RU2781855C1 - Способ исследования микробиоты толстого кишечника методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени и набор реагентов для его осуществления - Google Patents
Способ исследования микробиоты толстого кишечника методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени и набор реагентов для его осуществления Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781855C1 RU2781855C1 RU2021131090A RU2021131090A RU2781855C1 RU 2781855 C1 RU2781855 C1 RU 2781855C1 RU 2021131090 A RU2021131090 A RU 2021131090A RU 2021131090 A RU2021131090 A RU 2021131090A RU 2781855 C1 RU2781855 C1 RU 2781855C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fam
- bhq
- klpn
- bhq1
- microbiota
- Prior art date
Links
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 title claims abstract description 15
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 title claims abstract description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title description 7
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 title 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 101700053400 SALL1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100010806 SALL1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101700043774 SALL2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100010811 SALL2 Human genes 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- -1 2'-deoxycytidine-3 '-triphosphate Chemical compound 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010009657 Clostridium difficile colitis Diseases 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 2
- 206010064389 Dysbacteriosis Diseases 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 210000003608 Feces Anatomy 0.000 description 2
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 2
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 2
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 2
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 201000006704 ulcerative colitis Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-triaminopyrimidine Chemical compound NC1=CC(N)=NC(N)=N1 JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-N-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 210000003445 Biliary Tract Anatomy 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infection Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 210000001072 Colon Anatomy 0.000 description 1
- 206010011401 Crohn's disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000001848 Dysentery Diseases 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 208000010227 Enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000013165 Exonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 206010019641 Hepatic cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000002551 Irritable Bowel Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Process Diseases 0.000 description 1
- 206010033971 Paratyphoid fever Diseases 0.000 description 1
- 206010037128 Pseudomembranous colitis Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108060002241 SLC1A5 Proteins 0.000 description 1
- 102100012046 SLC1A5 Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000001072 Type 2 Diabetes Mellitus Diseases 0.000 description 1
- BZFAAUGVDSXTIZ-YDZBNSHISA-N [[(2R,3S,5R)-5-(2-amino-6-oxo-3H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate;[[(2R,3S,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1.C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 BZFAAUGVDSXTIZ-YDZBNSHISA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 201000011231 colorectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 201000010092 intestinal infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004044 liver cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 230000002956 necrotizing Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к микробиологии. Описан способ исследования микробиоты толстого кишечника путем определения ДНК микроорганизмов кишечника методом полимеразной цепной реакции. Способ включает взаимодействие образца микробиоты с набором олигонуклеотидных праймеров, определение для каждого олигонуклеотида в указанном наборе праймеров количества его нуклеотидных последовательностей-мишеней, которые присутствуют в указанном образце. Затем получают профиль микробиоты из относительных количеств нуклеотидных последовательностей-мишеней, присутствующих в образце. Также описан набор для осуществления способа. Он включает стрипы со смесями олигонуклеатидных праймеров для амплификации, запечатанные воском, раствор Taq-полимеразы, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, минеральное масло. Технический результат заключается в разработке более информативного способа исследования микробиоты и набора для его проведения за счет большего количества определяемых последовательностей мишеней и использования более точных олигонуклеотидных праймеров. 2 н.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностирования заболеваний кишечника.
Известен патент РФ на изобретение №2 605 913 от 16.12.2011 в котором описана группа изобретений, представленная набором олигонуклеотидных зондов для профилирования микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), где указанный набор включает в частности (а) олигонуклеотид, состоящий из (ai) нуклеотидной последовательности, выбранной из ACGCTTGCACCCT (SEQ ID NO: 1) необязательно с не более тремя замещенными основаниями или AGGGTGCAAGCGT (SEQ ID NO: 27) необязательно с не более тремя замещенными основаниями, и (aii) 0-5 нуклеотидов в дополнение к (ai), где олигонуклеотид согласно (а) способен гибридизоваться с SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 1, соответственно, в строгих условиях гибридизации. Также предоставлены способы профилирования микробиоты ЖКТ индивидуума и способы диагностики или мониторинга заболевания или состояния у индивидуума или прогнозирования или оценки риска развития у индивидуума заболевания или состояния, в которых используют набор олигонуклеотидных зондов.
Использование изобретений позволяет выявлять присутствие и количество определенных бактерий среди множества с высокой точностью благодаря комбинированному эффекту используемого набора зондов.
К недостаткам известного решения относится узкий спектр микроорганизмов, определяемый набором зондов.
Задача на решение которой направлено заявляемое решение разработка способа исследования микробиоты и набора для его проведения более информативного за счет большего количества определяемых последовательностей мишеней, использования более точных олигонуклеотидных праймеров.
Поставленная задача решается путем применения способа исследования микробиоты толстого кишечника путем определения ДНК микроорганизмов кишечника методом полимеразной цепной реакции. Способ включает взаимодействие образца микробиоты с набором олигонуклеотидных праймеров, определением для каждого олигонуклеотида в указанном наборе праймеров количества его нуклеотидных последовательностей-мишеней, которая присутствует в указанном образце. На основании этого получение профиля микробиоты из относительных количеств нуклеотидных последовательностей-мишеней, присутствующих в образце. При этом в состав набора олигонуклеотидных праймеров входят стрипы со смесями олигонуклеотидных праймеров (указаны в порядке прямой праймер, обратный праймер, флуоресцентный зонд) для амплификации, запечатанные воском, раствор Taq-полимеразы, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, минеральное масло. В качестве смесей праймеров в наборе используют олигонуклеотиды:
- Ca_its_F 5'CAGCGAAATGCGATACGTAATATG 3'
Ca_its_R 5' GTCTTTCAAGCAAACCCAAGTC 3'
Ca_its_Z 5' - FAM-CCTGTTTGAGCGTCGTTTCTCCCT - BHQ-1;
- SaAROE_F 5'AAAGGATTGCACAGCGTTTATC 3'
SaAROE_R 5'CGCAACAGTTAATTTGGGCTTTA 3'
SaAROE_z1 5' (R6G) TACCTTTACTTGCACCACCTGCGC (BHQ1);
- Kspp_F 5'GTTAACGCCCTGTCGCAGAAGC 3'
Kspp_R 5'TTC(G/A) T(A/G) GCTCGGCCAGAA(G/A) CGCAC 3';
- Clodif_F 5'TTGAGCGATTTACTTCGGTAAAGA 3'
Clodif_R 5'TGTACTGGCTCACCTTTGATATTCA 3'
Clo_Taqman 5' FAM CCACGCGTTACTCACCCGTCCG BHQ1 3';
- Fprau_F 5'ССАТСААТТСССТТСААААСТСТТ3'
Fprau_R 5'GAGCCTCAGCGTCAGTTGGT3'
Fprau_Z 6'FAM-AATTCCCGGTGTAGCGGTGGAA-BHQ-1;
- Bac_frag_F 5'CGGAGGATCCGAGCGTTA 3'
Bac_frag_R 5' CCGCAAACTTTCACAACTGACTTA 3'
Bac_frag_Z 6'FAM-CGCTCCCTTTAAACCCAATAAATCCGG-BHQ-1;
- eaeRT_F 5'CAGGCTGATGTATGAGCAGTAT 3'
eaeRT_R 5'TGCTGAGACCACGGTTTATC 3'
eae_z 5'FAM-TATAGTTTACACCAACGGTCGCCGC-BHQ-1;
- Bif_F 5'GCGTGCTTAACACATGCAAGTC3'
Bif_R 5'CACCCGTTTCCAGGAGCTATO'
Bif_Z 6'FAM-TCACGCATTACTCACCCGTTCGCC-BHQ-1;
- Lacto_1 5'TCGGCTATCACTTCTGGATGGA3'
Lacto_2 5'CCATTGTGGAAGATTCCCTACTGC3'
Lacto_Z 6'FAM-ATCGGCCACATTGGGACTGAGAC-BHQ-1;
- Tot_F 5'TCCTACGGGAGGCAGCAGT3'
Tot_R 5'GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT3'
Tot_Z 6'FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-BHQ-1;
- AkkM_F 5' CAGCACGTGAAGGTGGGGAC 3'
AkkM_R 5' CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT 3'
AkkM_Z 5' - R6G-TGCACACGTACTACAATGCCCAGT-BHQ-2-3';
- Cloper_F 5' AGGTGCTCAAAACATGCACT 3'
Cloper_R 5' TGT GCG AAA GCA GCT TTA AC 3'
Cloper_Z 5' HEX-AGC ATT CAC TGG AGA AAT CGC-BHQ 3';
-KlPn_F 5'AATAACACCGAGCAGGAGGTT3'
KlPn_R5' 5'CAATGGCCGAATAAATAAGCA3'
Klpn_Tagman 6'FAM-CGCTCAATCCAGGCTATGCCG BHQ-1;
- KlPn_F 5' AATAACACCGAGCAGGAGGTT3'
KlPn_R5' 5' С AATGGCCGAAT AAAT AAGC A3'
KLox_Z 5'R6G-TTAGTCGTTGGCGAGGCAAACA-BHQ2;
- eaeRT_F 5'CAGGCTGATGTATGAGCAGTAT 3'
eaeRT_R 5' TGCTGAGACCACGGTTTATC 3'
eae_z 5'FAM-TATAGTTTACACCAACGGTCGCCGC-BHQ-1;
- Ent3_F 5' GGGGCGTGGTCAAATATAAAyCT 3'
Ent3_R 5'CCTGACGGACTTCACACTTGTAA 3'
Ent3_Z 5' R6G-AGGCCGAGCACCCCTGGCGATGTAA-BHQ1 3';
- ProChF 5'GTG AAG GCG АТС GTA CCA CTC CT 3'
ProCh_R 5'GCG TCT TCG AAA CGA CGA CCG A 3'
ProCh_Z 5' FAM-CACAGCCTGACGTTTTGCCGG-BHQ 3';
- FusNuc_F 5' TTGTAAGTGCTGGTAAAGGGATTG 3'
FusNuc_R 5' CATTCCTACATAACGGTCAAGAGTA 3'
FusNuc_Z 5' FAM AGCTTCTATTGGTTCTTCTCGTCCAGTGGC BHQ1;
- ParMi_F 5' AAGAATGGAGAGAGTTGTTAGAGAAAGAA 3'
ParMi_R 5'TTGTGATAATTGTGAAGAACCGAAGA 3'
ParMi_Z (R6G)AACTCAAGATCCAGACCTTGCTACGCCTCA(BHQ1);
- Sal_1 5'GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA 3'
Sal_2 5'TCATCGCACCGTCAAAGGAACC 3'
Salm_Z 5'FAM-CTT CTC TAT TGT CAC CGT GGT CCA GT-BHQ 3';
- Sh_F 5'CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACATC 3'
Sh_R 5'TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC 3'
Shig_Z 5'VIC-CTCGTTGTTCAGGCATGAAATTAAGCC-BHQ2.
Для приготовления компонентов набора используются водные растворы реагентов, разбавителем в которых является вода деионизованная с удельной электропроводностью не более 4.3 мкСим/см. Далее по тексту под термином «водный раствор» подразумевается раствор реагента в деионизованной воде. Олигонуклеотидные праймеры представляют собой олигонуклеотиды, специфичные для определяемых микроорганизмов. То есть нуклеотидные последовательности праймеров и зондов комплементарны участкам ДНК соответствующих детектируемых микроорганизмов.
Олигонуклеотидные праймеры получают путем химического синтеза на ДНК-синтезаторе (Applied Biosystems ABI 3900 и другие приборы со сходными техническими характеристиками) и подвергают очистке методом электрофореза в полиакриламидном геле или методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Олигонуклеотидные праймеры поставляются в лиофилизированном виде.
Олигонуклеотидные праймеры получают путем химического синтеза на ДНК-синтезаторе с химической модификацией и подвергают двухэтапной очистке: методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей очисткой методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Химическая модификация заключается во введении молекулы флуорофора и молекулы гасителя флуоресценции.
В качестве флуорофора для канала флуоресценции FAM используют следующие красители: FAM [485 нм (возбуждение), 520 нм (эмиссия)]; для канала HEX используется краситель HEX [530 нм (возбуждение), 556 нм (эмиссия)]; допускается использование красителей VIC или R6G со сходными спектральными характеристиками. В качестве гасителя флуоресценции для канала FAM используют гаситель BHQ-1, для канала HEX используют гаситель BHQ-1 или BHQ-2.
Для приготовления водного раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) используют хроматографически чистые (99%) дезоксинуклеозидтрифосфаты (2'-дезоксиаденозин-5'-трифосфат 2'-дезоксигуанозин-5'-трифосфат 2'-дезокситимидин-5'-трифосфат 2'-дезоксицитидин-3'-трифосфат), свободные от примесей эндонуклеаз, экзонуклеаз и никаз, следовых количеств ДНК и нуклеотидов, поставляемые в концентрации не менее 100 mM.
Для приготовления раствора Taq-полимеразы используют термостабильную ДНК-полимеразу, полученную из бактерий Thermus aquaticus YT1, свободную от нуклеаз, с удельной активностью 5 ед/мкл.
Материалом для изготовления положительного контрольного образца являются образцы плазмидной ДНК, полученные методом генной инженерии с использованием продуктов специфической амплификации участка генома детектируемых микроорганизмов. Амплифицированные фрагменты встраивают в плазмиды путем лигирования, полученные конструкции используют для трансформации E.coli. Культуру E.coli выращивают на селективных средах; плазмидную ДНК со встроенными фрагментами очищают с помощью набора для очистки плазмидной ДНК.
Реагенты и смеси реагентов помещают в пробирки и стрипованные пробирки (стрипы) из полипропилена, предназначенные для ПЦР, сертифицированные на отсутствие следовых количеств ДНК, ДНК-аз, РНК-аз и ингибиторов ПЦР. Пробирки должны быть изготовлены из высококачественного полипропилена.
Для запечатывания смесей для амплификации в пробирках и стрипах используют воск для ПЦР с температурой плавления 37°С.
Для количественной оценки результатов анализа используют ЭВМ с программным обеспечением, которое преобразует полученные для каждого выявляемого показателя значения порогового цикла Ct в количество копий на мл. Пересчет проводится на основе метода Пфаффла с поправкой на эффективность амплификации. Полученные значения (копий/мл) преобразуются в КОЕ/мл с учетом копийности гена, используемого для амплификации и являются окончательным результатом теста.
В один стрип с олигонуклеатидным праймером входит:
- олигонуклеотидный праймер, представляющий водный раствор полученных на ДНК-синтезаторе двух олигонуклеотидных праймеров, специфичных для генома исследуемых микроорганизмов. Концентрация каждого праймера в реакционной смеси - 4,0 пмоль/мкл;
- водный раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ); концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ;
- 10-кратный буферный раствор, содержащий 300 mM Трис-НС1, 166 mM аммония сульфат, 25 mM магния хлорид, рН 8,6.
- флуоресцентный зонд для специфического фрагмента. Содержат флуорофор FAM [485 нм (возбуждение), 520 нм (эмиссия)] или флуорофор HEX [530 нм (возбуждение), 556 нм (эмиссия)]. Концентрация каждого зонда в реакционной смеси - 0,5 пмоль/мкл;
- вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72).
Раствор Taq-полимеразы представляет собой 2 пробирки по 200 мкл [термостабильная ДНК-полимераза, полученная из бактерий Thermus aquaticus YT1, свободная от нуклеаз, в буферном растворе с рН 8.6, состоящем из 700 mМ Трис-НС1, 60% глицерина; 1 мМ дитиотрейтола; 166 mM аммония сульфата, 25 mM магния хлорида, удельная активность фермента - 1 ед/мкл.
Отрицательный контрольный образец 1 пробирка (150 мкл) - вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72). Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.
При осуществлении способа по заявляемому изобретению из биологического материала (кал человека) выделяется бактериальная ДНК с помощью набора реагентов, предназначенных для этих целей. На одно определение генетических маркеров заболевания для одного образца используется 6 пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и интеркалирующий краситель. Во все подготовленные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы.
В каждую пробирку, кроме пробирок с отрицательным контрольным образцом и положительным контрольным образцом, при постановке реакции амплификации добавляется образец бактериальной ДНК, выделенной из образца кала человека. Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно стандартным режимам. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации. Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору. В случае наличия в ДНК специфических маркеров, комплементарных праймерам, происходит наработка ПЦР-продукта и возрастание уровня флуоресценции. Интенсивность флуоресценции свидетельствует о количестве образующегося продукта. Для количественной оценки результатов анализа используют ЭВМ с программным обеспечением, которое преобразует полученные для каждого выявляемого показателя значения порогового цикла Ct в количество копий на мл. Пересчет проводится на основе метода Пфаффла с поправкой на эффективность амплификации. Выявляемое изменение титра 10^4 коп/мл.
Разработанный способ исследования микробиоты толстого кишечника и варианты наборов для его осуществления позволяют выявить присутствие патогенных микроорганизмов или значительное увеличение отдельных представителей микрофлоры кишечника, например, снижение содержания бифидобактерий и/или лактобацилл, изменение количества сапрофитной, грибов или условно-патогенной микрофлоры, изменение соотношения субпопуляций анаэробных бактерий, осуществляющих различные виды брожения (например, продуцентов бутирата и продуцентов пропионата).
Разработанный способ и набор для его осуществления, за счет комбинации показателей используемых праймеров позволяет диагностировать дисбактериозы кишечника, кандидомикозный сепсис, антибиотик-ассоциированную диарею, иммунодефицитные состояния, гастроэнтерит, энтерит, энтероколит, стафилококковый дисбактериоз, антибиотик-ассоциированный колит, псевдомембранозный колит, пищевые токсикоинфекции, некротический энтерит, неспецифический язвенный колит, острые кишечные инфекционные заболевания, гастрит, неопластические процессы в толстом кишечнике, канцерогенез, генерализованный тифопаратифозный инфекционный процесс, дизентерию, дисбиоз, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, диабеты 1-го и 2-го типа, цирроз печени, избыточный бактериальный рост, анаэробный дисбаланс, различные аутоиммунные патологии, синдром раздраженной толстой кишки, аллергию, патологии желчевыводящих путей, полипоз толстого кишечника, колоректальный рак.
Claims (126)
1. Способ исследования микробиоты толстого кишечника путём определения ДНК микроорганизмов кишечника методом полимеразной цепной реакции, включающий взаимодействие образца микробиоты с набором олигонуклеотидных праймеров, определение для каждого олигонуклеотида в указанном наборе праймеров количества его нуклеотидных последовательностей-мишеней, которые присутствуют в указанном образце, и получение профиля микробиоты из относительных количеств нуклеотидных последовательностей-мишеней, присутствующих в образце, отличающийся тем, что в качестве набора олигонуклеотидных праймеров используют набор праймеров со следующими олигонуклеотидами:
- Ca_its_F 5'CAGCGAAATGCGATACGTAATATG 3'
Ca_its_R 5'GTCTTTCAAGCAAACCCAAGTC 3'
Ca_its_Z 5' - FAM- CCTGTTTGAGCGTCGTTTCTCCCT - BHQ-1;
- SaAROE_F 5'AAAGGATTGCACAGCGTTTATC 3'
SaAROE_R 5'CGCAACAGTTAATTTGGGCTTTA 3'
SaAROE_z1 5' (R6G) TACCTTTACTTGCACCACCTGCGC (BHQ1);
- Kspp_F 5'GTTAACGCCCTGTCGCAGAAGC 3'
Kspp_R 5'TTC (G/A) T(A/G) GCTCGGCCAGAA(G/A) CGCAC 3';
- Clodif_F 5'TTGAGCGATTTACTTCGGTAAAGA 3'
Clodif_R 5'TGTACTGGCTCACCTTTGATATTCA 3'
Clo_Taqman 5' FAM CCACGCGTTACTCACCCGTCCG BHQ1 3';
- Fprau_F 5'CCATGAATTGCCTTCAAAACTGTT3'
Fprau_R 5'GAGCCTCAGCGTCAGTTGGT3'
Fprau_Z 6'FAM-AATTCCCGGTGTAGCGGTGGAA-BHQ-1;
- Bac_frag_F 5'CGGAGGATCCGAGCGTTA 3'
Bac_frag_R 5'CCGCAAACTTTCACAACTGACTTA3'
Bac_frag_Z 6'FAM-CGCTCCCTTTAAACCCAATAAATCCGG-BHQ-1;
- eaeRT_F 5'CAGGCTGATGTATGAGCAGTAT 3'
eaeRT_R 5'TGCTGAGACCACGGTTTATC 3'
eae_z 5'FAM-TATAGTTTACACCAACGGTCGCCGC-BHQ-1;
- Bif_F 5'GCGTGCTTAACACATGCAAGTC3'
Bif_R 5'CACCCGTTTCCAGGAGCTATT3'
Bif_Z 6'FAM-TCACGCATTACTCACCCGTTCGCC-BHQ-1;
- Lacto_1 5'TCGGCTATCACTTCTGGATGGA3'
Lacto_2 5'CCATTGTGGAAGATTCCCTACTGC3'
Lacto_Z 6'FAM-ATCGGCCACATTGGGACTGAGAC-BHQ-1;
- Tot_F 5'TCCTACGGGAGGCAGCAGT3'
Tot_R 5'GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT3'
Tot_Z 6'FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-BHQ-1;
- AkkM_F 5' CAGCACGTGAAGGTGGGGAC 3'
AkkM_R 5'CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT 3'
AkkM_Z 5' - R6G-TGCACACGTACTACAATGCCCAGT-BHQ-2 - 3';
- Cloper_F 5' AGGTGCTCAAAACATGCACT 3'
Cloper_R 5' TGTGCGAAAGCAGCTTTA AC 3'
Cloper_Z 5' HEX-AGCATTCACTGGAGAAATCGC -BHQ 3';
- KlPn_F 5'AATAACACCGAGCAGGAGGTT3'
KlPn_R 5' 5'CAATGGCCGAATAAATAAGCA3'
Klpn_Tagman 6'FAM-CGCTCAATCCAGGCTATGCCG BHQ-1;
- KlPn_F 5'AATAACACCGAGCAGGAGGTT3'
KlPn_R 5' 5’CAATGGCCGAATAAATAAGCA3'
KLox_Z 5'R6G-TTAGTCGTTGGCGAGGCAAACA-BHQ2;
- eaeRT_F 5'CAGGCTGATGTATGAGCAGTAT 3'
eaeRT_R 5'TGCTGAGACCACGGTTTATC 3'
eae_z 5'FAM-TATAGTTTACACCAACGGTCGCCGC-BHQ-1;
- Ent3_F 5′ GGGGCGTGGTCAAATATAAAyCT 3'
Ent3_R 5′CCTGACGGACTTCACACTTGTAA 3'
Ent3_Z 5′ R6G - AGGCCGAGCACCCCTGGCGATGTAA - BHQ1 3';
- ProCh_F 5'GTGAAGGCGATCGTACCACTCCT 3'
ProCh_R 5'GCGTCTTCGAAACGACGACCG A 3'
ProCh_Z 5' FAM- CACAGCCTGACGTTTTGCCGG- BHQ 3';
- FusNuc_F 5' TTGTAAGTGCTGGTAAAGGGATTG 3'
FusNuc_R 5' CATTCCTACATAACGGTCAAGAGTA 3'
FusNuc_Z 5'FAM-AGCTTCTATTGGTTCTTCTCGTCCAGTGGC-BHQ1;
- ParMi_F 5' AAGAATGGAGAGAGTTGTTAGAGAAAGAA 3'
ParMi_R 5'TTGTGATAATTGTGAAGAACCGAAGA 3'
ParMi_Z (R6G)AACTCAAGATCCAGACCTTGCTACGCCTCA(BHQ1);
- Sal_1 5'GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA 3'
Sal_2 5'TCATCGCACCGTCAAAGGAACC 3'
Salm_Z 5'FAM-CTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGT-BHQ 3';
- Sh_F 5'CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACATC 3'
Sh_R 5'TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC 3'
Shig_Z 5'VIC-CTCGTTGTTCAGGCATGAAATTAAGCC-BHQ2.
2. Набор для проведения способа по п. 1, включающий стрипы со смесями олигонуклеатидных праймеров для амплификации, запечатанные воском, раствор Taq-полимеразы, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, минеральное масло, отличающийся тем, что в качестве смесей праймеров используют следующие олигонуклеотиды:
- Ca_its_F 5'CAGCGAAATGCGATACGTAATATG 3'
Ca_its_R 5’GTCTTTCAAGCAAACCCAAGTC 3'
Ca_its_Z 5' - FAM- CCTGTTTGAGCGTCGTTTCTCCCT - BHQ-1;
- SaAROE_F 5'AAAGGATTGCACAGCGTTTATC 3'
SaAROE_R 5'CGCAACAGTTAATTTGGGCTTTA 3'
SaAROE_z1 5' (R6G) TACCTTTACTTGCACCACCTGCGC (BHQ1);
- Kspp_F 5'GTTAACGCCCTGTCGCAGAAGC 3'
Kspp_R 5'TTC(G/A) T(A/G) GCTCGGCCAGAA(G/A) CGCAC 3';
- Clodif_F 5'TTGAGCGATTTACTTCGGTAAAGA 3'
Clodif_R 5'TGTACTGGCTCACCTTTGATATTCA 3'
Clo_Taqman 5' FAM CCACGCGTTACTCACCCGTCCG BHQ1 3';
- Fprau_F 5'CCATGAATTGCCTTCAAAACTGTT3'
Fprau_R 5'GAGCCTCAGCGTCAGTTGGT3'
Fprau_Z 6'FAM-AATTCCCGGTGTAGCGGTGGAA-BHQ-1;
- Bac_frag_F 5'CGGAGGATCCGAGCGTTA 3'
Bac_frag_R 5'CCGCAAACTTTCACAACTGACTTA 3'
Bac_frag_Z 6'FAM-CGCTCCCTTTAAACCCAATAAATCCGG-BHQ-1;
- eaeRT_F 5'CAGGCTGATGTATGAGCAGTAT 3'
eaeRT_R 5'TGCTGAGACCACGGTTTATC 3'
eae_z 5'FAM-TATAGTTTACACCAACGGTCGCCGC-BHQ-1;
- Bif_F 5'GCGTGCTTAACACATGCAAGTC3'
Bif_R 5'CACCCGTTTCCAGGAGCTATT3'
Bif_Z 6'FAM-TCACGCATTACTCACCCGTTCGCC-BHQ-1;
- Lacto_1 5'TCGGCTATCACTTCTGGATGGA3'
Lacto_2 5'CCATTGTGGAAGATTCCCTACTGC3'
Lacto_Z 6'FAM-ATCGGCCACATTGGGACTGAGAC-BHQ-1;
- Tot_F 5'TCCTACGGGAGGCAGCAGT3'
Tot_R 5'GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT3'
Tot_Z 6'FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-BHQ-1;
- AkkM_F 5' CAGCACGTGAAGGTGGGGAC 3'
AkkM_R 5'CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT 3'
AkkM_Z 5' - R6G-TGCACACGTACTACAATGCCCAGT-BHQ-2 - 3';
- Cloper_F 5'AGGTGCTCAAAACATGCACT3'
Cloper_R 5'TGTGCGAAAGCAGCTTTAAC3'
Cloper_Z 5' HEX-AGCATTCACTGGAGAAATCGC -BHQ 3';
- KlPn_F 5'AATAACACCGAGCAGGAGGTT3'
KlPn_R 5' 5'CAATGGCCGAATAAATAAGCA3'
Klpn_Tagman 6'FAM-CGCTCAATCCAGGCTATGCCG BHQ-1;
- KlPn_F 5'AATAACACCGAGCAGGAGGTT3'
KlPn_R 5'CAATGGCCGAATAAATAAGCA3'
KLox_Z 5'R6G-TTAGTCGTTGGCGAGGCAAACA-BHQ2;
- eaeRT_F 5'CAGGCTGATGTATGAGCAGTAT 3'
eaeRT_R 5'TGCTGAGACCACGGTTTATC 3'
eae_z 5'FAM-TATAGTTTACACCAACGGTCGCCGC-BHQ-1;
- Ent3_F 5' GGGGCGTGGTCAAATATAAAyCT 3'
Ent3_R 5'CCTGACGGACTTCACACTTGTAA3'
Ent3_Z 5' R6G - AGGCCGAGCACCCCTGGCGATGTAA - BHQ1 3';
- ProCh_F 5'GTGAAGGCGATCGTACCACTCCT3'
ProCh_R 5'GCGTCTTCGAAACGACGA CCG A 3'
ProCh_Z 5' FAM-CACAGCCTGACGTTTTGCCGG-BHQ 3';
- FusNuc_F 5' TTGTAAGTGCTGGTAAAGGGATTG 3'
FusNuc_R 5' CATTCCTACATAACGGTCAAGAGTA 3'
FusNuc_Z 5' FAM AGCTTCTATTGGTTCTTCTCGTCCAGTGGC BHQ1;
- ParMi_F 5' AAGAATGGAGAGAGTTGTTAGAGAAAGAA 3'
ParMi_R 5'TTGTGATAATTGTGAAGAACCGAAGA 3'
ParMi_Z (R6G)AACTCAAGATCCAGACCTTGCTACGCCTCA(BHQ1);
- Sal_1 5'GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA 3'
Sal_2 5'TCATCGCACCGTCAAAGGAACC 3'
Salm_Z 5'FAM-CTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGT-BHQ 3';
- Sh_F 5'CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACATC 3'
Sh_R 5'TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC 3'
Shig_Z 5'VIC-CTCGTTGTTCAGGCATGAAATTAAGCC-BHQ2.
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020140132A Division RU2782316C2 (ru) | 2020-12-07 | Способ исследования микробиоты толстого кишечника методом полимеразной цепной реакции с флуорисцентной детекцией в режиме реального времени и набор реагентов для его осуществления |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2781855C1 true RU2781855C1 (ru) | 2022-10-19 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007056680A2 (en) * | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Forsyth Dental Infirmary For Children | Methods and arrays for identifying human microflora |
| WO2014138999A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | University Of Ottawa | Methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease |
| RU2728241C1 (ru) * | 2019-12-06 | 2020-07-28 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ оценки эффективности трансплантации фекальной микробиоты у пациентов с иммунной реакцией после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007056680A2 (en) * | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Forsyth Dental Infirmary For Children | Methods and arrays for identifying human microflora |
| WO2014138999A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | University Of Ottawa | Methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease |
| RU2728241C1 (ru) * | 2019-12-06 | 2020-07-28 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ оценки эффективности трансплантации фекальной микробиоты у пациентов с иммунной реакцией после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Goloshchapov OV, Bakin EA, Kucher MA et al. Bacteroides fragilis is a potential marker of effective microbiota transplantation in acute graft-versus-host disease treatment. Cell Ther Transplant 2020; 9(2): 47-59. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Barken et al. | Advances in nucleic acid-based diagnostics of bacterial infections | |
| Chow et al. | Application of isothermal helicase-dependent amplification with a disposable detection device in a simple sensitive stool test for toxigenic Clostridium difficile | |
| CN106399517B (zh) | 一种多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感的核酸检测技术 | |
| AU3338999A (en) | Nucleic acid detection method | |
| CN102918155B (zh) | 沙眼衣原体检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的沙眼衣原体的检测方法 | |
| CN112592964A (zh) | 用于进行核酸多重检测的方法 | |
| CN113201594A (zh) | 一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法 | |
| WO2005075673A2 (en) | Detection, identification and differentiation of proteus species using the spacer region | |
| Jannes et al. | A review of current and future molecular diagnostic tests for use in the microbiology laboratory | |
| CN109777861A (zh) | 错配耐受的环介导等温扩增方法及应用 | |
| Mianzhi et al. | Contemporary nucleic acid-based molecular techniques for detection, identification, and characterization of Bifidobacterium | |
| Woron et al. | Development and evaluation of a 4-target multiplex real-time polymerase chain reaction assay for the detection and characterization of Yersinia pestis | |
| US20100112563A1 (en) | Multiplex analysis of nucleic acids | |
| RU2781855C1 (ru) | Способ исследования микробиоты толстого кишечника методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени и набор реагентов для его осуществления | |
| Rintamäki et al. | Detection of Streptococcus pneumoniae DNA by using polymerase chain reaction and microwell hybridization with Europium-labelled probes | |
| RU2782316C2 (ru) | Способ исследования микробиоты толстого кишечника методом полимеразной цепной реакции с флуорисцентной детекцией в режиме реального времени и набор реагентов для его осуществления | |
| Galluzzi et al. | Current molecular techniques for the detection of microbial pathogens | |
| JP2003174900A (ja) | ピロリン酸と核酸の定量方法およびその装置 | |
| Thies | Molecular methods for studying soil ecology | |
| JP2009504173A (ja) | 分析方法及びキット | |
| US20090311677A1 (en) | Identification of contaminating bacteria in industrial ethanol fermentations | |
| CN1973052B (zh) | 检测和区分病原性大肠杆菌的dna序列 | |
| EP0517361A1 (en) | A method for detecting and identifying pathogenic organisms using target sequences as detectors | |
| Wang et al. | A CRISPR-Cas12a-based platform facilitates the detection and serotyping of Streptococcus suis serotype 2 | |
| FI126289B (en) | Method for detecting the presence of a hypervirulent Clostridium difficile strain |