원 A (pneumococcal surface antigen A) (psaA) (Morrison et al., 2000), 망간 의존성 수퍼옥시드 디스뮤타아제(manganese-dependent superoxide dismutase) (sodA) (Kawamura et al., 1999), 페니실린 결합 단백질(penicillin-binding protein) (O'Neill et al., 1999), 및 추정의 알려지지 않은 유전자 (Suzuki et al., 2005)의 유전자들을 타겟으로 하였다. 그러나, 상기 타겟 유전자들은 호흡기 분비물에서 이 유기체를 검출하기 위해서는 비특이적인 PCR 타겟 유전자가 될 것이며, 최근에 확인된 종으로서, 폐렴구균(S. pneumonia)과 매우 밀접하게 연관되어 있는 Streptococcus pseudopneumoniae (Arbique et al., 2004)는 분석의 검증에 포함되어 있지 않았다(Greiner et al., 2001; Yang et al., 2005).

최근, 정량 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)와 같은 새로운 핵산-기반 기술에 의해 폐렴 질환의 진단을 향상시킬 수 있게 되었다. 통상적인 분석법에 대한 이러한 기술의 이점은 분석의 신속성, 오염을 일으킬 수 있는 후처리 단계의 불필요 및 타겟의 농도 변화에 대해 검출을 가능케 하는 광범위한 동적 범위와 같은 이점이 있다(Walker, 2002).

종래의 PCR-기반 방법이 밀접하게 관련된 viridans 그룹 연쇄상구균으로부터 폐렴구균(S. pneumoniae) 균주를 구분하기 위해 개발되었지만, 횡측 유전자 전달(lateral gene transfer)은 viridans 그룹 연쇄상구균 중에서 발생하였으며 이는 인간 환경으로부터 상기 유기체들을 진단하는 것을 어렵게 하였다. 실제로 폐렴 구균(S. pneumoniae)의 폐렴 병원성 유전자의 일부는 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 또는 스트렙토코커스 오랄리스(S. oralis) 분리 균주로부터 종종 검출되었다(Whatmore et al., 2000; Seki et al., 2005; Verhelst et al., 2003). 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 분석법은 뉴클레오타이드 Spn9802, lytA, ply 및 psaA 유전자의 검출을 위해 계속적으로 개량 및 향상되어 왔다(Abdeldaim et al., 2008; Carvalho Mda et al., 2007; Corless et al., 2001). 그러나, S. psudopneumoniae 균주의 지놈 DNA으로부터 몇 개의 위 양성(false-positive) 증폭이 관찰되었고(Abdeldaim et al., 2008), 이에 따라, 보다 정확하고 특이도 및 민감도 높은 폐렴구균 검출방법의 개발이 필요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 SSH (suppression subtractive hybridization) 방법을 사용한 폐렴구균(S. pneumoniae) 및 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 사이의 비교 유전학적 연구의 과정에서 폐렴구균(S. pneumoniae) 특이적 유전자 cpsA (capsular polysaccharide biosynthesis)를 발견하였다. 본 발명자들은 상기 폐렴구균(S. pneumoniae) 특이적 유전자 cpsA 를 타겟 유전자로 하여 인간 구강내 상존하는 폐렴구균(S. pneumoniae)을 특이적으로 검출 및 정량할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 방법을 개발하였고, 이 방법의 검출 특이도 및 민감도가 매우 우수하여, S. pseudopneumoniae, 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오랄리스(S. oralis)와 같은 다른 viridans 그룹 연쇄상구균으로부터 폐렴구균(S. pneumoniae)만을 매우 정확하게 구분하여 검출할 수 있다는 것을 실험적으로 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 실시간 중합효소연쇄반응 방법을 이용하여 폐렴구균을 정량하는 방법 및 검출하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 폐렴구균을 검출하기 위한 중합효소연쇄반응 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 폐렴구균을 검출 또는 정량하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 이용하여 폐렴구균(S. pneumoniae)을 검출하는 방법을 제공한다: (a) 시료로부터 세균의 지놈 DNA (genomic DNA)를 분리 및 정제하는 단계; (b) 상기 분리 및 정제한 지놈 DNA를 주형으로 하여, 서열목록 제1서열을 갖는 프라이머와 서열목록 제2서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍과, 5′- 말단에 형광물질로 표지되고, 3′- 말단에 형광억제물질이 표지된 서열목록 제 3 서열을 갖는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계, 및 (c) 실시간 중합효소연쇄반응으로부터 발생되는 형광 시그널을 분석하여 폐렴구균(S. pneumoniae)의 검출을 판단하는 단계.

이하에서, 본 발명의 방법을 각 단계에 따라 상세히 설명한다.

단계 (a): 시료로부터 세균의 지놈 DNA (genomic DNA)를 분리 및 정제하는 단계

본 발명에서 시료로부터 세균 세포의 지놈 DNA(genomic DNA)의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 이에 대한 구체적인 내용은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 세균 세포의 지놈 DNA의 분리 및 정제는 예컨대, 페놀-클로로포름 추출 방법으로 얻을 수 있다 (Neumann B, et al., Rapid isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria., Trends Genet. 8:332-333(1992)).

단계 (b): 상기 분리 및 정제한 지놈 DNA를 주형으로 하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계

상기 분리 및 정제한 세균 지놈 DNA를 주형으로 하고, 폐렴구균(S. pneumoniae)을 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 실시한다.

본 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 핵산 증폭 반응시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5'말단 서열 또는 3'말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

본 발명에서 상기 실시간 중합효소연쇄반응에 사용되는 프라이머쌍은 바람직하게는 서열목록 제1서열을 갖는 프라이머와 서열목록 제2서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍이다.

본 명세서에서 용어 "프로브(probe)"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃이 되는 염기서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위내에서 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 예를 들어, 리포터(reporter) 형광물질 또는 형광억제물질(quencher)이 프로브 올리고뉴클레오타이드의 말단에 태깅(tagging) 될 수 있다.

본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응에서 프로브는 프라이머쌍에 의해 증폭되는 염기서열 내부의 일부 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 사용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 PCR에 사용되는 프로브의 5'-말단에는 리포터-형광물질이 태깅(tagging)되어 있고, 3'-말단에는 형광억제물질(quencher)이 태깅되어 있다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 상기 프로브는 5'- 말단에 형광물질로 표지되고, 3'- 말단에 형광억제물질이 표지된 서열목록 제3서열을 갖는 프로브이다.

본 발명에서 리포터 형광물질과 형광억제물질은 특정의 물질로 한정되지 않으며 예를 들어, 5′-말단에 태깅되는 형광물질은 FAM(6-carboxyfluorescein) 또는 TET(tetrachlorofluorescin)이고, 3′-말단에 태깅되는 형광억제물질은 TAMRA(tetramethylrhodamine) 또는 MGB(dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove binder)이다.

본 발명의 프로브는 주형의 타겟 서열에 특이적으로 혼성화되지만, 3'-말단에 존재하는 형광억제물질의 작용에 의해 5'-말단의 리포터 형광물질이 형광을 방출하지 못한다. 그러나, 핵산증폭반응의 다음 단계인 연장 단계(extension step)에서 Taq DNA 중합효소가 가지고 있는 5'→ 3'exonuclease 활성에 의해, 주형에 혼성화된 프로브가 분해되고, 프로브 5'말단의 형광물질이 프로브로부터 분리되어 형광억제물질에 의한 형광억제가 해제됨으로써 형광이 방출된다. 따라서, 형광 방출은 정상적 실시간 중합효소연쇄반응을 지시한다.

본 발명의 방법에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 바람직하게는, DNA 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

한편, 유전자 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 주형 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 발명에서 중합효소에 의한 증폭 반응은 통상적인 (ⅰ) 초기 변성(denaturation) 과정, (ⅱ) 어닐링(annealing), 연장(elongation) 및 변성(denaturation)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 행한다.

단계 (c): 실시간 중합효소연쇄반응으로부터 발생되는 형광 시그널을 분석하여 폐렴구균( S. pneumoniae )의 검출을 판단하는 단계

상기 단계 (b)에서 행한 실시간 중합효소연쇄반응의 형광 방출을 분석하여 폐렴구균의 검출 여부를 판단한다. 이러한 분석 및 판단은 실시간 중합효소연쇄반응에서 발생되는 형광을 분석하는 소프트웨어를 사용하여 용이하게 행할 수 있다. 폐렴구균(S. pneumoniae) 특이적 cpsA 유전자내의 염기서열에 특이적으로 결합하도록 디자인된 서열목록 제3서열을 갖는 프로브로부터 발생되는 형광이 검출되는 경우 폐렴구균이 검출되는 것으로 판단한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열을 갖는 프라이머와 서열목록 제2서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 폐렴구균(S. pneumoniae) 검출용 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 키트를 제공한다.

본 발명의 폐렴구균(S. pneumoniae) 특이적 cpsA 유전자내의 염기서열에 특이적으로 결합하도록 디자인된 서열목록 제1서열을 갖는 프라이머 및 서열목록 제2서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응을 행하면, 폐렴구균(S. pneumoniae)을 특이적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열을 갖는 프라이머와 서열목록 제2서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍; 및 (b) 5'- 말단에 형광물질로 표지되고, 3'- 말단에 형광억제물질이 표지된 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 포함하는 폐렴구균(S. pneumoniae) 정량 검출용 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 형광물질은 FAM(6-carboxyfluorescein) 또는 TET(tetrachlorofluorescin)이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 형광억제물질은 TAMRA(tetramethylrhodamine) 또는 MGB(dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove binder)이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 키트는 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 더욱 포함한다.

본 발명의 키트는 선택적으로, 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 폐렴구균(S. pneumoniae)을 정량하는 방법, 검출하는 방법, 및 이에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 폐렴구균(S. pneumoniae)에 특이적인 cpsA 유전자내의 염기서열을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브를 사용하여, 폐렴구균과 매우 유사하여 종래 방법으로 구별하여 검출하기가 어려운 S. pseudopneumoniae, 스트렙토코커스 미티스(S. mitis), 스트렙토코커스 오랄리스(S. oralis)와 같은 viridans 그룹 연쇄상구균으로부터 폐렴구균을 매우 정확하게 구별하여 정량 및 검출할 수 있다.

도 1은 폐렴구균(S. pneumoniae) 지놈 DNA의 10배 희석물로부터 cpsA-348F 및 cpsA-415R 프라이머 및 cpsA-taqman 프로브를 사용한 qPCR에 의해 얻어진 표준 곡선 및 최소 검출 한계를 보여준다. 폐렴구균(S. pneumoniae) 지놈 DNA 10 배 희석물의 농도는 (1) 32×10^-1ng, (2)32×10^-2ng, (3) 32×10^-3ng, (4) 32×10^-4ng, (5) 32×10^-5ng, (6) 32×10^-6ng, (7) 32×10^-7ng의 최초 농도를 갖는다. 절편(intercept)은 표준곡선에서 회귀(regression)선이 y-축을 가로지르는 y값이다. y-절편은 1에 대응하는 양을 갖는 샘플에 대한 기대 C_T(threshold cycle)값을 나타낸다. R2 값은 표준곡선에서 회귀선으로부터 계산된 회귀 계수이다. R2 값은 표준곡선 회귀선과, 표준반응으로부터의 개별 C_T데이터 포인트 사이의 적합성의 밀접성을 나타낸다. 1.00 값은 회귀선과 데이터 포인트 사이의 완벽한 적합성을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 방법에 의해 행한 증폭 반응을 플로팅한 결과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

1. 균주 및 배양

본 발명의 실험에서 사용된 총 135개의 세균 균주는 표 1에 나타내었다.

각각의 균주는 Korea Collection for Type Culture (KCTC; 대전, 한국); Culture Collection of Antibiotics Resistant Microbe (CCARM; 서울, 한국); Korean Collection for Oral Microbiology (KCOM/ChDC; 광주, 한국); Deutsche Sammlung von ikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany); Belgian Co-Ordinated Collections of Micro-Organisms (BCCM/LMG; Gent, Belgium); 및 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)으로부터 구입하였다. 구강 연쇄상구균(streptococci) 균주는 혈액 한천 플레이트(Asan Pharm Co., Seoul, Korea)내에서 37℃에서 20시간 동안 호기적 조건하에서 배양하였다. 다른 참조 균주들도 동일한 조건하에서 BHI(brain heart infusion) 한천 배지 (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에서 배양하였다.

2. 세균 지놈 DNA 의 준비

세균 지놈 DNA는 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide) 방법 (Ausubel et al., 1993)을 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA는 Nano Quant Infinite M200 spectrophotometer (Tecan, Mㅴnnedorf, Switzerland)를 사용하여 260 nm의 파장에서 정량하였다.

3. 프라이머 및 프로브의 제작

폐렴구균을 검출하기 위한 실시간 중합효소 연쇄반응용 프라이머와 형광 염료 표지된 TaqMan MGB 프로브는 SSH (suppression subtractive hybridization) 방법에 의해 얻은 폐렴구균 (S. pneumoniae) 특이적 cps 유전자 (GenBank accession number NC_011072)에 대응되는 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 설계하였다.

프라이머 cpsA-348F (서열목록 제1서열 : 5′-GCTGTTTTAGCAGATAGTGAGATCGA-3′) 및 cpsA-415R (서열목록 제2서열 : 5′-TCCCAGTCGGTGCTGTCA-3′)의 프라이머 세트는 PCR 증폭반응에 의해 67 bp의 증폭산물을 생성하도록 설계하였다.

5′-말단에 카르복시플루오레신(carboxyfluorescein; FAM)이 표지되고, 3′-말단에 MGBNFQ 1(minor groove binder non-fluorescent quencher 1)이 표지된 프로브, 5′-^FAM-AATGTTACGCAACTGACGAG-^MGBNFQ1-3′(서열목록 제3서열)을 검출 프로브로 제작하였다.

4. 실시간 중합효소연쇄반응

표준곡선(standards curve) 및 최소 검출 한계는 폐렴구균(S. pneumoniae) KCTC 5080T 세포(10⁷ - 1 CFU/㎖)로부터 정제된 DNA의 연속 희석물에 대해 행한 qPCR의 CT (cycle threshold) 값을 투입 세포수/㎖의 로그값에 대해 플로팅하여 만들었다. 폐렴구균(S. pneumoniae)의 농도는 생존 세포 플레이트 계수 방법에 의해 계산하였다. 배양물의 10 배씩의 연속 희석액을 BHI (brain heart infusion) 배지 (Difco)에 접종하였다. 플레이트를 37℃에서 16 시간 동안 연속 인큐베이션하고 배양 계수(CFU)를 3회 반복하여 측정하였다. 3회의 반복 분석 실험 각각에 대해 프라이머 및 프로브의 농도를 최적화하였고, 실험적으로 최적화된 농도에 따라, 250 nM의 cpsA 특이적 프라이머 및 150 nM의 cpsA 특이적 프로브를 후속의 모든 실험에서 사용하였다. DNA는 95℃에서 10 분; 95℃에서 15초의 50 사이클; 및 60℃에서 1 분의 조건으로 7300 Real Time PCR system (Applied Biosystems)을 사용하여 증폭하였다. 증폭된 데이터는 SDS Software (7300 Real-time PCR System Sequence Detection Software v1.31, Applied Biosystems)에 의해 분석하였다. 샘플은 < 50 사이클 컷-오프(cut-off) 내에서 3회 중 2회의 포지티브 결과를 주는 경우를 포지티브로 간주하였다.

실험결과

1. 폐렴구균 ( S. pneumoniae ) 특이적 프라이머

본 발명자들은 SSH (suppression subtractive hybridization) 기술을 사용하여 매우 밀접하게 관련된 viridans 군 연쇄상구균(viridans group streptococci)의 일원을 이루는 균들로부터 폐렴구균(S. pneumoniae)만을 매우 정확하게 구별할 수 있는 폐렴구균(S. pneumonia) 특이적 신규 유전자 마커로써 cpsA 유전자를 확인하였다. 상기 신규 cpsA 유전자의 염기 서열을 기초로 cpsA-타겟 프라이머와 프로브인, cpsA-348F(서열목록 제1서열), cpsA-415R(서열목록 제2서열), cpsA taqman-FAM(서열목록 제3서열)을 각각 제작하였고, 이를 사용하여 폐렴구균(S. pneumoniae)의 검출 정확성을 검사하였다.

우선, 27주의 폐렴구균(S. pneumoniae), 2주의 S. pseudopneumoniae, 4주의 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 10주의 스트렙토코커스 오랄리스(S. oralis) 균주를 포함하여 Streptococcaceae 및 Enterococcaceae 과(family)의 일원인 135 주 균주에 대해 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 본 발명의 프라이머 및 프로브의 검출 특이도를 평가하였고, 그 결과는 표 2에 나타내었다.

상기 표 2의 결과에서와 같이, 본 발명의 cpsA-특이적 프라이머쌍 및 프로브는 폐렴구균(S. pneumoniae)에 대해서 높은 특이도를 보였으며, 다른 참조균주들을 증폭하지는 않았다.

2. 폐렴구균 특이적 실시간 중합효소연쇄반응

(1) 실시간 중합효소연쇄방법

S. pseudopneumoniae는 폐렴구균(S. pneumoniae)와 매우 밀접하게 관련된 유사한 종이다. Pairwise 비교에 의하면 이들의 16S rRNA 유전자 서열은 거의 동일하고, 오직 5 bp 만이 상이하여 99.7％의 동일성을 갖는다(Arbique et al., 2004). 그러나, DNA-DNA 재결합(reassociation) 값을 이용하면 폐렴구균(S. pneumoniae)와 S. pseudopneumoniae를 구분하는 것이 가능하다(Carvalho Mda et al., 2007). 종래 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 분석법은 폐렴구균(S. pneumoniae)을 특이적으로 검출하기 위해 개발되었으나, 타겟 유전자에 따른 특이도와 관련하여 상반되는 데이터가 존재하였다. 가장 최근의 spn9802-기반 분석법에 의하면 2개의 S. pseudopneumoniae 균주 (CCUG 49455T, CCUG 48465)에서 위-양성(false-positive) 결과가 나타났다(Abdeldaim et al., 2008). lytA 유전자를 사용하는 다른 분석 시스템은 폐렴구균(S. pneumoniae) 아닌 유기체로부터의 지놈 DNA에 대해서 검출가능한 형광 시그널을 나타내지 않아, 특이적인 결과를 나타내었다 (Carvalho Mda et al., 2007). 그러나, 상기 적용 방법들은 S. pseudopneumoniae, 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오랄리스(S. oralis)와 같이 구강 연쇄상구균(streptococci)에 표현형 및 유전학적으로 관련된 다른 유기체들이 폐렴구균(S. pneumoniae)의 병원성 인자 lytA 또는 ply 유전자들을 코딩하는 유전자들을 공유한다는 점에 주의해야 한다(Seki et al., 2005; Verhelst et al., 2003; Whatmore et al., 2000).

그러나 이와는 대조적으로, 캡슐 다당체(capsular polysaccharide)는 폐렴구균(S. pneumonia)에 의해서만 생성되고, 폐렴의 병원성에 필수적이다(Austrian, 1981; Henrichsen, 1995). 90 개의 공지된 혈청형의 cps 유전자는 dexB 과 aliA 유전자 사이에서 동일한 염색체내에서 위치한다(Garcia and Lopez, 1997; Morona et al., 1997; Munoz et al., 1997). 폐렴성 CPS 생합성(cps) 유전자좌 내에서의 최초 4개의 유전자(cpsA??cpsD)는 연구된 모든 혈청형에서 공통되는 것이고, cpsA 유전자에 기초한 PCR 방법은 S. pseudopneumoniae, 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오랄리스(S. oralis) 균주와 폐렴구균(S. pneumoniae) 균주를 구별할 수 있다. 따라서, 새롭게 개발된 본 발명의 cpsA 유전자 기반 qPCR 시스템은 매우 밀접하게 관련된 viridians 군 연쇄상구균(viridians group streptococci)로부터 폐렴구균(S. pneumoniae)을 구분하는 가장 강력한 특이도를 보였다.

(2) 실험결과

10⁷ CFU ㎖^-1 농도에서 배양한 폐렴구균(S. pneumoniae) 배양물로부터 DNA를 추출하고 10배로 연속 희석하여 qPCR의 민감도를 측정하였다. PCR 혼합액당 각각의 DNA 희석물(3.2 ng, 0.32 ng, 32 pg, 3.2 pg, 0.32 pg, 32 pg, 및 3.2 fg)을 표준곡선 제작에 사용하였고, 검출의 최소한계로 하였다(도 1). 새로운 cpsA 유전자 기반 qPCR 분석법을 사용하는 폐렴구균(S. pneumoniae) 지놈 DNA의 최소 검출한계는 32 fg으로서 14개의 지놈에 대응하는 수치이었다. 이러한 지놈 동등성은 지놈의 크기를 2.1 Mb으로 하여 다음의 방정식 : DNA 양(fg) = bp × 660 Da/bp × 1.6 × 10^-27kg/Da × 1 × 10^-18 fg/kg (Rodriguez-Lazaro et al., 2006)에 따라 계산하여 폐렴구균(S. pneumoniae) DNA 1몰을 2.2 fg의 DNA에 대응시켜 구한 것이다. 폐렴구균(S. pneumoniae)의 지놈 크기가 2.1 Mb이라는 것은 UK의 Wellcome Trust Sanger Institute로부터 얻었다. 폐렴구균(S. pneumoniae) 핵산 추출물에서 지놈 카피(copy)의 수는 다음의 식을 통해 결정하였다: 카피(copy)의 수 = 추출물내의 DNA양/2.2fg. 선형 회귀(linear regression)분석에 의해 폐렴구균(S. pneumoniae) 세포수의 log 값과 C_T 값 사이에 상당히 높은 상관관계가 있다는 것을 지시한다(R2 = 0.99). 분석 민감도는 PCR 혼합액당 10⁷ - 10개 세포이었으며, C_T 값은 희석된 지놈 DNA 농도에 따라 증가하였다. 이러한 검출 민감도는 다른 병원성 세균종으로부터 얻은 것과 매우 유사하였다(Lambertz et al., 2008; Sails et al., 2003; Yang et al., 2003). 하기 표 3에 본 발명의 실험에서 10⁷ 세포의 폐렴구균(S. pneumoniae)의 연속희속을 이용하여 C_T값을 결정한 결과를 나타내었다.

2차 세균 감염은 H1N1 대유행 인플루엔자에서 이병율과 사망률과 관련되어 있다. 치명적 인플루엔자 경우로부터 얻은 폐 조직 샘플 분석의 결과, 폐렴구균(S. pneumoniae)는 스타필로코커스 헤모리티커스(Staphylococcus haemolyticus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)에 뒤 따르는 가장 보편적인 병원균이다(Morens et al., 2008). 또한, 폐렴구균(S. pneumoniae) 공동감염은 H1N1 대유행 인플루엔자의 위중성의 주요한 원인으로 알려져 있고(Palacios et al., 2009), 인플루엔자 환자에게서 이 세균을 검출하는 것은 중요해지고 있다. 종래의 폐렴구균(S. pseumoniae) 병원성 인자의 qPCR 타겟, ply 및 lytA 유전자는 S. pseudopneumoniae, 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) 및 스트렙토코커스 오랄리스(S. oralis)와 공유되어 있고, 비특이적 검출이 호흡기 분비물에서 이러한 미생물으로 인지되었다(Carvalho Mda et al., 2007; Whatmore et al., 2000; Yang et al., 2005). 염색체 cpsA 유전자의 서열을 타겟으로 하는 본 발명의 정량적 실시간 PCR 방법에 의하면, 밀접하게 관련된 vridans 그룹 연쇄상구균(vridans group streptococci)으로부터 폐렴구균(S. pneumoniae)을 고민감도, 특이적 및 정확하게 정량적으로 검출할 수 있게 한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조문헌

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서열목록 전자파일 첨부

Claims

다음의 단계를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 이용하여 폐렴구균(S. pneumoniae)를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 폐렴구균을 스트렙토코커스 수도뉴모니아(S. pseudopneumoniae)와 구분 가능하게 검출하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 시료로부터 세균의 지놈 DNA(genomic DNA)를 분리 및 정제하는 단계;
(b) 상기 분리 및 정제한 지놈 DNA를 주형으로 하여, 서열목록 제1서열을 갖는 프라이머와 서열목록 제2서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍과, 5′-말단에 형광물질로 표지되고, 3′-말단에 형광억제물질이 표지된 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계; 및
(c) 실시간 중합효소연쇄반응으로부터 발생되는 형광 시그널을 분석하여 폐렴구균(S. pneumoniae)의 검출을 판단하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 형광물질은 FAM(6-carboxyfluorescein) 또는 TET(tetrachlorofluorescin)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 형광억제물질은 TAMRA(tetramethylrhodamine) 또는 MGB(dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove binder)인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
(a) 서열목록 제1서열을 갖는 프라이머와 서열목록 제2서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍; 및 (b) 5'- 말단에 형광물질로 표지되고, 3'- 말단에 형광억제물질이 표지된 서열목록 제3서열을 갖는 프로브를 포함하는 폐렴구균(S. pneumoniae)을 스트렙토코커스 수도뉴모니아(S. pseudopneumoniae)와 구분 가능하게 정량 검출하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)용 키트.
제 5 항에 있어서, 상기 형광물질은 FAM(6-carboxyfluorescein) 또는 TET(tetrachlorofluorescin)인 것을 특징으로 하는 키트.
제 5 항에 있어서, 상기 형광억제물질은 TAMRA(tetramethylrhodamine) 또는 MGB(dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove binder)인 것을 특징으로 하는 키트.
제 5 항에 있어서, 상기 키트는 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.