CN109022593A - 肝用鹅腹脂重与胴体重的辅助选择标记及利用分子标记辅助选择的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于家禽育种技术领域，具体涉及一种肝用鹅腹脂重与胴体重的辅助选择标记，具有SNP位点，SNP位点位于MC5R基因起始密码子下游第807bp位置。本发明还公开了利用分子标记辅助选择肝用鹅腹脂重与胴体重性状的方法：选定待测的朗德鹅个体，抽取血液并提取DNA，利用提供的试剂盒进行聚合酶链式反应（PCR）并检测产物，将PCR产物送测序公司测序并判定基因型，依据基因型挑选合格的个体留着种用。本发明不仅可避免屠宰测定法带来的高成本和大工作量大，以及优秀个体不能留作种用的缺点，而且可用于大规模选种，加快育种进程。

Description

肝用鹅腹脂重与胴体重的辅助选择标记及利用分子标记辅助 选择的方法
技术领域
本发明属于家禽育种技术领域，具体涉及一种利用候选基因核苷酸多态性辅助选择肥肝鹅的腹脂重、胴体重，以培育优良肥肝鹅。可供肥肝鹅育种企业和研究单位使用。
背景技术
不同品种间和同一品种内鹅的产肝性能差异大，说明遗传因素是重要影响因素。因此，通过遗传育种手段可改善肥肝鹅的生产性能，然而表型选择和屠宰测定对产肝性能的改良效果不佳或代价大。相比而言，标记辅助选择不仅可避免屠宰活禽带来的高成本、间接选择问题，还可显著提高选择的准确性和有效性，加快选育进程。所谓标记辅助选择是利用遗传标记与致因基因连锁而导致的标记与生产性状的关联，对生产性状进行选择，以挑选出优良个体。由于鹅肥肝形成常伴随腹脂和胴体重增加，而腹脂和胴体对鹅肥肝生产企业来说是副产品或废弃物，因此，减少肝用鹅的腹脂重和胴体重，可提高鹅肥肝生产的经济效益。
标记辅助选择育种成功的关键在于找到有效的遗传标记。遗传标记有两个来源：关联分析和功能已知的候选基因。单核苷酸多态性(SNP)是一种最为常见的分子标记，可通过测序筛查获得。目前有关肝用鹅的辅助选择标记还很少。黑素皮质激素5受体(MC5R)是一个良好的候选基因。已知其功能与能量消耗(如体温调节)、脂肪细胞的瘦素分泌减少(瘦素可参与食物摄入量和能量消耗的调节)、胰岛素抵抗相关，而且发现人类的MC5R多态性与肥胖相关。
对于肝用鹅来说，肥肝才是产品，而腹脂和胴体是副产品。在肝重一定的情况下，腹脂过多的沉积与胴体的增加意味着多消耗饲料而降低肥肝生产的经济效益。因此，在保持肥肝重不受影响的同时，减少腹脂沉积和胴体重，将对鹅肥肝生产大有裨益。然而目前除了屠宰测定方法外，还没有较好的方法测定或预测肝用鹅腹脂重和胴体重的方法。筛选与肝用鹅腹脂重和胴体重关联的遗传标记，并利用这种遗传标记来辅助选择肝用鹅的腹脂重和胴体重，将不失为一种有效的解决方法。
发明内容
本发明旨在解决对肝用鹅腹脂重和胴体重标记辅助选择的问题，提供一种肝用鹅腹脂重与胴体重的辅助选择标记及利用分子标记辅助选择的方法。本发明通过对朗德鹅的MC5R基因进行核酸多态性分析，筛查到一个SNP位点。在此基础上，通过关联分析，确立该SNP 与肥肝鹅的腹脂重、胴体重存在显著性关联，但与肥肝重无显著关联。因此，该SNP可用于选择腹脂重和胴体重较小的肝用鹅而对肥肝重不产生显著影响，提高鹅肥肝生产的经济效益。这种方法不仅可避免屠宰测定法带来的高成本和大工作量大，以及优秀个体不能留作种用的缺点，而且可用于大规模选种，加快育种进程。
本发明的第一个目的是提供一种肝用鹅腹脂重与胴体重的辅助选择标记，具有SNP位点，该位点位于MC5R基因起始密码子下游第807bp位置。SNP位点左右测核苷酸序列为ATGATCTCCTGCCCTCAAAACCTCTA(C/T)TGTGTTTGCTTCATGTCTC。
本发明的第二个目的是提供利用分子标记辅助选择肝用鹅腹脂重与胴体重性状的方法：选定待测的朗德鹅个体，抽取血液并提取DNA，利用提供的试剂盒进行聚合酶链式反应 (PCR)并检测产物，将PCR产物送测序公司测序并判定基因型，依据基因型挑选合格的个体留着种用；具体为
1)选定待测的朗德鹅个体：从朗德鹅(或其他品种的鹅)育种群体中挑选体重均匀的健康个体。
2)抽取血液并提取DNA：从检测个体的翅静脉中抽取0.1mL的血液。利用DNA提取试剂盒，提取DNA模板。
3)聚合酶链式反应及产物检测：利用提取的DNA作PCR中的模板和提供的PCR试剂盒进行PCR。取5μL产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，如呈现912bp大小的单一条带，则将 PCR产物送测序公司检测。
4)测序并判定基因型：将PCR产物和引物送测序公司测序，依据测序结果确定基因型。
5)依据基因型挑选合格的个体，凡是在多态性位点具有CC基因型个体都留着种用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)目前尚未见有关于对肝用鹅填饲后的腹脂重和胴体重进行选择的报道。本发明提供了对这两个性状同时选择而不影响肥肝重的方法，应用本发明可快速减少育种群体个体填饲后的腹脂重和胴体重，显著改善育种群体的种质。因此，本发明为肝用鹅提供了一种快速选种的方法，显著缩短选育时间。
2)相对于表型选择，本发明准确有效，明显提高育种效率。
3)本发明不涉及屠宰测定，显著减少工作量和测定成本，且可以大规模操作，是一种质优价廉的方法。
附图说明
图1是6个朗德鹅的DNA样品PCR产物电泳图；
图2A是MC5R基因SNP位点TT基因型所对应的测序峰图；
图2B是MC5R基因SNP位点CT基因型所对应的测序峰图；
图2C是MC5R基因SNP位点CC基因型所对应的测序峰图；
图2A、2B、2C中该SNP的左右侧序列为 ATGATCTCCTGCCCTCAAAACCTCTA(C/T)TGTGTTTGCTTCATGTCTC；
图3是MC5R基因SNP位点不同个体测序结果示例图。
具体实施方式
下面以一批66只朗德鹅为例具体阐述本发明：
1)选定待测的朗德鹅个体：从一批朗德鹅群体中挑选了66个体重均匀的健康个体。
2)抽取血液并提取DNA：从检测个体的翅静脉中抽取0.1mL的血液。利用DNA提取试剂盒，提取DNA模板。
3)聚合酶链式反应及产物检测：利用提取的DNA作PCR中的模板和提供的PCR试剂盒(所含试剂的清单详见附表1)进行PCR(反应体系详见附表2，反应条件详见附表3)。取5μL产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，如呈现912bp大小的单一条带(参见附图1)，则将 PCR产物送测序公司检测。
4)测序并判定基因型：将PCR产物和引物(引物同附表1中的引物)送测序公司测序，依据测序结果确定基因型(参见附图2、3)。
5)关联分析：为了分析该多态性位点与肝用鹅生产性状的关系，本例对这批朗德鹅进行了填饲与屠宰测定。屠宰测定指标包括：肥肝重、腹脂重和胴体重。根据统计分析，可以看出该多态性位点与腹脂重和胴体重显著关联，而与肥肝重的关联不显著(详见附表4)。数据表明CC基因型的平均腹脂重比其他两个基因型少10％左右，平均胴体重少8％左右，而肥肝重却略高一些。因此，选择CC基因型个体可以减少群体的平均腹脂重、胴体重，而对肥肝重无不利影响。注：该发明在实际应用时，无需对检测个体进行填饲与屠宰测定，应跳过此步骤。
6)依据基因型挑选合格的个体，凡是在多态性位点具有CC基因型个体都留着种用。
附表1试剂盒中的试剂清单
附表2 MC5R基因PCR体系
注：体系中的上述物质在按顺序加入反应管后在台式离心机上以1000转/分钟离心1分钟，使所加物质全部沉于底部，然后放置于PCR仪中按附表3反应条件进行PCR扩增。取5 μL产物用于凝胶电泳，检测产物的大小与单一性。
附表3 PCR条件
附表4 MC5R多态性位点与鹅填饲后生产性状的关联分析
注：同一列数据上的上标不同者为基因型间存在差异显著性，相同者为不显著。
<110>扬州大学
<120>肝用鹅腹脂重与胴体重的辅助选择标记及利用分子标记辅助选择的方法
<160>4
SEQ ID NO.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ACTCTGGGCA TTGTAAGCCT 20
SEQ ID NO.2
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
AGCAGAACAA CAAGGTGCAG 20
SEQ ID NO.3
<210>3
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ATGATCTCCT GCCCTCAAAA CCTCTACTGT GTTTGCTTCA TGTCTC 46
SEQ ID NO.4
<210>4
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ATGATCTCCT GCCCTCAAAA CCTCTATTGT GTTTGCTTCA TGTCTC 46

Claims (8)

1.一种肝用鹅腹脂重与胴体重的辅助选择标记，具有 SNP位点，SNP位点位于MC5R基因起始密码子下游第807bp位置。
2.利用分子标记辅助选择肝用鹅腹脂重与胴体重性状的方法，其特征是，所述方法为：选定待测的朗德鹅个体，抽取血液并提取DNA，利用引物对进行聚合酶链式反应并检测产物，将PCR产物测序并判定基因型，依据基因型挑选具有CC基因型个体留着种用；
所述引物对为：
上游引物：5’-ACTCTGGGCATTGTAAGCCT-3’；
下游引物：5’-AGCAGAACAACAAGGTGCAG-3。
3.根据权利要求2所述的利用分子标记辅助选择肝用鹅腹脂重与胴体重性状的方法，其特征是，所述方法具体为：
1）选定待测的朗德鹅个体：从朗德鹅育种群体中挑选体重均匀的健康个体作为待测个体；
2）抽取血液并提取DNA：从检测个体的翅静脉中抽取血液；利用DNA提取试剂盒，提取DNA模板；
3）聚合酶链式反应及产物检测：利用提取的DNA作PCR中的模板和权利要求1所述的引物对进行PCR；取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如呈现912 bp大小的单一条带，则将PCR产物检测；
4）测序并判定基因型：将PCR产物和引物测序，依据测序结果确定基因型；
5）依据基因型挑选合格的个体，凡是在多态性位点具有CC基因型个体都留着种用。
4.根据权利要求3所述的利用分子标记辅助选择肝用鹅腹脂重与胴体重性状的方法，其特征是，所述PCR反应体系为20 μL，10µM 上游引物0.5 μL；10µM下游引物0.5 μL；2×Taqmix 10 μL；水8 μL；200ng/μL DNA 1 μL。
5.根据权利要求4所述的利用分子标记辅助选择肝用鹅腹脂重与胴体重性状的方法，其特征是，所述PCR反应体系中的上述物质在按顺序加入反应管后在台式离心机上以1000转/分钟离心1分钟，使所加物质全部沉于底部，然后放置于PCR仪中进行PCR扩增。
6.根据权利要求3所述的利用分子标记辅助选择肝用鹅腹脂重与胴体重性状的方法，其特征是，所述PCR反应条件为：95 ºC预变性5分钟；95 ºC 30秒，58 ºC 30秒，72 ºC 1分钟，35个循环；72 ºC，5分钟；4 ºC，保持至电泳。
7.根据权利要求3所述的利用分子标记辅助选择肝用鹅腹脂重与胴体重性状的方法，其特征是，步骤2）取5 µLPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
8.根据权利要求3所述的利用分子标记辅助选择肝用鹅腹脂重与胴体重性状的方法，其特征是，步骤1）从检测个体的翅静脉中抽取0.1 mL的血液。
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