JP2010119351A - シャコ検出用プライマーセット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物から構成されるシャコ検出用プライマーセット。試料より抽出したDNAを鋳型としプライマーセットを用いてPCRを行い、標的サイズの増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とする、シャコの検出方法。プライマーセットを用いた場合の標的サイズが95bp〜96bpであることを特徴とするシャコの検出方法。
【選択図】なし
Description
(1) 以下の(a)のオリゴヌクレオチドと、(b)のオリゴヌクレオチドとから構成される、シャコ検出用プライマーセット。
(a) 配列番号1、2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物
(b) 配列番号3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物又は配列番号5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(2) 試料より抽出したDNAを鋳型とし、(1)に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、標的サイズの増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とする、シャコの検出方法。
(3) 配列番号1、2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物と配列番号3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物から構成されるプライマーセットを用いた場合の標的サイズが95bp〜96bpであることを特徴とする、(2)に記載のシャコの検出方法。
(4) 配列番号1、2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物と配列番号5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いた場合の標的サイズが195bp〜198bpであることを特徴とする、(2)に記載のシャコの検出方法。
(5) (1)に記載のプライマーセットを含む、シャコ検出用キット。
TTGTATGAATGGTCGGACAAGAT(配列番号1)
TTGTATGAATGGTCCGACAAGAT(配列番号2)
ATCGTCCCTCCATATCATTTAAGCTTTTTT(配列番号3)
ATCGTCCCTCCATATTATTTAAGCTTTTTT(配列番号4)
ATATACTTTTACCGCCCCAGT(配列番号5)
(実施例1)シャコ検出用プライマーの合成
(1) 16S rRNA遺伝子領域の配列収集及びアラインメント
カニ(352配列)、エビ{根鰓亜目(69配列)、コエビ下目(201配列)、ザリガニ下目(221配列)、イセエビ下目(52配列)}、オキアミ(19配列)、アミ(18配列)、シャコ(15配列)について16S rRNAの遺伝子の塩基配列情報を取得した。塩基配列情報は、GenBankに登録された種についてはデータベースから取得し、購入した種についてはシークエンスにより16S rRNAの遺伝子の塩基配列を決定した。これらの塩基配列情報を元に、解析ソフトCLUSTAL X(1.8)、FROG-Win、SEQ-09を用い、同領域の配列をアラインメントし、比較した。
アラインメント処理した配列をもとに、シャコ特異的な塩基を選別した。次に、選別した塩基の前後の塩基配列の相同性から、プライマー設計に適している領域を選択した。これら領域からシャコ特異性の高いプライマーを下記の基準で設計した。
<設計基準>
(a) フォワード、リバース両プライマーの3’末塩基はともにシャコのDNA配列の塩基と一致すること。
(b) フォワード、リバース両プライマーはシャコDNA配列に結合・伸長し、少なくともどちらか一方はシャコ以外の種のDNA配列に結合・伸長しないこと。
(c) 加工品を対象とすることからPCR増幅産物は200bp以下であることが望ましい。
(d) プライマー長は20〜30baseの範囲とし、プライマーとシャコのDNA配列のTm値は50〜60℃間で設定すること。
(e) PCR シミュレーションにより、シャコに特異的な標的サイズのPCR産物の増殖が予測されること。
(f) プライマーはダイマーや立体構造を形成しないこと。
フォワードプライマー(F2):
F2-1:TTGTATGAATGGTCGGACAAGAT(配列番号1)
F2-2:TTGTATGAATGGTCCGACAAGAT(配列番号2)
リバースプライマー(R54):
R54-1:ATCGTCCCTCCATATCATTTAAGCTTTTTT(配列番号3)
R54-2:ATCGTCCCTCCATATTATTTAAGCTTTTTT(配列番号4)
リバースプライマー(R188):
R188:ATATACTTTTACCGCCCCAGT(配列番号5)
上記のフォワード、リバースの各プライマー個々についてBlast配列検索を行った。無脊椎動物及び無脊椎動物以外の生物を対象にプライマーと類似配列を持つ上位100位までの配列について種を確認した。その結果、無脊椎動物以外の生物の中では、フォワード、リバース両プライマーと類似性の高い配列を有する種はなかった。無脊椎動物を対象とした場合、ザリガニ由来の2配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと類似性の高い配列としてヒットしたが、3’末塩基は一致しておらず、フォワード、リバース両プライマーともに、シャコ以外のDNA配列からはPCR増幅が起きる可能性の低いと予想された。
フォワードプライマー2種(F2-1:配列番号1, F2-2:配列番号2)とリバースプライマー3種(R54-1:配列番号3, R54-2:配列番号4, R188:配列番号5)の全ての組み合わせを用いて、Amplify simulator によるPCR シュミレーションを行ったところ、検討したシャコの16S rRNA 遺伝子15配列中14配列から標的産物の増幅が予想された(表1)。増幅の予想されなかった1配列(AY947836:Seudosquilla ciliata)については、配列番号1、2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの3’側に相当する箇所に1塩基挿入が存在し、不検出と予想されたが、その他のシャコ及び他の近縁の甲殻類では、この1塩基挿入が確認されなかったため、上記1塩基挿入はシークエンスミスの可能性が高いと判断した。
評価:増幅産物が得られる可能性の6段階評価(最大6、最小1)、「-」は増幅産物が得られないものを示す。
予想増幅産物長(bp):フォワードプライマーとリバースプライマーを含む増幅領域の塩基数を示す。
甲殻類、頭足類、魚介類、棘皮類(ウニ、ナマコ)などに属する種の16S rRNA 遺伝子配列を対象にして、各プライマーの3’末塩基が一致するかどうかを確認し、一致した種についてはPCR シミュレーションによって、標的サイズの増幅産物が得られるかどうかの予測を行なった。
カニ(352配列)、エビ[根鰓亜目(69配列)、コエビ下目(201配列)、ザリガニ下目(221配列)、イセエビ下目(52配列)]、オキアミ(19配列)、アミ(18配列)、シャコ(15配列)のうち、プライマーの3’末塩基との一致を確認した結果、フォワードプライマーはタラバガニ、アミと一致し、リバースプライマーはフォワードプライマーで一致したものとは別の種のアミ、オキアミと一致した。次にPCR シミュレーションによって標的サイズの増幅産物が得られるかどうかをこれらの種個々について予測した結果、プライマー配列との相同性が低いこと、及びフォワード、リバースプライマーどちらか一方の3’末塩基は一致しないことから、それら配列から標的サイズの増幅産物は得られないと予想された。
アミの近縁種であるヨコエビ目、ワラジムシ目及びアゴアシ網、コノハエビ亜網、ミジンコ網、ムカシエビ上目、ムカデエビ綱、カイムシ綱、カシラエビ網などの微小な甲殻類(142配列)のうち、フォワード、リバース両プライマーともに3’末塩基が一致したものについてPCR シミュレーションを実施した結果、2配列で「W2」となり、僅かながら増幅産物が得られる可能性があった。しかし、プライマーと類似配列とのTm値を算出した結果、30℃以下と低かったことから、本PCR増幅反応のアニーリング温度54℃または58℃では、プライマーの結合及び伸長反応は起きないと予想され、増幅産物は得られないと判断した。
ヤドカリなどの種で、フォワード、リバース両プライマーともに3’末塩基との一致が確認されたが、フォワードプライマーと類似配列との相同性は低く、増幅産物は得られないと予想された。その他の動物種では、配列番号1、2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと3’末塩基が一致せず、増幅産物は得られないと予想された。
(1) PCRテンプレートDNAの抽出
[サンプル]
(i) シャコ
(ii) エビ(14種類)
根鰓亜目:クルマエビ、アカエビ、ブラックタイガー、シバエビ、サクラエビ
コエビ下目:シマエビ、アマエビ、ボタンエビ
ザリガニ下目:アメリカザリガニ、オマールエビ、スキャンピー
イセエビ下目:イセエビ、ウチワエビ、キューバロブスター
(iii) カニ(13種類)
短尾下目:ズワイガニ、ベニズワイガニ、タカアシガニ、ケガニ、ダンジネスクラブ、マルズワイガニ、ワタリガニ、シャンハイガニ、アサヒガニ
異尾下目・タラバガニ科:タラバガニ、アブラガニ、ハナサキガニ、イバラガニ
(iv) その他の甲殻類(2種類)
オキアミ、アミ
(v) 頭足類(4種類)
マダコ、アカイカ、ヤリイカ、スルメイカ
(vi) 貝類(5種類)
アサリ、ハマグリ、ホタテ、サザエ、アワビ
(vii) 魚類(7種類)
ブリ、サケ、タラ、サバ、カツオ、マグロ、アジ
上記の各サンプルを水洗いした後、身(可食部)を0.1g秤量し、15mlチューブに入れ、Buffer G2(QIAGEN社製)2ml、Proteinase K(QIAGEN社製)100μl、100mg/ml RNaseA(QIAGEN社製)4μlを加え、混合し、50℃で2時間保温した(途中数回攪拌を行った)。 次に、遠心分離 (3500×g,15分間)を2回行い、上清を回収した。Buffer QBT 1mlで平衡化したGenomic Tip 20/Gカラム(QIAGEN社製)を15mlチューブにセットし、上清全量をアプライした。Buffer QC(QIAGEN社製)3mlでカラムを洗浄後、50℃に加温しておいたBuffer QF(QIAGEN社製)1mlでDNAを溶出し、イソプロパノール沈殿処理を行い、TE溶液50μlに溶解した。抽出したDNAはND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies,Inc)でスペクトルを測定し、DNA濃度、純度を算出した。
上記のようにしてサンプルから抽出したDNAをTE(pH8.0)で20ng/μlに希釈して得られたDNA溶液、および、同DNA溶液を20ng/μlサケ精子DNA含有TE (pH 8.0)緩衝液で段階希釈し調製したDNA溶液2.5μlをPCRのテンプレートとし、本発明のシャコ検出用プライマーセット(配列番号1、2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物と配列番号3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物から構成されるプライマーセット、および配列番号1、2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物と配列番号5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いてPCRを行い、特異性及び感度について検討を行なった。なお、配列番号1と2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマーについては、3’末端から9塩基目をG/Cの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。配列番号3と4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマーについても同様に3’末端から15塩基目をC/Tの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。
Claims (5)
- 以下の(a)のオリゴヌクレオチドと、(b)のオリゴヌクレオチドとから構成される、シャコ検出用プライマーセット。
(a) 配列番号1、2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物
(b) 配列番号3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物又は配列番号5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド - 試料より抽出したDNAを鋳型とし、請求項1に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、標的サイズの増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とする、シャコの検出方法。
- 配列番号1、2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物と配列番号3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物から構成されるプライマーセットを用いた場合の標的サイズが95bp〜96bpであることを特徴とする、請求項2記載のシャコの検出方法。
- 配列番号1、2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物と配列番号5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いた場合の標的サイズが195bp〜198bpであることを特徴とする、請求項2記載のシャコの検出方法。
- 請求項1に記載のプライマーセットを含む、シャコ検出用キット。
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CN111440882A (zh) * | 2020-06-02 | 2020-07-24 | 上海海洋大学 | 环境dna检测鉴定北太平洋海域柔鱼物种的pcr扩增引物及其检测方法和应用 |
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---|---|---|---|---|
JP2006280281A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | Nissin Food Prod Co Ltd | プライマー及び特定動物の検出方法 |
JP2008000128A (ja) * | 2006-01-12 | 2008-01-10 | House Foods Corp | エビ検出用プライマーセット |
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JPN6013039177; 田口大夢他4名: '"PCRを用いた食品中のエビおよびカニの識別検出法"' 日本食品衛生学会第95回学術講演会講演要旨集、2008年4月、60頁 * |
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