JP5615594B2 - アキアミ検出用プライマーセット - Google Patents
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Description
(1) 以下の(a)のオリゴヌクレオチドと、(b)のオリゴヌクレオチドとから構成される、アキアミ検出用プライマーセット。
(a) 配列番号1に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b) 配列番号2、3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物
(2) 試料より抽出したDNAを鋳型とし、(1)に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、標的サイズの増幅産物の有無を検出することを特徴とする、アキアミの検出方法。
(3) 前記増幅産物のサイズが82bpであることを特徴とする、(2)に記載のアキアミの検出方法。
(4) (1)に記載のプライマーセットを含む、アキアミ検出用キット。
AK-3:5'-ggttgtacaaaaagaaagctgtctca-3'(配列番号1)
ZA-R173:5'-gtccctctagaacatttaagccttttc-3'(配列番号2)
ZA-R173-N1:5'-gtccctttatactatttaagccttttc-3'(配列番号3)
ZA-R173-N2:5'-gtccccccaaattatttaagccttttc-3'(配列番号4)
(1) 16S rRNA遺伝子領域の配列収集とアラインメント
16S rRNA遺伝子の塩基配列として、GenBankに登録されたデータベースから、カニ(352配列)については各属から最低1配列を収集し、オキアミ(19配列)、アミ(18配列)、シャコ(15配列)については目以下の全ての配列を収集した。その他微少な甲殻類(164配列)については、目以下で代表1種の配列を収集した。アキアミについては16S rRNA遺伝子の塩基配列がGenBankに登録されていないため、今回新たに市場から5サンプルを入手し、16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した。これらの塩基配列情報をもとに、解析ソフトCLUSTAL X(1.8)、FROG-Win、SEQ-09を用いてアラインメントし、比較した。
16S rRNA 遺伝子領域は分子系統分類学に利用されており、さらに甲殻類で報告されている配列数が最も多いため、アキアミに特異的なフォワードプライマーの設計候補も多いと予想される。また、オキアミ、アミ、シャコを検出しないためには、特開2008-000128号公報に記載のエビ検出用プライマーセットの下記のリバースプライマー(配列番号2,3,4の等量混合物)を用いる必要がある。
ZA-R173:5'-gtccctctagaacatttaagccttttc-3'(配列番号2)
ZA-R173-N1:5'-gtccctttatactatttaagccttttc-3'(配列番号3)
ZA-R173-N2:5'-gtccccccaaattatttaagccttttc-3'(配列番号4)
(a) 加工品を測定することから、PCR増幅産物は200bp以下であること。
(b) プライマーの3’側塩基とテンプレートDNA配列との相同性は高いこと。
(c) プライマー長は20〜30baseの範囲とし、プライマーとアキアミのDNA配列のTm値は50〜60℃付近であること。
(d) プライマーはダイマーや立体構造を形成しないこと
その結果、下記の3種のプライマー(AK-1、AK-2、AK-3)をアキアミ検出用フォワードプライマー候補として設計した。
AK-1:5'-tctgcctgtttatcaaaaacatctctt-3'(配列番号5)
AK-2:5'-ctctttatgattatagttatataaagtata-3'(配列番号6)
AK-3:5'-ggttgtacaaaaagaaagctgtctca-3'(配列番号1)
上記のフォワードプライマー候補とリバースプライマーからなる3組のプライマーセット(配列番号5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号2、3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物から構成されるプライマーセット;配列番号6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号2、3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物から構成されるプライマーセット;配列番号1に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号2、3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物から構成されるプライマーセット)を用いてAmplify simulatorによるPCRシミュレーションを行い、アキアミ特異的な増幅産物が得られるかどうかを確認した。
カニ(352配列)、オキアミ(19配列)、アミ(18配列)、シャコ(15配列)のうち、カニ5配列で増幅する可能性が予想されたが、配列数が少なく、また小型のカニであった。
アミの近縁種であるヨコエビ目、ワラジムシ目及びアゴアシ網、コノハエビ亜網、ミジンコ網、ムカシエビ上目、ムカデエビ綱、カイムシ綱、カシラエビ網などの微小な甲殻類(142配列)のうち、フォワード、リバース両プライマーともに3’末塩基が一致したものについてPCR シミュレーションを実施した結果、ミジンコ網とムカシエビ上目それぞれの数配列で増幅する可能性が予想された。
Paguroidea(ヤドカリ上科) とThalassinidea(アナジャコ上科)の種で増幅する可能性が予想された。ただし、フォワードプライマー配列26塩基中、7塩基で不一致が確認された。
貝類(17配列)、頭足類(6配列)、魚類(46配列)、棘皮類(31配列)、畜肉家禽類(3配列)のうち、貝類の3配列では、3'末塩基と一致したが、フォワードプライマーの内部配列との相同性が低く、増幅産物は得られないと予想された。その他の配列では、フォワードプライマーの3'末塩基と一致しなかった。
(1) PCRテンプレートDNAの抽出
[サンプル]
アキアミ(3種類):瀬戸内産、台湾産、中国産
カニ(13種類):アサヒガニ、ズワイガニ、ベニズワイガニ、タカアシガニ、ケガニ、ダンジネスクラブ、マルズワイガニ、ワタリガニ、シャンハイガニ、タラバガニ、アブラガニ、ハナサキガニ、イバラガニ
その他の甲殻類(3種類):ツノナシオキアミ、イサザアミ、シャコ
魚類(7種類):ブリ、サケ、タラ、サバ、カツオ、マグロ、アジ
貝類(14種類):アサリ、ハマグリ、ホタテ、サザエ、アワビ、アカガイ、マテガイ、ホッキガイ、マガキ、ホンミルガイ、ツブガイ、ヒラガイ、アオヤギ、シジミガイ
頭足類(7種類):マダコ、アカイカ、ヤリイカ、スルメイカ、イイダコ、コウイカ、スミイカ
棘皮類(1種類):ナマコ
畜肉家禽類(3種類):ウシ、ブタ、トリ
上記の各サンプルを水洗いした後、身(可食部)を0.1g秤量し、15mlチューブに入れ、Buffer G2(QIAGEN社製)2ml、Proteinase K(QIAGEN社製)100μl、100mg/ml RNase A(QIAGEN社製)4μlを加え、混合し、50℃で2時間保温した(途中数回攪拌を行った)。 次に、遠心分離 (4200rpm,15分間)を2回行い、上清を回収した。Buffer QBT 1mlで平衡化したGenomic Tip 20/Gカラム(QIAGEN社製)を15mlチューブにセットし、上清全量をアプライした。Buffer QC(QIAGEN社製)3mlでカラムを洗浄後、50℃に加温しておいたBuffer QF(QIAGEN社製)1mlでDNAを溶出し、イソプロパノール沈殿処理を行い、TE(pH8.0)溶液または滅菌超純水50μlに溶解した。抽出したDNAはND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies,Inc)でスペクトルを測定し、DNA濃度、純度を算出した。
上記のようにして抽出したDNAはTE (pH 8.0)または滅菌水で希釈し、20ng/μlに調製した。アキアミは2pg/μl DNA溶液を使用し、その他のサンプルは20ng/μl DNA溶液をそのまま使用した。2pg/μl DNA溶液は、20ng/μlサケ精子DNA含有TE (pH 8.0) 緩衝液で段階希釈して調製した。これらのDNA溶液をテンプレートとし、前記フォワードプライマー候補をそれぞれ含む3組のプライマーセット(配列番号5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号2、3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物から構成されるプライマーセット;配列番号6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号2、3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物から構成されるプライマーセット;配列番号1に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号2、3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物から構成されるプライマーセット)を用いてPCRを行った。
実施例2と同じサンプルから抽出したDNA溶液をテンプレートとし、AK-3フォワードプライマーを用いたプライマーセット(配列番号1に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号2、3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物から構成されるプライマーセット)を用い、実施例2と同じ反応条件にてPCRを行い、特異性および感度の評価を行った。
Claims (4)
- 以下の(a)のオリゴヌクレオチドと、(b)のオリゴヌクレオチドとから構成される、アキアミ検出用プライマーセット。
(a) 配列番号1に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b) 配列番号2、3、4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物 - 試料より抽出したDNAを鋳型とし、請求項1に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、標的サイズの増幅産物の有無を検出することを特徴とする、アキアミの検出方法。
- 前記増幅産物のサイズが82bpであることを特徴とする、請求項2に記載のアキアミの検出方法。
- 請求項1に記載のプライマーセットを含む、アキアミ検出用キット。
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JP2010121606A JP5615594B2 (ja) | 2010-05-27 | 2010-05-27 | アキアミ検出用プライマーセット |
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