CN105002170B - 施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其应用 - Google Patents
施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105002170B CN105002170B CN201510460443.3A CN201510460443A CN105002170B CN 105002170 B CN105002170 B CN 105002170B CN 201510460443 A CN201510460443 A CN 201510460443A CN 105002170 B CN105002170 B CN 105002170B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sturgeon
- identification
- amur sturgeon
- amur
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明提供了一种施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其使用方法。该试剂盒包含fzd基因片段特异性引物。利用该试剂盒PCR扩增后获得的fzd8基因片段在施氏鲟与其它鲟鱼之间存在的种间序列差异，经序列比对直接鉴定出施氏鲟或其产品。用本发明的试剂盒鉴定施氏鲟或其产品，具有实验准确，鉴定可靠快捷，操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类种质的鉴定，具体涉及一种施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其应用。
背景技术
鲟形目鱼类是地球现存最古老的鱼类之一，有“活化石”之称。施氏鲟 （Acipenserdabryanus） 属鲟形目、鲟科、鲟属，俗名七粒浮子等，主要分布于黑龙江水系，自下游至上游额尔古纳河及石勒喀河等；多数分布于黑龙江中游和松花江下游，乌苏里江较少。由于过度捕捞和水体污染等原因，施氏鲟的资源量已经急剧减少。施氏鲟2010年被世界自然与资源保护联盟(International Union for Conservation of Nature and NaturalResources简称IUCN)红色名录列为极度濒危(Critically Endangered, CR)物种，具有很高的经济价值和科研价值。
目前对于鲟形目鱼类的鉴定主要采用形态学和分子生物学等方法，由于形态学不适用于鱼子酱等鲟鱼产品的鉴定，通常采用线粒体上的分子标记鉴定鲟鱼及其产品。如Boscari等（Boscari, E., et al., Species and hybrid identification of sturgeoncaviar: a new molecular approach to detect illegal trade.Molecular ecologyresources, 14(3): 489-498. May 2014 DOI: 10.1111/1755-0998.12203 ISSN 1755-098X）采用线粒体D-loop和S7对施氏鲟进行了鉴定，对施氏鲟的鉴定准确性不高，操作繁琐。因此，亟待开发出能够简便快速、准确检测施氏鲟与其他鲟鱼的分子鉴定技术，用于放流等种质鉴定，监管施氏鲟产品等。
中国专利申请号200510010346.0，名称为“一种鉴定史氏鲟、达氏鳇的技术”的发明专利，它是在施氏鲟、达氏鳇及其产品DNA检测中使用具有种属特异性的DNA分子标记AHN，AHN引物大小为10bp，碱基序列为cacccggatg。用此引物对施氏鲟、达氏鳇及其产品DNA进行PCR检测，施氏鲟可获得200bp电泳带，达氏鳇则无此带，达到对两种鱼及其产品进行鉴定、标识的目的。该专利方法仅能在一定程度上鉴定出施氏鲟，区分施氏鲟与达乌尔鳇，适用范围窄。因此，亟待开发出能够简便快速、准确检测施氏鲟与其他鲟鱼的分子鉴定技术，用于放流等种质鉴定和市场监管等。
发明内容
本发明为了鉴定施氏鲟及其产品，从分子生物学层面上将形态上不易区分的施氏鲟或其产品进行鉴定，提供了一种施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其使用方法。本发明在鲟科鱼类中筛选核基因片段作为分子标记，应用核基因片段SNP位点，成功鉴定了施氏鲟，同样适用于施氏鲟产品的鉴定。
SNP （single nucleotide polymorphism，SNP）是单个核酸差异的分子标记技术，在物种鉴定领域，方法是依据同一个目的基因序列在近缘物种间的单个碱基的差异，进而用于研究种群遗传变异和物种鉴定。
fzd8是卷曲蛋白基因片段，利用fzd8上含有的单核苷酸多态性（SNP）位点，用于施氏鲟的种质鉴定，具有实验准确快捷，操作简便，适用范围广等优点。
为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：
一方面，本发明涉及施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒，包括fzd8基因片段的特异性引物。进一步地，所述试剂盒还包含PCR试剂；优选地，所述PCR试剂为：2.5μL 含Mg2+的Taq酶10× buffer； 2.5 mM dNTPs 1 μL；25 pM上游引物0.5 μL；25 pM 下游引物0.5 μL；2.5 U μL-1 Taq DNA聚合酶 0.2 μL；19.8 μL超纯水。
使用时加入0.5μL待检测样本的DNA（约50 ng）。
另一方面，本发明涉及所述施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒在鉴定施氏鲟或其产品中的应用；优选地，所述应用是将施氏鲟或其产品从其他鲟鱼或其产品中鉴定出来；优选地，所述其他鲟鱼为达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟及达乌尔鳇的任意一种或者多种。
所述的施氏鲟产品或其他鲟鱼产品包括鱼子酱、熏制品、罐头、皮制品等。
本发明所述fzd8基因片段的特异性引物，其核苷酸序列为：
正向引物： 5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’ （SEQ ID NO:8）；
反向引物： 5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ （SEQ ID NO:9）。
利用本发明所述施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒鉴定施氏鲟种质的方法，包括如下步骤：
A、分别取各鲟科鱼类样本，提取基因组DNA；
B、分别以各鲟科鱼类的基因组DNA为模板，取施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒进行PCR扩增；
C、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并测序；
D、对鲟科鱼类样本的PCR产物测序结果分别进行序列比对，通过种间序列差异直接鉴定施氏鲟或其产品；
经序列比对后，扩增获得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位为C时，样本为施氏鲟或其产品；扩增获得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位为T时，样本为其他鲟鱼或其产品。
本发明所述的鲟科鱼类包括施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇中的任意一种或者多种。
所述的施氏鲟产品或其他鲟鱼产品包括鱼子酱、熏制品、罐头、皮制品等。
本发明所述扩增得到施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇的fzd8基因片段为707bp，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。
上述fzd8基因片段经序列比对后，确定fzd8基因片段的核苷酸序列的第299位点的碱基是C的样本来源于施氏鲟，其他鲟科鱼类样本来源的fzd8基因片段的第299位为T。即通过鉴定本发明所述特异性引物扩增出的fzd8基因片段中第299位的碱基是否为C，可鉴定施氏鲟或其产品。
本发明的有益效果表现为：
1、本发明采用核基因DNA序列作为分子标记，相较于线粒体基因，可以更准确快速地将形态上不易区分的施氏鲟或其产品鉴定出来。采用fzd8基因片段上SNP位点分析鉴定，具有实验准确，鉴定可靠快捷，操作简便等优点。
2、本发明在鲟科鱼类中筛选设计了fzd8基因片段作为分子标记，应用fzd8基因片段的SNP位点，能把施氏鲟或其产品从达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟及达乌尔鳇中鉴定出来。具有适用的待检测样本来源更广，准确性高，实验快捷，操作简便，结果准确可靠的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
本发明使用的主要仪器如下：
PCR仪：Bio-Rad iCycler和MJ100
离心机：Eppendorf Centrifuge 5415D
稳压稳流电泳仪：BIO-RAD power PAC 300
凝胶成像系统：Alphalmage Multimage Light Cabinet
电子天平、培养箱、蒸汽灭菌器、摇床以及一些常用的实验设备。
1 %的琼脂糖凝胶的制备方法：
用天平称取 0.3 g琼脂糖，倒入 30 ml的1×TAE缓冲液中，摇匀后置于微波炉中加热至完全溶解，取出待稍凉后（防止高温使EB挥发），加入EB 2μL。将制胶板（Bio-Rad公司）放置于水平位置，然后插入样品梳子。将之前配制的琼脂糖凝胶倒入制胶板内槽。冷却半小时待凝胶凝固后取出梳子，将凝胶放入电泳槽（Bio-Rad公司）内并加入1×TAE电泳缓冲液使其浸没凝胶。在点样板上点上1/5体积的点样缓冲液（溴酚蓝）。
实施例 1
施氏鲟种质分子标记鉴定方法，其特征在于：利用施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒PCR扩增后的fzd8基因片段在施氏鲟与达氏鲟之间存在的种间序列差异，经序列比对直接鉴定出施氏鲟。
所述试剂盒中包含的fzd8基因片段的特异性引物，其核苷酸序列为：
正向引物： 5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’ （SEQ ID NO:8）；
反向引物： 5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ （SEQ ID NO:9）。
实施例 2
施氏鲟种质分子标记鉴定方法，其特征在于：利用施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒PCR扩增后的fzd8基因片段在施氏鲟与达氏鲟和中华鲟之间存在的种间序列差异，经序列比对直接鉴定出施氏鲟。
所述试剂盒中包含的fzd8基因片段的特异性引物，其核苷酸序列为：
正向引物： 5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’ （SEQ ID NO:8）；
反向引物： 5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ （SEQ ID NO:9）。
实施例3
施氏鲟种质分子标记鉴定方法，其特征在于：利用施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒PCR扩增后的fzd8基因片段在施氏鲟与达氏鲟、中华鲟和俄罗斯鲟之间存在的种间序列差异，经序列比对直接鉴定出施氏鲟产品。
所述试剂盒中包含的fzd8基因片段的特异性引物，其核苷酸序列为：
正向引物： 5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’ （SEQ ID NO:8）；
反向引物： 5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ （SEQ ID NO:9）。
实施例4
施氏鲟种质分子标记鉴定方法，其特征在于：利用施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒PCR扩增后的fzd8基因片段在施氏鲟与达氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇之间存在的种间序列差异，经序列比对，得到707bp的fzd8基因序列，依据基因序列第299位点的碱基是C，鉴定为施氏鲟。
所述试剂盒中包含的fzd8基因片段的特异性引物，其核苷酸序列为：
正向引物： 5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’ （SEQ ID NO:8）；
反向引物： 5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ （SEQ ID NO:9）。
实施例5
施氏鲟种质分子标记鉴定方法，其特征在于：利用施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒PCR扩增后的fzd8基因片段在施氏鲟与达乌尔鳇之间存在的种间序列差异，经序列比对，得到707bp的fzd8基因序列，依据基因序列第299位点的碱基是C，鉴定为施氏鲟。
所述试剂盒中包含的fzd8基因片段的特异性引物，其核苷酸序列为：
正向引物： 5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’ （SEQ ID NO:8）；
反向引物： 5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ （SEQ ID NO:9）。
实施例6
施氏鲟种质分子标记鉴定方法，其特征在于：利用施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒PCR扩增后的fzd8基因片段在施氏鲟与达氏鲟、俄罗斯鲟和达乌尔鳇之间存在的种间序列差异，经序列比对，得到707bp的fzd8基因序列，依据基因序列第299位点的碱基是C，鉴定为施氏鲟产品。
所述试剂盒中包含的fzd8基因片段的特异性引物，其核苷酸序列为：
正向引物： 5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’ （SEQ ID NO:8）；
反向引物： 5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ （SEQ ID NO:9）。
实施例7
施氏鲟种质分子标记鉴定方法，以施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达氏鳇作为研究对象，包括以下步骤：
（Ⅰ）分别取施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇样本，提取基因组DNA。
然后用琼脂糖凝胶电泳检测模板DNA：
制备1 %的琼脂糖凝胶，并将2μL DNA溶液加入点样缓冲液并混匀上样电泳。100 V电压电泳25 min。电泳后根据紫外透射检测仪上电泳带的亮度来确定模板DNA的浓度，并相应稀释模板，使DNA模板的浓度最终约为100 ng / μL。
（Ⅱ）分别以施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇样本的基因组DNA为模板，利用施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒进行PCR扩增。
（1）施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒的PCR扩增
用施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒PCR扩增施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇的fzd8基因片段。fzd8引物参考西伯利亚鲟A. baerii的fzd8序列（GenBank号：AY333968），应用引物设计软件Primer 5.0设计：
fzd8-F（SEQID NO:8）（5’- TAACCACGACACACAGGATG-3’）和fzd8-R（SEQID NO:9）（5’- CTGAATAAAGACACGAACCC -3’），由Invitrogen公司合成。
fzd8-F和fzd8-R为扩增fzd8目的片段的引物对，其中的F代表上游引物（或正向引物），R代表下游引物（或反向引物）。下文引物的F/R与之相同。
反应体系为25μL，将各组分按以下顺序依次在0.2 mL的PCR管中混合：
(1)施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒混合液 24.5μL
(2)模板DNA（约50 ng） 0.5μL；
所述施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒混合液为：2.5μL Taq酶10× buffer （Mg2 +）；1 μL dNTPs（2.5 mM）；0.5μL上游引物（25 pM）；0.5μL下游引物（25 pM）；0.2μL Taq DNA聚合酶（2.5 U μL-1）；19.8μL超纯水。
扩增步骤为：
(1)94 ℃预变性 4 min
(2)94 ℃变性 45s
(3)58 ℃退火 40 s
(4)72 ℃延伸 1 min
(5)重复步骤(2)-(4)34次
(6)72 ℃充分延伸 10min。
（2）PCR产物检测与测序
用1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，取检测良好的样本送Invitrogen公司测序。
测序验证其序列信息，发现施氏鲟的fzd8基因片段与其他种类的鲟形目鱼类的fzd8序列存在差异，进行后期鉴定实验。
（Ⅲ）数据分析
采用MEGA 5.0 对鲟鱼样本的fzd8的测序结果分别进行比对和对齐，得到707bp的fzd8序列，施氏鲟在fzd8基因片段的第299位碱基为C，而达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇fzd8基因片段在该位点为T。
上述实验结果显示：本发明的施氏鲟的fzd8基因片段序列及SNP标记在GenBank中都未见报道。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 四川大学
<120> 施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 707
<212> DNA
<213> 施氏鲟（Acipenser schrenckii）
<400> 1
gttttggttg ccaacgtagc agatcccagc caccttgtca ccgtccacag aactgagtgc 60
cagtacagcg atagatttga tgctcgggat cagccaagct gccaggtgga aatactgaga 120
ataacttgct atggcctcgt tgccccattt cattcccgca gccaagaacc aagtgaggga 180
cagtataacc caccagatgg agctggccat gccaaagaag taaatcaaga gaaacacaac 240
agtgcacaga gcgggacccg tggtctcgta gtgaatgtgc tccacctcgt actccctgct 300
gcaggctact ttctcgtgcc cggcgatcag cctcacgatg tagcccacag aaacaaacat 360
gtagcaagct gacaggaaga tgatcggcct ctccgggtat ttgaaccttt ccatgtcgat 420
caagaaagtg gcgacagtgg caaaagtgga aacaaaacaa agcactgacc aaagtccaat 480
ccagaaagcg gtgaaagttc tctcgtcgtg ggtgaagtaa gggttgtggc atggcattgc 540
gcagttcggc atctgacccg tgttgaccct gttgtatagg gggtgccgct cgctggtgat 600
ctttaccata ggcgcacggc attggcaccc tggctcacag ggggtaaccg ggggtcggtg 660
tttgctgccc ggtactggag gtcggatctc atttttgttt ttgtgcg 707
<210> 2
<211> 707
<212> DNA
<213> 达氏鲟（Acipenser dabryanus）
<400> 2
gttttggttg ccaacgtagc agatcccagc caccgggtca ccgtccacag aactgagtgc 60
caggacagcg atagatttga tgctcgggat cagccaagct gccaggtgga aatactgaga 120
ataacttgct atggcctcgt tgccccattt cattcccgca gccaagaacc aagtgaggga 180
cagtataacc caccagatgg agctggccat gccaaagaag taaaccgaga gaaacacaac 240
agtgcacaga gcgggacccg tggtctcgta gtgaatgtgc tccacctcgt actccctgtt 300
gcaggctact ttctcgtgcc cggcgatcag cctcacgatg tagcccacag aaacaaacat 360
gtagcaagct gacaggaaga tgatcggcct ctccgggtat ttgaaccttt ccatgtcgat 420
caagaaagtg gcgacagtgg caaaagtgga aacaaaacaa agcactgacc aaagtccaat 480
ccagaatgcg gtgaaagttc tctcgtcgtg ggtgaagtaa gggttgtggc atggcattgc 540
gcagttcggc atctgacccg tgttgaccct gttgtatagg gggtgccgct cgctggtgat 600
ctttaccata ggcgcacggc attggcaccc tggctcacag ggggtaaccg gcggtcggtg 660
tttgctgccc ggtactggag gtcggatccc atttttgttt ttgtgcg 707
<210> 3
<211> 707
<212> DNA
<213> 中华鲟（Acipenser sinensis）
<400> 3
gttttggttg ccaacgtagc agatcccagc caccgggtca ccgtccacag aactgagtgc 60
cagtacagcg atagatttga tgctcgggat cagccaagct gccaggtgga aatactgaga 120
ataacttgct atggcctcgt tgccccattt cattcccgca gccaagaacc aagtgaggga 180
cagtataacc caccagatgg agctggccat gccaaagaag taaaccgaga gaaacacaac 240
agtgcacaga gcgggacccg tggtctcgta gtgaatgtgc tccacctcgt actccctgtt 300
gcaggctact ttctcgtgcc cggcgatcag cctcacgatg tagcccacag aaacaaacat 360
gtagcaagct gacaggaaga tgatcggcct ctccgggtat ttgaaccttt ccatgtcgat 420
caagaaagtg gcgacagtgg caaaagtgga aacaaaacaa agcactgacc aaagtccaat 480
ccagaatgcg gtgaaagttc tctcgtcgtg ggtgaagtaa gggttgtggc atggcattgc 540
gcagttcggc atctgacccg tgttgaccct gttgtatagg gggtgccgct cgctggtgat 600
ctttaccata ggcgcacggc attggcaccc tggctcacag ggggtaaccg gcggtcggtg 660
tttgctgccc ggtactggag gtcggatccc atttttgttt ttgtgcg 707
<210> 4
<211> 707
<212> DNA
<213> 俄罗斯鲟（Acipenser gueldenstaedtii）
<400> 4
gttttggttg ccaacgtagc agatcccagc caccgggtca ccgtccacag aactgagtgc 60
cagtacagcg atagatttga tgctcgggat cagccaagct gccaggtgga aatactgaga 120
ataacttgct atggcctcgt tgccccattt cattcccgca gccaagaacc aagtcaggga 180
cagtataacc caccagatgg agctggccat gccaaagaag taaaccatga gaaacacaac 240
agtgcacaga gcgggacccg tggtctcgta gtgaatgtgc tccacctcgt actccctgtt 300
gcaggctact ttctcgtgcc cggcgatcag cctcacgatg tagcccacag aaacaaacat 360
gtagcaagct gacaggaaga tgatcggcct ctccgggtat ttgaaccttt ccatgtcgat 420
caagaaagtg gcgacggtgg caaaagtgga aacaaaacaa agcactgacc aaagtccaat 480
ccagaaagcg gtgaaagttc tctcgtcgtg ggtgaagtaa gggttgtggc atggcattgc 540
gcagttcggc atctgacccg tgttgatcct gttgtatagg gggtgccgct cgctggtgat 600
ctttaccata ggcgcacggc attggcaccc tggctcacag ggggtaaccg ggggtcggtg 660
tttgctgccc ggtacttgag gtcggatccc atttttgttt ttgtgcg 707
<210> 5
<211> 707
<212> DNA
<213> 西伯利亚鲟鱼（Acipenser baerrii）
<400> 5
gttttggttg ccaacgtagc agatcccagc caccgggtca ccgtccacag aactgagtgc 60
cagtacagcg atagatttga tgctcgggat cagccaagct gccaggtgga aatactgaga 120
ataacttgct atggcctcgt tgccccattt cattcccgca gccaagaacc aagtcaggga 180
cagtatgacc caccagatgg agctggccat gccaaagaag taaaccatga gaaacacaac 240
agtgcacaga gcgggacccg tggtctcgta gtgaatgtgc tccacctcgt actccctgtt 300
gcaggctact ttctcgtgcc cggcgatcag cctcacgatg tagcccacag aaacaaacat 360
gtagcaagct gacaggaaga tgatcggcct ctccgggtat ttgaaccttt ccatgtcgat 420
caagaaagtg gcgactgtgg caaaagtgga aacaaaacaa agcactgacc aaagtccaat 480
ccagaaagcg gtgaaagttc tctcgtcgtg ggtgaagtaa gggttgtggc atggcattgc 540
acagttcggc atctgacccg tgttgaccct gttgtatagg gggtgccgct cgctggtgat 600
ctttaccata ggcgcacggc attggcaccc tggctcacag ggggtaaccg ggggtcggtg 660
tttgctgccc ggtactggag gtcggatccc atttttgttt ttgtgcg 707
<210> 6
<211> 707
<212> DNA
<213> 小体鲟（Acipenser ruthenus）
<400> 6
gttttggttg ccaacgtagc agatcccagc caccgggtca ccgtccacag aactgagtgc 60
cagtacagca atagatttga tgctcgggat cagccaagct gccaggtgga aatactgaga 120
ataacttgct atggcctcgt tgccccattt cattccagca gccaagaacc aagtcaggga 180
cagtatgacc caccagatgg agctggccat gccaaagaag taaaccatga gaaacacaac 240
agtgcacaga gcgggacccg tggtctcgta gtgaatgtgc tccacctcgt actccctgtt 300
gcaggctact ttctcgtgcc cggcgatcag cctcacgatg tagcccacag aaacaaacat 360
gtagcaagct gacaggaaga tgatcggcct ctccgggtat ttgaaccttt ccatgtcaat 420
caagaaagtg gcgactgtgg caaaagtgga aacaaaacaa agcactgacc aaagtccaat 480
ccagaaagcg gtgaaagttc tctcgtcgtg ggtgaagtaa gggttgtggc atggcattgc 540
acagttcggc atctgacccg tgttgatcct gttgtatagg gggtgccgct cgctggtgat 600
ctttaccata ggcgcacggc attggcaccc tggctcacag ggggtaaccg ggggtcggtg 660
tttgctgccc ggtactggag gtcggatccc atttttgttt ttgtgcg 707
<210> 7
<211> 707
<212> DNA
<213> 达乌尔鳇（Huso dauricus）
<400> 7
gttttggttg ccaacgtagc agatcccagc caccgggtca ccgtccacag aactgagtgc 60
caggacagcg atagatttga tgctcgggat cagccaagct gccaggtgga aatactgaga 120
ataacttgct atggcctcgt tgccccattt cattcccgca gccaagaacc aagtgaggga 180
cagtataacc caccagatgg agctggccat gccaaagaag taaatcatga gaaacacaac 240
agtgcacaga gcgggccccg tggtctcgta gtgaatgtgc tccacctcgt actccctgtt 300
gcaggctact ttctcgtgcc cggcgatcag cctcacgatg tagcccacag aaacaaacat 360
gtagcaagct gacaggaaga tgatcggcct ctccgggtat ttgaaccttt ccatgtcgat 420
caagaaagtg gcgacagtgg caaaagtgga aacaaaacaa agcactgacc aaagtccaat 480
ccagaaagcg gtgaaagttc tctcgtcgtg ggtgaagtaa gggttgtggc atggcattgc 540
gcagttcggc atctgacccg tgttgatcct gttgtatagg gggtgccgct cgctggtgat 600
ctttaccata ggcgcacggc attggcaccc tggctcacag ggggtaaccg gcggtcggtg 660
tttgctgccc ggtactggag gtcggatctc atttttgttt ttgtgcg 707
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
taaccacgac acacaggatg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctgaataaag acacgaaccc 20
Claims (4)
1.施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒在施氏鲟种质鉴定中的应用，所述试剂盒包括fzd8基因片段的特异性引物，所述fzd8基因片段的特异性引物的核苷酸序列为：
正向引物： 5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’ ，即SEQID NO:8；
反向引物： 5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ ，即SEQID NO:9。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包含PCR试剂；所述PCR试剂为：2.5μL 含Mg2+的Taq酶10× buffer；2.5 mM dNTPs 1μL；25 pM 上游引物 0.5μL；25 pM下游引物 0.5μL；2.5 U μL-1 Taq DNA聚合酶 0.2μL；19.8μL超纯水。
3.一种利用施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒鉴定施氏鲟种质的方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、分别取各鲟科鱼类样本，提取基因组DNA；
B、分别以各鲟科鱼类的基因组DNA为模板，取权利要求1-2任一项所述的施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒进行PCR扩增；
C、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并测序；
D、对鲟科鱼类样本的PCR产物测序结果分别进行序列比对，通过序列差异直接鉴定；
其中扩增获得的PCR产物的核苷酸序列中第299位为C时，样本为施氏鲟或其产品；扩增获得的PCR产物的核苷酸序列中第299位为T时，样本为其他鲟鱼或其产品；
所述的其它鲟鱼为达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇中的任意一种或者多种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：其中施氏鲟产品或其他鲟鱼产品包括鱼子酱、熏制品、罐头和/或皮制品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510460443.3A CN105002170B (zh) | 2015-07-31 | 2015-07-31 | 施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510460443.3A CN105002170B (zh) | 2015-07-31 | 2015-07-31 | 施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105002170A CN105002170A (zh) | 2015-10-28 |
| CN105002170B true CN105002170B (zh) | 2017-08-01 |
Family
ID=54375037
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510460443.3A Active CN105002170B (zh) | 2015-07-31 | 2015-07-31 | 施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105002170B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108660220B (zh) * | 2018-05-21 | 2021-07-13 | 中国水产科学研究院 | 一组鲟鱼snp分子标记、鲟鱼制种评估方法及遗传评估方法 |
| CN109337962A (zh) * | 2018-08-24 | 2019-02-15 | 暨南大学 | 基于荧光定量pcr检测鲟鱼的引物和探针及其试剂盒与方法 |
| CN111471775B (zh) * | 2019-01-24 | 2021-04-30 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 用于鲟鱼性别鉴定的特异性dna片段ssm2及应用 |
| CN112831573B (zh) * | 2021-03-22 | 2023-05-26 | 贵州省水产研究所 | 一种用于鲟鱼种质鉴定的snp引物和检测方法 |
| CN115323060B (zh) * | 2021-06-11 | 2023-08-01 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种鱼类核基因分子标记引物、分子标记及分子标记数据库 |
| CN113957158B (zh) * | 2021-12-15 | 2023-05-30 | 中国海关科学技术研究中心 | 一种用于检测施氏鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用 |
| CN114107521A (zh) * | 2021-12-20 | 2022-03-01 | 中国海关科学技术研究中心 | 一种用于检测纯种西伯利亚鲟核基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1936567A (zh) * | 2005-09-19 | 2007-03-28 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种鉴定史氏鲟、达氏鳇的技术 |
| CN103436610A (zh) * | 2013-08-20 | 2013-12-11 | 徐鹏 | 一种常见鲟鱼类的pcr-rflp快速检测方法 |
-
2015
- 2015-07-31 CN CN201510460443.3A patent/CN105002170B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1936567A (zh) * | 2005-09-19 | 2007-03-28 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种鉴定史氏鲟、达氏鳇的技术 |
| CN103436610A (zh) * | 2013-08-20 | 2013-12-11 | 徐鹏 | 一种常见鲟鱼类的pcr-rflp快速检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GenBank 登录号：AY333968;Hoegg.S 等;《NCBI》;20041025;参见序列部分 * |
| Molecular Identification and the Features of Genetic Diversity in Interspecific Hybrids of Amur Sturgeon(Acipenser schrenckii A.baerii,A.baerii A.schrenckii,A.schrenckii A.ruthenus,and A.ruthenus A.schrenckii)Based on Variability of Multilocus RAPD Markers;K.V.Rozhkovan 等;《MOLECULAR GENETICS》;20080131;第44卷(第11期);第1453-1460页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105002170A (zh) | 2015-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105002170B (zh) | 施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其应用 | |
| CN105063192B (zh) | 用于鉴定施氏鲟种质的分子标记及其应用 | |
| US20200232016A1 (en) | Methods and Compositions for the Analysis of Biological Molecules | |
| CN104087576B (zh) | 与番茄果实颜色性状相关的分子标记及应用 | |
| RU2017100253A (ru) | Набор или устройство для обнаружения рака предстательной железы и способ обнаружения | |
| Monfort et al. | A new set of polymorphic simple sequence repeat (SSR) markers from a wild strawberry (Fragaria vesca) are transferable to other diploid Fragaria species and to Fragaria× ananassa | |
| CN105274094B (zh) | Snp标记及其应用 | |
| CN104673790B (zh) | 油茶良种长林18号的分子特异性标记引物及鉴定方法 | |
| CN104593504B (zh) | 一种27个植物转基因位点复合pcr扩增荧光检测试剂盒 | |
| CN109234449A (zh) | 一种黑麦通用2rl染色体特异共显性kasp分子标记及其应用 | |
| CN105483267B (zh) | 血浆游离DNA双分子标记、标记和检测血浆cfDNA的方法及其用途 | |
| Nakajima et al. | Rapid detection of the red fire ant Solenopsis invicta (Hymenoptera: Formicidae) by loop-mediated isothermal amplification | |
| KR101716021B1 (ko) | 은행나무 암, 수 구별용 프라이머 및 이를 이용한 암, 수 구별 방법 | |
| CN110172525A (zh) | 林木差异表达基因ssr引物组及多态性ssr标记开发方法 | |
| KR20110039575A (ko) | 바이로이드 ＰＳＴＶｄ 및 ＴＣＤＶｄ의 동시 검출 방법 | |
| Peng et al. | Kamchatka crab duplex-specific nuclease-mediated transcriptome subtraction method for identifying long cDNAs of differentially expressed genes | |
| CN105238778B (zh) | Snp标记及其应用 | |
| KR20220076345A (ko) | 6종의 두족류 판별을 위한 종 특이적 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| KR102174274B1 (ko) | 대추 품종 '보은'과 '추석'을 판별하기 위한 분자마커 및 이의 용도 | |
| CN106755403A (zh) | 一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法 | |
| JP6853523B2 (ja) | ヘリカーゼを用いたｐｃｒ | |
| CN106282332B (zh) | 用于多重核酸测序的标签和引物 | |
| KR102254330B1 (ko) | 민어와 홍민어 판별용 프라이머 세트, 이를 이용하여 민어와 홍민어를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 키트 | |
| CN103305610B (zh) | 一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法 | |
| CN104498488A (zh) | 一种评估鲤鱼种群遗传多样性的remap标记 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |